针对人c-Jun氨基末端激酶的小RNA分子在老年痴呆症中的作用的制作方法

专利名称：：针对人c-Jun氨基末端激酶的小RNA分子在老年痴呆症中的作用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体的，本发明涉及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路与Y分泌酶依赖的淀粉样蛋白(AP)产生的相关性，以及针对人c-Jun氨基末端激酶的小RNA分子在老年痴呆症中的作用。
背景技术：
：阿尔茨海默症(Alzheimer'sdisease,AD)又叫老年痴呆症，是目前世界上最严重最普遍的神经退行性疾病，目前世界上约有2000万人患有这种疾病。它的临床病理特征表现为早期，病人记忆开始衰退，尤其短期记忆能力明显减弱。中期，病人记忆进一步衰退，生活行为混乱，对周围事物辨别困难。晚期，病人性格严重变异，生活难以自理，最终提前死亡。AD病人脑内的病理切片结果显示有三个典型的病理特征沉积在细胞外的老年斑(Senilepl叫ue，SP)，细胞内的神经纤维缠结(Neurofibrillarytangles,NFT)和神经元的丢失(Neuronalloss)。其中老年斑中的主要成分是p-淀粉样蛋白(Amyloid卩-peptide，Af3)，它的产生和积累被认为是造成AD的主要原因。在病人年轻时期，A(3蛋白含量很低，和正常人没有明显差别。但是随着病人年龄的增长，脑内的AP蛋白的含量开始增加，AP蛋白的含量以指数形式增加，最后造成灾难性的后果。但是，到目前为止，对于AD中晚期的淀粉样蛋白加速产生积累的原因还不是很清楚。A卩蛋白是一个含有39-43氨基酸的肽段，它由其前体蛋白APP经过分泌酶水解而来。全长APP蛋白在脑内的主要形式是APP695，成熟的APP单次跨膜，属于I-型跨膜类蛋白，N端含有-个17个氨基酸的信号肽。APP蛋白大部分位于细胞外，胞内部分是很短的APP蛋白C末端。APP被运输到细胞表面后，经过两种不同的代谢方式。根据最终是否产生Ap,可以分为淀粉样蛋白途径和非淀粉样蛋白途径。卩分泌酶和a分泌酶分别介导了这两个过程，所以又叫做卩分泌酶代谢途径和a分泌酶代谢途径。上述两种途径产生的C99和C83都被Y分泌酶水解。Y分泌酶是一个有四个组分构成的复合物，属于天冬氨酸酶家族，其中早老素蛋白(Presenilin，PS)是Y分泌酶的酶活中心成员，另外三个成员Nicastrin(Net)，早老蛋白增强因子-2(PEN-2)和Anteriorpharynxdefective1protein(Aph-1)负责复合物的组装，底物识别。PS1的基因敲除小鼠体内A(3的含量明显降低，y分泌酶活性下降。90%以上的家族性AD病症都和PS1的突变体有关，因此，一直以来y分泌酶受到了研究人员的极大兴趣。虽然目前对Y分泌酶复合物的生化特性已有比较清晰的了解，但是对于它活性的调控还不清楚，尤其是作为占有90%以上的散发性老年病中的y分泌醇如何受到调控，将是一个十分有意义的问题p氧自由基(ROS)是体内新陈代谢过程中带来的副反应，氧自由基产生和清除在正常体内受到严格的调控，当氧自由基的产生多于清除时，就会产生氧化应激(Oxidativestress)。H202，OH-，0—2属于氧自由基。在AD病人脑中，氧化应激修饰的DNA，蛋白，脂类都高于正常病人，尤其在神经纤维缠结，老年斑富集区域有着比较高的浓度。因此，氧自由基和AD发病之间有着密切的关系。一般认为，在体外，A(3单体逐渐聚合成可溶性Ap寡聚体的过程中，Cu+/Fe2+的辅助下，能够产生过氧化氢。l付且，有报道显小，A(3的神经毒性需要通过氧自由基来介导。将神经突触暴露fA卩共培养中，细胞出现离子浓度失衡，谷胱酰胺释放受阻等缺陷，这些都受到了氧自由基的介导。因此，经典的A(3假说认为，由于先天性家族突变或后天环境影响，使得淀粉样蛋白逐渐在体内沉积，产生的寡集体A卩具有神经毒性，'很重要的一条通路就是能够造成氧化应激攻击线粒体，使细胞内钙离子水平失衡，并激活下游一系列激酶。激酶的活化又引起神经纤维蛋白Tau的过量磷酸化，造成后者在细胞内的异常缠结，对细胞合成运输，以及其他正常生理功能都带来严重影响，最后造成细胞元的死亡和丢失，病人呈现痴呆的症状。目前有些证据表明氧化应激并不仅仅是A(3积累的后果，它还可能是A(3产生的原因。有证据表明，过氧化氢刺激后，能引起神经胶质母细胞瘤SH-SY5Y细胞内的A(3产生增加。而且，通过抗氧化剂维生素E服药后，能显著减少转基因小鼠AD模型脑内的老年斑数量和AP量。已有些证据试图解释氧化应激如何调控APP代谢过程来影响A卩生成。比如，在哺乳动物眼睛细胞内，过氧化氢处理后，能引起全长APP蛋白的表达量上升，从而引起A(3的产生上升。低浓度的过氧化氢刺激后，能够引起细胞内卩分泌酶的转录活性，从而增加P分泌酶的蛋白表达和酶解能力，使得C99的产量上升，AP的量增加，提示了过氧化氢具有将a水解途径向P水解途径转换的作用。但是，也有文献报道，过氧化氢刺激后，细胞内A卩上升的同时，其APP和C99的量都减少，提示APP整个代谢过程加快。总之，目前过氧化氢引起A卩上升的原因还不是很清楚，尤其作为限制A卩产生的最后一个关键性步骤的Y分泌酶，它在过氧化氢引起的A(3上升过程中的作用还没有研究。因此，.研究Y分泌酶在氧化应激中是否受调控，以及怎样受调控都是-'个七分重要和有意义的事情。
发明内容本发明的目的在于提供一种c-Jun氨基末端激酶信号通路的拮抗剂的用途，用于制备抑制淀粉样蛋白产生的组合物。本发明的另一目的在于提供--种用于抑制淀粉样蛋白产生的小RNA分子。在本发明的第-方面，.提供一种c-Jun氨基末端激酶信号通路的拮抗剂的用途，用于制备抑制淀粉样蛋白产生的组合物。在另一优选例中，"拮抗剂"包括抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。在另一优选例中，所述的淀粉样蛋白产生是氧化应激试剂诱导的；更特别的，所述的氧化应激试剂是过氧化氢。在另一优选例中，所述的组合物还用于预防或治疗神经退行性疾病。在另一优选例中，所述的神经退行性疾病是阿尔茨海默症。在另--优选例屮，所述的淀粉样蛋["产生是Y分泌酶依赖的淀粉样蛋白产生。在另一优选例中，所述的c-Jim氨基末端激酶信号通路的拮抗剂是特异性干扰c-Jun氨基末端激酶基因表达的小RNA分子。在另一优选例中，所述的小RNA分子(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第1-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的c-Jiin氨基末端激酶信号通路的拮抗剂是SP600125(分子式C14H8N20)。在本发明的第二方面，提供一种用于抑制淀粉样蛋白产生的小RNA分子，所述的小RNA分f:(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第1-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。在本发明的第三方面，提供一种筛选抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质的方法，所述的方法包括(1)用候选物质处理具有c-Jun氨基末端激酶信号通路的细胞(或细胞培养物)；和(2)检测所述细胞中c-Jim氨基末端激酶信号通路的变化情况；其中，若所述候选物质Bn沮断c-Jun氨基末端激酶信号通路，或抑制c-Jun氨基末端激酶信号通路的激活，则表明该候选物质是抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。在另一优选例中，步骤(l)包括在测试组屮，将候选物质加入到具有c-Jun氨基末端激酶信号通路的细胞中；和/或步骤(2)包括检测测试组的细胞中c-Jun氨基末端激酶信号通E各的变化情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的具有c-Jun氨基末端激酶信号通路的细胞；如果测试组中c-Jun氨基末端激酶信号通路或其相关蛋白的活性在统计学上低于(优选显著低于，如低50%以上，较佳的低100%以上；更佳的低200%以上)对照组，就表明该候选物是抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。在另一优选例中，所述方法还包括在候选物质处理之前或处理之后，用氧化应激试剂(如过氧化氢)刺激细胞。较佳的，釆用过氧化氢刺激细胞，且过氧化氢的浓度高-f100"M，更佳的浓度为0.2mM或高f0.2mM，最佳的浓度为lmM或高于lmM。在另一优选例中，进一步还包括检测所述细胞中Y分泌酶的活性；其中，若所述候选物质可抑制Y分泌酶的活性，则表明该候选物质是抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。在另一优选例中，还包括设置另一对照组，所述的对照组是添加所述候选物质的且不具有c-Jun氨基末端激酶信号通路的细胞。在另一优选例中，所述的细胞选自SH-SY5Y细胞、或HEK293细胞。在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制淀粉样蛋白产生有用的物质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l.过氧化氢促进细胞内外淀粉样蛋白的生成。A，SH-SY5Y/APP695myc细胞用含有1.0mM过氧化氢的无血清培液刺激l小时。培液收集后用酶联免疫反应检测分泌到胞外的淀粉样蛋白含量。B.刺激后的细胞用RIPA裂解，经过蛋白定量，测定细胞内的淀粉样蛋白图2.过氧化氢并不影响APP的合成，也不影响a，(3分泌酶的活性。A.过氧化氢(lmM)刺激细胞，裂解细胞，用Westernblot法检测APP蛋白的表达情况，抗休为myc抗体(a-myc，购自Covance公司)。其中，mAPP695myc表示成熟的APP，imAPP695myc表示未完全成熟的APP。以p-actin作为上样量对照。B-D.将刺激后的无血清培液用酒精沉淀，浓縮蛋白后用APP的各种特异性抗体检测，其中6E10(a-sAPPa或，购自Signetlaboratory)检测培液中的a分泌酶水解产物(sAPPa)，anti-sAPPp(a-sAPPp,购自IBL)检测培液中的(3分泌酶水解产物(sAPPp)，22Cll抗体(a-sAPPa+p,购自Chemicon)检测培液中的a，卩分泌酶水解产物(SAPPa+p)。其中，以丽春红染色的血清白蛋白条带作为上样量对照。E.先初步通过差速离心方法，提取了富含a，p分泌酶的细胞膜组分，然后加入a，(3分泌酶的特异性荧光底物各2ug，在体外37。C酶解反应后，在激发波长340nm，发射波长490nm条件下对分泌酶的活性进行了检测。图3.过氧化氢促进了Y分泌酶介3的APP水解过程。A，SH-SY5Y/APP695myc细胞用过氧化氢(1mM)刺激后，收集细胞用Westernblot检测APP蛋白羧基末端产物的表达情况(CTFmyc，AICDmyc)。以(3-actin作为上样量对照，a-p-actin为识别p-actin的抗体。B.过氧化氢促进Y分泌酶介导的APP水解过程具有时间依赖性。用过氧化氢(lmM)刺激后，每隔十分钟收集刺激的细胞，检测APP蛋白羧基末端产物的含量。C，细胞用Y分泌酶的特异性抑制剂DAPT(1"M(+)，10"1^(++))预先处理3小时，再用过氧化氢(浓度分别是O，0.2和lmM)刺激，以验证Y分泌酶是否参与其中。图4.过氧化氢促进Y分泌酶介导的SP-C99myc的水解过程。A-B.HEK293T细胞用pcDNA3.1-SP-C99myc瞬时转染24小时，然后用过氧化氢(lmM)刺激，收集培液和细胞，检测细胞内外的淀粉样蛋白的含量。C.HEK293T细胞用pcDNA3.1-SP-C99myc瞬时转染24小时，然后用过氧化氢(浓度分别是O，0.2和1mM)刺激后，Westernblot方法检测SP-C99myc的水解情况。用0，0.2和1.0mM过氧化氢刺激，Westernblot方法检测细胞内的AICD表达量。E.用报告基因实验检测过氧化氢对y分泌酶活性的促进作用。细胞用C99GVP(获自瑞典诺贝尔医学研究所)，Gal4-luc(购自promega)，PRL-TK质粒(购自promega)共同转染24小时后，DAPT(10uM)预处理3小时，然后过氧化氢(lmM)刺激1小时，细胞裂解，检测荧光素酶报告基闪活性。图5.过氧化氢通过JNK信号通路促进y分泌酶水解活性。A.SH-SY5Y细胞免疫荧光实验检测细胞内JNK磷酸化情况(一抗为抗p-JNK抗体(a-p-JNK)，购自CellSignaling;二抗为山羊抗兔IgG-Cy3，购自JacksonImmunoResearchLaboratories)。B-C.SH-SY5Y细胞分别用JNK信号抑制齐lJSP600125(浓度20uM)预处理3小时，然后检测其对过氧化氢(浓度分别是0，0.2和1mM)引起的y分泌酶活化的抑制作用。D.设计针对JNK的特异性siRNA，将siRNA和APP695myc瞬时共转染到HEK293T细胞中。再用过氧化氢(lmM)刺激，.检测JNK信号通路对y分泌酶的活性影响。其中，a-JNK为抗JNK抗体，购自PharMingen公司。E和F.将对应于APP蛋白序列第668位的JNK磷酸化位点的突变(由T突变为A)，建立APP695mt(APP(T688A)),C99mt(C99(T688A))，用westernblot方法检测过氧化氢(浓度1mM)刺激对其代谢的变化。图6.JNK信^通路特异性介^r过諷化^引起的y分泌酶的水解活性。将SH-SY5Y细胞血清饥饿12小时，然后用U0126(5^M，购自Calbiochem)(A)，Wortmannin(20nM，购自Calbiochem)(B)，SP600125(20岸，购自Calbiochem)(C)分别刺激3小时。然后收集细胞，用Westernblot方法检测ERK,PKB，JNK信号通路本身是否激活，以及对过氧化氢引起y分泌酶活化的影响。其中，a-p-ERK为抗磷酸化ERK的抗体(购自CellSignaling),a-ERK为抗ERK的抗体(购自SantaCruz);a-p-PKB为抗磷酸化PKB的抗体(购自SantaCruz)，a-PKB为抗PKB的抗体(购自SantaCruz)。图7.体内JNK信号通路在老年痴呆症老年斑周围激活。A.Westernblot方法检测病人大脑组织(n-4)和对照大脑组织(n二4)中的JNK活化情况。B.组织免疫荧光实验检测转基因小鼠Tg2576大脑内的JNK激活状况。冰9C.AD病理发生机制的示意图。具体实施例方式本发明人经过长期的研究，首次发现，氧化应激试剂(如过氧化氢)可通过激活c-Jim氨基术端激酶(JNK)信号通路促进y分泌酶的激活，从而导致淀粉样蛋白(AP)的产生。因此，可基于该发现开发出新的针对神经退行性疾病的药物耙点。本发明人还幵发了可抑制JNK信号通路的制剂，其可有效降低细胞内源性JNK蛋白的表达，有效抑制AP或y分泌酶活性的增加。JNK信号通路拮抗剂及其用途本发明人在研究中发现，H202促进了Y分泌酶水解活性，从而加速了APP，C99(C-末端99片段)的代谢过程。但是全长APP蛋白的表达，以及a和p分泌酶的活性却没有显著变化。进一步的分子机制研究表明，JNK信号通路在过氧化氢刺激的细胞中被激活，然后通过激活Y分泌酶来促进AI3的产生。利用抑制剂阻断JNK信号通路，或利用合适的针对JNK的siRNA下调JNK表达，能够有效的抑制11202对丫分泌酶水解活性的促进。并且发现，磷酸化的JNK蛋白在阿尔茨海默症(AD)病人的脑组织中明显高于正常人，也即JNK蛋白在AD病人体内被激活，而且激活的JNK定位在老年斑周围。因此，氧化应激活化的JNK通路通过激活Y分泌酶，从而促进了A(3的产生和老年斑的扩展。因此，基-f本发明人的新发现，本发明提供了JNK信^通路(或该通路相关蛋白，如JNK蛋t'l)的用途，川f筛选抑制A(3产化:的潜在物质。也即，筛选通过抑制JNK信号通路，进而抑制y分泌酶活性，从而抑制Af3产生的潜在物质。基于本发明的新发现，还提供了JNK信号通路的拮抗剂的用途，用于制备抑制AP产生的组合物。特别是可用于由抑制氧化应激试剂(如过氧化氢)诱导的AP的产生。AP的产生是导致神经退行性疾病的关键因素，因此所述的JNK信号通路的拮抗剂可用午预防或治疗神经退行性疾病(例如AD)。如本文所用，所述的拮抗剂包括了抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可抑制或阻断JNK信号通路(或该通路相关蛋白，如JNK蛋白)的活性，降低JNK信号通路相关蛋白的稳定性，抑制JNK信号通路相关蛋白的表达，或抑制JNK信号通路相关基因的转录或翻译的物质均可用于本发明，作为抑制淀粉样蛋白产生的有效物质。10作为本发明的一种方式，所述的JNK信号通路的拮抗剂例如是SP600125(分子式Cl4H8N20)。或者，所述的拮抗剂是一种特异性结合JNK信号通路相关蛋白的抗体。作为本发明的特别优选的方式，所述的拮抗剂是一种JNK特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，"小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)"是指一种短片段双链RNA分子，能够以问源互补序列的mRNA为靶kl标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA千扰(RNAinterference)过程。本发明的小干扰RNA分子nj特异性的f-扰JNK基因的表达，与其它的人类核酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰JNK表达的效果。所述的小RNA分f:(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第l-19位所示的核苷酸序列或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。其中，(a)和(b)的小RNA分子可有效千扰JNK1的表达；(c)和(d)的小RNA分子可有效干扰JNK1或JNK2的表达(也即小RNA分子的序列对应于JNK1或JNK2中同源序列部分)。本发明对siRNA的制备方法没有特别的限制，.包括但不限于化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的siRNA的序列以后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的siRNA。例如，在本发明的一种优选例中，所述的siRNA是化学合成的。siRNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。-个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。W此，举例来讲，h:补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产牛合成的双链RNA复合物。所述的siRNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域己知的多种技术被输送到细胞内。此外，siRNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链siRNA。筛选抑制淀粉样蛋白产生的物质的方法在得知了所述的氧化应激试剂可激活JNK信号通路，进而促进Y分泌酶活性，导致AJ3的产，i这一机制后，可以基于该机制筛选抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。可从所述的潜在物质中找到对f预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。因此，本发明提供一种筛选抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质的方法，所述的方法包括用候选物质处理具有JNK信号通路的细胞(或细胞培养物)；和检测所述细胞中JNK信号通路的变化情况；若所述候选物质可阻断JNK信号通路，或抑制JNK信号通路的激活，则表明该候选物质是抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到JNK信号通路的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的具有JNK信号通路的体系。更佳地，还包括设置另一对照组，该对照组是添加所述候选物质的且不具有JNK信号通路的细胞。在本发明的优选方式中，还包括在候选物质处理之前或处理之后，用氧化应激试剂(如过氧化氢)刺激细胞。单纯使用所述的氧化应激试剂可激活JNK信号通路，如用候选物质处理的细胞中JNK信号通路的激活情况低于对照组，或JNK信号通路被抑制，则说明该候选物质是抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。在本发明的优选方式中，进一步还包括检测所述细胞中Y分泌酶的活性；其中，若所述候选物质可抑制Y分泌酶的活性，则表明该候选物质是抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。对于所用的细胞没有特别的限制，只要其中具有JNK信号通路；较佳地还具有Y分泌酶；更佳地其在受到氧化应激试剂刺激后，可发生"JNK信号通路-Y分泌酶-Ae产生"这一机制。通常，所述的细胞是一种真核细胞。作为本发明的优选方式，所述的细胞选自SH-SY5Y细胞、或HEK293细胞。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对了-抑制淀粉样蛋白产生有用的物质。另一方面，本发叨还提供r釆用所述筛选方法获得的抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。-这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制淀粉样蛋白产生和/或预防或治疗神经退行性疾病有用的物质。组合物本发明还提供了--种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt。/。)的所述的JNK信号通路的拮抗剂，以及药学上或食品学上可接受的载体。作为本发明的-种优选方式，提供了-种fflf抑制淀粉样蛋白产生的组合物，所述的组合物含有有效量的本发明所述的小RNA分子(如0.000001-50wt%)，以及药学上可接受的载体。所述药学t:可接受的载体是在本质上对于人和/或动物无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质，并在本质上与所述的小RNA分子、任何所用到的靶向元件以及其它成分无作用。所述"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。本发明所述的小分子RNA的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所述的小分子RNA的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的重组腺病毒制剂每天以约0.0000lmg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。在得知了所述JNK信号通路的拮抗剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的JNK信号通路的拮抗剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限f:皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。优选的，可釆用基I大1治疗的P段进行。比如，R/点接将JNK信号通路的拮抗剂通过诸如注射等方法给药f受试者；或者，可通过-定的途径将携带JNK信号通路的拮抗剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性JNK信号通路的拮抗剂，具体情况需视所述的拮抗剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。本发明的主要优点在于-(1)首次发现，氧化应激试剂可通过激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路促进y分泌酶的激活，从而导致淀粉样蛋白(ap)的产生。因此，可基于该发现开发出新的针对神经退行性疾病的药物靶点。(2)找到一种"丁有效地抑制jnk信号通路的小rna分子，其可有效降低细胞内源性jnk^ri的^达，碰抑制ae或产卞ae所必需的y分泌酶活性的增加。下面结合具体实施例，进一-步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。1.质粒的构建pcDNA3.1-APP695myc表达载体构建以APP695cDNA(GenBank登录号A33292)为模板，使用正向引物(5-TTTTCTAGAGATGCTGCCCGGTTTG-3(SEQIDNO:4)和反向引物(5-GAGTCTAGACTAGTTCTGCATCTGC-3(SEQIDNO:5))进行PCR扩增(F划线为XbaI的位点)。纯化PCR扩增片段，使用XbaI酶切后插入经过同样酶切的载体myc-pcDNA3.1(购自Invitrogen)，获得pcDNA3.1-APP695myc表达载体。pcDNA3.1-SP-C99myc表达质粒的构建从pcDNA3.l-APP695myc载体，切出带有myctag的APP蛋白的C末端片段(C99myc)，构建成为pcDNA3.1-C99myc。另外，带有APP695信号肽序列的SP-C99参见THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,Vol.278,No.9，IssueofFebruary28:pp.68036808,2003，TheTransmembraneDomainoftheAmyloidPrecursorProteininMicrosomalMembranesIsonBothSidesShorterthanPredicted,通过两端的HindIII和EcoRI位点，插入到pcDNA3.1-C99myc的对应位点，连接成带有信号肽的pcDNA3.1-SP-C99myc。IRES2-EGFP-AICD50myc，IRES2-EGFP-AICD57myc，IRES2-EGFP-AICD59myc质粒的构建以全长pcDNA3.1-APP695myc质粒为模板，分别以正向引物5GAGAAGATCTATGATAGCGACAGTGATCGTC3'(SEQIDNO:6)，5-GAGAAGATCTATGACAGTGGATCGTCATTCACC-3(SEQIDNO:7)，5-GAGAAGATCTATGGTGATGCTGAAGGAAGAAAC-3(SEQIDNO:8)，禾口反向引物5GAATAGGGCCCTCTAGATGCATG3'(SEQIDNO:9)为引物，PCR克隆出AICD50myc,ACID57myc，AICD59myc片段，其中5端引入ATG启动子，两端引入BglII和BamHI位点，此片段插插入到IRES2-EGFP表达质粒(获自Invitrogen)对应位点，连接成为相应的IRES2-EGFP-AICDmyc质粒。用于Y分泌酶荧光素报告基因实验的质粒C99GVP购自瑞典诺贝尔医学研究所，Gal4-luc，PRL-TK购HPromega公口」。2.定点突变pcDNA3.1-APP695myc和pcDNA3.1-SP-C99myc的定点突变通过PCR策略达到目的，正向引物是(5-TTGACGCCGCTGTCGCCCCAGAGGAGCGCCACCT-3(SEQIDNO:IO))和反向引物(5-GCTCCTCTGGGGCGACAGCGGCGTCAACCTC-3(SEQIDNO:11));PCR体系为模板0.5y1(50ng);20yM引物(5/3):0.5iU;2.0mMdNTP:l.Oul;T叫缓冲液l.Oul;Mg2+:0.4KOD-plusT叫聚合酶0.2ul;H20:6.4ul。PCR条件为95°C,3min;94°C,45s;60°C，30s;68°C，8min;68°C，10min;30个循环。PCR产物用Dpnl消化，37'C酶解反应30min，降解来自模板的甲基化DNA。体系为PCR产物18.0Jil;NEB缓冲液1.0iM;Dpnl:l.Oul;37。C进行lh。取liM经酶解的PCR产物，电转化到DH5a感受态细菌中。涂板，抗生素筛选后，酶切鉴定E确后，测序最后确定。获得含冇的APP编码基因中第2004位由ACC突变为GCC(对应卩APP695蛋白序列第668位由苏氨酸突变为丙氨酸)的表达载体。3.细胞的瞬时转染HEK293T细胞用磷酸钙方法瞬时转染，转染前一天，将HEK293T细胞按密度为2.0乂105细胞接种到12孔板中培养，次日达50%密度。转染前4h，换为新鲜的10%FBS/DMEM/F12培液。分别配制溶液A:21pl2MCaCl2，1-2吗大抽质粒，142Wd2H20;溶液B:167^12XHEPEs(调pH为7.05)。轻轻混匀溶液A和溶液B，l-3min内加入到细胞中。在显微镜下观察形成的沉淀，一般情况下，沉淀呈现均匀太小的细沙状，逐渐下沉到细胞表面被摄入。如果形成的CaP04沉淀过大，则需要重新制备液A和溶液B的混合物。HEPEs的pH,大抽的质粒纯度，A，B液混和的均匀程度对CaP04沉淀均有影响。37'C培养6-9h后，吸去转染培液4.SH-SY5Y/APP695myc稳定细胞株的建立SH-SY5Y细胞(获自北京大学第六医学院)，用Fugene6试剂转染入pcDNA3-APP695myc载体。生长至70-80°/。满时，进行传代操作，将细胞稀释，均分至4个60mm培养皿中。(1)12h后，在培液中添加G418,使终浓度在500吗/ml。添加选择压力后，细胞开始死亡。视细胞死t的程度，隔天换液。(2)2-3周后，基本再无死亡的细胞。此时进行传代操作，细胞计数后，按比例稀释细胞至10cm培养皿中共200个细胞；此时细胞培液中的G418改为200"g/ml。剩余的细胞悬液则冻存，保存—f-液氮中。此时，可检测转染效率，或者进行功能初步检测。'(3)培养1周后，在显微镜下观察，此时单个细胞己长成较大的单克隆，选择形态较好，且均为单克隆的细胞，在培养皿的底部标记。(4)小心将灭过菌的克隆环粘附无菌硅胶后，粘在标记好的细胞克隆上，使细胞位于克隆环的正中。往克隆环中加入20tU胰酶，进行细胞传代操作，将细胞悬液尽数转移至24孔板中，分别编号。(5)每天观察细胞，待24孔板中的细胞长至70-80%满时，将其传代，转移至6孔板中。(6)待6孔板中的细胞长至70-80%满时，将其分别转移至60mm培养皿中。(7)待60mm培养皿中的细胞长至70-80%满时，可将细胞冻存，抽RNA或蛋白，进行下一步的鉴定。(8)对稳定表达的细胞在含G418抗性压力的培液中持续培养。5.RNA干扰(1)siRNA目标序列分别为siJNKl(5UCACAGUCCUGAAACGAUAtt3(SEQIDNO:l)):针对/"WmRNA(距离起始密码子第59个核苷酸)；siJNK1/2(5AAAGAAUGUCCUACCUUCUtt3(SEQIDNO:2)):针对/"W，/"/t2mRNA(距离起始密码子第377个核苷酸)；阴性对照siCtrl(5-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3(SEQIDNO:3))针对荧光素酶序列。siRNA采用化学合成法合成，3末端进行了碱基修饰。'(2)配制20MMsiRNA储液，往5nmolsiRNA中加入250"1常规溶解缓冲液，轻轻混匀后，在95i:水浴中变性2min，继续放在水浴中自然冷却至室温，此过程在45min以上，以保证充分的退火配对，4'C放置过夜后待用。(3)用Lipfectine2000转染HEK293T细胞，将siRNA禾口pcDNA3.1-APP695myc质粒共转，其中pcDNA3.1-APPmyc为1.5Pg,siRNA为20lU。4872h后，检测siRNA的抑制效率和作用结果。6.细胞免疫荧光染色将细胞固定于盖玻片上，有细胞面朝上。在含0.5%羊血清，P/。BSA的PBS中室温封闭1h。一抗室温作用lh或4'C过夜，PBS洗3次，每次10min。二抗室温1h，PBS洗3次，每次10min。DAPI染色，室温3min，PBS洗3次，每次5min。用石蜡封片剂封片，在室温避光晾干，荧光镜下观察。7.组织切片的免疫染色(1)组织灌流固定用戊巴比妥钠(浓度4%，剂量40mg/kg)麻醉动物，70%乙醇消毒胸部，剖开胸部暴露心脏。用止血钳夹住F腔静脉，剪开右心房。从下部剪开左心室，沿左心室后壁插入针头至主动脉弓，用止血钳同时夹住针头与心脏，以固定针头。灌流200ml37'C预温的0.9%生理盐水，之后缓慢灌流100ml4%PFA(溶于0.1MPBS缓冲液，pH7.4)，约需30分钟。剥离脑组织，在4%PFA中固定8小时。组织放入20%蔗糖中至沉底，换于30%蔗糖4'C保存。(2)固定组织的冰冻切片将蔗糖平衡后的组织放置于冰切专用模具中，加入OCT进行包埋。将包埋好的组织块固定于冰切机的切片头上进行切片，厚度一般为12-15pm。切好的切片在室温放置l-2h晾干，-20'C或-8(TC保存。(3)组织切片固定穿孔从冰箱中取出切片，在室温放置10-20min，使切片上的冷凝水晾干。在1XPBS中浸泡10min,使OCT溶解在1XPBS中。在预冷的4%PFA中4。C固定15min，0.3%TritonX-100穿孔20min。用70%甲酸小心处理脑片15min，暴露转基W小鼠老年斑抗原，PBS洗去残余甲酸。(4)免疫染色H/细胞免疫荧光染色基本相同。8.Western-blot(l)细胞蛋白裂解及样品处理.-将35mm培养皿培养的细胞用lxPBS洗一遍，加入合适体积的蛋白裂解液，其中裂解液含有:.150mMNaCl，10mMEDTA，1%TritonX-100，0.25mMPMSF，0.1%SDS,l%Na-deoxycholate，20mMNaF，lmMPMSF，完全蛋白酶抑制剂(购自Roche)。混匀后，4'C放置20min，使细胞完全从培养皿表面脱落并完全裂解。将裂解液4i:，12,000rpm离心15min。蛋白用Bradford方法进行蛋[::l定量后，取100ul上清，加入100ul含1.3。/。醋酸钾的80%乙醇和800u1无水乙醇，混匀后4°C，12,000rpm离心15min。弃上清，加入500^的75%乙醇洗盐，离心后弃去上清，将沉淀晾干。加入适量的蛋白上样缓冲液(2x上样缓冲液0.125MpH6.8Tris-HCl，4%SDS，20%甘油，10%(3-巯基乙醇，0.2%溴酚蓝)，煮沸10min后离心备用。细胞离心后可以直接加入迠量lx上样缓冲液(按照1X1()S细胞加入00nllx上样缓冲液)裂解细胞，煮沸后上样。(2)细胞培液中的分泌型蛋白处理取条件性培养液，进行乙醇沉淀，沉淀后用上样缓冲液煮沸上样。(3)组织样品裂解及样品处理取约50mg的组织，加入合适体积的组织裂解液，其中裂解液含有20mMED丁A(溶于0.1NNaOH)，10mMEGTA(溶于0.1NNaOH)'lmMPMSF(溶于无水EtOH)，2M尿素(溶fPBS),lmMDTT，完全蛋G酶抑制剂(购自Roche)，.匀浆器匀浆30次，4'C裂解20min，离心取上清进行蛋白检测。'2)制胶及电泳按照检测目的蛋白的大小，先后配制合适浓度的下层胶(分离胶)及上层胶(浓缩胶)。上样后，上层胶以10mA/Gel，下层胶以20mA/Gel的电流在室温进行垂直电泳，直至上样缓冲液跑出胶的前沿[50mllOX电泳液(Tris30g，Glycine144g)'5ml10。/。SDS，d2H20补到500ml]。3)转膜裁取7X9cm的3M滤纸4张，6X8cm的PVDF膜1张。将PVDF膜预先在无水乙醇中浸润lmin，再在转膜液中平衡5min[100ml10X转膜液(丁ris30-g,Glycine144g)，200ml无水乙醇，&&0补到lOOOml]。取出SDS-PAGE胶，(121120冲洗后浸在转膜液中，平衡5min。在转膜液中，制备一个转膜三明治(从上到下依次为滤纸、胶、膜、滤纸)，注意各层之间不要有气泡，可以用空50ml离心管朝同一方向滚压。将转膜-:明治放入转膜容器屮，注意胶朝负极，膜朝正极，4°C，50V转膜3h。转膜后，用丽存红溶液对PVDF染色，检测转膜效率，剪取合适大小的含有H的蛋白的PVDF膜，用水洗去红色染料。4)免疫反应5%脱脂牛奶室温封闭1h。加入一抗，室温反应3h或4'C过夜，回收一抗，4。C保存。含有0.1%Tween20的"PBS洗膜3次，每次10min。加入二抗室温反应lh，洗膜。显色。9.细胞荧光素酶活性测定1)在24孔板中接种2-4x104细胞/孔于0.5ml含10%FBS的DMEM/F12，在37。C、5%(302的培箱中培养，次日细胞达50-80%的覆盖率即可用于转染。2)制备溶液A和B:溶液A:每个样品取0.5(agDNA(含C99GVP,Gal4-TK);0.1ng内标DNApRL-tk(Promega)，含iem〃a荧光素酶报告基因)，用DMEM/F12补足体积至25pl。若共转其它质粒，一起加入溶液A。溶液B:每个样品取1.25piFugene6转染试剂加至23.75(ilDMEM/F12中。轻轻混和溶液A、B，室温放置30分钟以上。3)用1mlDMEM/F12将每孔漂洗两次后，每孔加入200(alDMEM/F12。4)将A、B混和液加到各样品孔中，轻轻混匀后置于细胞培养箱。5小时后每孔中加入含20%FBS的DMEM/FI2250pi,37"C培养过夜。'5)次日用500^含10%FBS的DMEM/F12更换培液。继续37。C培养，过夜后测定荧光素酶活性。6)吸去细胞培液，轻轻加入lmlPBS溶液漂洗；吸尽PBS，加入细胞裂解液lxPLB100pl/L，室温轻晃30分钟。7)样品测定管中加入10nl细胞裂解液及17Wfirefly荧光素酶底物LARII(获自Promega)，混匀后测定firefly荧光素酶活性；再加入/^w7/a荧光素酶底物Stop&Glo(获自Promega)17(al测定W，.〃a荧光素酶活性(Stop&Glo液兼可灭活firefly荧光素酶活性)。8)读取flrefly、^m7/"荧光素酶活性数值以及两者的比值。10.ELISA实验为了检测细胞内外的AP40和AP42含量，12孔板中的SH-SY/APP695myc细胞或瞬转pcDNA3.1-SP-C99myc的HEK293T细胞长到90%接触状态，用含有过氧化氢的无血清培液(300nl)处理1小时，收集培液待分析。细胞用预冷的RIPA溶液裂解。RIPA含有50mMTris-HCl(pH8.0)，150mMNaCl，5mMEDTA，l%NP-40，0.25mMPMSF和完全蛋白酶抑制剂(Roche)。裂解液经过匀浆，13,000g，4X:离心30分钟，取上清。经过Bradford蛋白定量后，取相同蛋白量待做ELISA检测细胞内的A曰。所有试剂室温放置30min，使用前轻匀。标准空白孔，标准Ae蛋白样品孔，样品空白孔，样品孔各100ul，4。C过夜；7.8pg/ml500pg/ml。预哺育抗人A3(获自Biosource)3540的96孔板中。用洗涤缓冲液洗7次，每次30s,吸水纸快速扣干。加入带有HRP的标'ki第".抗体(获自Biosource)各100ul到各孔，室温反应lh;用洗涤缓冲液洗9次，毎次30s，吸水纸快速扣干；加100tUTMB缓冲液到各孔中，室温避光放置30mins,颜色将由无色变为蓝色；加100ul终止缓冲液到各孔，轻打板侧混匀，颜色由蓝色转黄色；在450nm下测值，30min内完成。实施例1.过氧化氢诱导A卩表达过氧化氢是体内存在的一种氧自由基，它具有自由通透细胞膜的特点，因此一直被用来模拟体外的氧化应激实验。己经有文献报道过氧化氢能够诱导A(3产量上升，但是其机制还不是很清楚。本发明人利用高浓度的过氧化氢来模拟病人体内的病理状态，以研究病理状态下的氧化应激和淀粉样蛋白之间的关系。利用过氧化氢刺激APPmyc稳定表达的细胞株后，收集细胞培养液，用A(3酶联免疫反应试剂盒(购f:1Biosource)检测A|340和A卩42的含量，结果发现，过氧化氢刺激后，确实能够引起AP的表达上升(图1A)。由于A(340和AP42在细胞培液中的上升，可能是由于细胞内A(3的分泌效率增加造成，因此，本发明人又收集过氧化氢刺激的SH-SY5Y细胞，检测了细胞内的A(3含量。本发明人发现，同样，细胞内的A(3含量也有显著上升(图1B)。因此可见，过氧化氢刺激能够引起APP-SY5Y细胞株内的A(3含量上升。实施例2.过氧化氢并不能引起APP表达变化和a，p分泌酶活性改变因此需要研究导致过氧化氢促进AP的上升的原因。AP由其前体蛋白APP蛋白经过水解而来，因此，这个代谢过程中任何环节的调控失衡，都有可能最终造成AP的不正常沉积。本发明人首先检测了全长蛋白APP蛋白的表达情况。Westernblot结果显示，过氧化氢刺激前后，APP本身的代谢没有明显变化(图2A)。包括成熟的APP(N-和0-糖基化APP)和未成熟的APP(N-糖基化APP)，因此提示，过氧化麵Uf没有通过影响APP合成，翻译后加L:途径来影响AP的生成。其次，a分泌酶和e分泌酶能够影响CTF(Ae前体蛋白)的生成，从而最终卩经常被作为衡量a，卩分泌酶水解的指标。本发明人收集了过氧化氢刺激前后的条件性培液，检测了其中sAPP的含量。22C11能够识别全长APP的N端，因此能够识别培液中的sAPP，结果发现过氧化氢刺激前后，sAPP总量就没有明显变化(图2B)。本发明人乂利用6E10，它能够识别培液屮的sAPPa，以及抗sAPP(3，特异性识别sAPPp，结果发现刺激甜/^，sAPPa和sAPPpL^都没有明显的改变(图2C和图2D)。为了更加确定结果，又采用了分泌酶荧光素底物的方法，体外检测a，卩分泌酶的活性。本发明人先初步收集了富含分泌酶的细胞膜组分，经过体外37r酶活反应两小时。结果发现，无论刺激前后，a，P分泌酶活性也没有明显的变化(图2E)。因此可知，APP表达、分泌酶活性的改变并不是导致过氧化氢引起A卩生成增加的原因。实施例3.过氧化氢激活Y分泌酶水解途径A卩由其前体蛋白APP经过(3，y分泌酶依次分步水解而来，因此，对APP代谢的调控对AI3的最后含量有明显的影响。鉴了-前面过氧化氢引起了A(3上升，本发明人检测了APP的代谢情况，观察Y分泌酶水解途径是否受到影响。结果发现，正常情况下，APP能够被水解成C83和-.小部分C99,C末端再次给水解成AICD(APP胞内结构域)片段。当过氧化氢刺激后，能够引起C83，C99的产量减少，同时伴随着AICD产量的明显上调(图3A)。本发明人收集了不同刺激时间的细胞，对细胞代谢进行Time-Course实验，结果发现，随着刺激时间的增加，CTF逐渐代谢成为AICD的比例上升，并且在刺激后半小时开始有明显的转变。有趣的是，全长APP蛋白(成熟APP和非成熟APP)含量没有明显的改变(图3B)。说明过氧化氢引起的Ap上升，并不是由于APP的量改变造成的，而确实是由于APP代谢过程发生了改变。由于AICD，CTF分别是Y分泌酶的产物和底物，本发明人定义AICD/(AICD+CTF)作为Y分泌酶水解效率的指标。对几次不同实验结果进行灰度扫描，发现过氧化氢刺激后，确实能够AICD/(AICD+CTF)的比值明显上升，提示过氧化氢显著的促进了Y分泌酶水解效率。为了确汄Y分泌酶是否确实参4了i:t:中的过程，本发明人应用Y分泌酶特异性的抑制剂预处理细胞后WW过氣化S刺激，发现过氧化氢引起的AICD上调被抑制。在高浓度DAPT(10uM，Y分泌酶抑制剂)的刺激下，AICD完全被抑制，说明过氧化氢确实通过激活Y分泌酶水解途径，促进A卩的上升(图3C)。实施例4.过氧化氢直接促进了c99的代谢C99是A卩的直接前体，因此它的含量和A卩的最终产量密切相关。为了确定AP的上升由fY分泌酶的水解能力上升引起，木发明人首先构建了带有信号肽的C99，利用它表达后顺利上膜，来代替全长APP来研究AP的代谢。结果发现，过氧化氢刺激后，细胞外的AP含量显著上调(图4A)。同样，本发明人对细胞内的AP含量也进行ELISA检测，也发现细胞内的A(3含量也有明显上升(图4B)。C99经过y分泌酶分泌酶水解，代谢产物除了Af3外，还有一个产物就是AICD。本发明人发现，随着过氧化氢的不同浓度刺激，AICD的产量也相应的明显上调(图4C)。由于AICD的产量上升也有可能是过氧化氢引起AICD降解减少造成，因此本发明人构建了AICDmyc质粒，瞬时表达24小时，检测过氧化氢对其产量的变化。结果发现，AICD在过氧化氢刺激前后并没有明显的增加(图4D)。而且，DAPT预处理细胞后，抑制了Y分泌酶活性，从而阻断了新的AICD的产生。残留的AICD并没有因为过氧化氢的刺激而在细胞内累积。上述实验都很好的说明了AICD的增加，是由于过氧化氢确实促进了Y分泌酶水解途径造成的。Y分泌酶荧光素报告基因实验是一个被广泛用来衡量内源性Y分泌酶活性的手段，在C99cDNA内部Y分泌酶水解位点处，插入了Gal4禾nVP16的融合蛋白表达序列。在正常情况下，C99-GalGVP融合蛋白横跨细胞膜，因此和只有本底表达的荧光素酶报告基因一起表达后，荧光素值非常小。但是如果经过Y分泌酶水解后，产生了Ap和游离的GVP-AICD的片段，后者通过核定位序列，入核调控报告基因表达。因此，报告基因的荧光值能够在一定程度上定量Y分泌酶的水解活性。本发明人发现，仅仅转染Luc质粒，荧光值非常低，而同时转染了C99-GVP的质粒后，荧光素值有明显的上调。说明这个系统能够正确工作。在加入过氧化氢刺激后，荧光素值又上升了2.5倍，本发明人加入DAPT预处理后，这个荧光值又被明显的抑制到本底水平，说明y分泌酶水解确实在过氧化氢刺激过程中激活(图4E)。实施例5.jnk信号通路通过激活y分泌酶介导过氧化氢引起的ap增加接下来需要研究细胞内导致了Y分泌酶在过氧化氢刺激过程中被激活的机制。本发明人首先检测了JNK信号通路在过氧化氢刺激后是否被激活。细胞免疫荧光实验发现，磷酸化的JNK在刺激后呈现染色阳性，而且分布在细胞核和细胞质中。而在未刺激对照组中，并不能检测同样的JNK磷酸化阳性细胞(图5A)。本发明人又用Westernblot证实了过氧化氢确实能够引起JNK家族的P46，P54这两个蛋白的磷酸化水平的上升。预先在细胞培液中加入JNK信号通路特异性抑制剂SP600125(20yM)(购自Calbiochem)3h，结果发现这种JNK的磷酸化水平被明显抑制。JNK信号通路确实在过氧化氢中被激活，之后研究它的激活与Y分泌酶活化的关系。本发明人将SP600125(20uM)预处理细胞后，发现y分泌酶水解途径被明显抑制，而在DMSO对照组中，过氧化氢依然能够激活Y分泌酶活性依赖的AICDmyc生成增加(图5B)。说明JNK抑制剂有效的抑制了Y分泌酶水解活性。对几次实验进行灰度扫描实验，发现这个抑制具有显著性意义。接着，又对SP600125对C99的Y分泌酶代谢抑制进行了检测，发现同样能够抑制AICD的增加(图5C)。为了更加确认JNK信号通路在过氧化氢激活Y分泌酶水解途径中的作用，本发明人利用siRNA技术，针对JNK1，JNK2进行了siRNA序列设计，经过多次实验比较和对一系列siRNA序列的筛选，最终找到对于抑制JNK1具有优异效果的siRNA—条，以及适合于同时抑制JNK1禾l]JNK2的siRNA—条。将上述siRNA禾uAPP695myc共同转染HEK293T细胞后，所述的siRNA确实能够有效的降低细胞内源性JNK蛋白的表达。而在针对荧光素酶的对照siRNA中，JNK表达没有受到明显影响。进一步检测rY分泌酶的水解途径，发现JNKsiRNA抑制后，确实能够很好的抑制AICD的增加(图5D)。之后研究JNK信号通路能够激活Y分泌酶的原因。由于Y分泌酶途径的促进有可能来源于底物APP的修饰或者酶Y分泌酶的活性修饰。有文献报道，APP的C末端668位苏氨酸磷酸化能够促进APP的代谢，从而增加A(3的生成。本发明人将APP蛋白第668位苏氨酸突变成丙氨酸。结果发现过氧化氢依然能够促进APP668位突变体的y分泌酶水解途径(图5E)。同样，在C99对应位点的突变，也不能抑制y分泌酶的水解途径(图5F)。因此，本发明人的实验说明，过氧化氢通过JNK信号通路激活y分泌酵水解，并不依赖APP668位苏氨酸的磷酸化。将SH-SY5Y细胞血清饥饿12小时，然后用U0126，Wortmannin，SP600125分别预处理3小时，再用&02刺激30min，然后收集细胞，用Westernblot方法检测ERK，PKB，JNK信号通路本身是否激活，以及对过氧化氢引起y分泌酶活化的影响。结果发现，JNK信号通路特异性介导了过氧化氢引起的y分泌酶的水解活性(图6)。实施例6.JNK信号通路在体内的作用JNK信号通路属于SAPK-JNK信号通路，它负责了体内对应激状态下的应答。本发明人选用了AD病人组织和正常老年人病人的脑组织作为检测对象。AD病人和正常对照的情况见表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>Westernblot结果显示，磷酸化的活化JNK蛋白在AD病人里明显高于正常病人，但是JNK本身并没有太多明显的变化(图7A)。为了验证JNK蛋白在体内是否被激活，本发明人又采用了组织免疫荧光的方法，检测转基因小鼠Tg2576(获自Taconic公司)的JNK的磷酸化水平以及定位情况。结果发现(图7B)在转基因小鼠中A卩特异性抗体6E10呈现淀粉样蛋白沉积阳性(a)。而在非转基因小鼠对照中，并没有观察到老年斑沉积(e)。同样在转基因小鼠中还检测到JNK阳性(b)。激光共聚焦显微镜检测到活化的JNK活化的细胞定位在老年斑周围，而在老年斑所处位置，DAPI基本无法染上，说明细胞已经死亡丢失(c，g)。因此，本发明人认为，JNK细胞在AD病人和转基因小鼠脑内，被老年斑活化，定位在老年斑周围，使老年斑呈现扩展的趋势。实施例7.药物筛选细胞模型转染了pcDNA3.1-APP695myc的SH-SY5Y细胞，其中具有JNK信号通路。观!j试组用候选物质处理的上述细胞的培养物；对照组不用候选物质处理的上述细胞的培养物。在候选物质处理后，用过氧化氢刺激细胞，然后采用如实施例5的方法检测JNK信号通路的变化情况。如果与对照组相比，测试组中的JNK信号通路的激活情况降低，则说明该候选物质是潜在的抑制淀粉样蛋白产生的物质。实施例8.含siRNA的组合物将5nmolsJRNA加入到250ul纯水中，或也可加入到250yl常规溶解缓冲液中，配制成含siRNA的组合物。讨论在AD病人脑内，氧化应激现象比正常人要高，很多实验也证明氧自由基参与了AD的发病过程，但是具体机制还不是很清楚。本发明人的结果发现高浓度下的过氧化氢能够促进a卩的生成。而且，过氧化氢激活了y分泌酶的水解效率。进一步还发现，JNK信号通路的激活介导了Y分泌酶水解活性的增强。A(3的生成需要全长APP蛋白经过p，Y分泌酶，依次水解而来。因此，APP的水解过程和A卩的量有着密切的关系。已经有些实验试图解释为什么氧化应激过程中能够引起A(3的生成。比如，有人报道APP本身量的增加，或者卩分泌酶的量和或活性的增加。但是，龟面有些矛盾的地方，还是没有很清楚的给以解释。尤其是y分泌酶作为A(3生成前最密切的一个步骤，它的活性是否受到调控，以及怎么受调控都是一个卜分重要而且吸引人的问题。本发明人发现，y分泌酶水解活性得到增强，这个结论基于下面证据1.过氧化氢促进AP生成的同时，另一个产物AICD的量也有显著的上升，而作为Y分泌酶的直接底物，C83和C99的量却明显下降。同样，过氧化氢激活Y分泌酶活性具有time-course效应。2.Y分泌酶的特异性抑制剂DAPT能够抑制过氧化氢诱导的AICDh升过程，说明Y分泌酶确实参与了这个过程。3.C99代替和A卩的增加。说明"y分泌酶确实被激活。本发明人的实验中全长APP表达没有变化，而巨P分泌酶的水解活性没有明显的变化，这和现有报道不同。本发明人推测在高强度的过氧化氢刺激条件下，Y分泌酶的水解活性才有特异性的增强。过氧化氢属f氧自由基的一种，它能在体内新陈代谢中产牛。H前己有报道证明过氧化氢在生理条件和病理条件下都发挥着重要的作用。体内正常的生理条件V，过氧化氢的浓度约为100uM。但是在免疫细胞内，'为了清除病原体的侵入，机体会在局部地区产生高达mM级别的过氧化氢。而在AD病人脑内的老年斑周围区域，报道显示氧自由基明显上调。本发明人推测，AD周围的老年斑区域，由于小胶质细胞富集，炎症的发生，而且本身A(3蛋白在沉积过程中，均会产生较高浓度的氧自由基。本发明人实验中所使用的lmM过氧化氢正是代表了AD脑内局部的病理条件。总之，在高浓度的过氧化氢刺激条件下，y分泌酶特异性的被激活，从而促进了A卩的产生。接下去要研究的一个问题是过氧化氢通过细胞内怎样的机制来促进Y分泌酶的水解活性。已有报道显示过氧化氢能够激活细胞内很多条信号通路，包括MAPK/ERK，PKB/AKT，SAPK/JNK信号通路。本发明人发现JNK信号通路特异性的介导了过氧化氢促进的y分泌酶活性增强过程。基于下面的证据1.细胞免疫染色和westernblot实验显示，JNK信号通路在过氧化氢刺激后被激活。2.JNK特异性抑制剂SP600125的预处理能够抑制y分泌酶水解活性。而ERK,PKB'的抑制剂都没有类似效果。3.JNK的siRNA能够抑制过氧化氢促进的y分泌酶活性。JNK信号通路属于体内MAPK信号通路家族，它负责应答体内的应激反应，决定细胞的生死命运。本发明人的实验提示，在外界压力下，细胞体内通过JNK这条信号通路，应对各种外界压力，起了中枢的作用。Y分泌酶在半小时内就被显著激活，在这么短的时间内不可能完成Y分泌酶各组成成分的转录翻译修饰，并a经运输组装，最后完成水解APP这个冗长的过程。那么，口J能的机制是JNK直接磷酸化APP蛋白，使得APP这个底物变得更加适合y分泌酶水解。已有报道，APP蛋白的C末端668位苏氨酸能够被JNK激酶磷酸化。而且APP668的磷酸化和APP的代谢密切相关。本发明人假设APP668的苏氨酸介导了本发明人的过氧化氢诱导的y分泌酶水解活性的增强过程，然而，令人意外的是，在过氧化氢刺激卩，Y分泌酶依然能够促进对APP668位突变体水解活性。同样，SP-C99突变体的代谢能力也没有受到影响。这提示了过氧化氢活化的y分泌酶水解活性并不依赖于底物APP蛋白的668为磷酸化。另一个可能是JNK信号通路的激活直接激活了Y分泌酶的酶活。过氧化氢刺激后，细胞呈现死亡现象，表现出一系列细胞死亡的外形特征，比如细胞边缘变圆，细胞核固缩，MTT下降，台酚兰染色增加。本发明人发现，JNK抑制剂SP600125能够特异tt:抑制过氧化氢导致的细胞死'，外形h具有明显改观。而其他抑制剂并没"这种效^。联系到Ap/i:细胞死卩:过程屮产生增加的现象，可以认为，过氧化争l刺激卜，细胞内JNK倍^通路被激活，细胞走向死亡的命运。在这个过程中，由于细胞内亚细胞器的崩裂，细胞质中的pH下降，呈现微酸性，这符合了Y分泌酶的偏酸性喜好，使得Y分泌酶的水解活性增强。经典的A(3假说认为，家族遗传或外界环境的长期作用下，导致脑内A卩的逐渐积累。A卩的神经毒性逐渐发挥，通过积聚过程中攻击细胞线粒体等增强氧自由基，改变细胞内钙离子等水平，引起细胞毒性，并使得一系列激酶活化。激酶的活化又引起了Tau蛋白的过量磷酸化，形成神经纤维缠结。这些都将促进细胞死亡。而本发明的发现为这个假说补充A(3逐渐积累后，引起的炎症反应，这些过程中氧自由基的积累，将会造成Y分泌酶的活化，从而促进A(3的产生。这个恶性循环的加剧，很可能是AD中晚期AP沉积加速的一个原因，本发明人的发现为AD，尤其是散发性AD病理发生机制提供了一种可能的解释(图7C)。本发明人发现，过氧化氢活化的JNK信号通路，促进了"/分泌酶水解活性，使得A卩的生成增加和老年斑的扩人。根据这个理论，新的治疗靶点可以在这个通路中产生。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。<110〉中国科学院上海生命科学研究院<120〉针对人c-Jun'試基末端激酶的小RNA分于在老年痴呆症中的作用<130>082O18<160>11<170〉Patentnversion3.3<210〉1<211〉21<212〉RNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>小分子RNA<400〉1ucacaguccugaaacgauatt21<210〉2<211〉21<212>RNA<213〉人丄序列<220><221〉misc_t'eaUire<223〉小分于I州A<400>2aaagaauguccuaccuucutt21<210>3<211〉19<212〉隨<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉小分亍RNA<400>3cuuacgcugaguacuucga19<210〉4<211〉25<213〉人T.序列<220><221〉misc一feature<223〉引物〈400〉4mtctagagatgctgcccggtttg25<210〉5<211〉25<212〉画<213〉人I序夕U<220〉<221>misc—feature<223〉引物<210>6<211〉31<212〉DNA<213〉人—K序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉6gagaagatctatgatagcgacagtgatxgtc31<210>7'<211〉33<2I2〉DNA<213〉人1:序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>gagtctagactagttctgcatctgc<400>gagaagatctatgacagtggatcgtcattcacc<210〉<211〉〈212〉<213〉833腿<■〉gagaagatctatggtgatgctgaaggaagaaac<210〉9<211〉23<212〉隨<213〉人l:序列<220〉<22>misc—feature<223>引物<400〉9gaatagggccctctagatgcatg23<210〉10<211>34〈212>DNA<213〉人丁.序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<210>11<211〉31<212〉腿<213>人1〈220〉<221〉misc—feature<223〉引物"00〉11gctcctctggggcgacagcggcgtcaacctc31<400>ttgacgccgctgtcgccccagaggagcgccacct权利要求1.一种c-Jun氨基末端激酶信号通路的拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备抑制淀粉样蛋白产生的组合物。2.如权利要求1所述的用途，K持征在f，所述的组合物还用于预防或治疗神经退行性疾病。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的淀粉样蛋白产生是Y分泌酶依赖的淀粉样蛋白产生。4.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的c-Jun氨基末端激酶信号通路的拮抗剂是特异性干扰c-Jim氨基末端激酶基因表达的小RNA分子。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的小RNA分子(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第l-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。6.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的c-Jun氨基末端激酶信号通路的拮抗剂是SP600125。7.—种用于抑制淀粉样蛋白产生的小RNA分子，其特征在于，所述的小RNA分子(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第l-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。8.—种用于抑制淀粉样蛋白产生的组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的权利要求7所述的小RNA分子，以及药学上可接受的载体。9.一种筛选抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)用候选物质处理具有c-JUn氨基末端激酶信号通路的细胞；和(2)检测所述细胞中c-Jim氨基末端激酶信号通路的变化情况；其中，若所述候选物质P—J阻断c-Jun氨基末端激酶信号通路，或抑制c-Jun氨基末端激酶信号通路的激活，则表明该候选物质是抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括在候选物质处理之前或处理之后，用氧化应激试剂刺激细胞。全文摘要本发明公开了一种c-Jun氨基末端激酶信号通路的拮抗剂的用途，用于制备抑制淀粉样蛋白产生的组合物。本发明还公开了一种用于抑制淀粉样蛋白产生的小RNA分子。本发明人首次发现氧化应激试剂可通过激活c-Jun氨基末端激酶信号通路促进γ分泌酶的激活，从而导致淀粉样蛋白的产生。因此，可基于该发现开发出新的针对神经退行性疾病的药物靶点。文档编号A61K38/10GK101549147SQ200810035449公开日2009年10月7日申请日期2008年4月1日优先权日2008年4月1日发明者景乃禾,沈承勇,陈永峰申请人:中国科学院上海生命科学研究院