专利名称：谷氨酰胺转胺酶的用途的制作方法
技术领域：
本发明是关于谷氨酰胺转胺酶作为药物的用途，用于加快皮肤创伤愈合过程，减少 炎症发生几率，縮短创伤愈合时间之目的。
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase, 简称TG, Y-glutaminyl-peptide amine' Y-glutamyl transferase; EC 2. 3. 2.13)是一种催化酰基转移反应的转移酶，它可使 蛋白分子间和分子内产生共价交联反应，从而可进一步改善蛋白质的持水性及稳定性等 功能特性。由于该酶的相关催化特性，在食品工业、纺织工业和医药工业上具有广泛的 应用前景及优势，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种之一，引起了国内外研 究者的高度重视和兴趣，国内刚刚起步，国外对谷氨酰胺转胺酶的研究较多也较为深入， 所报道的主要有在食品方面的应用以及在抗体工程上的应用，在促伤口愈合方面尚未研 究。创伤愈合(wound healing)是指机体遭受外力作用，皮肤等组织出现离断或缺损(包 括割伤，刀伤，划伤，烧伤和外科手术切口)后的愈复过程，是一个非常复杂的病理过 程，基本可以可分为三个相互区别而又重叠联系的时期(阶段)①炎症反应期，即炎症 反应、溶解、清除坏死组织；②肉芽组织形成期，为结缔组织细胞和血管内皮细胞游动、 增殖、形成肉芽组织；③肉芽组织改建期，即新生结缔组织基质沉积和新生组织改造、 改建,而这些过程往往是重叠进行的。其中最关键的步骤是肉芽组织形成期，肉芽组织数量的多少和质量的好坏直接影响 着创面的修复愈合程度；结缔组织具有很强的再生能力，创伤的愈合多通过它的增生而 完成。而在创面修复过程中，形成的结缔组织主要是成纤维细胞及其产生的胶原蛋白， 胶原蛋白为创伤面上皮化提供基质支架。蛋白多糖(proteoglycan)是由蛋白质与大量多 糖结合成的大分子复合物，是结缔组织基质、线粒体、核膜、质膜等的重要组成成分。 其中多糖均是以含有氨基已糖与糖醛酸(硫酸角质素为半乳糖)组成的二糖单位重复聚 合而成的直链多糖，总称为糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAGs)。蛋白多糖复合物的立 体构型形成有许多微孔隙的分子筛，小于孔隙的水和溶于水的营养物、代谢产物、激素、 气体分子等可以通过，便于血液与细胞之间进行物质交换，大于孔隙的大分子物质，如细菌等不能通过，使基质成为限制细菌扩散的防御屏障，近来发现其与皮肤的生物学功 能有着极为密切的关系，对伤口愈合亦有重要影响，并参与了创伤愈合过程。发明内容本发明提供一种谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺转胺酶作为皮肤创 伤愈合促进剂或其活性成分。如上所述的谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于包含O. lU/ml 100U/ml或者0. l 100%干重的谷氨酰胺转胺酶作为皮肤创伤愈合促进剂的活性成分。如上所述的谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于所述创伤包括擦伤、割伤、外科手术伤口或者烧伤。如上所述的谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺转胺酶是利用微生物所产。在现有技术的基础上，本发明人用试验证明，谷氨酰胺转胺酶具有促进创伤愈合的 作用。在伤口部位涂抹谷氨酰胺转胺酶或者以其为组分的制剂，可以促进创伤愈合，加 快伤口愈合速率。本发明人选择健康SD品系大鼠体质量(200土20) g， IO个月大小，雌雄不限，所有 大鼠分为两组，实验组大鼠用剃刀将背部净毛，面积为2cmX2cm，待消毒后在麻醉条 件下用手术刀在大鼠背部处，切割l个l cmXl cm正方形创面，形成创伤动物模型， 所有大鼠伤口暴露并单笼喂养，充足给水，对照组涂抹生理盐水。记录大鼠在创伤和给 药后，创面红肿、感染、结痴情况，并记录创面愈合时间。创面愈合率术后用创面照 像、透明膜描记称量法记录伤后第2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16天创面面积，伤后不 同天沿创缘划线，将动物创面大小描印在透明膜上，然后用TECBIAS-6803型真彩色生 物医学图像分析系统测量创面面积，创伤愈合率按如下公式计算侖厶申原创面面积-现创面面积，證 愈合率=-^國^^化-xl00%原创面面积用注水法测量伤腔容积；术后第5、 10、 15、 20天，每组各处死10只老鼠，取创 面组织，先称湿重，在60'C烘干24小时后，再称得干重，并测定其中总蛋白质，羟脯氨酸，氨基已糖和己糖醛酸的含量。实验结果表明谷氨酰胺转胺酶可明显提高手术创伤大鼠的愈合率，增加肉芽组织的干湿重、蛋白质含量、羟脯氨酸含量和促使创伤组织中胶原的合成和积累。本发明可广泛应用于创伤外科和烧伤整形外科手术患者的外用治疗药剂或药剂的 组分、外用敷料的药剂组分、家用的小伤口包扎敷料药剂成分和喷剂成分，作为伤口恢 复的促进剂或促进剂之一，在损伤修复方面具有广阔的应用前景。本发明的谷氨酰胺转胺酶是利用微生物所产，具有成本低廉，易于工业化生产的优点。
具体实施方式
下面用实施例进一步详细说明本发明。实施例l1. 谷氨酰胺转胺酶的生产取一环产谷氨酰胺转胺酶的菌种接至50ml种子培养基中(0. 2%K2HP04， 0. l%MgS04, 0.2%蛋白胨，0.5%葡萄糖，pH7.0)， 28°C, 100rpm/min培养24小时;转接至新鲜配置 的发酵培养基(接种量4%, 1%甘油，1.5%酵母膏，0.2%K2HPO4, 0. l%MgS04， pH7. 0), 28°C， 100 rpm/min培养96小时，离心取发酵上清夜作为粗酶液。2. 谷氨酰胺转胺酶的分离纯化发酵离心后的初酶液用35%的硫酸铵对其进行第一次沉淀(4'0，将混合液用低速 大容量冷冻离心机离心，4800r/min， 15分钟，取上清液。然后将上清液中硫酸铵浓度 提高到75%,同上条件离心，取沉淀，即得粗酶。用蒸馏水对硫酸铵盐析所得到的粗酶 样品透析过夜，其间换水若干次，以除去沉淀中高浓度的硫酸铵，使酶恢复活性。将透 析好的酶液上02.6X20cm的CM-纤维素52层析柱，先用0. 02mol/L的p朋.5磷酸 缓冲液洗脱，流速约lmL/min，后用0. 02mol/L-0. 5mol/L ( pH6. 5)磷酸缓冲液进行梯 度洗脱，用部分收集器收集活性部分，再过O1.6X80cm的S印hadex G-75层析柱， 以0.05M的Tris缓冲液(pH 6.0)洗脱，用部分收集器分部收集活性部分，冷冻干燥 成干粉状，-20'C备用。3. 皮肤创伤愈合促进剂本实施例是以溶于生理盐水的纯酶作为创伤愈合剂，故促进剂为纯的谷氨酰胺转胺酶。4. 创伤愈合实验方法(1) 动物创伤模型健康SD品系大鼠，体质量(200土20) g, IO个月大小，雌雄不限，分为两组，实验 当日禁食，用剃刀将动物背部净毛，面积为2cmX2cm，待消毒后在麻醉条件下用手术 刀在大鼠背部处，切割l个l cmXl cm正方形创面，形成创伤动物模型，所有大鼠伤 口暴露并单笼喂养。(2) 观察指标记录大鼠在创伤和给药(皮肤创伤愈合促进剂)后，创面红肿、感染、结痴情况， 并记录创面愈合时间。创面愈合率术后用创面照像、透明膜描记称量法记录伤后第2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16天创面面积，伤后不同天沿创缘划线，将动物创面大小描印 在透明膜上，然后用TECBIAS-6803型真彩色生物医学图像分析系统测量创面面积，创 伤愈合率按如下公式计算愈合率=原、包価皿禾只—m@MM@xioo% 原创面面积用注水法测量伤腔容积；术后第5、 10、 15、 20天，每组各处死10只老鼠，取创面 组织，先称湿重，在6(TC烘干24小时后，再称得干重，并测定其中总蛋白质，羟脯氨 酸，氨基巳糖和己糖醛酸的含量。 5.试验结果(1) 创伤一般观察实验组、对照组之间创面修复情况有明显差别。术后48 h，实验组伤口开始出现少 许红晕，表明肉芽组织已在生长，而对照组伤口仍然较湿润；伤后5天，实验组肉芽 组织生长明显，局部已长出薄层或点状上皮，创伤边缘皮肤收缩明显；伤后IO天，实 验组伤口干燥、无感染，创面已基本为肉芽组织所填充，而对照组伤口湿润，有渗出物， 收縮不明显，仅见薄层肉芽，未见明显的新生上皮。伤后18天，实验组创面基本愈合， 而对照组创面愈合修复欠佳。(2) 肉芽组织的干湿重及总蛋白质含量实验结果表明在整个创伤愈合过程中(第5 20天)，实验组肉芽组织的干湿重及总 蛋白质含量明显高于对照组(尸〈0.05);由此可以说明谷氨酰胺转胺酶在创伤愈合过 程中可促进肉芽组织的代谢和内蛋白质的合成。(3) 肉芽组织胶原蛋白及蛋白多糖的代谢情况结缔组织具有很强的再生能力，创伤的愈合多通过它的增生而完成。而在创面修复过程中，形成的结缔组织主要是成纤维细胞及其产生的胶原蛋白，胶原蛋白为创伤面上 皮化提供基质支架。因此创面愈合过程中胶原蛋白代谢的状况可反映创面愈合的情况。 羟脯氨酸(Hyp)是胶原蛋白的主要成分之一，且所占比例相对恒定(约12.5%)，因此羟 脯氨酸含量可反映胶原含量，是创面愈合的指标之一。本实验结果表明在创伤中后期， 实验组羟脯氨酸含量明显高于对照组，第15天时达到峰值，表明新生胶原代谢合成旺 盛，说明谷氨酰胺转胺酶可促使创伤组织中胶原的合成和积累。实验结果表明在创伤愈合过程中，谷氨酰胺转胺酶影响着创伤修复的整个过程。谷 氨酰胺转胺酶在创面局部通过复杂的调节过程促进创面愈合，同时刺激加快创伤组织代 谢速率，造成创伤组织中蛋白质含量增加；另一方面促进了蛋白多糖合成进程；再一方 面，促进Hyp代谢，加快胶原的积累从而促使肉芽组织迅速生长，促使创伤组织再上皮 化，从而加快创伤愈合过程。实施例2谷氨酰胺转胺酶20 U的粉剂 松萝酸钠 0.5mg溶于100ml生理盐水 组方解释松萝酸是长松萝(te/7朋A /^i^i/7a^c/ .)的主要成分，据报道，其不仅具有抗菌 消炎作用，还具有促伤口愈伤作用。长松萝属地衣植物，具有清热解毒、止咳化痰、杀 菌消炎等功效。谷氨酰胺转胺酶作为同样一种促创伤愈合的物质，其合用在一起具有更 佳的促进创伤愈合的作用。实施例3制剂的组方2谷氨酰胺转胺酶400 U的粉剂 胰岛素 0.05g生理盐水 100 ml组方解释由实施例l可知谷氨酰胺转胺酶可作为促进创伤愈合的因子，而研究显 示胰岛素也具有一定的促进创伤愈合的作用，故主要以二者配伍，溶于生理盐水做成溶 液，可涂于创伤口，动物创伤模型烦的试验结果显示其具有加快创伤愈合的作用，且创伤愈合率明显高于单个促愈合因子。实施例4制剂的组方3谷氨酰胺转胺酶8000 U的粉剂重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF)冻干粉制剂，160 U生理盐水 100ml组方解释成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)是体内分布极为广泛的生长 因子之一，主要分酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 两大类，均具有促进哺乳动物多种来源于中胚层和神经外胚层细胞如上皮细胞、内皮细 胞、肌细胞、成纤维细胞等分裂增殖作用。大量基础及临床研究表明，bFGF能促进烧创 伤、溃疡等的修复与愈合，故本配伍中添加了成纤维细胞生长因子。由案例1可知谷氨 酰胺转胺酶也是一种促进创伤愈合的因子，二者溶于生理盐水做成溶液，可涂于创伤口， 试验结果显示其具有加快创伤愈合的作用，创伤愈合率明显高于施用单个促愈合因子。
权利要求
1. 谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺转胺酶作为皮肤创伤愈合促进剂或其活性成分。
2、 如权利要求1所述的谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于包含O. lU/ml 100U/ml 或者0.1 100%干重的谷氨酰胺转胺酶作为皮肤创伤愈合促进剂的活性成分。
3、 如权利要求1或2所述的的谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于所述创伤包括 擦伤、割伤、外科手术伤口或者烧伤。
4、 如权利要求1或2所述的谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺转胺酶 是利用微生物所产。
全文摘要
本发明提供了一种谷氨酰胺转胺酶的用途，其特征在于谷氨酰胺转胺酶作为皮肤创伤愈合促进剂或其活性成分。谷氨酰胺转胺酶对如刀割伤、擦伤、外科手术切伤口、皮肤溃疡和烧伤等皮肤创伤的愈合表现出了明显的促进作用，因此施用谷氨酰胺转胺酶或是含有该酶的混合制剂，可以促进创伤愈合，加快伤口愈合速率。
文档编号A61K38/45GK101264321SQ200810047588
公开日2008年9月17日 申请日期2008年5月6日 优先权日2008年5月6日
发明者李冬生, 王金华, 丹 谈, 雄 陈 申请人:湖北工业大学