专利名称：表皮生长因子培养液、利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药物，特别涉及一种表皮生长因子培养液、利用 培养液治疗糖尿病创伤的外用药及其制备方法。(二) 背景技术糖尿病以危及人类健康"三大杀手"之一高居诸病前锋。在全世界构成庞大的患者群。据近年统计，中国的年发病率在3.2%以上， 且呈不断上升趋势，发病形势日趋严峻。糖尿病创伤导致的坏疽及截 肢是糖尿病并发症的严重后果之一，糖尿病创伤的治疗至今仍为困扰 医界的棘手难题。患者中偶遇创伤，往往因延误治疗而后果惨重。全 世界都在寻求治疗糖尿病创伤的高效制剂，广大患者更渴盼日常创伤 能及时自我处理的普及制剂。(三) 发明内容本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种效果显著、使用便 捷的表皮生长因子培养液、利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药及其 制备方法。本发明是通过如下技术方案实现的一种表皮生长因子培养液，其特殊之处在于是采用如下方式制 成的在无菌控制操作条件下摘取哺乳动物幼仔下颌腺活体组织，快 速称重后剪为碎块，经1640培养液自然沉淀洗涤3次后，置于含有20%FCS的1640营养液的培养瓶中，在37°C， 5。/。C0,孵箱中培养6_7 天；细胞培育过程中，培养液保持清彻，分次收集全部上清液，并于 -2(TC冷冻保存即可。一种利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药，其特殊之处在于由 以下体积份数的原料制成表皮生长因子培养液1-2份；3%壳聚糖混悬液 1-2份。本发明的利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药，所述外用药为涂 剂或敷贴剂。一种利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药的制备方法，其特殊之 处在于包括如下步骤(1) 制备表皮生长因子培养液在无菌控制操作条件下摘取哺乳 动物幼仔下颌腺活体组织，快速称重后剪为碎块，经1640培养液自然沉淀洗涤3次后，置于含有20%FCS的1640营养液的培养瓶中，在 37°C， 5%0)2孵箱中培养6-7天；细胞培育过程中，培养液保持清彻， 分次收集全部上清液，并于-2(TC冷冻保存；(2) 制备壳聚糖；(3) 把1-2份体积表皮生长因子培养液和1-2份体积的3%壳聚糖 混悬液混合即成成品。本发明的利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药的制备方法，所述壳聚糖的制备步骤如下(1) 新鲜或陈旧虾壳经挑检剔除杂质后用适量3%HC1浸泡过夜， 用自来水漂洗至残液PH6. 5-7. 0;(2) 加入适量3%Na0H溶液煮沸2小时，弃洗涤液用自来水冲洗 虾壳残液至中性；(3) 在碱洗过的虾壳中加入0. 2%的高锰酸钾煮沸20分钟，弃高锰酸钾反应液，用自来水冲洗数次；(4) 在高锰酸钾着色的虾壳中加入适量5%草酸溶液，加热至虾壳 全部脱色为止，依次分别用自来水和蒸馏水冲洗干净；(5)将脱色后的虾壳用3-4倍体积的40。/。NaOH在110。C控温下煮 沸反应4-6h，趁热过滤，弃反应液；用自来水冲洗虾壳至中性，再用 蒸馏水冲洗数次，在5(TC烘干收藏备用。本发明的发明者在利用水囊引产人胎胰岛细胞异体生物移植治 疗糖尿病的研究课题中发现人胎腺体细胞经体外培养可释放出多种 活性天然肽物质，其主要成分之一为HEGF，该物质可刺激皮肤细胞的 生长与修复。海洋生物壳体组织的提取物甲壳素及其改性衍生物壳聚 糖具有一系列优良的理化性能和药物功效，它具有很强的生物兼容性其分子中的氨基和羟基与生物大分子蛋白质、氨基酸、核酸、酶 类具有很好亲合性。壳聚糖对创伤的促愈作用已有专门报道。另据报 道它还具有抑癌效应和免疫活性。毒理研究还证实壳聚糖无热源反 应；无皮肤刺激反应；无皮肤致敏反应；无全身过敏反应；对眼结膜 及角膜无刺激性；与生物材料亦无溶血反应。壳聚糖优良的药理功能 和安全性在研究和实践的广泛领域获得公认。本发明将哺乳动物幼仔 腺体组织经体外培养所获多肽活性因子与壳聚糖加以优化兼容，使两 者在不同作用机制下刺激细胞生长，促进创伤愈合的相同功效达到协 同强化效果。将本品试用于糖尿病及各种创伤治疗，促愈效果优于常 规治疗，对其它溃疡性皮肤损伤亦同样收到满意疗效。本发明将生物活性肽与壳聚糖两者兼具的激活细胞生长与修复 受损组织的独特功能优化组合，集于一体，多向协同联合促进创伤的 愈合。本发明具有抑菌、消炎、敛疮、促进各类创伤的修复愈合，不 留疤痕等显著功效。本发明使用安全，无不良反应。除普通外伤、疮 疡疖肿、皮表损伤外，亦可做为糖尿病疮伤的最佳用药。本发明用生 物培养技术体外获取哺乳动物幼仔腺体组织产生的高活性多肽因子， 再将该活性多肽复合物与壳聚糖配合物融合制成本剂。本品将生物活 性肽与壳聚糖两者同时兼具的激活细胞生长，修复受损组织的功能优 势集于一体，多向协同，联合促进创伤愈合。本品具有抑菌消炎、敛 疮、愈伤，促进各类创伤的修复、愈合不留疤痕的显著功效，使用安 全、简便，无不良反应。除广泛适用于普通外伤、疮疡疖肿等皮表损 伤外，尤适用于糖尿病疮伤的治疗。本发明通过生物技术分离生物活性多肽物质，经复合调配开发出 一种促进创伤愈合、高效修复皮肤损伤，名为"创可宁"的外用创伤 制剂。本发明使用简单，除在医院外科临床和家庭内施治外，亦可做 为短期旅游或野外作业时一般外伤及皮肤感染的应急备用品。经初步 临床实验，该制剂对各类创伤及皮肤损伤具有修复病损组织，促进愈 合的显著作用，尤对糖尿病患者的各种疮伤显示独特功效。该品效果 显著、使用便捷、无任何毒副作用、安全可靠，适于临床和家庭普及 应用。
具体实施方式
实施例1:该表皮生长因子培养液(以下简称EGF)体外培养制备方法及与 壳聚糖的复配制备药品的方法。一、 主要组分表皮生长因子培养液及3%壳聚糖混悬液各lOrnl。二、 制备方法1、 表皮生长因子体外培养制备技术在无菌控制操作条件下摘取哺乳动物幼仔下颌腺活体组织140 240mg，快速称重后剪为碎 块，经1640培养液自然沉淀洗涤3次后，置于含有20%FCS的1640 营养液16ml的培养瓶(50ml)中，在37°C， 5%(:02孵箱中培养6_7 天。细胞培育过程中，培养液应保持清彻，分次收集全部上清液， 并于-2(TC冷冻保存。2、 壳聚糖的制备(1) 新鲜或陈旧虾壳经挑检剔除杂质后用适量3%HC1浸泡过夜， 用自来水漂洗至残液接近PH6. 5-7. 0。(2) 加入适量3%NaOH溶液煮沸2小时，弃洗涤液用自来水冲洗虾壳残液至接近中性。(3) 在碱洗过的虾壳中加入0. 2%的高锰酸钾煮沸20分钟，弃高锰酸钾反应液，用自来水冲洗数次。(4) 在高锰酸钾着色的虾壳中加入适量5%草酸溶液，加热至虾壳 全部脱色为止，依次分别用自来水和蒸熘水冲洗干净。(5) 将脱色后的虾壳用3-4倍体积的40。/。NaOH在ll(TC控温下煮 沸反应4-6h，趁热过滤，弃反应液。用自来水冲洗虾壳至中性， 再用蒸馏水冲洗数次，在5(TC烘干收藏备用。实施例2:该外用药由以下体积配比的原料制成表皮生长因子培养液 20ml; 3%壳聚糖混悬液10ml。 实施例3:该外用药由以下体积配比的原料制成表皮生长因子培养液10ml; 3%壳聚糖混悬液20ml。 实施例4: 一、基础试验1、 "创可宁"EGF对哺乳动物幼仔胰岛细胞体外培养增殖效应的 试验观察。胰岛细胞采用单层软琼脂培养。培养液构成20%马血清，20%EGF 提取液，15%人AB血清，10%琼脂(3%)， 35%哺乳动物幼仔胰岛细胞 悬液(2X105个细胞/ml);对照组为不含EGF的1640基液，其余构成 同上。试验与对照各取3份(lml)上述培养液，分别接种于35mm2培 养皿内，置37i:， 5%0)2孵箱内培养9天，记数细胞集落数(含有》40 个细胞的增殖细胞群为1个集落)。结果新鲜胰岛细胞增殖集落数 实验组与对照组分别为394±7个/皿和28±2个/皿(t = 41.77 P< 0.001)提示下颌腺EGF对胰岛细胞的分化，生长具有显著生物效 应。2、 "创可宁"EGF对哺乳动物幼仔胰岛细胞胰岛素释放量的影响。(1) 下颌腺EGF的制备见实施例l。(2) 不同浓度下颌腺EGF对哺乳动物幼仔胰岛细胞分泌功能的影响将新鲜分离的胰岛细胞5X 107ml浓度接种于16孔培养板，各孔 分别含有0.5、 1.5、 3、 6.25、 12.5、 25、 37.5、 50%浓度的下颌腺 EGF液，同时设2孔阴性对照，置37。C， 5%〔02培养箱培养48小时， 收全部上清液-2(TC保存。按胰岛素放免测试盒(中国原子能科学研 究院产品)规定步骤进行检测，结果在半对数坐标中EGF提取液配 比含量在6. 25%处胰岛细胞胰岛素释放量呈最大值，实验组与对照组 分别为5.2X103 p u/5X105cells和2. 8X103 y u /5 X 105cells，提 示下颌腺EGF配比量对胰岛细胞分泌活性有一定调控作用。3、 "创可宁"EGF对哺乳动物皮肤细胞体外培养试验观察(1) 下颌腺EGF的制备见实施例l。(2) 壳聚糖的制备见实施例l。(3) 皮肤细胞培养液由20%EGF提取液，3%壳聚糖及77%1640培养液组成。(4) 无菌试验哺乳动物EGF复合物均经无菌试检验合格方可启用。(5) 皮肤细胞体外培养试验 经常规消毒取哺乳动物幼仔的大腿上侧皮肤，两块， 一块为5X5cm2，另一块为6X6cm2，用Hanks液洗涤3次，置12 ，2的培养 皿中，将2块皮肤剪成11块为1Xlcm2，并以间距lmm排成平面，贴 于平皿底面，分别置入两个平皿，然后每个平皿内加入16ml细胞培 养液，置37°C， 02孵箱培养，观察生长情况，观察1周。结果表 明，人皮肤碎片在EGF培养液中培养6天后皮肤碎片有纤维细胞生长， 相互融连延展成片而对照组皮片调萎死亡。提示哺乳动物EGF培养液 可促进皮肤上皮细胞再生而有利于创伤愈合。 二、临床试验(1) EGF复合剂成分见实施例l。(2) 治疗糖尿病患者的疮面经生理盐水或硫酸庆大霉素注射液 清疮后，将消毒药棉浸渍适量药液铺于疮面上，或将药液直接 涂于患处再覆盖辅料，每天或隔日换药一次疗程7-15天。附病例1:患者XXX，女，73岁，患II型糖尿病25余年，消瘦、乏力、倦 怠、四肢无力，麻木，三多一少症状不明显，査体身高1.56米， 体重45公斤，BP120/70，心肺(一)，1996年11月检査尿糖等，胆 固醇4. 91mmol/L，甘油三脂1. 1 lmmol/L，血糖15. 64mmol/L，血肌 酐61. 43mmol/L，尿素氮6. 28mmol/L，血粘度、全血比粘高彻5.85， 低彻13.75，血浆比粘1.62，细胞电泳率1. 58u m/t/v/cm，血沉 40mm/h，红细胞比积40%，颅脑CT扫描左内束后支小片状低密度灶， 左基底节区脑梗塞(腔隙性)患者于1995年-2007年曾6次创伤， 一次脚趾开水烫伤，三次手指(食、拇指)刀切伤，二次脚趾(大、 小拇指)磨破伤，其面积大为3X2.5cm，小为1X2cm，均为感染化 脓，用红霉素软膏和其他抗菌素均无效。患者用"创可宁"治疗后均 为7-IO天痊愈，痊愈后皮肤光滑同正常皮肤，无瘢痕。附病例2:患者XXX，女，63岁，患II型糖尿病10余年，消痩、乏力、倦 怠，三多一少症状不明显，查体身高1.60米，体重54公斤，BP150/90， 心肺(一)，2007年4月检査空腹血糖12.6mmol/L，总胆固醇 6.75mmol/L，甘油三脂0. 64mmol/L，肌酐109. 2umol/L，尿素氮 4. 9mmol/L，尿酸417. 5 u mol/L，乙肝五项全(一)。患者于2005年6 月患带状疱疹，左胸、背部簇集性血疹，水疱，血疱，皮疹，皮肤潮 红，呈带状分布。2007年7月开水烫伤右上肢前端呈水疱，但未感 染，其面积为4X9cm2。2007年10月，左小腿因外伤引起红斑，丘疹，渗出液瘙痒，3 周后发展为全身泛性湿疹，住院16天经控制糖尿病和抗过敏治疗虽 全身丘疹治愈，但左小腿的创伤仍未愈，自动出院。左小腿患处溃烂， 其面积为20X20cm2。用若干中、西药膏均过敏，用"创可宁"治疗 后，15-30天痊愈，痊愈后皮肤光滑同正常皮肤，无瘢痕。附病例3:患者XXX，女，33岁，身体健康。2007年春节期间，由于过量食 用海鲜，下巴右下方引起过敏反应，出现几个米粒大的小疱，未当回 事，只用酒精擦拭，因为痒，将其挠破，疮面感染成片，面积为3X 4cm2，又疼又痒，开始使用"创可宁"。连续四天涂"创可宁"7ml， 疮面痊愈。痊愈后皮肤光滑同正常皮肤，无瘢痕。总述上述试验结果说明，"创可宁"EGF能显著刺激细胞生长和增加胰 岛素释放量，可促进皮肤上皮细胞的再生而有利于创伤愈合。EGF是 一种天然肽，是强有力的促细胞分裂因子，在体内可刺激多种细胞 DNA、 RNA及蛋白质的合成、对上皮细胞、间皮及内皮细胞均有剌激生 长的生物效应。甲壳质由N—2酰氨葡聚糖构成、具有止血促进细胞 增生和伤口愈合的功效，以二者复合剂用于皮肤培养，证实该复合剂 对促进皮肤生长有显著功能。
权利要求
1.一种表皮生长因子培养液，其特征在于是采用如下方式制成的在无菌控制操作条件下摘取哺乳动物幼仔下颌腺活体组织，快速称重后剪为碎块，经1640培养液自然沉淀洗涤3次后，置于含有20％FCS的1640营养液的培养瓶中，在37℃，5％CO2孵箱中培养6-7天；细胞培育过程中，培养液保持清彻，分次收集全部上清液，并于-20℃冷冻保存即可。
2. —种利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药，其特征在于由以下体积份数的原料制成表皮生长因子培养液1-2份；3%壳聚糖混悬液 1-2份。
3. 根据权利要求2所述的利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药，其特征在于所述外用药为涂剂或敷贴剂。
4. 一种利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1) 制备表皮生长因子培养液在无菌控制操作条件下摘取哺乳动物幼仔下颌腺活体组织，快速称重后剪为碎块，经1640培养液自然 沉淀洗涤3次后，置于含有20。/。FCS的1640营养液的培养瓶中，在37 °C， 5。/。C02孵箱中培养6-7天；细胞培育过程中，培养液保持清彻，分 次收集全部上清液，并于-2(TC冷冻保存；(2) 制备壳聚糖；(3) 把1-2份体积表皮生长因子培养液和1-2份体积的3%壳聚糖混 悬液混合即成成品。
5. 根据权利要求4所述的利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药的制备方法，其特征在于所述壳聚糖的制备歩骤如下(1) 新鲜或陈旧虾壳经挑检剔除杂质后用适量3%HC1浸泡过夜，用 自来水漂洗至残液PH6. 5-7. 0;(2) 加入适量3。/。NaOH溶液煮沸2小时，弃洗涤液用自来水冲洗虾壳 残液至中性；(3) 在碱洗过的虾壳中加入0.2%的高锰酸钾煮沸20分钟，弃高锰酸 钾反应液，用自来水冲洗数次；(4) 在高锰酸钾着色的虾壳中加入适量5%草酸溶液，加热至虾壳全 部脱色为止，依次分别用自来水和蒸馏水冲洗干净；(5 )将脱色后的虾壳用3 - 4倍体积的4 0 %N a0 H在11 (TC控温下煮沸反 应4-6h，趁热过滤，弃反应液；用自来水冲洗虾壳至中性，再用蒸馏 水冲洗数次，在5(TC烘干收藏备用。
全文摘要
本发明公开了一种药品，特别公开了一种表皮生长因子培养液、利用培养液治疗糖尿病创伤的外用药及其制备方法。本发明将哺乳动物幼仔腺体组织经体外培养所获多肽活性因子与壳聚糖加以优化兼容，使两者在不同作用机制下刺激细胞生长，促进创伤愈合的相同功效达到协同强化效果。将本品试用于糖尿病及各种创伤治疗，促愈效果优于常规治疗，对其它溃疡性皮肤损伤亦同样收到满意疗效。开发本产品，不仅为糖尿病创伤溃疡的治疗提供了新的有效途径，而且给外伤的常规治疗增添了更好，更快，更有效的手段。
文档编号A61K35/55GK101328472SQ20081013846
公开日2008年12月24日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者崔树玲, 华 钟, 峻 钟 申请人:崔树玲