专利名称：：一种新型细胞靶向药物递送载体、包含该载体的药物组合物以及利用该载体递送药物的方法
技术领域：
：本发明涉及药物的靶向递送领域,景技术细胞靶向给药、基因治疗、RNAi等生命科学研究是攻克癌症、艾滋病以及其它疾病的前沿研究领域(1-3)。但它们都不可避免要向各种特异细胞进行物质(药物、DNA和RNA等)的定向运输。目前，已经有各种各样的方法实现药物的靶向运输。有用仪器或器械实现的，如基因枪、电穿孔仪等；有用病毒栽体介导，如腺病毒、慢病毒等。而现在，更多的研究更趋向于用非病毒栽体，特别是生物可降解的高分子材料来进行基因、药物的靶向运输(4，5)。用生物高分子材料来制作药物运输载体，要具备以下条件(l)高分子材料的载体必需是无毒、无害的生物相容性材料，有一定的物理机械性能，能保护所运输的药物不受破坏；(2)栽体要能在细胞中降解，以利于运输物质的释放，而降解产物也必需无毒、无害，不影响细胞的正常功能；(3)要能方便地接上各种配体，以便载体能特异性地运输到各种细胞。目前所出现的高分子药物运输载体，大部分都有前两个优点，而在靶向方面，却有不同程度的局限性，因此使得高分子材料在药物把向运输方面一直得不到广泛的运用(5)。基于各种不同细胞的特异性受体，采用受体介导的胞吞作用是细胞靶向物质运输的研究热点(4，6)。受体介导的基因转移已经在基因治疗中得到了运用。如果能将受体介导的胞吞作用与生物可降解高分子材料结合起来，将会大大增强生物高分子材料栽体的靶向运输能力。基于对微生物合成聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，简称PHA)和降解作用机理的深入研究以及一些相关蛋白的发现，使得类似优势(7-9)Y、。一'PHA是近二十多年迅速发展起来的生物高分子材料，它是4多种微生物的细胞内聚酯，是一种天然的、结构多变的生物聚酯高分子材料。PHA兼具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的热加工性能，因此可作为生物医用材料和生物可降解包装材料。PHA在微生物合成过程中，具有与相关合成、降解或调控蛋白结合的天生优点。这些的蛋白包括在PHA合成过程中的合成酶(PhaC)、颗粒结合蛋白(PhaP)、调控蛋白(PhaR)以及PHA的降解过程中的降解酶(PhaZ)。PHA合成酶(PHAsynthase)PhaC是PHA生物合成过程中的关键酶，能够用羟基脂肪酸(Hydroxyalkanoate,简称HA)的辅酶A疏酯作为底物，催化HA脱去辅酶A聚合成为PHA。大约16年前3个不同的实验室先后从罗氏真养杆菌/^/Wo&"ew/ro/7/w中克隆得到了PHA合成酶的结构基因。此后，从多种微生物中克隆得到了PHA合成酶基因。PhaC具有高度的底物特异性，在合成PHA过程中，PhaC通过共价键与PHA颗粒表面结合已经得到证实(10,11)。PHA在细菌体内以颗粒(granule)的形式存在，PHA分子形成疏水核心，表面是磷脂单分子层和一些蛋白。这些蛋白中，存在着大量的PHA颗粒结合蛋白(phasin,PhaP)。PhaP和油料作物的种子中发现的油质蛋白(oleosin)在功能上有类似的地方，所以称之为phasin(12)。PhaP具有对疏水性材料的高度亲和性，PhaP已经证实在胞内和胞外都能与PHA紧密结合(12),并且基于这种性质，已经开发出蛋白纯化系统(13)。PHA合成的调控蛋白PhaR，能够在PHA颗粒形成前绑定在phaP基因和其自身基因phaR的启动子区域，从而抑制两个基因的表达。随着PHA颗粒的慢慢形成，调控蛋白PhaR就从启动子上掉下来，又结合到PHA颗粒上(14)。phaR基因的突变研究发现，调控蛋白PhaR也存在两个独立的功能区域，DNA结合区域和颗粒结合区域(15)。PhaR除了可以吸附在PHB表面外，还可以吸附在聚乙烯、聚苯乙烯和聚乳酸的表面(16)，说明PhaR与PHB的结合是非特异性的，可能只是简单的疏水性相互作用的结果。PHA降解酶(PhaZ)包含两个功能区域，底物结合区域(SBD)和催化区域。研究发现，这两个区域由中间的linker区域隔开，各自行驶自己的功能(17)。Lee等将SBD与绿色荧光蛋白eGFP融合表达，并成功将其固定化于PHB微J求颗粒上(18)。这就暗示着SBD也5可能是一种好的吸附标记。目前仍然需要能够有针对性地进行药物靶向运输的载体。
发明内容发明人发现，将生物可降解的疏水性材料制成纳米或微米尺度的颗粒，并包衷基因、蛋白质或其他需要运输到目标细胞的药物，然后利用亲脂蛋白(或其疏水颗粒结合区&戈)与疏水颗粒的结合作用，将所述载药疏水颗粒与包含亲脂蛋白和目标细胞特异配体的融合蛋白结合在一起，并通过所述特异配体对目标细胞的有效识别和结合，可以实现药物对目标细胞的有针对性的靶向递送。不受任何特定理论的约束，认为在所述特异配体与目标细胞结合后，可以通过例如胞吞作用等生物过程，使所述栽药疏水颗粒进入目标细胞，从而实现药物的耙向递送。具体地，本发明提供了以下实施方案。[实施方案1]一种用于向目标细胞递送药物的靶向药物递送栽体，包括.-融合蛋白，所述融合蛋白包含目标细胞特异配体以及一个或多个疏水颗粒结合结构域；以及疏水颗粒，所述疏水颗粒中包含待递送的药物。[实施方案2]实施方案1的革巴向药物递送载体，其中所述疏水颗粒结合结构域的数目为1个、2个或3个。[实施方案3]实施方案l-2之任一项的靶向药物递送栽体，其中所迷多个疏水颗粒结合结构域不完全相同。[实施方案4]实施方案l-3之任一项的靶向药物递送栽体，其中所述疏水颗粒结合结构域各自独立i也选自由PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC、脂肪酶、GBD、ZSBD和RSBD构成的组。[实施方案5]实施方案l-4之任一项的靶向药物递送载体，其中所述一个或多个疏水颗粒结合结构域选自由SBD-SBD-SBD、GBD-GBD-GBD、PhaP-PhaP、PhaP-PhaP-PhaP、ZSBD-ZSBD-ZSBD、RSBD-RSBD-RSBD、PhaC-PhaC-PhaC、PhaP-ZSBD、ZSBD陽RSBD、PhaP-ZSBD-RSBD构成的组。[实施方案6]实施方案1-5之任一项的靶向药物递送栽体，6其中所述多个疏水颗粒结合结构域之间通过连接肽连接。[实施方案7]实施方案l-6之任一项的靶向药物递送载体，其中所述疏水颗粒由选自羟基已酸和乳酸共聚物PLGA、聚己内酯PCL、聚乙烯、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚乳酸、聚己内酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯构成的组的疏水性高分子材料形成。[实施方案8]实施方案l-6之任一项的靶向药物递送载体，其中所述疏水颗粒由选自聚羟基丁酸酯、羟基丁酸和羟基戊酸共聚物、羟基丁酸和羟基己酸共聚物、聚羟基庚酸酯、聚羟基辛酸酯、聚羟基癸酸酯、羟基丁酸和轻基辛酸共聚物、羟基丁酸羟基戊酸和羟基己酸共聚物构成的组的疏水性PHA材料形成。[实施方案9]实施方案1-8之<壬一项的靶向药物递送载体，其中所述目标细胞特异配体位于所迷融合蛋白的N端、C端或中间。[实施方案10]实施方案1-9之任一项的靶向药物递送载体，其中所迷目标细胞特异配体与所述一个或多个疏水颗粒结合结构域之间直接连接。[实施方案11]实施方案1-9之任一项的靶向药物递送栽体，其中所述目标细胞特异配体与所述一个或多个疏水颗粒结合结构域之间通过连接肽连接。[实施方案12]实施方案1-11之任一项的靶向药物递送载体，其中所述目标细胞特异配体为所述目标细胞表面受体的特异配体。[实施方案13]实施方案1-12之任一项的靶向药物递送载体，其中所迷目标细胞特异配体选自由表皮生长因子、甘露糖基化蛋白、去唾液酸糖蛋白构成的组。[实施方案14]实施方案l-U之任一项的靶向药物递送栽体，其中所迷目标细胞特异配体为所述目标细胞表面蛋白的特异抗体。[实施方案15]实施方案14的靶向药物递送栽体，其中所述目标细胞表面蛋白选自由表皮生长因子受体、甘露糖受体、去唾液酸糖蛋白受体构成的组。[实施方案16]实施方案1-15之任一项的靶向药物递送载体，其中所述目标细胞为体外培养的细胞。[实施方案17]实施方案1-15之任一项的靶向药物递送载体，其中所迷目标细胞为生物体内的细胞。[实施方案18]实施方案1-17之任一项的靶向药物递送栽体，其中所述目标细胞选自白细胞、癌细胞。[实施方案19]实施方案1-18之任一项的扭向药物递送栽体，其中所述药物为蛋白质、DNA或RNA。[实施方案20]—种药物组合物，包含药学上可接受的栽体，以及实施方案l-19之任一项的靶向药物递送栽体。[实施方案21]实施方案20的药物组合物，其中所述药物组合物为注射剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、酏剂、溶液剂、悬浮液、滴眼液、喷雾剂或酊剂。[实施方案22]—种用于向目标细胞递送药物的方法，包括向所述目标细胞施用实施方案1-19之任一项的耙向药物递送栽体的步骤。本发明利用可生物降解的疏水性高分子材料制作靶向药物运输栽体，从而使得药物运输载体具有生物相容性，并且有一定的机械强度，可以更好的保护好所运输的药物，并具有运输各种药物的潜能。本发明很好地解决了高分子材料制作药物运输栽体的靶向性问题。本发明中利用一些高度亲脂性蛋白(或其疏水颗粒结合区域)与各种细胞的特异性配体、抗体及其他各种特异性因子，例如癌细胞表面表皮生长因子受体特异性识别的表皮生长因子，巨噬细胞表面甘露糖受体识别的甘露糖基化蛋白，肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体识别的去唾液酸糖蛋白，癌细胞表面表皮生长因子受体的抗体等，形成融合蛋白，使其结合在包裹有药物的疏水性纳米或微米微球表面，使得納米或微米微球具有对细胞的靶向性。因此，通过改变配体，从而改变药物运输栽体的靶向性，具有将药物运输到多种细胞或组织的潜能。在一些优选的实施方式中，本发明利用PHA来制作疏水微球。由于PHA的降解性能与其分子量有关，而PHA的分子量可控，所以，可以过调控PHA的分子量来控制被运输物质在细胞中的释放速率。在另一些优选的实施方式中，本发明利用聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或羟基已酸和乳酸共聚物(PLGA)等常见的疏水性材料来制作疏水微球。由于这些材料比PHA更廉价，也更容易获得，因此可以使该药物运输系统得到更广泛的应用。图1显示了细胞靶向药物运输载体示意图。Drugs:药物；NanocapsuleofPHAs:PHA纳米颗粒；Cell-specificalligand:细胞特异性配体；PhaP:亲脂性的颗粒结合蛋白；Cell-specificalreceptor:细胞特异性受体；Targetcell:目标细胞。PhaP与细胞特异性配体做成一个亲脂性融合蛋白，此融合蛋白通过PhaP粘附在包有药物的疏水性PHAs颗粒上，形成一个具有细胞靶向性的药物运输载体。药物运输栽体通过特异性配体而被细胞表面的受体所识别，从而通过受体介导的胞吞作用，实现药物的靶向运输。图2显示了栽有氰酸罗丹明B(RBITC)的药物运输栽体的电镜照片。PHAs通过超声方法制成包有RBITC的納米颗粒，通过扫描电镜放大50000倍拍得的电镜照片。图3显示了毕赤氏酵母尸/c/z'apo^onj表达亲脂性融合蛋白的质粒图谱。AOX1promoter:醇氧化酶启动子；oc-factor:融合蛋白的分泌信号；OR(Human):人血清类粘基因；PhaP(Re):罗氏真养杆菌ew^op/w颗粒结合蛋白；AOX1termination:醇氧化酶终止子；Zeocin:Zeocin抗生素的抗性基因。此质氺立电转化入毕赤氏酵母尸/c/n'apawons中后重组到酵母基因组，通过甲醇诱导，可以稳定分泌表达亲脂性融合蛋白。图4显示了激光共聚焦显微镜观察PHA药物栽体向体外培养的巨噬细胞运输异疏氰酸罗丹明B(RBITC)。A,表面有融合蛋白的耙向性药物栽体通过特异性配体而被细胞表面的受体所识别，从而通过受体介导的胞吞作用，实现药物的靶向运输。细胞迅速胞吞栽体在40分钟左右就能达到饱和。B,表面没有融合蛋白的非靶向性药物载体被巨噬细胞非特异性吞噬。吞噬作用比受体介导的胞吞作用弱，在120分钟时，被细胞吞噬的栽体还没达到饱和。图5显示了大肠杆菌Origami(DE3)表达亲脂性融合蛋白质粒PT-EphaP构建图。T7promotor:T7启动子；lacoperator:乳糖操纵基因；SDs叫uence:核糖体识别序列；hEGF:人表皮生长因子；PhaP:颗粒结合蛋白；T7Terminator:T7终止子；Amp:氨千青霉素抗性基因。hEGF基因与PhaP基因插入到PTWIN-2质粒中，以T7启动子作为起始转录的因子，最终表达出EGF与PhaP的融合蛋白EPhaP。图6显示了激光共聚焦显微镜观察把向性药物载体向体外培养的Bel7402细胞运输RBITC。A，表面有融合蛋白的耙向性药物载体通过特异性配体而被细胞表面的受体所识别，从而通过受体介导的胞吞作用，实现药物的靶向运输。B,表面没有融合蛋白的非靶向性药物栽体不能被肝癌细胞Bel7402识别和内吞。结果表明，靶向药物载体对目标细胞具有耙向性。具体实施例方式发明人发现，如果将PhaC，PhaP，PhaR或phaZ等亲脂性蛋白与相关配体接起来做成融合蛋白，这种融合蛋白就能与包装有待运输药物的PHA颗粒结合，形成一个外面带有配体的复合体。这种复合体与相关细胞的特异性受体结合，通过受体介导的胞吞作用，将颗粒运输进细胞(图1)。颗粒在细胞内降解，释放出被运输的药物。本文所用的术语"药物"应当做广义的理解，是指各种具有治疗、预防、保健、营养等作用的物质，包括但不限于蛋白质、DNA、RNA、抗生素、维生素、激素、脂类、合成化合物、天然提取物等。适合采用本发明的栽体递送的药物包括治疗肝炎的有效成份胆碱磷酸甘油二酯，治疗肝炎使乙肝病毒复制终止的拉米夫定，替比夫定，司他夫定等，抑制病毒复制的干扰素等。还包括治疗胂瘤的烷化剂抗肿瘤药，抗代谢类抗肿瘤药，抗生素类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药，天然来源抗肿瘤药，抗肿瘤辅助药，及其他抗肿瘤药，包括喜树碱，长春烯碱，伊立替康，环磷酰胺，阿糖胞苷，司莫司汀，尼莫司汀，福莫司汀，高三尖杉酯碱，他莫昔芬，阿霉素，表阿霉素，顺铂、卡粕，草酸铀，博来霉素，阿克拉霉素，平阳霉素，阿柔比星，吡柔比星，吡喃阿霉素甲氨蝶呤，硫鸟嘌呤，去氧氟尿苷，优福定，喷司他丁，卡莫氟，多抗甲素，氯曱双磷酸二钠，美素生，盐酸阿糖胞苷，长春新碱，秋水仙胺，长春地辛，长春碱，长春地辛，靛玉红，野百合碱，莪术醇，甲地孕酮，曱羟孕酮，雌二醇氮芥，枸橼酸他莫昔芬，托瑞米芬，比卡鲁胺，福美司坦，来曲唑，福美坦，胸腺刺激素，阿可达，伊立替康，右雷佐生，替尼泊苷，兰他隆，替拉扎明，西曲瑞克，右尼古地平，英丙舒凡，异丙铂，茚托利辛等，但不局限于此。对于基因治疗而言，合适的药物包括肺瘤基因治疗中常用HSV-TK/GCV自杀基因系统等，但不局限于此。10在采用本发明的栽体递送药物时，药物被包泉在疏水颗粒中，对药物具有一定的保护作用。本文所用的术语"目标细胞"(targetcell)是指希望将感兴趣的药物递送到其中的细胞。例如，对于抗癌药物而言，"目标细胞"可以是癌细胞，例如肝癌细胞。又如，对于抗肝炎药物而言，"目标细胞"可以是肝脏细胞。本文所用的术语"目标细胞特异配体"是指能特异性识别目标细胞或被目标细胞识别的物质。本发明中的目标细胞特异配体包括细胞的各种特异性配体、细胞的特异性抗体和细胞的其他特异性分子。例如，目标细胞特异配体可以是所述目标细胞表面受体的特异配体，或者配体类似物或者目标细胞表面蛋白的特异抗体。例如，对于癌细胞而言，所述"特异配体"可以是表皮生长因子，也可以是表皮生长因子受体的抗体，可以是叶酸也可以是叶酸类似物，还可以是转铁蛋白、低密度脂蛋白等。又如，对于肝细胞而言，所述"特异配体"可以是半乳糖为端基的糖蛋白，对于肝非实质细胞而言可以是甘露糖基化蛋白。对于胰腺细胞而言可以是胰岛素。所述"特异配体"的具体实例包括但不限于癌细胞表面表皮生长因子受体特异性识别的表皮生长因子，癌细胞表面特异转铁蛋白受体，特异叶酸受体，特异促血管生成素受体等。巨噬细胞表面甘露糖受体识别的甘露糖基化蛋白，肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体识别的去唾液酸糖蛋白，癌细胞表面表皮生长因子受体的抗体，。本文所用的术语"特异，，、"特异性"或"特异的"是指配体与目标细胞的结合具有专一性。通常，配体与目标细胞的结合亲和力是所迷配体与所述目标细胞以外的细胞的结合亲和力的至少2倍。优细胞的结合^和力的至少io〗。配体与目标细:的结合亲;力可以通过荧光标记、ELISA、激光能量共振转移等本领域公知的方法确定。本发明中用到的亲脂蛋白是一类对疏水材料具有高度亲和性的蛋白质，包括几种PHA颗粒表面结合蛋白，其中包括颗粒结合蛋白Phasin、PHA降解酶PhaZ的底物绑定区域(SBD)、抑制蛋白PhaR的颗粒绑定区域(GBD)、PHA合成酶PhaC。其他具有亲脂功能的蛋白质包括脂肪酶lipase以及它的底物结合区域等也适合用于本发明。在本文中，术语"亲脂性蛋白"或"亲脂蛋白"与"疏水颗粒结合蛋白"表示相同的含义，可互换使用。本文所用的术语"疏水颗粒结合结构域"是指本发明的融合蛋白中能够与疏水颗粒紧密结合的部分。本发明的"疏水颗粒结合结构域"可以是完整的疏水颗粒结合蛋白，例如颗粒结合蛋白(Phasin/PhaP)、PHA合酶(PhaC)、PHA降解酶(PhaZ)、调控蛋白(PhaR)、脂肪酶(lipase);也可以是疏水颗粒结合蛋白的底物结合区域，例如PHA降解酶的底物结合区域(substratebindingdomainofPhaZ，ZSBD)、PhaR的底物结合区域(substratebindingdomainofPhaR,RSBD)。本发明的"疏水颗粒结合结构域"的数目可以是一个，也可以是二个、三个或更多个。在具有多个疏水颗粒结合结构域的情况下，这些结构域之间可以相同，也可以不同。可以是Phasin，PhaZ,PhaR，PhaC等之间的任意组合。例如，多个颗粒结合蛋白Phasin组成的体系PPP(Phasin-Phasin-Phasin),多个PHA降解酶PhaZ的底物绑定区域(SBD)组成的体系SSS(SBD-SBD-SBD)，多个抑制蛋白PhaR的颗粒绑定区域(GBD)组成的体系GGG(GBD-GBD-GBD),多个PHA合酶组成的体系CCC(PhaC-PhaC-PhaC)，PhaP-PhaP,ZSBD-ZSBD曙ZSBD,RSBD-RSBD-RSBD，PhaP-ZSBD，ZSBD-RSBD,PhaP-ZSBD-RSBD等。不受任何特定理论的约束，认为结构域数目的增加有可能使得与疏水颗粒之间的结合更为紧密。优选地，多个疏水颗粒结合结构域之间通过连接肽(linker)连接。合适的连接肽可以是任何柔软的短肽，它可以保证两边的蛋白可以正确折叠成活性形式，例如pTWIN2中的linker1，AsnAsnGlyAsnAsnGlyLeuGluLeuArgGluSerGly(EvansT.C.etal.,C/zem.274(1999)18359-18363)。目标细胞特异配体与所述一个或多个疏水颗粒结合结构域之间可以通过连接肽连接。不受任何特定理论的约束，认为通过连接肽连接有助于保证各部分蛋白折叠成正确的三维结构。作为另一种选择，目标细胞特异配体与所迷一个或多个疏水颗粒结合结构域之间也可以直接连接。本发明中疏水颗粒结合结构域可以在融合蛋白的N端，也可在融合蛋白的C端，还可以同时存在于融合蛋白的两端。本发明中的亲脂性融合蛋白可以是原核、真核表达，可以细胞外翻译，也可以直接合成，还可以将疏水颗粒结合结构域与配体用本领域技术人员熟知的化学方法连在一起。本文所用的术语"疏水颗粒"是指由疏水材料形成并具有疏水表面的颗粒。本发明的疏水颗粒并不限于任何特定的形状，可以为球形、卵形、橄榄形、方形或不规则的形状，只要能够实现与疏水颗粒结合结构域的紧密结合即可。疏水颗粒的收集和/或分离通常可以通过离心和/或过滤来进行。在本文中，术语"疏水颗粒"与"疏水微球"表示相同的含义，可互换使用。本发明的疏水颗粒可以按照乳液制备(Sandersetal.，」w.Oze/w.Soc.116(1993)2695-2702)或者单体聚合(Yangetal.,Jow脂/o/A^fg"etowa"t/Magw"/cMa&naAy293(2005)187-192)的方法制备。例如，一种典型的疏水颗粒的制备方法如下(1)油相溶液将疏水性高分子材料(PHA、PCL、PMMA等)按5%(w/v)溶解于氯仿中；(2)水相溶液将表面活性剂(10mM油酸钠、1%w/v的PVA等)溶解到水中；(3)将水相溶液倒入油相溶液中，油相与水相的体积比为20:1，超声成乳液(输出功率50%，工作1秒，间隙1秒，总时间10-30分钟)；(4)用旋转蒸发仪除去乳液中的氯仿，即为需要的疏水颗粒乳液，室温保存，用时离心取沉淀的颗粒即可。'本发明的疏水颗粒的尺寸没有特定的要求，但应该在能被细胞内吞的范围内，通常在纳米或微米尺度上。原则上颗粒粒径越小，与蛋白质的接触面积越大，单位质量的颗粒能够承栽的蛋白就越多，但同时可能会增加离心收集颗粒的难度。在本文中，术语"纳米或微米微球"与"疏水颗粒"、"疏水微球"等可互换使用。用于制备本发明的疏水颗粒的材料可以是具有较好脂溶性的疏水高分子材料，也可以是能够通过单体聚合的方式形成微粒的疏水高分子材料。合适的具体的疏水性材料包括聚乙烯、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚乳酸、聚己内酯、聚丙烯、聚曱基丙烯酸曱酯、聚氯乙紼等疏水性高分子材料，特别是聚羟基丁酸酯、羟基丁酸和羟基戊酸共聚物、13羟基丁酸和羟基己酸共聚物、聚羟基辛酸酯、聚羟基庚酸酯、聚羟基癸酸酯、羟基丁酸和羟基辛酸共聚物、羟基丁酸羟基戊酸和羟基己酸共聚物等疏水性PHA材料。聚轻基丁酸酯、羟基丁酸和羟基戊酸共聚物是特别优选的疏水性PHA材料。本发明中所采用的疏水性材料既可以是完全疏水材料，也可以是两亲性材料，例如聚乙二醇与PHA的共聚物(PEG-PHA)，只要制得的颗粒表面具有疏水性质即可。材料包括均聚、共聚、嵌段及改性的疏水材料。本发明中的疏水材料是生物可降解材料，包括生物合成与非生物合成的疏水性高分子材料。本文所用的术语"任选"(optional)表示"可有可无，，或"非必需"等含义。"任选的连接肽"是指可以有该连接肽，也可以没有该连接肽。这可以由本领域技术人员根椐情况进行选择。本发明中的药物靶向载体既可以应用于体外培养的细胞，可以注射到生物体内实现靶向运输药物及其他物质。本发明的药物靶向栽体可以与现有技术中公知的药学上可接受的栽体一起配制为药物组合物，例如通过将本发明的药物粑向栽体与药学上可接受的栽体紧密结合而制备。可以制备成注射剂、片剂、胶嚢剂、糖浆剂、酏剂、溶液剂、悬浮液、滴眼液、喷雾剂或酊剂等药学领域技术人员熟知的剂型，这可以根据具体的给药需求来确定。"药学上可接受的栽体"包括例如惰性稀释剂如乳糖、碳酸钠、磷酸4丐等；制粒剂和崩解剂如玉米淀粉或藻酸；粘合剂如淀粉；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂如对-轻基苯甲酸乙酯或丙酯；和抗氧化剂，如抗坏血酸等。糖浆剂和酏剂可以用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨醇、阿司帕坦或蔗糖来进行制备，并且还可以包含緩和剂、防腐剂、矫味剂和/或着色剂等。本发明的药物靶向栽体的一种优选制备方法如下1)用超声或均质匀浆方法将基因、蛋白质或其他药物包裹进生物降解性疏水材料中并形成纳米或微米颗粒。2)利用蛋白表达系统表达或者人工合成亲脂性融合蛋白3)将亲脂性融合蛋白与疏水微球共同孵育，使融合蛋白结合到疏水微球表面，形成具有靶向性的药物栽体。4)用离心收集药物栽体，洗涤几次，即得到均质的靶向性药物栽体。为了更加详细地解释本发明，下面将给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。实验中所用到的限制性内切酶均购自NEB公司，DNA聚合酶2xPfuMasterMix购自北京天根生物技术有限公司，用于小于4kb的片段基因的克隆，PrimeSTARHSDNAPolymerase购自Takam公司，用于长片段基因的克隆，DNAligationVer.2.0购自Takara公司，质粒提取及DNA纯化试剂盒购自北京碧云天生物枝术研究所，其他生化试剂购自上海生物工程有限公司，聚合酶链式反应、DNA连接、酶切，及其它基因操作方法参考《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1989)。实施例1利用靶向药物栽体，通过巨噬细胞表面的甘露糖受体介导的内吞，实现向体外培养的巨噬细胞运输RBITC显色剂。由于巨噬细胞能高表达甘露糖受<体，|此受体能特异性识、别:内吞甘，糖，化的蛋异性运输药物。人oc1酸糖蛋白(humana1-acidglycoprotein,简称hAGP)是具有5个糖基化位点的糖蛋白，在完全糖基化后，其糖链可占分子量的40%。将hAGP的基因(在Genebank的GeneID:5004)重组到酵母基因组后，能通过翻译后修饰分泌表达得到甘露糖基化的hAGP。将PhaP与hAGP在酵母中融合表达，使得糖基化的hAGP通过PhaP能结合在疏水的PHA纳米颗粒上，成为具有向巨噬细胞把向运输的药物栽体。利用PHA材料制成装栽RBITC的納米颗粒。RBITC是脂溶性的荧光染料，溶于氯仿，二氯甲烷等，不易溶于水。在波长为550nm的激发光下，发射出575nm左右的红色荧光。RBITC易于装栽于脂溶性的PHA材料中，作为指示剂代替药物，在激发光的作用下，发出荧光，便于监测靶向药物栽体对药物的运输。完整的靶向性药物运输载体制作成后，加入到体外培养的巨噬细胞培养体系中，运用激光共聚焦显微镜通过观察红色焚光实时监15测栽体向细胞运输RBITC的情况。作为对照，将非完整的药物载体(即装栽有RBITC的纳米颗粒外面没有PhaP与hAGP融合蛋白)加入巨噬细胞的培养体系中。由于非完整的药物栽体没有巨噬细胞所能特异性识别的受体，因此通过激光共聚焦显微镜不能观察到巨噬细胞的特异性胞吞现象。具体实验方法如下1、3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物(Poly[hydroxybutyrate-co-hydroxyhexanoate],简称PHBHHx)纳米颗粒的制作先将纯化后的PHBHHx(清华大学生物系微生物实验室惠赠，分子量44,000Da，其中HB含量88Q/q，HHx含量为2%)和RBITC(美国Sigma公司产品)溶于二氯甲烷中为有机相，使其终浓度分别为50mg/mL和1mg/mL。在50mL离心管中装20mL浓度为1%的聚乙烯醇(PVA，美国Sigma公司产品)溶液置于水水中超声1min后，用注射器取1mL有机相逐滴注入超声乳化的1.0%PVA水溶液中，继续乳化45min，然后升温至40。C，超声乳化5min使溶剂蒸发。乳化后得到的胶体在室温下磁力温和搅拌24h(小时)。高速离心才几离心，用重蒸水洗涂2次。由上迷方法得到了半透明状的胶体溶液，并用450nm的膜过滤去除大颗粒电镜检测PHBHHx颗粒,颗粒直径大约为100-300nm左右(图2)。2、亲脂性融合蛋白表达质粒pPIOP(图3)的构建以pPICZa-B(美国Invitrogen公司产品)为栽体，以hAGPcDNA(购自美国ProteintechGroup,Inc)为模板，PCR获得MG尸基因，通过NsiI和KpnI双酶切后连接入PstI和KpnI双酶切后的pPICZa-B栽体，得到pPIO栽体。再以尺a/Womaew^op/wH16基因组为模板，PCR反应得到尸/w尸基因，通过KpnI和XbaI双酶切后连接入pPIO质粒，得到表达载体pPIOP。2.1PCR克隆/l4G尸基因设计引物如下5'-AGTATGCATTGTCCTGGGTTCTTACAGTCCTG-3'(引物1)和5'-ATGGTACCGGATTCCCCCTCCTCCTGTTTC-3'(引物2),以hAGPcDNA为才莫板。反应条件:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>反应体系hAGPcDNA(0.5jag/pl)0.5|tiL引物1(10^M)0.5引物2(10pM)0.5|liL2xPfuMasterMix12.5ddH20_U|LtL总体积25|uL将PCR产物纯化回收后，用NsiI和KpnI双酶切，插入到经PstI和KpnI双酶切后的pPICZoc-B质粒中，得到pPIO质粒。转化到大肠杆菌中扩增。2.2PCR克隆尸/za尸基因设计引物如下5'-TAGGTACCATCCTCACCCCGGAACAAGTTG-3'(引物1)和5'-TATTCTAGATCAGGCAGCCGTCGTCTTC-3'(引物2),以Aa/Wom"ew&op/wH16基因组为模板反应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>反应体系RalstoniaeutrophaH16基因组0.5|nL(0.5她l)P引物l(10pM)0.5|tiL引物2(10pM)0.52xPfuMasterMix12.5ddH20_U|uL总体积25将PCR产物纯化回收后，用KpnI和XbaI双酶切，插入到经KpnI和XbaI双酶切后的pPIO质粒中，得到pPIOP质粒。转化到大肠杆菌中扩增。3、将pPIOP质粒电转化入尸/'cA/a;7aWo〃j酵母1)培养500mL酵母细胞至OD600nm=1.3-1.5。2)4°C、1500g离心细胞5分钟，再用500mL无菌水水重悬细胞。3)4°C、1500g离心细胞5分钟，再用250mL无菌水水重悬细胞。4)4'C、1500g离心细胞5分钟，再用20mL无菌冰冷1M山梨醇溶液重悬细胞。5)4。C、1500g离心细胞5分钟，加入lmL无菌水冷lM山梨醇溶液。6)将质粒pPIOP用SacI酶切使其线性化。2亲脂性融合蛋白hEGF-PhaP表达质粒PT-EphaP(图5)的构建。以pTWIN2质粒为栽体(美国NEB公司产品)，分别以合成的hEGF基因和通过PCR分别获得/^GF和尸/w尸基因，扩增的/五GF基因的5'与3'末端加上了Ndel与Kpnl酶切位点，扩增的PhaP基因5'与3'端加上了Kpnl与BamHI酶切位点。将上迷扩增的基因以Kpnl酶切并纯化后，体外以DNA连接酶连接后获得融合基因E尸W尸(/^GF-尸/w尸)。将融合基因以Ndel和BamHI双酶切，pTWIN2质粒亦以Ndel和BamHI双酶切，之后以DNA连接酶将融合基因构建入pTWIN2质粒中得质粒栽体pT-EphaP2.1PCR克隆/^GF基因设计引物如下5'-GCGCATATGAATAGTGACTCTGAATGTCC-3'(引物1)和5'-GTGGTACCGCGCAGTTCCCACCACTTCA-3'(引物2)具体反应条件反应条件:预变性94。C3min变性94。C30sec30个循环退火55°C30sec延伸72。C25sec后延伸72。C5min反应体系模板_基因组DNA(1-3ng/pl)0.5|liL引物1(10jiM)0.5|uL引物2(10(nM)0.5|liL2xPfuMasterMix12.5ddH20_11|iiL总体积25将PCR产物純化回收后，用KpnI酶切，纯化酶切产物。2.2PCR克隆PhaP基因。设计引物如下5'-GCGGTACCATCCTCACCCCGGAACAAGT-3'(引物1);5'國CGGGATCCTTAGGCAGCCGTCGTCTTCTTTG-3'(引物2),具体反应条件如下反应条件:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>反应体系尺a/Womaew^o//zaH16基因纟且DNA(1-3一1)'引物1(10jaM)引物2(10pM)2xPfuMasterMixddH20_总体积25)uL将PCR产物純化回收后，用KpnI酶切，純化酶切产物。用T4DNA连接酶将产物和步骤2.1中的产物连接起来。再经NdeI和BamHI双酶切，插入到经BamHI和KpnI双酶切后的pTWIN2质粒中，得到pT-EphaP质粒。转化到大肠杆菌中扩增。3大肠杆菌表达融合蛋白hAGP-PhaP将构建好的质粒转化入大肠杆菌Origanmi(具有卡那霉素抗性)中，通过氨节青霉素与卡那霉素抗性筛选阳性菌抹。37°C,200rpm/min摇菌培养5小时，OD值达0.5时，加入IPTG至终浓度0.2mM/L,200rpm/min18°C下培养12小时，表达亲脂性融合蛋白EphaP。IPTG诱导12小时后，离心收集菌体，以pH7.4磷酸緩沖溶液PBS溶液清洗菌体2次后，加入PBS溶液悬浮菌体，冰上超声破碎20分钟后，再离心，所得上清即含有融合蛋白。4组装靶向性药物栽体(同实例1的第5)5靶向药物栽体对肝癌细胞的靶向运输。〖0153]1)将肝癌细胞Be17402以1x105Cells/mL接种于激光共聚焦专用培养皿里，用RPMI-1640+10%胎牛血清培养基，在37'C，5%的C02中培养24小时。2)弃去培养基上清，用PBS洗涤细胞2次，加入新鲜RPMI-1640+10%胎牛血清培养基，在37。C，5。/o的C02中培养30分钟。3)将细胞培养体系置于激光共聚焦显微镜的栽物台上，IOO倍的油镜观察，调节激发光和发射光波长分别为550nm和575nm。4)在细胞培养体系中加入药物栽体至终浓度为100mg/L，立即激光共聚焦显微镜每隔15秒扫描一次图像，并实时记录单个细胞的荧光强度变化。5)对照组加入非完整药物载体，操作步骤同上。结果如图6所示，在同样的培养体系中加入同量的药物栽体，实验组和对照组有明显的区别。实验组在的靶向性药物栽体表面由于有与肝癌细胞上表皮生长因子受体能特异识别的融合蛋白hEGF-PhaP,使得药物栽体能特异性被肝癌细胞识别而内呑，因而荧光强度增强迅速。相反，非靶向性的药物栽体不能被肝癌细胞识别，不能将药物运输进入肝癌细胞中。结果表明，靶向药物载体能特异性的将药物快速运输到目的细胞。23参考文献(1).Oh，P.，Li，Y.，Yu，丄，Durr,E.,Krasinska,K.M.，Carver,L.A.,Testa，丄E.,Schnitzer,J.E.(2004)Subtractiveproteomicmappingoftheendothelialsurfaceinlungandsolidtumoursfortissue-specifictherapy.Nature429:629-35.(2).Seng叩ta，S.,Eavarone，D.，Capila，I.,Zhao,G.,Watson,N.，Kiziltepe,T.，Sasisekharan,R.(2005)Temporaltargetingoftumourcellsandneovasculaturewithananoscaledeliverysystem.Nature436:568-72.(3).Carmeliet,P.(2005)Angiogenesisinlife,diseaseandmedicine.Nature438:932-36.(4).Lavigne,M.D.,andG6recki.D.C.(2006)Emergingvectorsandtargetingmethodsfornonviralgenetherapy.ExpertOpin.EmergingDrugs11:541-557.(5).Eliyahu，H.,Barenholz,Y.，andDomb,A.J.(2005)PolymersforDNADelivery.Molecules10:34-64(6).Langer,R.(1998)Drugdeliveryandtargeting.Nature392:5-10.(7).Sudesh，K.，Abe,H.,andDoi,Y.(2000)Synthesis,structureandpropertiesofpolyhydroxyalkanoates:biologicalpolyesters.Prog.Polym.Sci.25:1503-55.(8).Val邵pil,S.P.,Misra,S.K.,Boccaccini,A.R.,andRoy,I.(2006)Biomedicalapplicationsofpolyhydroxyalkanoates:anoverviewofanimaltestingandinvivoresponses.ExpertRevMedDevices.3:853-68.(9).Potter,M.,Madkour,M.H.,Mayer,F.,Steinbuchel,A.(2002)Regulationofphasinexpressionandpolyhydroxyalkanoate(PHA)granuleformationinRalstoniaeutrophaHI6.Microbiology.148:2413-26.(10).Peters,V.，B.H.A.Rehm.(2006)/"v/voenzymeimmobilizationbyuseofengineeredpolyhydroxyalkanoatesynthase.Appl.Environ.Microbiol.72:1777-83.(11).Peters,V.,B.H.A.Rehm.(2005)/"v/vomonitoringofPHAgranuleformationusingGFP-labeledPHAsynthases.FEMSMicrobiol.Lett.248:93-100.(12).Wieczorek,R.，Pries,A.,Steinbuchel,A.，Mayer,F.(1995)Analysisofa24-kilodaltonproteinassociatedwiththepolyhydroxyalkanoicacidgranulesinAlcaligeneseutrophus.JBacteriol.177:2425-35.(13).Banki,M.R.，Gerngross，T.U.，Wood,D.W.(2005)Novelandeconomicalpurificationofrecombinantproteins:Intein-mediatedproteinpurificationusinginvivopolyhydroxybutyrate(PHB)matrixassociation.ProteinScience14:1387-95.(14).Maehara,A.,Taguchi,S.，Nishiyama,T.,Yamane,T.,Doi,Y.(2002)Arepressorprotein,PhaR,regulatespolyhydroxyalkanoate(PHA)synthesisviaitsdirectinteractionwithPHA.JBacteriol.2002184(14》3992-4002.(15).Yamada,M，Yamashita，K.，Wakuda,A.，Ichimura,K.，Maehara,A.，Maeda,M.，Taguchi，S.(2007)AutoregulatorproteinPhaRforbiosynthesisofpolyhydroxybutyrate[P(3HB)]possiblyhastwoseparatedomainsthatbindtothetargetDNAandP(3HB):FunctionalmappingofaminoacidresiduesresponsibleforDNAbinding.JBacteriol.189:1118-27.(16).Yamashita,K.,Yamada,M.，N圃ata,K.，Taguchi,S.(2006)Nonspecifichydrophobicinteractionsofarepressorprotein,PhaR，withpoly[(R)-3-hydroxybutyrate]filmstudiedwithaquartzcrystalmicrobalance.Biomacromolecules.7:2449-54.(17).Hisano，T.，Kasuya，K.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