心力衰竭预防剂的制作方法

专利名称：：心力衰竭预防剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有心脏壁肥厚抑制作用的有效成分，含有该有效成分的心脏肥大预防剂和心力衰竭预防剂，以及含有该有效成分、有望获得心脏肥大和心力衰竭预防效果的功能性食品。本发明涉及抑制心脏壁肥厚的方法。更具体地说，本发明涉及预防心脏月巴大和心力衰竭的方法。
背景技术：
：近年来，在部分国家，由于带有吸烟、高血压、高血糖、高血脂等引发心脏疾病的危险因素的人日渐增多，心力衰竭患者数有增加趋势。这些病态并不只限于人类，在犬类或猫等其它伴侣动物或宠物动物等与人类有密切关系的动物中也有增加趋势。心力衰竭的病态、分类、过程各有不同，无法简单定义，但可以大致分为收缩期心力衰竭和舒张期心力衰竭两大类，该两种也可能同时发生。收缩期心力衰竭是由于心脏无法正常收缩而发生。心脏4聂取血液，但是由于心肌较弱，因此无法将充满的血液充分压出，结果送至全身或肺部的血液量减少，心脏、特别是左心室肥大。而舒张期心力衰竭是由于心脏的壁变硬变厚、心脏无法充分存留血液而发病。结果，血液停留在左心房内或肺部血管内，引发淤血。这样，通常的心力衰竭是心脏的泵功能陷入衰竭，因此心脏无法送出足够量的血液，由于心力衰竭，发生血流量减少、血液在静脉或肺中滞留等使心脏功能进一步降低的其它变化。形成心力衰竭的原发病(原疾患)例如有高血压，主动脉狭窄等导致压力负荷的增大、瓣膜病等导致的容量负荷增大等而引起的心脏壁肥厚的心脏肥大。而心肌梗塞发病后，损伤组织中作为自发性功能回复反应而形成心脏壁肥厚。心肌病等由于发生原因不明的心肌障碍而导致心脏壁肥厚。持续地对心脏施加机械性负荷，则心肌的收缩力渐渐降低，导致心功能降低，即而导致心室性心律失常、心脏缺血、冠状动脉疾病、缺血性心力衰竭。由此，具有心脏壁肥厚抑制作用的化合物对于心脏月巴大或心力衰竭的预防和治疗有效。例如由于高血压等导致心脏肥大时，作为心脏壁肥厚的改善方法，通过治疗作为病因的高血压也可以改善心脏壁肥厚，但是其作用并不令人满意，并且降压药可能完全无效(AmJHypertens.1997Aug;10(8):913~20)。即使高血压得到改善，也大多残留心脏壁肥厚未改善的状态，这种状况下也有心力衰竭发病的危险性。对心力衰竭治疗有效的药物是可抑制由血管紧张素I变换为具有升压作用的血管紧张素II的酶(即血管紧张素转换酶，ACE)、具有降压作用的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，例如依那普利。有报告指出，降压剂在降低血压的同时可以改善肾功能障碍的发展(丄Clin.Invest,77,1993-2000,1986)。但是另一方面，ACE抑制剂未必对于由各种原有疾病诱发的心力衰竭的所有的病例有效，并且伴随着降压，也有导致急性肾功能衰竭的危险，因此必须慎重给予(最新医学，48:1404-1409,1993),即，降压剂不仅对于心力衰竭的预防不充分，还可能诱发肾功能衰竭。另一方面，有报告指出酪蛋白等来自食品材料的肽具有ACE抑制活性，已知它们具有降血压作用，但是并未直接显示是否具有心脏壁肥大抑制作用(日本特许第2782142号公报，J.DairySci.1995,78:777-78,J.DairySci.1995,78:1253-1257,Am.J.Clin.Nutr.1996,64:767-771)。如上所述，ACE抑制带来的心力衰竭的预防或治疗效果是有限度的，人们需求不依赖ACE抑制的疾病的预防或治疗。
发明内容本发明提供不依赖于ACE抑制活性、具有心脏壁肥厚抑制作用的4匕合物或组合物。本发明又提供含有上述化合物或组合物的心力衰竭预防剂。本发明还提供含有上述化合物或组合物、有望获得心力衰竭预防效果的功能性食品。本发明进一步提供抑制心脏壁肥厚的方法，该方法包含将上述化合物或组合物给予对象。本发明还提供预防心力衰竭的方法，该方法包含将上述化合物或组合物给予对象。本发明是上述化合物或组合物在制备抑制心脏壁肥厚的药物中的应用。特别是本发明是上述化合物或组合物在制备预防心脏肥大用药物中的应用。本发明还是上述化合物或组合物在制备预防心力衰竭用药物中的应用。本发明人发现具有XaaProPro(Xaa为任意的天然氨基酸)这样的特定结构的三肽具有心脏壁肥厚抑制作用，从而发明了对预防心力衰竭起作用的药物和功能性食品。其具体内容如下所述。本发明提供含有XaaProPro作为有效成分的心脏壁肥厚抑制剂。本发明提供具有上述心脏壁肥厚抑制作用的心脏肥大预防剂。本发明提供具有上述心脏壁肥厚抑制作用的心力衰竭预防剂。本发明提供包含上述心脏壁肥厚抑制剂的功能性食品。本发明提供抑制心脏壁肥厚的方法，该方法包含将XaaProPro或含有XaaProPro的组合物给予对象。本发明提供预防心脏肥大的方法，该方法包含将XaaProPro或含有XaaProPro的组合物给予对象。本发明提供预防心力衰竭的方法，该方法包含将XaaProPro或含有XaaProPro的组合物给予对象。本发明是XaaProPro或含有XaaProPro的组合物在制备抑制心脏壁肥厚的药物中的应用。特别是本发明是XaaProPro或含有XaaProPro的组合物在制备防止心脏肥大用药物中的应用。本发明还是XaaProPro或含有XaaProPro的组合物在制备预防心力衰竭用药物中的应用。优选XaaProPro是ValProPro和/或lieProPro。在本发明的另一方案中，有效成分XaaProPro来自动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物。本发明的又一方案中，有效成分XaaProPro来自用瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)种的菌使含有乳蛋白质的原料发酵得到的发酵物。优选瑞士乳杆菌种的菌是瑞士乳杆菌CM4林(FERMBP-6060)。具体实施例方式本发明的心脏壁肥厚抑制剂含有XaaProPro结构的三肽作为有效成分。这里，"剂，，并不限于药物，例如是指药物组合物或食品组合物等的组合物，或者例如食品添加剂等的化合物。本发明中所述的"心脏壁肥厚抑制剂"是指具有抑制心脏壁肥厚病变发展的作用、具有改善心脏壁肥厚病变的作用、或者具有心脏壁肥厚发病的预防效果的化合物或组合物。本发明的有效成分XaaProPro的Xaa可以是任意的天然氨基酸。具体有ValProPro(缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸)、lieProPro(异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸)、SerProPro(丝氨酸-脯氨酸-脯氨酸)、LeuProPro(亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸)等，优选ValProPro、lieProPro,更优选ValProPro。有效成分可以含有ValProPro和lieProPro这样的1种以上三肽XaaProPro的组合。有效成分XaaProPro可以是有机化学合成的三肽，还可以是天然的三肽。三肽XaaProPro的有才几化学合成方法可以采用固相法(Boc法、Fmoc法)或液相法等常规方法，例如可以是使用岛津制作所制造的肽合成装置(PSSM-8型)等肽自动合成装置合成的。肽合成的反应条件等可根据本领域技术常识、结合所选择的合成方法或所需的三肽XaaProPro,任意设定适当的反应条件等。或者，作为天然的三肽XaaProPro可以来自动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物，还可以来自用曲霉菌或乳酸菌等菌类使含有蛋白质的食品原料发酵得到的发酵物。使用动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物、或用瑞士乳杆菌种的菌使含有乳蛋白质的原料发酵得到的发酵物时，除本发明的有效成分一一三肽XaaProPro之外，还可以含有游离氨基酸，并且，除上述肽和游离氨基酸之外，例如可含有通常动物乳酪蛋白、乳蛋白质中所含有的脂类、灰分、碳水化合物、食物纤维、水分等，还可根据需要将其中的适当的成分的一部分或者全部除去。本发明的有效成分XaaProPro可以来自动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物，该动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物可以通过使用可得到XaaProPro、特别是ValProPro和lieProPro的酶组(酵素群)将动物乳酪蛋白水解的方法、将动物乳酪蛋白用曲霉菌发酵的方法获得。动物乳酪蛋白例如有牛乳、马乳、山羊乳、羊乳等的酪蛋白，可特别优选使用牛乳酪蛋白。对将动物乳酪蛋白水解或发酵时的酪蛋白浓度没有特别限定，为了高效的生产动物乳酪蛋白分解物，优选1-19重量％。上述酶组例如优选酶组(X)，该酶组(X)含有可切断XaaProProXaa序列的羧基末端的ProXaa残基之间的肽酶。酶组(X)优选含有在活性中心具有丝氨酸的丝氨酸型的蛋白酶或在活性中心具有金属的金属蛋白酶。金属蛋白酶有中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶等，进一步含有它们的至少一种可以效率良好且在短时间内、并且以一步反应即可以获得所需的水解物，因此优选。另外，可切断上述ProXaa序列的肽酶优选为等电点显示为酸性区域的酶。上述酶组或酶组(X)例如有来自米曲霉(Aspergillusoryzae)等曲霉菌的酶组。上述酶组可以是在适当的培养基中培养菌体、通过水提取生成的酶所得的酶组等，特别优选来自米曲霉的酶组中的等电点显示酸性区域的酶组。来自米曲霉的酶组可以利用市售商品，例如优选4吏用义；、f一厶FP、LP或MP(以上为注册商标，新日本化学(抹)制)、々7;、if>f厶(注册商标，天野工乂if、厶(林)制)、SternzymeB11024、PROHIDROXYAMPL(以上为商品名，林式会社樋口商会制)、才i;工7夕一七、ons(注册商标，阪急"4才0夕'只卜卩一(林)制)、f、大f—厶AP(注册商标，,方、七生化学制)等，特别优选使用只Sf—厶FP(以上为注册商标，新日本化学(抹)制)。使用这些市售酶组时，通常设定最佳条件，也可以根据所使用的酶组，适当改变获得上述酪蛋白水解物的条件、例如使用的酶量或反应时间等进行。对上述动物乳酪蛋白进行水解时的酶组的添加量例如是在溶解动物乳酪蛋白的水溶液中，酶组/动物乳酪蛋白按照重量比为1/1000以上、优选1/1000-1/10、特别优选1/100-1/10、进一步优选1/40-1/10的比例的量。反应条件根据所使用的酶组适当选择，以获得目标酪蛋白水解物，温度通常是25-60°C，优选45-55。C,pH为3-10，优选5-9，特别优选5-8。酶促反应时间通常为2-48小时，优选7-15小时。酶促反应的结束可通过使酶失活进行，通常在60-ll(TC下使酶失说活，使反应停止。酶促反应停止后，可以根据需要通过离心分离或各种过滤器处理除去沉淀物。味成分i2味成分的除去;使用活性碳或疏水性树;旨等进行。例如，可以在所得水解物中添加相对于所使用的酪蛋白量为1-20重量％的活性碳，反应1-10小时。所使用的活性碳的除去可通过离心或膜处理操作等7>^口的方法进4亍。上述得到的含有动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物的反应液可以直接添加到饮料等液体制品中，用作功能性食品。另外，为了提高动物乳酪蛋白水解物的通用性，可以将上述反应液浓缩，然后干燥，制成粉末形态。动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物中所含的XaaProPro的含有比例相对于动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物中肽和游离氨基酸的总量通常为1重量％以上、优选1-5重量％。使该含有比例为1重量％以上，可以获得更高的作用。动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物中所含的lieProPro或ValProPro的含有比例相对于动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物中肽和游离氨基酸的总量分别单独为0.3重量％以上，或lieProPro和ValProPro的总量为0.3重量°/。以上都可获得高效果。并且，在分别含有0.3重量％以上lieProPro和ValProPro时，可获得更高的效果。本发明的有效成分XaaProPro还可以来自用瑞士乳杆菌种的菌4吏含有乳蛋白质的原料发酵获得的发酵物。乳杆菌种的菌，可以将瑞士乳杆菌种单独用于发酵，在不损害本发明的效果的范围内也可以含有其它乳酸菌等。瑞士乳杆菌种的菌优选可以高产lieProPro和/或ValProPro的蛋白酶生产菌。例如可优选按照Yamamoto等人的根据Twining等人的方法((Twining,S.Anal.Biochem.)1433410(1984)的方法(Yamamoto，N,等人.J.Biochem.)(1993)114,740)测定的、U/OD590的值为400以上的菌抹。上述优选的菌林例如有瑞士乳杆菌CM4林(日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，日本国茨城县筑波市东1丁目l番3号，邮政编码305(现产业技术综合研究所特许生物寄托中心，日本国茨城县央笫6,邮政编码305-8566),保藏号FERMBP-6060,保藏日1997.8.15)(以下称为CM4抹)。该CM4抹在专利手续上在基于微生物保藏的国际性认可的布达佩斯条约下，以上述保藏号注册，该菌林已经获得专利。用瑞士乳杆菌种的菌使含有乳蛋白质的原料发酵获得的发酵物可通过将含有瑞士乳杆菌种的菌林的发酵乳引子添加到含有乳蛋白质的原料中，适当选择发酵温度等发酵条件，通过发酵获得。将这样得到的发酵物的浓缩物等进行冷冻干燥、喷雾干燥等，以粉末形式使用。瑞士乳杆菌种的菌优选预先进行预培养，以活性足够高的引子的形式使用。初始菌数优选为10M(^个/mL左右。用瑞士乳杆菌种的菌使含有乳蛋白质的原料发酵获得的发酵物例如在利用于特定保健用食品等功能性食品中时，为了使风味良好、喜好性良好，可以将酵母与上述瑞士乳杆菌种的菌林并用进行发酵。对酵母的菌种没有特别限定，例如优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母属酵母等。酵母的含有比例可根据目的适当选择。含有乳蛋白质的原料例如有牛乳、马乳、羊乳、山羊乳等动物乳，以及豆乳等植物乳，它们的加工乳一一脱脂乳、还原乳、乳粉、炼乳，优选牛乳、豆乳、它们的加工乳，特别优选牛乳或其加工乳。对乳的固形成分浓度没有特别限定，例如使用脱脂乳时，无脂乳固形成分浓度通常为3-15重量％左右，从生产性考虑优选6-15重量％。上述发酵通常通过静置或搅拌发酵、例如在发酵温度25-45°C、优选30-45t:、发酵时间3-72小时、优选12-36小时下、在乳酸酸度达到1.5%以上时停止发酵的方法进行。用瑞士乳杆菌种的菌使含有乳蛋白质的原料发酵得到的发酵物中含有的XaaProPro、优选HeProPro和/或ValProPro的含有比例换算为100g该发酵物的冻干物，优选为10mg以上，更优选15mg以上。对于人类，本发明的心脏壁肥厚抑制剂的给予量或摄取量是每天以通常lOpg-lOg、优选1mg-5g、进一步优选3mg-1g左右的用量，每天分多次给予或摄取有效成分XaaProPro、优选ValProPro和/或lieProPro。心脏壁肥厚抑制剂的给予或摄取时间可以考虑给予或摄取的人或动物的年龄、该人或动物面对心力衰竭的危险因素的环境等进行各种调节，例如通常可以是l天以上，优选7天-365天。本发明的心力衰竭预防剂是以上述三肽作为有效成分。对于人类，本发明的心力衰竭预防剂的给予量或摄取量是每天以通常10昭-10g、优选lmg-5g、进一步优选3mg-lg左右的用量，每天分多次给予或摄取有效成分XaaProPro、优选ValProPro和/或lieProPro。心力衰竭预防剂的给予或摄取时间可以考虑给予或摄取的人或动物的年龄、该人或动物面对心力衰竭的危险因素的环境等进行各种调节，例如通常可以是l天以上，优选7天-365天。本发明的心力衰竭预防剂是以上述三肽作为有效成分。本发明的心脏肥大预防剂的给予量或摄取量、以及给予或摄取的时间与本发明的心力衰竭预防剂相同。本发明的心脏壁肥厚抑制剂、心脏肥大预防剂以及心力衰竭预防剂的给予或摄取的方法优选为经口。使用本发明的心脏壁肥厚抑制剂、心脏肥大预防剂以及心力衰竭预防剂作为药物时的形态可以是用于经口给予的制剂的形态。例如有片剂、丸剂、硬胶嚢剂、软胶嚢剂、微嚢、散剂、颗粒剂、液体制剂等。制备成药物的形式时，例如可以根据需要适当使用制药可接受的载体、佐剂、赋型剂、补型剂(補形剤)、防腐剂、稳定剂、结合剂、pH调节剂、緩冲剂、增稠剂、凝胶化剂、保存剂、抗氧化剂等，以通常认可的制剂给予时所要求的单位用量形式制备。本发明的食品含有本发明的心脏壁肥厚抑制剂作为有效成分，例如可以制成具有心脏壁肥厚抑制作用、心脏肥大预防和心力衰竭预防等效能的特定的保健用食品等功能性食品。关于为获得上述效能而采取的摄取量，对于食品、例如功能性食品来讲，鉴于日常、连续性或断续性长时间摄取，人每天的有效成分XaaProPro的摄取量、或者ValProPro和/或lieProPro的摄取量通常为10ILig-10g,优选1mg-5g,进一步优选3mg-lg左右，根据每天的摄取次数，可以使食品、例如功能性食品中每次的摄取量比上述量低。含有有效成分XaaProPro的动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物直接使用时，对于人，每天通常摄取1mg-100g、特别是100mg-10g左右该水解物或其浓缩物。直接^f吏用含有有效成分XaaProPro的发酵物的冷冻干燥物时，对于人，以干燥量计，每天通常摄取1-100g、特别是2-50g左右该发酵物的冷冻干燥物。本发明的食品、例如功能性食品的摄取时间没有特别限定，优选长时间摄取，为了获得上述效能，例如通常可以是1天以上，优选7天-365天。本发明的食品、例如功能性食品含有心脏壁肥厚抑制剂，该心脏壁肥厚抑制剂含有本发明的有效成分XaaProPro，优选含有ValProPro和/或lieProPro，例如，可以将如上所述得到的动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物、或含有乳蛋白质的原料的发酵物直接或者制成粉末状或颗粒状添加到各种食品中。还可以根据需要添加瑞士乳杆菌以外的乳酸菌的发酵物、或食品中使用的其它成分，例如糖类、蛋白质、脂类、维生素、矿物质、风味剂例如各种碳水化合物、脂类、维生素类、矿物质类、甜味剂、香精、色素、口感改善剂或它们的混合物等添加物，可以改善营养平衡或风味等。本发明的食品例如功能性食品可以制成固形物、凝胶状物、液体状物的任何形态，例如有乳酸菌饮料等发酵乳制品、各种加工饮料食品、干燥粉末、片剂、胶嚢剂、颗粒剂等，还可以制成各种饮料、酸奶、流食、果冻、糖果、罐头食品、糖果片、曲奇、蛋糕、面包、饼干、巧克力等。以下采用实施例更详细地说明本发明，本发明的范围并不限于实施例。(实施例)[肽合成例]本发明的有效成分lieProPro和ValProPro按以下所示有机化学合成方法(Fmoc法)合成。合成通过使用岛津制作所制造的肽自动合成装置(PSSM-8型)的固相法进行。固相载体使用50mg树脂，该树脂是2-氯三苯曱基(2-Chlorotrityl)型的聚苯乙烯树脂，结合有氨基被芴基甲氧基羰基(以下简称为Fmoc)保护的脯氨酸(岛津制作所制，注册商标SynProPep树脂)。按照上述氨ii基酸序歹'j，按照常规方法，将氨基被Fmoc基团保护的Fmoc-Ile、Fmoc-Pro和Fmoc-Val各100pmol按照肽序列依次反应，获得结合有肽的树脂。接着，将该结合有肽的树脂悬浮于1mL反应液A(10容量。/。乙酸、10容量％三氟乙醇、80容量％二氯曱烷)，在室温下反应30-60分钟，从树脂上切离肽，然后将反应液A用玻璃滤器过滤。减压除去滤液的溶剂，然后立即加入lmL的反应液B(82.5容量％三氟乙酸、3容量％乙基曱基硫醚、5容量％纯水、5容量％茴香硫醚、2.5容量％乙二硫醇、2容量%苯硫酚)，在室温下反应6小时，除去侧链保护基团。向其中加入10mL无水乙醚，4吏肽沉淀，以3000转离心5分钟，进行分离。将该沉淀用无水乙醚清洗数次，然后吹氮气干燥。将这样得到的未纯化的合成肽全部溶解于2mL0.1N盐酸水溶液中，然后通过采用C18反相柱的HPLC、在以下条件下纯化。泵型号L6200智能泵(日立制作所)，检测仪用型号L4000UV检测器(日立制作所);险测215nm的紫外部分的吸收，柱74夕口求>夕'^7工75(xC18(々才一夕一乂制备)，洗脱液A液0.1重量。/oTFA水溶液、B'液加入0.1%重量TFA的乙腈(B/A+B)x100(0/0)0—40%(60分钟)，流速1mL/分钟。制备显示最大吸收的洗脱组分，将其冷冻干燥，分别获得5.7mg、6.5mg目标合成肽lieProPro和ValProPro。将纯化肽用全自动蛋白质一级结构分析装置(型号PPSQ-10,岛津制作所制造)，由肽的N末端分析，进一步通过氨基酸分析装置(型号800系列，日本分光制造)进行分析，结果确认与所设计的一致。将1g来自牛乳的酪蛋白(日本NZMP社制)加入到99g调节为约80。C的蒸馏水中，充分搅拌，然后添加1N氢氧化钠(和光纯药社制)溶液，使pH为7.0,将温度调节为2(TC，制备底物溶液。向所得底物溶液中添加来自米曲霉、至少含有金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶的市售酶(注册商标"只；、*一厶FP，，，新日本化学工业社制)，使酶/酪蛋白的重量比为1/25,在50。C下反应14小时。接着在110。C下进行10分钟的高压釜蒸，使酶失活，获得酪蛋白酶分解物溶液。接着将所得酶分解物溶液通过喷雾干燥机干燥，制备粉末。进行所得粉末中含有成分的分析。蛋白质通过凯氏定氮法测定，氨基酸用氨基酸分析装置测定。由该蛋白质质量减去氨基酸，所得的量为肽量。脂类通过酸分解法、灰分通过直接灰化法、水分通过常压加热干燥法分别测定。从100°/。中减去各成分，所得的余量为碳水化合物量。结果氨基酸为35.8重量％,肽为45.7%重量，水分为6.6重量％,脂类为0.2重量％,灰分为4.1重量％,碳水化合物为7.6重量％。<构成肽的氨基酸的测定>将上述制备的粉末溶解于适量蒸馏水中，使用自动肽分析仪(商品名PPSQ-10(抹)岛津制作所制备)进行分析，在粉末中，由N末端一侧依次测定氨基酸的位置。自动肽分析仪无法检测游离氨基酸。第5个残基的氨基酸合计为120pmol，第6个残基的氨基酸合计为lOOpmol。由该结果判定，上述粉末中所含的肽的大部分是二肽和三肽。第2个残基的氨基酸为Pro的肽的比例为49.5%,显著升高。第3个残基的氨基酸为Pro的肽的比例为29.8%，也较多。因此，上述粉末中含有大量XaaProPro,这可以推测这些肽是对于生物体内蛋白酶的酶解作用抵抗性高的肽。'<酶解物中所含的肽的测定〉对于上述酶解物的粉末，使用各种化学合成标准肽，按照常规方法求出该粉末中所含的表1所示的三肽量。结果如表1所示。肽序列粉末10mg/mL中的三肽量(貼/mL)SerProPro2.9ValProPro29.5lieProPro28.1PheProPro27.2其它XaaProPro28.8将上述粉末用蒸馏水稀释溶解，所得溶液中的肽和游离氨基酸的量为8.15mg/mL，肽量为4.57mg/mL，该肽中的XaaPro量为514.5吗，13因此XaaPro相对于粉末中的肽和游离氨基酸的总量的比例为6.3重量%,并且该肽中XaaProPro量为116.5^g，因此XaaProPro相对于粉末中的肽和游离氨基酸的总量为1.4重量％。使用通过CM4抹使含有乳蛋白质的原料发酵得到的发酵乳，制备含有本发明的有效成分XaaProPro的动物饲料。将市售的脱脂乳粉用蒸馏水溶解，使固形成分比例为9%(w/w)，通过高压釜、在105。C下高温加热灭菌10分钟，然后冷却至室温，接种3。/。(v/w)CM4抹引子发酵液(菌数5x1()8个/ml)，在37。C在静置状态下发酵24小时，得到CM4发酵乳。将所得CM4发酵乳在80。C下灭菌，然后通过冷冻干燥获得粉末。所得冷冻干燥粉末与市售的粉末飼料(商品"CE-2"，日本夕！^T抹式会社制)按照质量比10:90混合，制备固形饲料，作为CM4发酵乳饲料。该饲料中含有来自CM4发酵乳的ValProPro34.1mg/kg和lieProPro17.1mg/kg。对三肽ValProPro(VPP)对于左心室壁肥厚的抑制效果进行试验。将7周龄、雄性Wistar系大鼠(日本工久工/k一林式会社)以每组9-12只共3组进行试验。驯化饲养一周后，使其自由摄取8周下述饮用水以1g/L的浓度溶解一氧化氮合成抑制剂NG-硝基-L-精氨酸曱基酯盐酸盐(L-NAME,Sigma社制)得到的饮用水、分别以1g/L和0.3g/L的浓度溶解L-NAME和VPP得到的饮用水、分别以1g/L和0.5mg/L的浓度溶解L-NAME和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂依那普利得到的饮用水。这里，依那普利给予量设定为与VPP和ACE抑制活性同等。大鼠是在乙醚麻醉下放血致死，摘除心脏后用10%中性緩冲福尔马林液固定。由固定的心脏水平切断心房的下部，包含右心室、中隔、左心室和冠状动脉，制成轮状的组织切片。将组织切片用石蜡包埋，然后用切片机切薄成3.0-3.5pm的厚度。各大鼠制备2-5个切片。将切薄的切片用苏木精/曙红染色，测定左心室壁的厚度。心室壁厚度的测定是对一个切片，在显微镜下通过目镜测微计实际测定被认为有平均厚度的多个点的厚度，以该平均厚度作为该切片的测定值，进行统计处理。厚度的测定和评<介由不知各样品名的病理学者进行。所得结果如图1所示。与只给予L-NAME的组相比，给予L-NAME和VPP的组左心室壁的厚度减小，显示VPP抑制左心室壁的肥厚，对心力衰竭的预防有效。另外，设定为具有同等的ACE抑制活性的给予量的依那普利未见效果，由此可以确认本效果不依赖于ACE抑制。为了确认三肽ValProPro(VPP)的右心室壁肥厚的抑制效果，与试-验l同样进行试^r,进行测定和评价。所得结果如图2所示。与只给予L-NAME的组相比，给予L-NAME和VPP的组左心室壁的厚度减小。因此，VPP抑制右心室壁的肥厚，对心力衰竭的预防有效。与试验1同样，依那普利未见效果，由此可以确认本效果不依赖于ACE抑制。对三肽lieProPro(IPP)对于心室壁肥厚的抑制效果进行试验。将7周龄、雄性Wistar系大鼠(日本工只工A少一抹式会社)以每组9-11只共3组进行试验。驯化祠养一周后，使其自由摄取8周下述饮用水以1g/L的浓度溶解L-NAME(Sigma社制)得到的饮用水、分别以1g/L和0.3g/L的浓度溶解L-NAME和IPP得到的饮用水、分别以1g/L和0.5mg/L的浓度溶解L-NAME和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂依那普利得到的饮用水。这里，依那普利给予量设定为与VPP和ACE抑制活性同等。大鼠是在乙醚麻醉下放血致死，摘除心脏后用10%中性緩冲福尔马林液固定。由固定的心脏水平切断心房的下部，4吏包含右心室、中隔、左心室和冠状动脉，制成轮状的组织切片。将组织切片用石蜡包埋，然后用切片机切薄成3.0-3.5jLim的厚度。各大鼠制备2-5个切片。将切薄的切片用苏木精/曙红染色，测定左心室壁的厚度。心室壁厚度的测定是对一个切片，在显微镜下通过目镜测微计实际测定被认为有平均厚度的多个点的厚度，以该平均厚度作为该切片的测定值，进行统计处理。厚度的领'J定和评价由不知各样品名的病理学者进行。所得结果如图3所示。与只给予L-NAME的组相比，给予L-NAME和IPP的组左心室壁的厚度减小，显示IPP抑制左心室壁的肥厚，对心力衰竭的预防有效。另外，设定为具有同等的ACE抑制活性的给予量的依那普利未见效果，由此可以确认本效果不依赖于ACE抑制。为了确认三肽lieProPro(IPP)的右心室壁肥厚的抑制效果，与试验3同样进行试验，进行测定和评价。将7周龄、雄性Wistar系大鼠(日本工只工A—林式会社)以每组9-12只共3组进行试验。驯化饲养一周后，使其自由摄取8周下述饮用水以1g/L的浓度溶解L-NAME(Sigma社制)得到的饮用水、分别以1g/L和0.3g/L的浓度溶解L-NAME和IPP得到的饮用水、分别以1g/L和0.5mg/L的浓度溶解L-NAME和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂依那普利得到的饮用水。这里，依那普利给予量设定为与IPP和ACE抑制活性同等。大鼠是在乙醚麻醉下放血致死，摘除心脏后用10%中性緩冲福尔马林液固定。由固定的心脏水平切断心房的下部，4吏包含右心室、中隔、左心室和冠状动脉，制成轮状的组织切片。将组织切片用石蜡包埋，然后用切片机切薄成3.0-3.5(xm的厚度。各大鼠制备2-5个切片。将切薄的切片用苏木精/曙红染色，测定右心室壁的厚度。心室壁厚度的测定是对一个切片，在显微镜下通过目镜测微计实际测定被认为有平均厚度的多个点的厚度，以该平均厚度作为该切片的测定值，确定各个体的心室壁的厚度。厚度的测定和评价由不知各样品名的病理学者进行。心室壁肥厚的判定是测定不加L-NAME、用通常的自来水祠养的相同周龄的6只大鼠的心室壁的厚度，以其平均作为基准值。心室壁的厚度比基准值大则为肥厚，相同或较低的厚度为正常，由有肥厚和正常的大鼠数进行似然比检验的比较。其结果如下表2所示。[表2]大鼠右心室壁肥厚的判定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>**:p<0.01通过所得结果可知，IPP抑制右心室壁的肥厚，IPP对于心力衰竭的预防也有效。另外，设定为同等的ACE抑制活性的给予量的依那普利未见效果，由此可确i人本效果不依赖于ACE抑制。为了确认三肽lieProPro(IPP)的心脏中隔壁肥厚的抑制效果，与试马全3同样进行试-验，进行测定和评价。所得结果如图4所示。与只给予L-NAME的组相比，给予L-NAME和IPP的组心脏中隔壁的厚度减小，显示IPP抑制心脏中隔壁的肥厚，对心力衰竭的预防有效。另外，设定为具有同等的ACE抑制活性的给予量的依那普利未见效果，由此可以确认本效果不依赖于ACE抑制。本发明的心脏壁肥厚抑制剂在血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂未见抑制作用的情形下也显示有效性，因此作为不依赖ACE抑制活性的心脏肥大或心力衰竭预防用和/或治疗用的药物、特别是作为预防剂非常有用。另外，有效成分是来自食品等的天然存在的三肽，因此副作用少，并且有望提供具有高效力的药物。通过将本发明的心脏壁肥厚抑制剂用于或添加到饮料或食品中，可以安全且日常摄取，提供有望获得预防心脏肥大和心力衰竭的效果的功能性食品。参考文献1.日本特许第2782142号公报2.AmJHypertens.1997Aug;10(8):913~203.J.Clin.Invest.77,1993-2000,19864.最新医学48:1404~1409，19935.J.DairySci.1995,78:777-7836.J.DairySci.1995,78:1253-12577.Am.J.Clin.Nutr.1996,64:767-77图1表示试验1的ValProPro(VPP)对大鼠左心室壁肥厚的抑制效果进行试验的结果。L-NAME给予组每组11只、L-NAME和依那普利给予组每组9只、L-NAME和VPP给予组每组12只进行试验，图表以平均值土标准误差表示。通过单侧t-检验进行比较。图中的符号(*)表示有显著差异(p0.05)。图2表示试验2的ValProPro(VPP)对大鼠右心室壁肥厚的抑制效果进行试纟全的结果。L-NAME给予组每组11只、L-NAME和依那普利给予组每组9只、L-NAME和VPP给予组每组12只进行试验，图表以平均值土标准误差表示。通过单侧t-检验进行比较。图中的符号(*)表示有显著差异(p0.05)。图3表示试验3的lieProPro(VPP)对大鼠左心室壁肥厚的抑制效果进行试验的结果。L-NAME给予组每组9只、L-NAME和依那普利给予组每组9只、L-NAME和IPP给予组每组11只进行试验，图表以平均值土标准误差表示。通过单侧t-检验进行比较。图中的符号(#)表示有显著差异(pO.l)。图4表示试马全5的lieProPro(VPP)对大鼠心脏中隔壁肥厚的抑制效果进行试验的结果。L-NAME给予组每组9只、L-NAME和依那普利给予组每组9只、L-NAME和VPP给予组每组11只进行试验，图表以平均值土标准误差表示。通过单侧t-检验进行比较。图中的符号(*)表示有显著差异(p0.05)。18权利要求1.心脏壁肥厚抑制剂，其含有XaaProPro作为有效成分。2.权利要求1所述的心脏壁肥厚抑制剂，其中，XaaProPro是ValProPro和/或HeProPro。3.权利要求1或2所述的心脏壁肥厚抑制剂，其中，XaaProPro来自动物乳酪蛋白水解物或其浓缩物。4.权利要求3所述的心脏壁肥厚抑制剂，其中，动物乳酪蛋白水解物是通过曲霉菌使动物乳酪蛋白发酵得到的发酵物。5.权利要求3所述的心脏壁肥厚抑制剂，其中，动物乳酪蛋白水解物是用来自曲霉菌的酶分解动物乳酪蛋白得到的分解物。6.权利要求5所述的心脏壁肥厚抑制剂，其中，来自曲霉菌的酶是来自米曲霉的酶。7.权利要求1或2所述的心脏壁肥厚抑制剂，其中，XaaProPro来自通过瑞士乳杆菌种的菌使含有乳蛋白质的原料发酵得到的发酵物。8.权利要求7所述的心脏壁肥厚抑制剂，其中，瑞士乳杆菌种的菌是瑞士乳杆菌CM4抹(FERMBP-6060)。9.心脏肥大预防剂，该心脏肥大预防剂含有权利要求1-8中任一项所述的心脏壁肥厚抑制剂作为有效成分。10.心力衰竭预防剂，该心力衰竭预防剂含有权利要求1-8中任一项所述的心脏壁肥厚抑制剂作为有效成分。11.功能性食品，该功能性食品含有权利要求1-8中任一项所述的心脏壁肥厚抑制剂。12.权利要求11所述的功能性食品，该功能性食品标记用于预防心力衰竭的效能。全文摘要本发明可提供具有心脏壁肥厚抑制作用的剂、以及含有上述剂的心力衰竭预防剂或有望获得心力衰竭预防效果的功能性食品。本发明的心脏壁肥厚抑制剂含有XaaProPro作为有效成分。文档编号A61K38/00GK101641113SQ20088000972公开日2010年2月3日申请日期2008年3月19日优先权日2007年3月27日发明者中村哲平,大木浩司,弘田辰彦,高野俊明申请人:卡尔皮斯株式会社