专利名称：含有活性物质的交联水凝胶的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于控制生物活性物质移动的生物相容性亚稳中间体材料，例如凝 胶，其中该中间体材料是交联的、活化的、灭菌的(优选高压灭菌(autoclaving)的)多 糖。本发明还涉及所述中间体材料的制备方法，以及其作为医疗器械和用于药物传输(drug delivery)的用途。另外，本发明涉及包括至少一种亚稳中间体材料和至少一种无菌生物活 性物质的药物传输系统(pharmaceutical delivery system)，该药物转运系统的制备方法 及其用于生物活性物质的给药的用途。本发明还涉及包括至少两种组分的试剂盒，其中第 一种组分是亚稳中间体材料或药物传输系统，第二种组分是生物活性物质。
背景技术：
对药物及医疗用品提出许多要求以将其视为安全，该要求的一种是无菌。首先，使 用热、辐射或气体或者其组合，通过消灭不需要的组分例如孢子、细菌与病毒，或者能够引 起这些组分的不期望生长的成分，以赋予产品无菌。其次，使用无菌过滤器(sterilizing filters)，以从不需要的组分分离活性物质。生物活性物质例如蛋白质和肽由于热、辐射或气体处理而将变性或变为失活。因 此，它们必须使用无菌过滤器、由于其大小而不适用于交联多糖例如凝胶的灭菌方式来灭 菌。因此，包含多糖载体例如凝胶和活性物质例如蛋白质或肽的药品(pharmaceutical product)不能以最终产品的形式进行灭菌。因而包含在药品中的全部组分必须在使它们组 合之前进行灭菌。通常，将需要无菌过滤(sterile filtration)的生物活性物质以固体供给，该固 体通过无菌溶剂(通常为静脉注射用无菌水)的方式来重构。通过给药该水溶液难以控制 活性物质的移动性和释放。存在已知的用于控制生物活性物质释放的方法，该生物活性物质例如Lupron Depot(TAP Pharmaceutical Products Inc. . Illinois, USA)(—禾中 # 方文 ffi 夕台 # 前列腺癌和子宫内膜异位的促性腺激素释放激素类似物的聚交酯-乙交酯共聚物 (polylactide-co-glycolide)微球配方)，包含填充有类固醇分散体的硅橡胶管的可植入 式避孕用诺普兰(Norplant) (the PopulationCouncil的注册商标)，其中药物释放通过管 壁内类固醇的渗透性来控制，并在几年内保持相当恒定，以及支架上的输药涂层，其中将药 物掺入涂层中并以特定方式释放，以实现确定的药理效应例如再狭窄的降低(http://WWW. ptca. org/des. html) 0多糖的水结合(Water-binding)凝胶在生物医药领域中广泛使用。它们通常通过 使聚合物化学交联为无限网络来制备。最广泛使用的医学用生物相容性聚合物之一是透明 质酸(一种多糖)。由于它存在于各生物体的相同组成中，因此它给予最小的副反应并使其 可用于高级的医学用途。其它生物相容性多糖是例如葡聚糖、藻酸盐和肝素。在*艮据 N. Kashyap, N. Kumar 禾口 Μ· N. V. Ravi Kumar 在 Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,22(2) 107-149(2005) , "Hydrogels forpharmaceutical and biomedicalapplications，，的综述中，描述 了水凝胶的优点禾口 缺点。水凝胶的优点是例如它们优良的组织相容性、容易操作和溶质渗透性(solute permeability)。水凝胶的一些显著的局限性代表它们的缺点，例如机械强度低、灭菌困难 和由交联剂造成的毒性。James R. Glass φ ^t Biomaterials, vol 17, pages 1101 — 1108， (1996), “Characterization of hyaluronic acid-Arg-GIy-Asp peptidecel1 attachment matrix”中描述了 BDDE (1，4-丁二醇二缩水甘油醚)交联透明质素(hyaluronan)和高碘酸 钠从而形成醛基的用途。US 2004/0077592公开了用于治疗剂输药的生物可降解载体，其中载体包含交联 多糖。该载体通过将具有醛基的第一多糖衍生物与第二多糖胺衍生物反应来制备，于是当 两种多糖交联时使载体成为凝胶状或海绵状的形状。通过在胶凝化或者从药物溶液的扩散 之前将治疗剂与衍生物之一混合，能够将治疗剂截留在凝胶/海绵之中。在通过将载体上 的醛基与该剂上的胺基反应形成凝胶或海绵之前，还能够将该剂共价结合至载体上。虽然 没有提及使终产物无菌的方式，但是能够假设用于制备载体的全部组分在混合和反应之前 必须是无菌的，这是因为这些步骤之后的灭菌不是可选择的。在US 2007/0149441 (Aeschlimarm等)中，描述了具有多种官能团的透明质酸的 化学改性的方法，这些官能团允许生理条件下透明质酸的交联。在该申请中，认识到以下方 法由于致使不被细胞识别的天然骨架结构的损失将降低最终交联凝胶的生物相容性，所述 方法包括例如通过使用高碘酸钠，并将其与天然HYA和一些生物活性分子组合来活化透明 质酸从而提供醛基。Aeschlimarm等在‘441中用相对复杂的工艺解决了此问题，该工艺包 括引入多种官能团从而促使期望的生物分子的交联与结合。在根据 Robert A. Peattie 等 在 Biomaterials, vol 27, issue 9, pages 1868-1875 ；(2006),"Dual growth factor-inducedangiogenesis in vivo using hyaluronan hydrogel implants”的文章中，描述了透明质素作为蛋白质/肽载体或基质的 用途，其中反应的全部步骤均在无菌条件下进行，并且由此制备的膜在无菌下贮藏至需要 时。还存在以下需要控制将其给药之后生物活性物质的移动性的改进的无菌传输方 式。同样地，存在以下需要包含生物活性物质的药物传输系统的改进的制备方法。
发明内容
本发明通过提供生物相容的无菌亚稳中间体材料，至少部分克服了现有技术方法 的缺点，该亚稳中间体材料能够用于控制生物活性物质的移动性。本领域技术人员在本申 请时已知可以活化具有醛基的多糖。这些基团存在时可以共价结合生物活性物质的胺基。 但是，认为通过不丧失活性即通过失去醛基和/或在不劣化凝胶至失去凝胶性能的程度的 高压灭菌，不能够灭菌该凝胶。在本发明的第一方面，提供生物相容性亚稳中间体材料，其中该中间体材料是交 联的、活化的、灭菌的(优选高压灭菌的)多糖，该多糖包含用于结合生物活性物质至期望 程度的醛基。在本发明的第二方面，提供亚稳中间体材料的制备方法。
在本发明的另一方面，提供将亚稳中间体材料作为医疗器械和用于药物传输的用 途。还在本发明的另一方面，提供生物相容性药物传输系统，用于控制至少一种生物 活性物质的移动性例如用于组织再生，该系统包括本发明的至少一种亚稳中间体材料和至 少一种无菌生物活性物质。在本发明的再一方面，提供药物传输系统的制备方法，该药物传输系统包括本发 明的至少一种亚稳中间体凝胶和至少一种无菌生物活性物质。仍在本发明的再一方面，提供用于生物活性物质给药的所述系统的用途。另外，在本发明的一方面，提供包括至少两种组分的试剂盒，其中第一种组分是本 发明的亚稳中间体材料或者本发明的药物传输系统，第二种组分是生物活性物质，优选无 菌。
具体实施例方式在第一方面，本发明涉及用于控制生物活性物质的移动性的生物相容性亚稳中间 体材料。该中间体材料是交联的、活化的、灭菌的(优选高压灭菌的)多糖，该多糖包含用 于结合生物活性物质的醛基。亚稳中间体材料在水溶液中是不溶性的。在本申请中，确定的术语和表达给出以下确定含义术语“活化的”用于描述交联多糖材料的性能，原因在于它含有意欲与其它分子例 如蛋白质和肽上的官能团(胺)反应的官能团(醛)。术语“活性醛基”应当解释为包含在 意欲用于在其它分子如蛋白质和肽上的胺基的共价结合中使用和反应的材料中包含的普 通醛基。因此，在本发明意义上的活性醛基不用于交联。关于“亚稳的”，我们意指贮藏时能够保持其性能并且还保持对确定分子反应性的 材料。关于“凝胶”，我们意指相互连接分子例如多糖分子的多孔网络，该多孔网络贯穿 (span)液体介质的容量且在液体介质中是不溶性的。关于“高压灭菌”，我们意指蒸汽灭菌法。关于“生物活性物质”，我们意指含有胺基的化合物，例如蛋白质和肽。亚稳中间体材料的多糖选自由以下组成的组葡聚糖、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、淀 粉、纤维素、透明质酸和其它葡萄糖氨基聚糖(glucoseaminoglycans)以及它们的衍生物， 优选透明质酸。术语透明质酸能够可互换地用透明质素替代，其中透明质酸以几种盐的形式存 在，例如透明质酸钠。根据本发明的第一方面的亚稳中间体材料的特征在于，是生物相容性的、交联的、 活化的和灭菌的(优选高压灭菌的)。这使得材料例如凝胶能够用作用于生物活性物质的 载体或基质，将该生物活性物质例如皮下或肌内给药至受试者，或者植入受试者。由于已知 当高压灭菌时透明质素降解以及当使用高碘酸钠氧化时也降解，意外的是透明质素的低度 交联材料能够氧化和高压灭菌，并且仍保持活化、保持其生物相容性和形态。尽管高度交联 的透明质素凝胶可以经受住氧化和高压灭菌，但最可能的是由于分子的高度改性而导致副 作用，由此较少地被活细胞识别。
优选亚稳中间体材料是凝胶。它可以是微粒或者构成膜。以微粒形式，它能够容 易地通过注射器注射。亚稳中间体材料还可以是另一由多糖制成的物理实体的形式，例如 心脏瓣膜(cardiac valve)，或者以使该实体变为生物相容性的方式涂布在物理实体上。由于根据本发明生产的亚稳中间体材料为已灭菌的(优选已高压灭菌的)，并且 贮藏一段时间而不显著失活，即，失去活性醛基，或者失去该材料的其它任何特性，因此可 以将其贮藏并运输至最终制造商或使用者。从制造的观点，与无菌制备的系统相比，本发明显著地简化了制造过程，增强了无 菌的保证和降低了药物传输系统的制备成本。本发明的亚稳中间体材料具有能够与具有胺基的化合物(例如肽和蛋白质)反应 的活性醛基。亚稳中间体进一步的特征是，在给药部位在延长时间内保持其能力，而使得 生物活性物质在例如眼或膝内、在外科部位或者在癌组织内局部作用，由此显示延长释放 (extended release)或缓释。根据本发明的第二方面，涉及亚稳中间体材料例如凝胶的制备方法，该方法包括 以下步骤a)交联多糖从而形成材料例如凝胶，或者提供例如凝胶形式的交联多糖；b)用氧化剂处理交联多糖材料，从而打开糖环并形成活性醛基；c)除去和/或中和未反应的交联剂(如果有)和氧化剂；d)将凝胶进行灭菌。优选通过高压灭菌进行步骤d)的灭菌。本领域技术人员知道如何交联多糖从而形成材料例如凝胶。优选使用含有公知 交联剂BDDE(1，4-丁二醇二缩水甘油醚)的NaOH溶液进行交联。交联凝胶还从公司例如 Q-Med AB(瑞典)商购获得。凝胶起初是否高压灭菌无关于本发明的方法。重要性在于调 节对材料例如凝胶进行随后处理的初始交联度，然而要慎重待之，从而保持其生物相容性。醛基的形成通过使用氧化剂，优选高碘酸钠，经多糖与高碘酸钠的反应来实现。氧 化剂的使用量依赖于凝胶的量、期望的活性醛基数量(活化度)和反应时间。通常，反应在 室温下进行，然而，也可以在其它温度下进行反应。强调的是，形成醛基的目的在于，能够共 价结合生物活性分子至亚稳中间体材料，而不将它们用于任意交联。在清洗步骤中，未反应的交联剂(如果有)和氧化剂通过使用水溶液的洗涤来除 去，该水溶液包含盐、缓冲剂、乙醇或者其组合。优选在清洗步骤中使用去离子水或者0. 9% m NaCl溶液。适合地通过使用在医药器械和制药工业方面通常的标准程序的蒸汽灭菌来进行 高压灭菌，优选在121°C下将高压灭菌进行20分钟。根据本发明，亚稳中间体能够以可再现的方式来生产，并且能够在进一步使用前 被表征和详细记录。本发明还允许生产具有不同交联度与活化度能用于不同目的的材料。 可以组合具有不同交联度与活化度的凝胶的组合，从而实现期望的持续时间和/或活性。在另一方面，本发明涉及亚稳中间体材料例如凝胶用作医疗器械和用于药物传输 的用途。该医疗器械的典型实例是支架、导管、软组织植入体和心脏瓣膜。对于药物传输， 可以使用该材料作为用于传输疫苗和药物(例如抗癌药、毒素、生长因子和抗生素)的载体 或基质。
还根据另一方面，本发明涉及用于控制至少一种生物活性物质的移动性的生物相 容性药物传输系统，该生物相容性药物传输系统包含至少一种亚稳中间体例如凝胶和至少 一种无菌生物活性物质，其中使生物活性物质共价结合至亚稳中间体凝胶。该体系可以包 括亚稳中间体材料例如凝胶，该亚稳中间体材料具有不同交联度和/或不同活化度，即不 同量的用于结合生物活性物质(例如蛋白质和肽)上胺基的活性醛基。生物活性物质的实 例是生长因子、癌症药、抗炎药、毒素和抗原。还可能的是除了任意共价结合物质之外，凝胶 还包含至少一种用于给药后的加强剂量(boost dosage)的非结合生物活性物质。由于许多蛋白质和肽非常昂贵，具有改进特性的本发明的亚稳中间体材料例如凝 胶的使用将失败的风险最小化，并因此降低了生产成本。再一方面，本发明涉及所述药物传输系统的制备方法，该方法包括以下步骤任选 地在用于进一步还原的还原剂的存在下，使至少一种无菌生物活性物质与至少一种亚稳中 间体材料接触，由此通过席夫碱的形成使生物活性物质共价结合至亚稳中间体凝胶的活性酸基。还原剂的使用使生物活性物质与亚稳中间体材料之间的键转变成在水性环境下 高度稳定和不容易水解的键。通过使用还原剂的所述键的转变要归因于化学平衡移向不能 被水解的键，从而生物活性物质将更牢固地结合至亚稳中间体材料。还原剂包括例如氰基 氢硼化物(cyanoborohydride)、氢硼化钠(sodiumborohydride)和抗坏血酸，其中在本发 明中优选抗坏血酸。使用抗坏血酸将给出即用型产物(ready-to-use product)而不用任 何进一步的纯化。优选在混合生物活性物质与亚稳中间体凝胶时或者该混合发生之后添加还原剂。包含在生物活性物质中的胺基越多，对凝胶的结合部位的数量就越高，使用还原 剂的需要也就越少。再一方面，本发明涉及所述系统用于生物活性物质的给药的用途。本发明的一个 重要特征是提供种类繁多的物质的局部沉积的可能性，该物质如果通过例如静脉注射法给 药将引起不期望的系统效应(systemic effects) 0特别地，在该物质在某些方面是有毒的 且毒性用于体内特定创伤部位的局部治疗时是这样的情况。典型实例是用于例如癌肿瘤治
疗的毒素。将具有不同交联和活化度的生物相容性亚稳中间体材料与结合至其的生物活性 物质组合使用(其中所得醛_胺键显示不同水解性(hydrolysability))，提供具有期望的 生物活性物质的释放性能的系统。一旦给药至受试者的体内，与具有高交联度的多糖材料 相比，具有低交联度的多糖材料降解地更快。因而由于其身体较快降解的能力，与其如果结 合至具有高交联度的材料相比，生物活性物质如果结合至具有低交联度的材料，将例如作 为加强剂量而从亚稳中间体材料更快释放。经过降解意味着产生亚稳中间体材料通过体内 过程而破坏。亚稳中间体材料的活化度还使其变得可以控制生物活性物质期望的释放性 能，这是因为存在的醛基越多，对于生物活性物质中胺基的结合部位的数量就越高。亚稳中 间体材料的醛与生物活性物质的胺之间键的水解性还给出用于控释活性物质的机理。该系统可以例如用于组织再生，该系统包括结合至亚稳中间体材料的生长因子 BMP(骨形态发生蛋白)，其中由于亚稳中间体材料例如凝胶在体内降解，因此BMP将在给药 后释放至受试者。该系统还可以例如使用在包括结合至亚稳中间体材料的抗原的疫苗中。
凝胶结合具有胺官能团的物质例如肽和蛋白质或者激素的能力将揭开与目前使 用方法相比具有潜在优良特性的整个应用领域。它还具有非常巨大的经济含意，这是因为用储存型(cbpottype)给药能够使剂量 率基本上得到降低。在现有技术方法的临床研究方面，可以显示从每周两个剂量到每月一 个剂量的速率的降低，即几乎90%的降低。对于例如与贫血相关联的生长激素或激素(它 们是非常昂贵的药物)而言，这将意味着显著的节省。结合蛋白质和其他复合物至根据本发明的材料例如凝胶的另外的巨大优点在于， 该物质能够实质上以它们的天然态使用，即不需化合物本身的改性。仅有的“改性”是指使 一些官能团用于结合至凝胶，但是一旦它从凝胶释放，该结合不影响此物质。仍根据本发明的另一方面，提供包含至少两种组分的试剂盒，该组分的第一种是 本发明的亚稳中间体材料或者本发明的药物传输系统，第二种是生物活性物质。亚稳中间 体材料可以是凝胶、膜，或者由所述材料制成的或涂布有所述材料的物理实体。药物传输系 统包括至少一种亚稳中间体材料和至少一种结合至凝胶的生物活性物质。另外，非结合生 物活性物质可以存在于亚稳中间体材料中，其中可以例如通过扩散将它引入材料中。可想到的是提供试剂盒，其中可以将例如亚稳中间体材料或药物传输系统提供于 管形瓶中，以及将生物活性物质提供于注射器中，以便使用前混合。另一可能的试剂盒可 以包括两个分别包含亚稳中间体或药物传输系统以及生物活性物质的注射器，其中通过连 接两个注射器来进行混合，并通过交替排空一个注射器至另一个注射器来混合它们的内容 物。本发明的试剂盒能够在贮藏至少六个月，优选更长时保持其性能。实施例实施例1 (活化凝胶的制备)使用布氏漏斗用0. 9%的NaCl溶液来洗涤Restylane SubQ(由Q_Med，Uppsala, Sweden制造并由此获得)。将约9. 7g洗涤的凝胶与9. 7g氧化剂高碘酸钠(在0. 9% NaCl 中为2. 3mM)溶液混合。将凝胶用0. 9% NaCl重复洗涤，然后在121°C下高压灭菌20分钟。 使用BCA (二辛可宁酸；从Pierce获得的蛋白质检测试剂)，通过改变颜色显示凝胶含有醛 基。而既未用高碘酸钠也未高压灭菌处理的洗涤的Sub Q凝胶没有显示可测的量的醛基的 迹象。作为氧化剂，将高碘酸钠添加至由交联透明质酸组成的凝胶Restylane Sub Q(由 Q-Med, Uppsala, Sweden制造并由此获得)。约40分钟之后，将混合物使用去离子水洗涤 数次。为了试验醛基活性，将品红的水溶液添加至洗涤的凝胶。在约25分钟后，用0.9% 的NaCl溶液重复洗涤凝胶。凝胶为深红色表示由于醛基的存在使品红结合至凝胶。没有 用高碘酸钠处理的凝胶仅略带颜色。实施钢丨3(交联丨疑胶的泡丨备禾Π氧补流泊个变杉舌仆,的景如向)使用BDDE将透明质酸钠交联以形成凝胶。在室温下，将凝胶块用不同量的高碘酸 钠(从0到40mg)处理40分钟，然后使用0. 9%的NaCl充分洗涤。使用BCA(由Pierce的 蛋白质检测试剂)，通过颜色改变显示在凝胶块中发现的醛基数量随着高碘酸钠的量的 增加而增加。
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在121°C下，将一组根据实施例3制备的凝胶块高压灭菌20分钟。用30至40mg 高碘酸钠处理的试样表现为粘性溶液而不是凝胶颗粒。然而，用高碘酸钠(即浓度为10至 20mg)活化的剩余试样仍然为凝胶形式，并根据BCA得知，试样保持活化，试样含有醛基。棚列5 (舶胸舌仆碰禾口縫仆碰齢隱·)将FITC-白蛋白溶液添加至在磷酸盐缓冲剂中的一种活化和一种非活化的透明 质素凝胶中。活化凝胶明显地呈黄色，表示FITC-白蛋白结合至凝胶。非活化凝胶是透明 的，几乎不显黄色。棚列6 (舶贴‘杯隨仆遍紐.碰劃糊齢)将FITC-白蛋白溶液添加至实施例4中生产的活化并高压灭菌的各凝胶中。用 20mg高碘酸钠处理的凝胶大多数呈黄色，而用0. 4mg高碘酸钠处理的凝胶呈最轻微的黄 色。
权利要求
一种生物相容性亚稳中间体材料，其用于控制至少一种生物活性物质的移动性，其特征在于，所述亚稳中间体材料为交联、灭菌的多糖，所述多糖包含能够结合生物活性物质至期望程度的醛基。
2.根据权利要求1所述的亚稳中间体材料，其特征在于，所述材料已通过高压灭菌来 灭菌。
3.根据权利要求1或2所述的亚稳中间体材料，其特征在于，所述多糖选自由以下组成 的组葡聚糖、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、淀粉、纤维素、透明质酸和其它葡萄糖氨基聚糖，以及 它们的衍生物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的亚稳中间体材料，其特征在于，所述多糖为透明质酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的亚稳中间体材料，其特征在于，所述材料为凝胶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的亚稳中间体材料，其特征在于，材料为至少部分 由所述材料制成的物理实体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的亚稳中间体材料，其特征在于，材料为全部由所 述材料制成的物理实体。
8.一种根据前述权利要求中任一项所述的亚稳中间体材料的制备方法，所述方法包括 以下步骤a)将多糖交联以形成材料，或者提供交联多糖材料；b)用氧化剂处理所述交联多糖材料，从而打开糖环并形成醛基；c)除去和/或中和未反应的交联剂和所述氧化剂；d)将所述凝胶进行灭菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤d)包括将所述凝胶进行高压灭菌。
10.一种根据权利要求1至7任一项所述的亚稳中间体材料作为医疗器械和用于药物 传输的用途。
11.一种生物相容性药物传输系统，其用于控制至少一种生物活性物质的移动性，所 述生物相容性药物传输系统包括至少一种根据权利要求1至7任一项所述的亚稳中间体 凝胶，和至少一种经所述材料中的醛基共价结合至所述亚稳中间体材料的无菌生物活性物 质。
12.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述生物活性物质为蛋白质或肽。
13.根据权利要求11或12所述的系统，其特征在于，所述生物活性物质为已灭菌的。
14.一种根据权利要求11至13任一项所述的系统的制备方法，所述方法包括以下步 骤使所述生物活性物质与所述亚稳中间体材料接触，其中所述生物活性物质经所述材料 中的醛基共价结合至所述亚稳中间体材料。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在还原剂的存在下，发生所述生物活性物质经 所述材料中的醛基与所述亚稳中间体凝胶的结合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述还原剂为氰基氢硼化物或氢硼化钠。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述还原剂为抗坏血酸。
18.根据权利要求11至13任一项所述的系统用于生物活性物质给药的用途。
19.一种试剂盒，所述试剂盒包含至少两种组分，其中第一种组分为根据权利要求1至7任一项所述的亚稳中间体材料或者根据权利要求11至13任一项所述的系统，第二种组分 为生物活性物质。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述生物活性物质为已灭菌的。
全文摘要
本发明涉及一种生物相容性亚稳中间体材料，其用于控制至少一种生物活性物质的移动性。本发明的实例是由交联透明质酸钠形成的水凝胶，该水凝胶用氧化剂处理从而打开糖环并形成醛基。根据本发明的凝胶例如通过高压灭菌来灭菌。
文档编号A61K47/36GK101918032SQ200880120932
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月21日
发明者乌鲁夫·温特, 尼努斯·卡拉姆-勒汉姆, 本格特·阿格鲁普 申请人:恩希瑟有限公司