LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途的制作方法

专利名称：LINGO-1和TrkB拮抗剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经学、神经生物学、分子生物学和药理学。更特别地，本发明涉及使 用LING0-1拮抗剂和TrkB激动剂促进神经元存活和再生的方法。此外，本发明涉及使用 LING0-1拮抗剂治疗压力诱导的视神经病变的方法。本发明还通常涉及使用LING0-1拮抗 剂增加TrkB活性并抑制JNK通路信号转导的方法。
背景技术：
视神经病变是包括各种临床表现和病因的一组眼部疾病。青光眼是示例性的视神 经病变，其包括在视神经上的病理变化，视神经乳头盘(optic disk)可见以及相应的视野 减小，如果不治疗会导致失明。青光眼与眼内压增加有关，但也涉及其他因素。目前对青光眼的治疗旨在减少眼内压。医学治疗包括减少眼内液的产生或增加眼 内液的流出的局部眼用滴剂或口服药物。然而对于青光眼的这些药物治疗有时伴随显著的 副作用，例如头痛、视觉模糊、变应性反应、由心肺并发症导致的死亡以及与其他药物的可 能的相互作用。也使用手术治疗，但是它们也具有许多缺点以及并不大的成功率。因此，有对另外的用于压力引起的视神经病变(包括青光眼和由视网膜神经节细 胞(RGC)的变性表征的其他病况)的治疗方法的需求。发明简述本发明是以神经元中LING0-1与TrkB相互作用并抑制TrkB的发现为基础的。眼 内高压后，TrkB配体脑源性神经营养因子(BDNF)被上调。BDNF促进TrkB磷酸化和细胞存 活信号转导通路的活化。然而在眼内高压后，LING0-1也被上调。本文所描述的实验使用 LING0-1拮抗剂以显示LING0-1抑制TrkB的磷酸化和活化，由此抑制细胞存活信号转导通 路。本文描述的实验还显示LING0-1促进与细胞死亡有关的JNK信号转导通路的活性。因 此LING0-1的拮抗剂和TrkB的激动剂促进细胞存活。以这些发现为基础，本发明通常涉及通过施用LING0-1拮抗剂抑制LINGO-1-TrkB 相互作用的方法。本发明还涉及通过施用LING0-1拮抗剂促进TrkB磷酸化和TrkB信号转 导的方法以及抑制JNK磷酸化和JNK信号转导的方法。而且，本发明涉及通过施用LING0-1 拮抗剂促进视网膜神经节细胞存活或者治疗压力诱导的视神经病变的方法。此外，本发明 涉及通过施用LING0-1拮抗剂和TrkB激动剂促进神经元细胞存活的方法。在某些实施方 式中，本发明涉及通过施用LING0-1拮抗剂和TrkB激动剂治疗与神经元细胞死亡相关的病 况的方法。在某些实施方式中，本发明包括抑制细胞中LING0-1和TrkB相互作用的方法，其 包括将共表达LING0-1和TrkB的细胞与LING0-1拮抗剂接触。在其他的实施方式中，本发 明包括促进细胞中TrkB磷酸化或TrkB通路信号转导的方法，其包括将共表达LING0-1和 TrkB的细胞与LING0-1拮抗剂接触。在某些其他的实施方式中，本发明包括促进TrkB磷酸 化的方法，其包括将CNS神经元与LING0-1拮抗剂接触。在某些实施方式中，本发明包括促进细胞中JNK磷酸化的方法，其包括将表达LING0-1和JNK的细胞与LING0-1拮抗剂接触。在其他实施方式中，本发明提供抑制JNK磷 酸化的方法，其包括将CNS神经元与LING0-1拮抗剂接触。在某些实施方式中，本发明包括促进处于死亡危险的神经元存活的方法，其包括 将神经元与有效量的ING0-1拮抗剂和TrkB激动剂接触。在其他的实施方式中，本发明包括促进显示压力诱导的视神经病变的体征或症状 的哺乳动物中视网膜神经节细胞存活的方法，其包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效 量的LING0-1拮抗剂和载体。本发明还包括治疗与神经元细胞死亡相关的疾病或病症的方 法，其包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的LING0-1拮抗剂和TrkB激动剂。在一 些实施方式中，哺乳动物已经被确诊为青光眼。在上文的方法的不同实施方式中，TrkB激动剂可以是增加TrkB促进神经元存活 的能力的任何分子。在某些实施方式中，TrkB激动剂选自由TrkB激动剂化合物、TrkB激 动剂多肽、TrkB激动剂抗体或其片段、TrkB激动剂多核苷酸、TrkB适体或者两种或更多种 TrkB激动剂的组合所组成的组。在某些实施方式中，TrkB激动剂是TrkB激动剂化合物。本发明的某些TrkB激动剂 化合物包括但不限于L-783，281腺苷和CGS21680。此外，TrkB激动剂化合物可以是模拟神 经营养蛋白的决定性区域的小分子。例如，小分子可决定性地为BDNF0-转角环(0-turn loop)的模拟物。可根据本发明使用的小分子模拟物的特定的实例公开于美国公开申请第 2007/0060526A1号，其通过引用全文引入本文。在某些实施方式中，TrkB激动剂是TrkB激动剂多肽。本发明的某些TrkB激动剂 多肽包括但不限于BDNF、NT-3和NT-4/5。在某些实施方式中，TrkB激动剂多肽包含SEQ ID N0:4。在一些实施方式中，TrkB激动剂是包含非TrkB-激动剂异源多肽或聚合物的融 合多肽或轭合物。在一些实施方式中，非TrkB-激动剂多肽或聚合物选自由聚乙二醇、1-酰 基-甘油衍生物和抗体Ig肽、血清白蛋白肽、靶向肽、报告肽和促进纯化的肽所组成的组。 在一些实施方式中，抗体Ig肽是铰链和Fc肽。在可选择的实施方式中，TrkB激动剂是与TrkB多肽结合的抗体或其片段。本发明 的方法中使用的扑1^激动剂抗体包括但不限于6￡2、7 5、1比1、16￡11、17011、19￡12、2907。在其他的实施方式中，TrkB激动剂是TrkB激动剂多核苷酸，例如编码肽或蛋白的 多核苷酸，或适体。在另外的实施方式中，TrkB激动剂是TrkB适体。TrkB适体是结合TrkB并促进 TrkB增加神经元存活的能力的小的多核苷酸。在上文方法的不同实施方式中，LING0-1拮抗剂可以是干扰LING0-1负调节神经 元存活和/或与TrkB结合和/或抑制或减少TrkB磷酸化的能力的任何分子。在某些实施 方式中，LING0-1拮抗剂选自由LING0-1拮抗剂多肽、LING0-1抗体或其片段、LING0-1拮抗 剂多核苷酸(例如RNA干扰)、LING0-1适体或者两种或更多种LING0-1拮抗剂的组合所组 成的组。在某些实施方式中，LING0-1拮抗剂多肽是可溶的LING0-1多肽。本发明的某些可 溶的LING0-1多肽包括但不限于包含或缺少下列结构域中的一个或多个的可溶的LING0-1 多肽(i)LING0-l富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域，(ii)LRR结构域C-端的LING0-1 碱性区，和(iii)LINGO-l免疫球蛋白(Ig)结构域。在一些实施方式中，可溶的LING0-1多肽缺少LINGO-lIg结构域、LING0-1LRR结构域、跨膜结构域和胞质结构域中的一个或多个。 本发明的另外的LING0-1可溶多肽包括缺乏跨膜结构域和胞质结构域的多肽。在一些实施 方式中，可溶的LING0-1多肽包含LING0-1LRR结构域但缺乏LINGO-lIg结构域、LING0-1碱 性区、跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施方式中，可溶的LING0-1多肽包含SEQ ID NO: 2的34-532或SEQ ID NO 2的36-532氨基酸残基。在一些实施方式中，LING0-1拮抗剂是包含非LING0-1拮抗剂异源多肽的融合多 肽。在一些实施方式中，非LING0-1拮抗剂多肽选自由抗体Ig多肽、血清白蛋白多肽、靶向 多肽、报告多肽和促进纯化的多肽组成的组。在一些实施方式中，抗体Ig多肽是铰链和Fc 多肽。在可选择的实施方式中，LING0-1拮抗剂是与包含下列LING0-1结构域中的一个 或多个的LING0-1多肽结合的抗体或其片段(i)LING0-l富含亮氨酸的重复序列(LRR) 结构域，(ii)LRR结构域C-端的LING0-1碱性区，和(iii)LING0-1免疫球蛋白(Ig)结 构域。另外，LING0-1拮抗剂抗体或其片段特异地结合含有如本文所描述的LING0-1多 肽片段的多肽中的表位。在另外的实施方式中，LING0-1拮抗剂抗体或其片段选自由 201 ‘、3A3、3A6、3B5、1A7、1D5、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1B1. 1F9、3P1D10. 2C3、3P1E11. 3B7、 3P2C6. 3G10. 2H7、3P2C9. 2G4、3P4A6. 1D9、3P4A1.2B9、3P4C2. 2D2、3P4C5. 1D8、3P4C8. 2G9、 6P4F4.lDs、6P4F4. 1F9、7P1D5.1G9、1B6.4、2C7.2、2D6. 1、2F7. 3、2H3.2、3C11.1、3E3.1、 3H11. 2、3G8. 1、2B8. 1、3B5. 230-C12 (LiOl)、38_D01(Li02)、35_E04 (Li03)、36_C09(Li04)、 30—All (Li05).34-F02 (Li06).29-E07(Li07)、34—G04(Li08)、36—A12(Li09)、 28-D02(Lil0)、30-B01 (Li 11)、34—B03 (Li 12)、Lil3、Li32、Li33、Li34、3383 (Lla. 1)、 3495 (Lla. 2)、3563(Lla. 3)、3564(Lla. 4) ,3565 (Lla. 5) ,3566 (Lla. 6) ,3567 (Lla. 7)、 3568 (Lla. 8) ,3569 (Lla. 9) ,3570 (Lla. 10) ,3571 (Lla. 11) ,3582 (Lla. 12)、1968 (Lla. 13)、 3011、3012、3013、3418、3422、3562、D05、D07、D08、D10 和 Dll 组成的组。LING0-1 拮抗剂可 以是这些抗体中的任一种的抗原结合片段或者两种或更多种抗体或其片段的组合。在其他的实施方式中，LING0-1拮抗剂是LING0-1拮抗剂多核苷酸，例如反义多核 苷酸、适体、核酶、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。在另外的实施方式中，LING0-1拮抗剂是LING0-1适体。LING0-1适体是结合 LING0-1和干扰LING0-1与TrkB相互作用和/或促进或增加TrkB磷酸化的小的多肽或多
核苷酸。在上文方法的一些实施方式中，TrkB激动剂和/或LING0-1拮抗剂通过包含下列 步骤的方法施用(a)向CNS神经元引入通过与表达控制序列可操作连接的编码TrkB激动 剂和/或LING0-1拮抗剂的多核苷酸；和(b)允许所述TrkB激动剂和/或LING0-1拮抗剂 的表达。在一些实施方式中，CNS神经元是在哺乳动物中并且所述引入包括(a)向所述哺乳 动物施用通过与表达控制序列可操作连接的编码TrkB激动剂和/或LING0-1拮抗剂的多 核苷酸。在一些实施方式中，培养的宿主细胞来源于有待被治疗的哺乳动物。在某些实施 方式中，多核苷酸通过转染、电穿孔、病毒转导或直接的显微注射被引入宿主细胞或CNS神 经元。在某些实施方式中，TrkB激动剂和/或LING0-1拮抗剂是可在疾病、病症或损伤的 部位或附近向哺乳动物施用的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸作为表达载体被施用。在一些实施方式中，载体是病毒载体，其选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠病毒载体、 瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体(例如埃巴病毒载体(Epstein Barr viral vector)或单纯疱疹病毒载体)、乳多空病毒载体、痘病毒载体(例如牛痘病毒载体) 和细小病毒组成的组。在一些实施方式中，载体通过选自由局部施用、眼内施用和胃肠外施 用(例如静脉内的、动脉内的、肌肉内的、心内的、皮下的、真皮内的、鞘内的、腹膜内的)所 组成的组的路线施用。


图1A和B-概括实施例中使用的2周(图1A)和4周(图1B)的实验性眼内高压 模型的图示。图2-显示在视网膜裱片(flat-mounted retinas)中定量视网膜神经节细胞 (RGC)所用的切片的图示。在200X200P m2的目镜网格下沿着每一象限的中线从视神经盘 (optic disc)开始至边缘处以500 iim的间隔定量RGC。图3-激光凝固前(顶部)和之后立即(底部)的房水静脉图像。图4A和B-正常和受伤的大鼠视网膜切片中LING0-1的表达。图5-正常和受伤的大鼠视网膜中LING0-1的蛋白质印迹和其定量。图6-用 PBS、对照蛋白、抗 LING0-1 抗体(1A7)或可溶的 LING0-1 (LINGO-l-Fc)治 疗的左眼(正常的)和右眼(受伤的)中的眼内压测量。图7A和B-受伤并用PBS、对照蛋白、1A7或LINGO-1-Fc治疗两周和四周后存活的 RGC的数目(图7A)和密度(图7B)的定量。图8A和B-用PBS、LING0-1-Fc或1A7治疗的正常的动物和受伤的动物中RGC(图 8A)和内网层的细胞(图8B)中的微结构的图像。图9-体外生长并暴露于对照蛋白、LINGO-1-Fc、BDNF和对照蛋白或BDNF和 LINGO-1-Fc的存活的RGC的定量。图10-正常视网膜中、受伤但没有治疗的视网膜中和受伤并用PBS、LING0-1-Fc或 1A7治疗的视网膜中的BDNF的蛋白质印迹和其定量。图 11A 禾口 B-用 PBS、抗 BDNF 抗体、1A7、1A7 禾口 抗 BDNF 抗体、LINGO-1-Fc 或 LINGO-1-Fc和抗BDNF抗体治疗的受伤的眼睛中RGC的数目(图11A)和密度(图11B)的定量。图12A和B-来自共表达TrkB和LING0-1的293细胞的抗LING0-1免疫沉淀物中 TrkB和LING0-1的蛋白质印迹(图12A)。来自具有和不具有LING0-1表达并且具有和不 具有BDNF刺激的细胞的抗TrkB免疫沉淀物中磷酸-TrkB、总TrkB和LING0-1的蛋白质印 迹和其定量(图12B)。图13A和B-来自正常的和受伤的视网膜溶解产物的抗TrkB、抗LING0-1和抗对照 蛋白免疫沉淀物中LING0-1的蛋白质印迹(图13A)。视网膜切片中的LING0-1和磷酸-TrkB 免疫染色(图13B)。图14A和B-用PBS、LINGO-1-Fc或1A7治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的磷 酸-TrkB和总TrkB的蛋白质印迹和其定量(图14A)。用BDNF、BDNF和LINGO-1-Fc或BDNF 和1A7治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的磷酸-TrkB和总TrkB的蛋白质印迹(图14B)。
图15-用或不用LINGO-1-Fc治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的磷酸_Akt和总 Akt的蛋白质印迹和其定量。图16-视网膜切片中的pAkt免疫染色。图17六和8-用？85、1^294002( 131(/^肚通路的抑制剂)丄1呢0-1呼(；或1^294002 和LINGO-1-Fc治疗的受伤的眼睛中RGC的数目(图17A)和密度(图17B)的定量。图18-用LINGO-1-Fc和LY294002或LY294002单独治疗的左眼(正常的)和右 眼(受伤的)中的眼内压测量。图19-正常的眼睛和用PBS、LINGO-1-Fc和1A7治疗的受伤的眼睛中的磷 酸-JNK-2、磷酸-JNK-1、总JNK-2和总JNK-1的蛋白质印迹和其定量。图20-显示建议的分子机制的图示。眼内压的升高导致LING0-1和BDNF的水平 增加。BDNF促进TrkB的磷酸化和细胞存活信号转导通路的活化，但是LING0-1抑制这一 活性。LING0-1拮抗剂例如1A7或LINGO-1-Fc通过干扰LING0-1阻止响应于BDNF信号转 导的TrkB磷酸化的能力来促进细胞存活。图21-用PBS或LINGO-1-Fc治疗的正常的眼睛和受伤的眼睛中的GTP-RhoA和总 RhoA的蛋白质印迹和其定量。发明详述定义除非另外说明，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域 的普通技术人员所通常理解的相同含义。矛盾的情况下，以本申请包括的定义为准。除非 内容上另外要求，否则单数的术语将包括复数形式而复数的术语将包括单数形式。本文提 及的所有出版物、专利和其他参考文献为所有目的通过引用全文并入本文，如同明确并单 独地指示每个单独的出版物或专利申请通过弓I用并入本文。尽管与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可用来实行或检测本发明，但下 文描述了适合的方法和材料。材料、方法和实施例仅是示例性的并不意为限制性的。从详 细的描述和权利要求书来看本发明的其他特征和优点将是明显的。 为了进一步定义本发明，提供了下列术语和定义。应注意术语“一” (a)或“一” (an)实体是指一个或多个那种实体；例如“免疫球蛋 白分子”应理解为代表一个或多个免疫球蛋白分子。像这样，术语“一” (a)(或“一”(an))、 “一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。整个说明书和权利要求中，词语“包含”(comprise)或其变化形式例如“包 含”(comprises)或“包含” (comprising)表明包括所叙述的任何整体或整体的组而不排除 任何其他的整体或整体的组。术语“包含”是包含的或开放的，并不排除另外的、未叙述的
元素或方法步骤。短语“主要由......构成”表明包括特定的材料或步骤以及不实质上影
响权利要求所要求的本发明的基本的和新的特征的那些材料或步骤。如本文所用的，术语 “组成”仅指表明的材料或方法步骤。如本文所用的“治疗有效量”是指以必要的剂量和时间段对获得所期望的治疗结 果有效的量。治疗结果可以是例如，症状的减轻、延长的存活、改善的活动性以及类似结果。 治疗结果不必为“治愈”。如本文所用的，术语“治疗” (treatment)或“治疗” (treating)是指向动物施用药剂以便改善或减轻疾病的症状。此外，术语“治疗”(treatment)或“治疗”(treating)是 指向动物施用药剂以阻止疾病的发展。如本文所用的，“预防有效量”是指以必要的剂量和时间段对获得所期望的预防结 果有效的量。通常，由于预防剂量在疾病之前或疾病的早期用于受治疗者，预防有效量将少 于治疗有效量。如本文所用的，“多核苷酸”可包括全长eDNA序列的核酸序列并且可包括核酸序列 的未翻译的5’和3’序列、编码区或者片段或变体。多核苷酸可包括任何多聚核糖核苷酸 或多聚脱氧核糖核苷酸，所述多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸可以是未修饰的RNA 或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可包括单链或双链DNA、为单链区和双链区的 混合物的DNA、单链或双链RNA、和为单链区和双链区的混合物的RNA、含有DNA和RNA的杂 交分子，所述杂交分子中的DNA和RNA可以是单链的或通常为双链的或单链区和双链区的 混合物。此外，多核苷酸可包括包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。多核苷酸还 可含有一种或多种修饰的碱基或为了稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰 的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基或不常见碱基例如肌苷。可对DNA和RNA进行各种修 饰；因此“多核苷酸”包括化学修饰、酶促修饰或代谢修饰的形式。在本发明中，“多肽”可包括通过肽键或修饰的肽键即肽电子等排体彼此连接的氨 基酸并且可包括20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸(即非天然存在的氨基酸)。如描 述本发明所用的，术语“肽”和“多肽”可互换使用。本发明的多肽可通过天然过程例如翻 译后加工或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰。在教科书、更加详细的专题论文以 及大量的研究文献中描述了这种修饰。修饰可在多肽中任何地方发生，包括肽主链、氨基酸 侧链和氨基或羧基端。应当理解的是在给定的多肽中相同类型的修饰可以相同或不同的程 度在多个位点存在。并且，给定的多肽可包含许多类型的修饰。多肽可以是支链的，例如 作为泛素化的结果，并且它们可以是具有或不具有分支的环状的。环状的、支链的和支链环 状的多肽可从翻译后的天然过程获得或通过合成的方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP 核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共 价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、 去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、Y羧基化、糖基化、 GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异 戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白加入氨基酸例如精氨酰化、和泛素 化(参见,例如Proteins-Structure and MolecularProperties (蛋白结构和分子特性)第 2 版，T. E. Creighton, ff. H. Freeman and Company, New York(1993) ；Posttranslational CovalentModification of Proteins (蛋白的翻译后共价修饰)，B. C. Johnson 编 辑，Academic Press, New York,第 1-12 页(1983) ；Seifter 等人，MethEnzymol 182 626-646(1990) ；Rattan 等人，Ann NY Acad Sci 663 :48_62 (1992))。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”在指本发明的LING0-1拮抗剂或TrkB 激动剂时包括保持至少一些抑制LING0-1活性或促进TrkB活性的能力的任何拮抗剂或激 动剂分子。只要LING0-1拮抗剂或TrkB激动剂仍起到其作用，如本文所描述的LING0-1拮 抗剂和TrkB激动剂可无限制地包括片段、变体或衍生物分子。本发明的LING0-1拮抗剂或 TrkB激动剂多肽可包括LING0-1或TrkB-激动剂蛋白水解片段、缺失片段、和特别是当递送至动物时更容易到达作用位点的片段。多肽片段还包括包含天然多肽的抗原表位或免疫表 位(包括线性以及三维表位)的多肽的任何部分。本发明的LING0-1或TrkB-激动剂多肽 可包含变异的LING0-1或TrkB-激动剂区(包括如上文所描述的片段)，以及由于氨基酸 取代、缺失或插入而具有变化的氨基酸序列的多肽。变体可天然存在，例如等位基因变体。 通过“等位基因变体”意指占据生物体的染色体上给定的基因座的基因的不同形式。Genes II(基因 II)，Lewin，B.编辑，John Wiley & Sons，New York(1985)。非天然存在的变体可 使用领域已知的诱变技术产生。LING0-1或TrkB-激动剂多肽可包含保守的或非保守的氨 基酸取代、缺失或添加。本发明的LING0-1拮抗剂或TrkB激动剂还可包括衍生物分子。例 如，本发明的LING0-1或TrkB激动剂多肽还可包括已被改变的LING0-1或TrkB激动剂区 以便表现在天然多肽未发现的另外的特征。实例包括融合蛋白和蛋白轭合物。在本发明中，“多肽片段”是指LING0-1或TrkB-激动剂多肽的短的氨基酸序列。 蛋白片段可以是“独立式的”或包含在所述片段形成其部分或区域的更大的多肽中。本发 明的多肽片段的代表性的实例包括例如包含长度为约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个 氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、 约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸和约100个氨基酸或者更多的片段。在一些实施方式中，用于本文公开的方法中的LING0-1拮抗剂或TrkB激动剂是 “抗体”或“免疫球蛋白”分子或其免疫特异性片段，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子 或以与抗体分子类似的方式结合抗原的工程抗体分子或片段。术语“抗体”和“免疫球蛋 白”在本文互换使用。此外，用于本发明方法中的免疫球蛋白分子也描述为“免疫特异性” 或“抗原特异性”或“抗原结合”分子，并可互换使用以指抗体分子和其片段。抗体或免疫 球蛋白包含至少重链的可变结构域并且通常包含至少重链和轻链的可变结构域。脊椎动 物系统中基本的免疫球蛋白结构是相对充分理解的。参见例如Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual (抗体实验手册)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二 版.1988)，其通过引用并入本文。如下文更详细地讨论的，术语“免疫球蛋白”包括生物化学上区分的五大类型的多 肽。所有五个类型清楚地在本发明的范围中，下列讨论将通常针对IgG类的免疫球蛋白分 子。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两个相同的分子量约23，000道尔顿的轻链多肽 和两个相同的分子量53，000-70, 000的重链多肽。四个链通常通过二硫键以“Y”构型连接， 其中轻链托住起始于“Y”的开口处并且持续整个可变区的重链。重链和轻链分为结构和功能同源的区。就其功能使用术语“恒定的”和“可变的”。 在这一点上，应当理解的是轻链的可变结构域和重链的可变结构域(VH)部分确定抗原 识别和特异性。相反，轻链的恒定区(⑦和重链的恒定结构域((^、(^或^^)赋予重要 的生物学特性，例如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合和类似特性。按照惯例， 恒定区结构域的编号随它们变得离抗原结合位点或抗体的氨基端更远而增加。N端部分是 可变区而C-端部分是恒定区；Ch3和Q结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。轻链分为kappa或lambda ( k，入)。每种重链类型可与k或入轻链结合。通常， 当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或遗传工程宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合并 且两个重链的“尾”部通过共价的二硫键合或非共价键合彼此结合。在重链中，氨基酸序列 从位于Y构型的叉状末端的N-端延伸至位于每条链的底部的C-端。本领域技术人员将理解的是，重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon( y、！i、a、S、e ),其中有一些亚类 (例如Y 1-Y4)0重链的性质决定抗体的“类型”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫 球蛋白亚类(同种型)例如IgA、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi等也是充分表征的并且已知赋予功 能特化。根据本公开内容，这些类型和同种型中的每一个的修饰形式对本领域技术人员来 说是容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。如上文所表明的，可变区允许抗体选择性地识别并特异地结合抗原上的表位。也 就是说，抗体的\结构域和VH结构域组合形成定义三维的抗原结合位点的可变区。这一四 级抗体结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由在VH 和八链中的每一个上的三个互补决定区(⑶R)界定。在一些实例，例如一些来源于骆驼物 种的免疫球蛋白分子或以骆驼免疫球蛋白为基础工程化的免疫球蛋白分子中，完整的免疫 球蛋白分子可仅由重链组成，没有轻链。参见例如Hamers-Casterman等人，Nature363 446-448(1993)。在天然存在的抗体中，存在于每个抗原结合结构域中的六个“互补决定区”或 “CDR”是短的、不连续的氨基酸序列，其当抗体在水环境中呈现其三维构型时特异地放置 以形成抗原结合结构域。称为“框架”区的抗原结合结构域中其余的氨基酸显示出较小 的分子间变异性。框架区主要采用折叠构型而CDR形成连接并且在某些情况下形成 部分折叠结构的环。因此框架区起到形成提供通过链间的非共价反应以正确的方向 放置CDR的支架的作用。通过所放置的CDR形成的抗原结合结构域界定与免疫反应性 抗原上的表位互补的表面。这一互补的表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。对于 任何给定的重链或轻链可变区来说，分别构成CDR和框架区的氨基酸可由本领域的普通 技术人员容易地鉴定，因为它们已经被明确地定义(参见“Sequences of Proteins of Immunologicallnterest (免疫上重要蛋白的序列)，，Kabat，E.等人，U. S. Departmentof Health and Human Services, (1983)；禾口 Chothia 禾口 Lesk， J. Mol.Biol. , 196 901-917(1987)，其都通过引用全文并入本文)。然而，在骆驼物种中，称为VhH的重链可变区形成整个⑶R。骆驼VhH可变区和源 自普通抗体的可变区(VH)之间的主要差异包括(a)与VhH中相应的区相的轻链接触 面的疏水氨基酸更多，(b)VHH中的⑶R3较长，以及(c)在VhH中的⑶R1和⑶R3之间频繁 出现二硫键。在一些实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含抗体分子的至少一 个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含至少两 个来自一个或多个抗体分子的CDR。在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结 合分子包含至少三个来自一个或多个抗体分子的CDR。在另一个实施方式中，本发明的方 法中使用的抗原结合分子包含至少四个来自一个或多个抗体分子的CDR。在另一个实施方 式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含至少五个来自一个或多个抗体分子的CDR。 在另一个实施方式中，本发明的方法中使用的抗原结合分子包含至少六个来自一个或多个 抗体分子的⑶R。包含可包括在主题抗原结合分子中的至少一个⑶R的示例性的抗体分子 是本领域已知的并且本文描述了示例性分子。本发明的方法中使用的抗体或其免疫特异性片段包括但不限于多克隆的、单克 隆、多特异性的、人类的、人源化的、灵长类化的或嵌合的抗体，单链抗体、表位结合片段例
19如，Fab、Fab'和 F(ab' )2、Fd、Fv、单链 Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的 Fv(sdFv)、包 含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗个体基因型(抗Id)抗体(包 括例如本文所公开的结合分子的抗Id抗体)。ScFv分子是本领域中已知的并且被描述于 例如美国专利5，892，019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任 何型(例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、类(例如 IgG” IgG2、IgG3、IgG4、IgA,和 IgA2) 或亚类。包括单链抗体的抗体片段可包含单独或与下列的整体或部分组合的可变区铰链 区、重链的CH1、CH2和Ch3结构域、或轻链的Q。本发明还包括的是还包含可变区与铰链区、 CH1、Ch2、Ch3或Q结构域的任何组合的抗原结合片段。本文公开的方法中使用的抗体或 其免疫特异性片段可来自包括鸟类和哺乳动物的任何动物来源。抗体可以是人类、鼠、驴、 兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马、或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区在来源上可以是 condricthoid(例如来自鲨)。如本文所用的，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白的氨基 酸序列的抗体，并包括从人类免疫球蛋白文库或从以一种或多种人类免疫球蛋白转基因 并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，如下文描述的并且例如Kucherlapati等 人的美国专利第5，939，598号中的。这种抗体还包括含有一个或多个氨基酸取代的变体。如本文所用的，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含 重链部分的多肽包含下列中的至少一个CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结 构域、Ch2结构域、Ch3结构域或其变体或片段。例如，重链部分可包括包含CH1结构域的多 肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和Ch2结构域的多肽链；包含CH1结构域和 CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链；或 包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、Ch2结构域和Ch3结构域的多肽链。重链部分 也可包括包含含有Ch3结构域的多肽链的多肽。此外，本发明中使用的结合多肽可缺少Ch2 结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或部分)。如上文所展示的，本领域普通技术 人员应理解的是，这些结构域(例如重链部分)可被修饰以便它们在氨基酸序列上不同于 天然存在的免疫球蛋白分子。在本文所公开的方法中使用的一些LING0-1拮抗剂或TrkB激动剂抗体或其免疫 特异性片段中，多聚体的一个多肽链的重链部分可与多聚体的另一多肽链上的那些相同。 可选择地，本发明的方法中使用的含有重链部分的单体是不相同的。例如每个单体可包含 不同的靶向结合位点，形成例如双特异性抗体。在本文所公开的方法中使用的结合多肽的重链部分可来源于不同的免疫球蛋白 分子。例如，多肽的重链部分可包含来源于IgGi分子的CH1结构域和来源于IgG3分子的铰 链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgA分子并且部分来源于IgG3分子的 铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来源于IgA分子并且部分来源于IgG4分子 的嵌合的铰链区。如本文所用的，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链 部分可包含\或Q结构域的至少一个。编码来源于免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然 变体的分离的核酸分子可通过向免疫球蛋白的核苷酸序列引入一个或多个核酸取代、添加 或缺失，以致一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入编码的蛋白来产生。通过标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变可引入突变。保守的氨基段取代可在一个多个非必需氨基 酸残基进行。还以对本发明的多肽的结合亲和力的方式描述或详细说明本文公开的方法中 使用的抗体或其免疫特异性片段。在某些实施方式中，结合亲和力是具有小于5X10_2M、 1(T2M、5X 1(T3M、1(T3M、5X 1(T4M、1(T4M、5X 1(T5M、1(T5M、5X 1(T6M、1(T6M、5X 1(T7M、1(T7M、 5X 1(T8M、1(T8M、5X 1(T9M、1(T9M、5X 1(T10M、1(T10M、5X 10-11] 、10-11]\1、5\ 1(T12M、1(T12M、 5 X 10_13M, 10_13M,5 X 10_14M, 10_14M,5 X 10_15M ^ 10_15M 的解离常数或 Kd 的那些。如本文描述的，本文公开的方法中使用的抗体或其免疫特异性片段作为LING0-1 的拮抗剂或TrkB的激动剂起作用。例如，本发明的方法中使用的抗体可作为阻滞或抑制 LING0-1多肽的抑制活性的拮抗剂或作为促进TrkB的活性的激动剂起作用。如本文所用的，术语“嵌合抗体”将适用于意指其中免疫反应性区或位点获得或来 源于一种物种而恒定区(依照本发明其是完整的、部分的或修饰的)获得于另一种物种的 任何抗体。在某些实施方式中，靶向结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类) 而恒定区是人类的。如本文所用的，术语“工程化抗体”是指这样的抗体，其中重链或轻链或者两者中 的可变结构域通过来自已知特异性的一个或多个CDR的至少部分替代并且如果必要的话 通过部分的框架区替代和序列变化而改变。虽然CDR可来源于与框架区源自的抗体相同类 或者甚至亚类的抗体，设想CDR将来源于不同类的抗体或来自来源于不同物种的抗体。其 中来自已知特异性的非人类抗体的一个或多个“供体”CDR被嫁接到人类重链或轻链框架区 中的工程化抗体在本文称为“人源化抗体”。不必用来自供体可变区的完整CDR替代所有 的CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个。相反地，只需要转移对维持靶 向结合位点的活性来说必要的那些残基。考虑到在例如美国专利第5，585，089,5, 693，761、 5，693，762和6，180，370中展示的解释，通过进行常规实验或通过试错试验以获得功能性 工程化或人源化抗体在本领域技术人员的能力之内。如本文所用的，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通 过包括化学共轭或重组方法的任何方法将两个或更多个元件或成分连接在一起。“框内融 合”是指将两个或更多个开放读码框(0RF)以保持原始0RF的正确读码框的方式连接以形 成连续的更长的0RF。因此，所得的重组的融合蛋白是含有与由原始0RF编码的多肽(其片 段天然不是正常地如此连接的)相符的两个或多个片段的单一的蛋白。尽管整个融合片段 中读码框因此为连续的，但片段可以是物理上或空间上由例如框内连接序列分隔的。对于多肽来说，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基端到羧基端方向的氨基酸的 顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。如本文所用的术语“表达”是指DNA序列用于产生生物化学物质例如RNA或多肽 的过程。所述过程包括细胞中功能性存在的基因的任何表现，包括但不限于基因敲除以及 瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于基因转录为信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发 夹RNA (shRNA)、小干扰RNA (siRNA)或任何其他的RNA产物以及这种mRNA翻译为多肽。如 果最终所期望的产物是生物化学物质，表达包括生物化学物质和任何前体的产生。“受治疗者”或“个体，，或“动物，，或“患者”或“哺乳动物，，意指期望对其诊断、预 后或治疗的任何受治疗者，尤其是哺乳动物受治疗者。哺乳动物受治疗者包括但不限于人类、家畜、农场动物、动物园动物、体育动物(sport animals)、宠物动物例如犬、猫、豚鼠、仓 鼠、兔、大鼠、小鼠；灵长类动物例如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物例如狐狸和狼；猫科动 物例如狮子和老虎；马科动物例如马、驴和斑马；食用动物例如牛、猪和绵羊；有蹄动物例 如鹿和长颈鹿；熊等等。在一些实施方式中，哺乳动物是人类受治疗者。术语“RNA干扰”或“RNAi ”是指通过siRNA沉默或减少基因表达。其是在动物和 植物中序列特异性的转录后的基因沉默过程，由在双链区与所沉默的基因同源的siRNA起 始。基因可以是生物体内源或异源的，整合在染色体中或存在于没有整合至基因组中的转 染载体中。基因的表达可以被完全或部分抑制。还可认为RNAi抑制了靶RNA的功能；靶 RNA的功能可以是完全或部分的。LING0-1(Sp35/LRRN6)天然存在的人类LING0-1是糖基化的神经系统特异的蛋白，其由614个氨基酸 (SEQ ID NO 2)组成。人类LING0-1多肽含有由14个富含亮氨酸的重复序列组成的LRR结 构域(包括N-端帽和C-端帽)、Ig结构域、跨膜区和胞质结构域。胞质结构域含有标准的 酪氨酸磷酸化位点。此外，天然存在的LING0-1蛋白含有信号序列、LRRCT和Ig结构域之间 的短的碱性区以及Ig结构域和胞质结构域之间的跨膜区。人类LING0-1含有可选的翻译起 始密码子，以致六种另外的氨基酸(MQVSKR ；SEQ ID NO 7)可在LING0-1信号序列的N-端 存在或不存在。根据氨基酸残基数目，以SEQ IDN0:2的序列为基础，表1列出了 LING0-1 结构域和其他区。如本领域技术人员应理解的，下文所列的结构域的起始残基和终止残基 可取决于确定结构域所使用的计算机建模程序或所使用的方法而变化。LING0-1多肽被更 详细地表征于PCT公开第W02004/085648号和美国公开专利申请第2006/0009388A1号中， 其通过引用全文并入本文。表 权利要求
一种抑制细胞中LINGO 1和TrkB相互作用的方法，包括将共表达LINGO 1和TrkB的细胞与LINGO 1拮抗剂接触。
2.一种促进细胞中TrkB磷酸化的方法，包括将共表达LING0-1和TrkB的细胞与 LING0-1拮抗剂接触。
3.一种促进TrkB磷酸化的方法，包括将CNS神经元与LING0-1拮抗剂接触。
4.一种抑制细胞中JNK磷酸化的方法，包括将共表达LING0-1和JNK的细胞与LING0-1 拮抗剂接触。
5.一种抑制JNK磷酸化的方法，包括将CNS神经元与LING0-1拮抗剂接触。
6.一种促进处于死亡危险的神经元存活的方法，包括将所述神经元与有效量的 LING0-1拮抗剂和TrkB激动剂接触。
7.一种促进显示压力诱导的视神经病变的体征或症状的哺乳动物中视网膜神经节细 胞存活的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的LING0-1拮抗剂和载 体。
8.一种促进显示压力诱导的视神经病变的体征或症状的哺乳动物中视网膜神经节细 胞存活的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的LING0-1拮抗剂和TrkB 激动剂的组合。
9.一种治疗与神经元细胞死亡相关的疾病或病症的方法，包括向需要这种治疗的哺乳 动物施用有效量的LING0-1拮抗剂和TrkB激动剂。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括将所述细胞与TrkB激动剂接触。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂包含可溶的 LING0-1 多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽包含选自由下列组成的 组的LING0-1区(i)LINGO Ig结构域或者其片段、变体或衍生物，(ii)LINGO LRR结构域或者其片段、变体或衍生物，(iii)LINGO胞质结构域或者其片段、变体或衍生物，(iv)LINGO跨膜结构域或者其片段、变体或衍生物，(v)LRR结构域C-端的LINGO碱性区或者其片段、变体或衍生物，和(vi)(i)至(v)的所述LING0-1结构域或者其片段、变体或衍生物中的至少两种的组
13.如权利要求11所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽缺少选自由下列所组成 的组的LING0-1区(i)LINGO Ig 结构域，(ii)LINGOLRR 结构域，(iii)LINGO胞质结构域，(iv)LINGO跨膜结构域，(v)LRR结构域C-端的LINGO碱性区，和(vi)(i)至(v)的所述LING0-1结构域中的至少两种的组合。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽缺少LING0-1跨膜结构域和LING0-1胞质结构域。
15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽包含(i)LINGO-lLRR结构域或者其片段、变体或衍生物，(ii)LRR结构域C-端的LINGO碱性区或者其片段、变体或衍生物，和(iii)LINGO-1免疫球蛋白(Ig)结构域或者其片段、变体或衍生物。
16.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽包含所述 LING0-1LRR结构域的至少一部分，但缺少LING0-1 Ig结构域、LING0-1碱性区、LING0-1跨 膜结构域和LING0-1胞质结构域。
17.如权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽包含选自 由下列组成的组的多肽片段(i)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 33 ；(ii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 35 ；(iii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 64 ；(iv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 64 ；(v)SEQ ID NO 2 的氨基酸 66 至 89 ；(vi)SEQID NO 2 的氨基酸 90 至 113 ；(vii)SEQID NO 2 的氨基酸 114 至 137 ；(viii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 138 至 161 ；(ix)SEQID NO 2 的氨基酸 162 至 185 ；(x)SEQ ID NO 2 的氨基酸 186 至 209 ；(xi)SEQID NO 2 的氨基酸 210 至 233 ；(xii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 234 至 257 ；(xiii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 258 至 281 ；(xiv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 282 至 305 ；(xv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 306 至 329 ；(xvi)SEQID NO 2 的氨基酸 330 至 353 ；(xvii)SEQID NO 2 的氨基酸 363 至 416 ；(xviii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 417 至 424 ；(xix)SEQ ID NO 2 的氨基酸 419 至 493 ；(xx)SEQ ID NO 2 的氨基酸 494 至 551 ；(xxi)SEQ ID NO 2 的氨基酸 1 至 64 ；(xxii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 89 ；(xxiii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 113 ；(xxiv)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 137 ；(xxv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 1 至 161 ；(xxvi)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 185 ；(xxvii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 209 ；(xxviii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 233 ；(xxix)SEQ ID NO 2 的氨基酸 1 至 257 ；(xxxx)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 281 ；(xxxxi)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 305 ；(xxxxii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 329 ；(xxxxiii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 353 ；(xxxxiv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 1 至 416 ；(xxxxv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 1 至 424 ；(xxxxvi)SEQ ID NO 2 的氨基酸 1 至 493 ；(xxxxvii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 551 ；(xxxxviii)SEQID NO 2 的氨基酸 1 至 531 ； (iL)SEQ ID NO 2 的氨基酸 1 至 532 ；(Li) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 89 ； (Lii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 113 ； (Liii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 137 ； (Liv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 161 ； (Lv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 185 ； (Lvi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 209 ； (Lvii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 233 ； (Lviii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 257 ； (Lix) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 281 ； (Lx) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 305 ； (Lxi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 329 ； (Lxii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 353 ； (Lxiii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 416 ； (Lxiv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 424 ； (Lxv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 493 ； (Lxvi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 551 ； (Lxxi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 530 ； (Lxxii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 531 ； (Lxxiii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 532 ； (Lxxiv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 533 ； (Lxxv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 534 ； (Lxxvi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 535 ； (Lxxvii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 536 ； (Lxxviii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 537 ； (Lxxix) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 538 ； (Lxxx) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 539 ； (Lxxxi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 30 至 532 ； (Lxxxii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 31 至 532 ； (Lxxxiii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 32 至 532 ；(Lxxxiv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 33 至 532 ；(Lxxxv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 532 ；(Lxxxvi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 35 至 532 ；(Lxxxvii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 532 ；(Lxxxviii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 30 至 531 ；(Lxxxix) SEQ ID NO 2 的氨基酸 31 至 531 ；(Lxxxx) SEQ ID NO 2 的氨基酸 32 至 531 ；(Lxxxxi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 33 至 531 ；(Lxxxxii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 531 ；(Lxxxxiii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 35 至 531 ；(Lxxxxiv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 531 ；(Lxxxxv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 89 ；(Lxxxxvi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 113 ；(Lxxxxvii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 137 ；(Lxxxxviii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 161 ；(Lxxxxvc) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 185 ；(c) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 209 ；(ci) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 233 ；(cii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 257 ；(ciii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 281 ；(civ) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 305 ；(cv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 329 ；(cvi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 353 ；(cvii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 416 ；(cviii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 424 ；(cix) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 493 ；(cx)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 551 ；(cxi) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 530 ；(cxii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 531 ；(cxiii) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 532 ；(cxiv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 533 ；(cxv) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 534 ；(cxvi)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 535 ；(cxvii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 536 ；(cxviii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 537 ；(cxix) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 538 ；(cxx) SEQ ID NO 2 的氨基酸 36 至 539 ；(cxxi)任何所述多肽片段的变体或衍生物，以及(cxxii)任何所述多肽片段或者其变体或衍生物中的至少两种的组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽包含SEQID NO 2的氨 基酸 34-532 或 SEQ ID NO 2 的氨基酸 36-532。
19.如权利要求11-18中任一项所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽包含 LING0-1 Ig结构域或者其片段、变体或衍生物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽包含SEQID NO 2的氨 基酸 417-493。
21.如权利要求11至20中任一项所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽还包含非 LING0-1 部分。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述非LING0-1部分是融合至所述可溶的 LING0-1多肽的异源多肽。
23.如权利要求22所述的方法，其中异源多肽选自由免疫球蛋白片段、血清白蛋白、靶 向蛋白、报告蛋白和促进纯化的蛋白组成的组。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述异源多肽是免疫球蛋白片段。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述免疫球蛋白片段含有铰链和Fc区。
26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽被轭合至聚 合物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖聚合物和多 肽所组成的组。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述聚合物是聚亚烷基二醇。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述可溶的LING0-1多肽被轭合至1、2、3或4个 聚合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述聚合物的总分子量从5，OOODa至100，OOODa。
32.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂包含LING0-1抗 体或其片段。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述LING0-1抗体或其片段与主要由选自由下列 所组成的组的多肽片段组成的表位特异性结合(i)SEQ ID NO 2 的氨基酸 66 至 89 ；(ii)SEQID NO 2 的氨基酸 66 至 113 ；(iii)SEQ ID NO 2 的氨基酸 66 至 137 ；(iv)SEQID NO 2 的氨基酸 90 至 113 ；(v)SEQ ID NO 2 的氨基酸 114 至 137 ；(vi)SEQID NO 2 的氨基酸 138 至 161 ；(vii)SEQID NO 2 的氨基酸 162 至 185 ；(viii)SEQID NO 2 的氨基酸 186 至 209 ；(ix)SEQID NO 2 的氨基酸 210 至 233 ；(x)SEQ ID NO 2 的氨基酸 234 至 257 ；(xi)SEQID NO 2 的氨基酸 258 至 281 ；(xii)SEQID NO 2 的氨基酸 282 至 305 ；(xiii)SEQID NO 2 的氨基酸 306 至 329 ；(xiv)SEQID NO 2 的氨基酸 330 至 353 ；(xv)SEQ ID NO 2 的氨基酸 34 至 64 ；(xvi)SEQ ID NO 2 的氨基酸 363 至 416 ；(xvii)任何所述多肽片段的变体或衍生物，以及(xviii)任何所述多肽片段或者其变体或衍生物中的两种或更多种的组合。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述LING0-1抗体选自由下列所组成的组 201 ‘、3A3、3A6、3B5、1A7、1D5、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1B1. 1F9、3P1D10. 2C3、3P1E11. 3B7、 3P2C6.3G10. 2H7、3P2C9. 2G4、3P4A6. 1D9、3P4A1. 2B9、3P4C2. 2D2、3P4C5. 1D8、3P4C8. 2G9、 6P4F4. lDs、6P4F4. 1F9、7P1D5. 1G9、1B6. 4、2C7.2、2D6.1、2F7.3、2H3.2、3C11.1、3E3.1、 3H11. 2、3G8. 1、2B8. 1、3B5. 230-C12 (LiOl)、38_D01(Li02)、35_E04 (Li03)、36_C09(Li04)、 30—All (Li05).34-F02(Li06).29-E07(Li07)、34—G04(Li08)、36—A12(Li09)、 28-D02(Lil0)、30-B01 (Li 11)、34—B03 (Li 12)、Lil3、Li32、Li33、Li34、3383 (Lla. 1)、 3495 (Lla. 2)、3563(Lla. 3)、3564(Lla. 4) ,3565 (Lla. 5) ,3566 (Lla. 6) ,3567 (Lla. 7)、 3568 (Lla. 8) ,3569 (Lla. 9) ,3570 (Lla. 10) ,3571 (Lla. 11) ,3582 (Lla. 12)、1968 (Lla. 13)、 3011、3012、3013、3418、3422、3562、D05、D07、D08、D10 和 Dll。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述LING0-1抗体是1A7。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述LING0-1抗体是3B5。
37.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂包含LING0-1拮 抗剂多核苷酸。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂多核苷酸选自由下列组成的组(i)反义多核苷酸；(ii)核酶；(iii)小干扰RNA(siRNA)；禾口(iv)小发夹RNA(shRNA)。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂多核苷酸是包含与LING0-1 mRNA的编码部分互补的至少10个碱基的反义多核苷酸。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂多核苷酸是核酶。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂多核苷酸是siRNA。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂多核苷酸是shRNA。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述shRNA包含核苷酸序列UGAUCGUCAU CCUGCUAGAC UUCAAGAGAGUCUAGCAGGA UGACGAUCUU UUUUC(SEQ ID NO :34)。
44.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂是适体。
45.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述接触包括(a)将通过与表达控制序 列可操作连接的编码所述LING0-1拮抗剂的多核苷酸引入所述细胞或所述CNS神经元，和 (b)允许所述LING0-1拮抗剂的表达。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述多核苷酸通过选自由下列所组成的组的方法 引入所述细胞(a)转染；(b)电穿孔；(c)转导；和(d)直接的微注射。
47.如权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸作为表达载体施用。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠 病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体、痘病 毒载体和细小病毒所组成的组。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述疱疹病毒载体选自由单纯疱疹病毒载体和埃 巴病毒载体所组成的组。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述痘病毒载体是牛痘病毒载体。
52.如权利要求49所述的方法，其中所述慢病毒载体是pLL3.7。
53.如权利要求49所述的方法，其中所述细小病毒载体是腺伴随病毒(AAV)。
54.如权利要求1-6或10中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述细胞、所述神经 元或所述CNS神经元与选自由下列所组成的组的另外的拮抗剂接触(i)NGF拮抗剂；(ii)NgRl拮抗剂；(iii)TAJ拮抗剂；和(iv)OMgp拮抗剂。
55.如权利要求7-9中任一项所述的方法，所述方法还包括施用选自由下列所组成的 组的另外的拮抗剂(i)NGF拮抗剂；(ii)NgRl拮抗剂；(iii)TAJ拮抗剂；和(iv)OMgp拮抗剂。
56.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动 剂化合物。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述TrkB激动剂化合物选自由L-783，281、腺苷 和CGS 21680所组成的组。
58.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB-激动 剂多肽。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽选自由TrkB配体、TrkB配 体的片段、TrkB配体的变体、TrkB多肽、TrkB多肽的片段或TrkB多肽的变体所组成的组。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽是BDNF多肽。
61.如权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽还包含非 TrkB-激动剂部分。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述非TrkB-激动剂部分是融合至所述TrkB激动 剂多肽的异源多肽。
63.如权利要求61或62中任一项所述的方法，其中所述非TrkB-激动剂部分选自由免 疫球蛋白片段、血清白蛋白、靶向蛋白、报告蛋白和促进纯化的蛋白所组成的组。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述非TrkB-激动剂部分是免疫球蛋白片段。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述免疫球蛋白片段包含铰链和Fc区。
66.如权利要求61所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽轭合至聚合物。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖聚合物和多 肽所组成的组。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
69.如权利要求61所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽轭合至1_酰基-甘油衍生物。
70.如权利要求66所述的方法，其中所述TrkB激动剂多肽轭合至1、2、3或4个聚合物。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述聚合物的总分子量是从5，OOODa至 100，OOODa。
72.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动 剂抗体或其片段。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述TrkB激动剂抗体或其片段选自由下列所组成 的组6E2、7F5、11E1、16E11、17D11、19E12、29D7 或 TrkB 单克隆抗体。
74.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动 剂多核苷酸。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述TrkB激动剂多核苷酸编码神经营养蛋白或其 片段或变体。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述神经营养蛋白是BDNF。
77.如权利要求6、8、9或10中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂是TrkB激动 剂适体。
78.如权利要求1-6或10中任一项所述的方法，其中所述细胞或神经元或所述CNS神 经元是在哺乳动物中，并且其中所述接触包括向需要其的哺乳动物施用有效量的LING0-1 拮抗剂或所述LING0-1拮抗剂和TrkB激动剂。
79.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物已经被诊断为患有 涉及神经变性的疾病、病症或损伤。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述疾病、病症或损伤是青光眼。
81.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂或LING0-1拮 抗剂中的至少一种通过弹丸注射或慢性输注来施用。
82.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂或LING0-1拮 抗剂中的至少一种被直接施用至中枢神经系统中。
83.如权利要求6、8、9、10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂选自由 TrkB激动剂多核苷酸或者编码TrkB激动剂多肽或TrkB激动剂适体的多核苷酸所组成的 组。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述接触或施用包括(a)向细胞引入所述TrkB激动剂多核苷酸或者编码所述TrkB激动剂的多核苷酸和(b)允许所述TrkB激动剂的表达。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述多核苷酸通过选自由下列所组成的组的方法 引入所述细胞(a)转染；(b)电穿孔；(c)转导；和(d)直接的微注射。
86.如权利要求84-85中任一项所述的方法，其中所述细胞是在哺乳动物中，并且其中 所述引入包括(a)向所述哺乳动物施用所述TrkB激动剂多核苷酸或者编码所述TrkB激动 剂的所述多核苷酸和(b)允许所述TrkB激动剂的表达。
87.如权利要求83所述的方法，其中所述TrkB激动剂多核苷酸或者编码所述TrkB激 动剂的所述多核苷酸被施用于能够表达所述多核苷酸的培养的宿主细胞中。
88.如权利要求84至87中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸作为表达载体施用。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述表达载体是病毒载体。
90.如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸在所述疾病、病症或 损伤的部位或附近被引入所述哺乳动物中。
91.如权利要求87所述的方法，其中所述培养的宿主细胞通过包括以下的方法来制 备(a)用如权利要求83所述的TrkB激动剂多核苷酸或编码TrkB激动剂的多核苷酸或如 权利要求88或权利要求89所述的载体转化或转染受体宿主细胞，和(b)培养所述转化或 转染的宿主细胞。
92.如权利要求87至91中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞来源于有待被治疗的 哺乳动物。
93.如权利要求89所述的方法，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠 病毒载体、瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体、痘病 毒载体和细小病毒所组成的组。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述疱疹病毒载体选自由单纯疱疹病毒载体和埃 巴病毒载体所组成的组。
95.如权利要求93所述的方法，其中所述痘病毒载体是牛痘病毒载体。
96.如权利要求93所述的方法，其中所述慢病毒载体是pLL3.7。
97.如权利要求93所述的方法，其中所述细小病毒载体是腺伴随病毒(AAV)。
98.如权利要求8-10或78中任一项所述的方法，其中所述TrkB激动剂通过选自由局 部施用、眼内施用、玻璃体内施用、胃肠外施用、鞘内施用、硬膜下施用、皮下施用所组成的 组的路线或通过胶囊植入物施用。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂或TrkB激动剂中的至少一种 被直接施用至眼中。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述LING0-1拮抗剂或TrkB激动剂中的至少一 种通过胶囊植入物被施用。
101.如权利要求1-6或78中任一项所述的方法，其中所述细胞或神经元或者所述CNS 神经元是感觉神经元。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述感觉神经元在视网膜神经节细胞(RGC)中。
103.如权利要求7-10或78中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有视神经病变。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述视神经病变是青光眼。
105.如权利要求101所述的方法，其中所述感觉神经元是毛细胞。
106.如权利要求9或78所述的方法，其中所述哺乳动物患有选自由ALS、亨廷顿舞蹈 症、阿尔茨海默氏病、帕金森病、糖尿病性神经病变、中风和听力损失所组成的组的疾病或 病症。
107.如权利要求34所述的方法，其中所述LING0-1抗体是Li33。
全文摘要
本发明涉及使用LINGO-1拮抗剂和TrkB激动剂促进神经元存活和再生的方法。此外，本发明涉及使用LINGO-1拮抗剂治疗压力诱导的视神经病变的方法。本发明还通常涉及使用LINGO-1拮抗剂增加TrkB活性并抑制JNK通路信号转导的方法。
文档编号A61K31/00GK101980603SQ200880121178
公开日2011年2月23日 申请日期2008年10月10日 优先权日2007年10月11日
发明者米莎 申请人:比奥根艾迪克Ma公司