专利名称：结合il-13的配体的制作方法
结合IL-13的配体
背景技术：
Th2型免疫应答促进了抗体的产生和体液免疫，并尽力击退细胞外病原体。Th2细胞是Ig产生(体液免疫)的介导者并且产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13 (Tanaka 等，Cytokine Regulation of humoral immunity (体液免疫的细胞因子调节)，251-272， Snapper 编辑，John Wiley and Sons, New York(1996)) Th2 型免疫应答通过某些细胞因子(例如IL-4、IL-13)和特定类型的抗体(IgE、IgG4)的产生来表征，并且对于变态反应是典型的，变态反应可导致泪溢和哮喘症状，例如气道炎症和肺的气道肌细胞收缩。白细胞介素-13 (IL-U)是诱导免疫球蛋白同种型转换至IgG4和IgE、诱导⑶23 增量调节、诱导VCAM-I表达并直接激活例如嗜酸性粒细胞和肥大细胞的多效细胞因子。 IL-13主要由Th2细胞产生并且抑制LPS刺激的单核细胞产生炎性细胞因子(IL-I、IL-6、 TNF、IL-8)。IL-13与IL-4联系紧密，与IL-4在氨基酸水平上共享20-25%的序列相似性。 (Minty 等，Nature, 363 (6417) :248-50 (1993))。尽管 IL-13 的很多活性与 IL-4 的活性相似，但IL-13并不如同IL-4那样具有对活化T细胞或活化T细胞克隆的生长促进效应。 (Zurawski 等，EMBO J. 12 :2663 (1993))。细胞表面受体和受体复合物以不同的亲和力与IL-13结合。结合IL-13的受体和受体复合物的基本组分是IL-4Ra、IL_13Ra 1和IL_13Ra 2。这些链表达在细胞的表面上作为IL_4Ra/IL_13Ra 1或IL_4Ra/IL13Ra 2的单体或异二聚体。IL_4r α单体结合 IL-4 而非 IL-13。IL-13Ra 1 单体和 IL-13Ra 2 单体结合 IL-13 但不结合 IL-4。IL_4Ra/ IL-13Ra 1 和 IL-4Ra /IL13Ra 2 的异二聚体结合 IL-4 和 IL-13 两者。IL-13基于其生物学功能是治疗上重要的蛋白。IL-13已显示出增强抗肿瘤免疫应答的潜能。由于IL-13涉及变应性疾病的发病机制，该细胞因子的抑制剂可提供治疗益处。IL-13抑制剂公开于W02007085815中，其公开内容在此引作参考。W02007085815公开了良好的抗IL-13抗体单可变域D0M10-53-474。由于存在对抑制IL-13的改良药物的需要， 因此本文的发明人旨在寻找表现甚至比D0M10-53-474更好的IL-13抑制剂，特别是寻找具有提高的IL-13结合动力学和/或中和能力和/或IL-13种属交叉反应性的抑制剂。本发明人认识到这样的好处将提供改进的治疗性和预防性抗IL-13药物和这些药物的开发。发明简述本发明提供了改进的抗IL-13免疫球蛋白单可变域、包含这些可变域的拮抗剂和组合物、方法和用途。在一个方面，本发明提供了一种包含以下氨基酸序列的抗白细胞介素-13(IL_13) 的免疫球蛋白单可变域，所述氨基酸序列除与D0M10-53-474(SEQ ID NO :1)相比具有1、2、 3、4或5个氨基酸改变之外，与D0M10-53-474(SEQ ID NO :1)相同，其中所述单可变域在依照Kabat编号的观位具有缬氨酸，任选其中所述单可变域不由D0M10-53-616(SEQ ID NO: 5)组成。在第二个方面，本发明提供了一种包含以下氨基酸序列的抗白细胞介素-13(IL-13)的免疫球蛋白单可变域，所述氨基酸序列除与D0M10-53-474(SEQ ID NO 1)相比具有1、2、3、4或5个氨基酸改变之外，与D0M10-53-474相同，并且其中所述单可变域具有序列XGX' X"，其中G在依照Kabat编号的M位并且X = H或 K;X' =G 或K;X" =1(或1，并且任选其中所述单可变域不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。在另一个方面，本发明提供了抗白细胞介素-13(IL_13)的免疫球蛋白单可变域，其中所述可变域为 D0M10-53-546 (SEQ ID NO :2)、D0M10-53-567 (SEQ ID NO
3)、D0M10-53-568(SEQ ID NO 4)或 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。在另一个方面， 本发明提供了抗白细胞介素-13(IL-i;3)的免疫球蛋白单可变域，其中所述可变域为 D0M10-53-546(SEQ ID NO :2)、D0M10-53_567 (SEQ ID NO 3)或D0M10-53-568(SEQ ID NO:4)。本发明的一个方面提供了由D0M10-53-546(SEQ ID NO :6)、D0M10-53-567 (SEQ ID NO 7), D0M10-53-568 (SEQ ID NO :8)或 D0M10-53-616 (SEQ ID NO 9)的核苷酸序列编码的抗白细胞介素-13 (IL-13)的免疫球蛋白单可变域，任选其中所述单可变域不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。本发明的一个方面提供了包含与D0M10-53-M6 (SEQ ID NO :2)、 D0M10-53-567(SEQ ID NO :3)、D0M10-53-568(SEQ ID NO :4)、或 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)至少99%相同或100%相同的氨基酸序列的多肽，任选其中所述多肽不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。本发明还涉及包含这样的单可变域的拮抗剂、融合蛋白和装置、用途、方法和组合物。所述拮抗剂可用于处理患者例如人患者中IL-13介导的疾病和病况，例如用于治疗和 /或预防肺疾病例如哮喘、COPD或流感。不同范围的本发明的另外实施方案考虑于本文中，并且如以下公开。附图简述
图1 :pD0M5载体的图谱图2 (a)本发明抗IL-13免疫球蛋白单可变域和现有技术抗IL-13单可变域 D0M10-53-474(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列；和(b)单可变域的CDR(依照Kabat)的核苷酸序列。图3 编码本发明抗IL-13免疫球蛋白单可变域和现有技术抗IL-13单可变域 D0M10-53-474的核苷酸序列；图4 (a)和(b)本发明抗IL-13免疫球蛋白可变域的氨基酸序列与 D0M10-53-474(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列的比对情况。编号基于Kabat。氨基酸残基对比D0M10-53-474(SEQ ID NO 1)的差异通过出现差异的位置上的氨基酸(单字母形式)表示。在与D0M10-53-474相比氨基酸没有差别的特定位置处，用“.”表示。⑶R是加下划线的。(c)和(d)本发明抗IL-13免疫球蛋白可变域的氨基酸序列与D0M10-53_474(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列的比对情况。编号基于Chothia。氨基酸残基对比 D0M10-53-474(SEQ ID NO :1)的差异通过出现差异的位置上的氨基酸(单字母形式)表示。在与D0M10-53-474相比氨基酸没有差别的特定位置处，用“.”表示。⑶R是加下划线的。图5 本发明抗IL-13免疫球蛋白单可变域和现有技术抗IL-13单可变域 D0M10-53-474(SEQ ID NO 1)的胰蛋白酶消化情况。详述在本说明书内，已参考实施方案，以能够清晰且简洁地书写说明的方式描述本发明。预期且应理解的是实施方案可在不背离本发明的情况下，进行各种组合或分开。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。将标准技术用于分子、遗传和生物化学方法(通常参见Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版· (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y.禾口Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999) 第四版，John Wiley & Sons，Inc.其在此引作参考)和化学方法。术语“与D0M10-53_474(SEQ ID NO 1)相比的氨基酸改变”在其范围内包括其中各个改变为氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸改变。在一个实施方案中，该术语仅表示氨基酸取代。本文所用术语“配体”是指包含至少一种具有以下结合位点的肽、多肽或蛋白部分的化合物，所示结合位点具有针对IL-13的结合特异性。本发明的配体任选包括具有不同结合特异性的免疫球蛋白可变域，但不包括共同形成针对靶化合物的结合位点的可变域对 (即，并不包括共同形成针对IL-13的结合位点的免疫球蛋白重链可变域和免疫球蛋白轻链可变域)。任选地，具有含针对靶标的结合特异性的结合位点的各个域，为具有针对所需靶标(例如IL-13)的结合特异性的免疫球蛋白单可变域(例如免疫球蛋白单重链可变域 (例如VH、Vhh)、免疫球蛋白单轻链可变域(例如\))。具有含针对靶标(例如IL-13)的结合特异性的结合位点的各个多肽域，还可以合适的形式包含一个或多个对所需靶标(例如IL-13)具有结合特异性的抗体或抗体片段(例如免疫球蛋白单可变域)的互补决定区 (CDR)，使得所述结合域具有对所述靶标的结合特异性。例如，CDR可移植至合适的蛋白支架或蛋白骨架(例如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类域或EGF域)上。此夕卜， 如本文所述，配体可为二价(异二价)或多价(异多价)的。因此，“配体”包括含两个dAb 的多肽，其中各个dAb结合不同的靶标(例如IL-4、IL-13)。配体还包括以合适的形式含有结合不同靶标的至少两个dAb (或dAb的CDR)的多肽，所述合适的形式为例如抗体形式 (例如IgG样形式、SCFV、Fab、Fab'、F(ab' )2)或合适的蛋白支架或蛋白骨架(例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类域、EGF域、avimer和如本文所述的双特异性配体和多特异性配体)。具有对靶标(例如IL-13)有结合特异性的结合位点的多肽域，还可为包含针对所需靶标的结合位点的蛋白域，例如蛋白域选自亲和体、SpA域、LDL受体A类域、avimer (参见例如美国专利申请第2005/0053973号、第2005/0089932号、第2005/0164301号)。若需要的化，“配体”还可包含一个或多个另外的部分，其可彼此独立地为肽、多肽或蛋白部分或非肽部分(例如聚亚烷基二醇、脂质、碳水化合物)。例如，配体还可包含如本文所述的半衰期延长部分(例如聚亚烷基二醇部分、包含白蛋白的部分、白蛋白片段或白蛋白变体、包含转铁蛋白的部分、转铁蛋白片段或转铁蛋白变体、结合白蛋白的部分、结合新生Fc受体的部分)。“双特异性配体”是指包含第一抗原结合位点或表位结合位点(例如第一免疫球蛋白单可变域)和第二抗原结合位点或表位结合位点(例如第二免疫球蛋白单可变域)的配体，其中所述结合位点或可变域能够结合两个抗原(例如不同的抗原或相同抗原的两个拷贝)或相同抗原上通常并不被单特异性免疫球蛋白结合的两个表位。例如，两个表位可在相同的抗原上，但并非相同的表位或足够相近而被单特异性配体结合。在一个实施方案中， 本发明的双特异性配体由具有不同特异性的结合位点或可变域组成，但不含有具有相同特异性的互相互补的可变域对(即VH/VL对)(即不形成单一的结合位点)。本文所用措词“靶标”是指含有结合位点的多肽域可与其结合的生物分子，例如肽、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物。靶标可为例如细胞内靶标(例如细胞内蛋白靶标)、可溶性靶标(例如分泌蛋白如IL-4、IL-13)或细胞表面靶标(例如膜蛋白、受体蛋白)。在一个实施方案中，靶标为IL-4或IL-13。措词“免疫球蛋白单可变域”是指不依赖不同或其它的V区或结构域而特异性结合抗原或表位的抗体可变域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白单可变域可以具有其它的可变区或可变域形式(例如同多聚体或异多聚体)存在，其中其它的区或域并不为单个免疫球蛋白可变域结合抗原所需(即其中免疫球蛋白单可变域不依赖另外的可变域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”为“免疫球蛋白单可变域”，如该术语在本文使用。“单个免疫球蛋白可变域” 与“免疫球蛋白单可变域”相同，如该术语在本文所用。“单个抗体可变域”或“抗体单可变域，，与“免疫球蛋白单可变域”相同，如该术语在本文所用。免疫球蛋白单可变域在一个实施方案中为人抗体可变域，但还包括来自其它物种的单个抗体可变域，所述其它物种为例如啮齿动物(例如如WO 00/29004中公开的，其公开内容在此以其整体引作参考)、铰口鲨和骆驼科(Camelid)VHH dAb。骆驼科Vhh是来源于包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼在内的物种的免疫球蛋白单可变域多肽，该物种产生天然缺乏轻链的重链抗体。Vhh可为人源化的。本文所述的免疫球蛋白单可变域(dAb)包含互补决定区(⑶R1、⑶R2和⑶R3)。 CDR的位置和框架(FR)区和编号系统业已由Kabat等定义(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Off ice (1991))。根据熟知的 Kabat 氨基酸编号系统和CDR定义，本文公开的Vh和VJVK) dAb的CDR(CDR1、CDR2、CDR3)氨基酸序列对于本领域的技术人员是显而易见的。依照Kabat编号系统，重链⑶R-H3具有可变的长度，将插入物用大至K的字母编号于残基H100和HlOl之间(即Η100、Η100Α. · · H100K、H101)。CDR可备选地利用Chothia系统(Chothia等，(1989)免疫球蛋白高可变区的构象(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions) ；Nature 342,第 877-883 页)依照 AbM或如下的Contact法确定。参见http://www. bioinf. org. uk/abs/关于确定CDR的合适方法。一旦各残基已编号，可接着应用以下的⑶R定义(“_”表示与Kabat所示相同的残基号)Kabat-基于序列变异性的最常使用的方法(使用Kabat 编号)CDR Hl :31_35/35A/35B
CDRH2 ；50-65
CDRH3 :95-102
CDRLl ；24-34
CDRL2 ；50-56
CDRL3 ；89-97
Chothia-基于结构环区域的位置
(使用Chothia编号)
CDRHl ；26-32
CDRH2 ；52-56
CDRH3 :95-102
CDRLl ；24-34
CDRL2 ；50-56
CDRL3 ；89-97
AbM-Kabat和Chothia之间的折衷
(使用Kabat编号)(使用Chothia编号)
CDR Hl 26-35/35A/35B 26-35
CDR H2: 50-58-
CDR H3: 95-102-
CDR Ll 24-34-
CDR L2: 50-56-
CDR L3:89-97-Contact-基于晶体结构和对与抗原的接触残基的预测
(使用Kabat编号)(使用Chothia编号)
CDR Hl 30-35/35A/35B30-35
CDR H2: 47-58-
CDR H3: 93-101-
CDR Ll 30-36-
CDR L2: 46-55-
CDR L3: 89-96-本文所用的“白细胞介素-4” (IL-4)是指天然存在或内源的哺乳动物IL-4蛋白和具有与天然存在或内源的相应哺乳动物IL-4蛋白氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白 (例如重组蛋白、合成蛋白(即利用合成有机化学的方法制备的))。因此，如本文所定义， 该术语包括成熟的IL-4蛋白、IL-4的多态变体或等位变体和其它同种型，以及前述蛋白的经修饰或未经修饰的形式(例如脂化、糖基化)。天然存在或内源的IL-4包括野生型蛋白例如成熟的IL-4、天然存在于哺乳动物(例如人、非人的灵长类)中的多态变体或等位变体以及其它同种型和突变形式。例如，这样的蛋白可从天然产生IL-4的来源中回收或分离。这些蛋白和具有与天然存在或内源的相应IL-4相同的氨基酸序列的蛋白，通过相应哺乳动物的名称来提及。例如，当相应的哺乳动物为人时，蛋白命名为人IL-4。几种突变的 IL-4蛋白为本领域已知，如WO 03/038041中公开的那些。本文所用的“白细胞介素-13” (IL-13)是指天然存在或内源的哺乳动物IL-13蛋白和具有与天然存在或内源的相应哺乳动物IL-13蛋白氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白(例如重组蛋白、合成蛋白(即利用合成有机化学的方法制备的))。因此，如本文所定义，该术语包括成熟的IL-13蛋白、IL-13的多态变体或等位变体和其它同种型(例如通过可变剪接或其它细胞处理法产生的)，以及前述蛋白的经修饰或未经修饰的形式(例如脂化、糖基化)。天然存在或内源的IL-13包括野生型蛋白例如成熟的IL-13、天然存在于哺乳动物(例如人、非人的灵长类)中的多态变体或等位变体以及其它亚型和突变形式。例如， 本文所用的IL-13包括与哮喘(特应性和非特应性哮喘)相关的人IL-13变体(其中成熟的人IL-13的110位Arg被Gln置换(成熟人IL-13的110位对应于前体蛋白的130位))， 以及 IL-13 的其它变体(Heinzmann 等，Hum MoI Genet. 9 :549-559 (2000)) 例如，这样的蛋白可从天然产生IL-13的来源中回收或分离。这些蛋白和具有与天然存在或内源的相应 IL-13相同的氨基酸序列的蛋白，通过相应哺乳动物的名称来提及。例如，当相应的哺乳动物为人时，蛋白命名为人IL-13。几种突变的IL-13蛋白为本领域已知，如WO 03/035847中公开的那些。“亲和力，，和“亲合力，，是描述结合相互作用的强度的本领域术语。关于本发明的配体，亲合力是指细胞上的多个靶标(例如第一靶标和第二靶标)和配体之间结合的总体强度。亲合力大于对单独靶标的单独亲和力的总和。本文所用“毒素部分”是指包含毒素的部分。毒素是对细胞生理有有害作用和/或改变细胞生理(例如导致细胞坏死、凋亡或抑制细胞分裂)的物质。本文所用术语“剂量”是指一次全部给予受试者的配体量(单位剂量)，或在限定的时间间隔之内以两次或者更多次给予给予受试者的配体量。例如，剂量可表示在一天( 小时)(日剂量)、两天、一周、两周、三周或一个或多个月期间之内(例如通过单次给药、或通过两次以上给药)给予受试者的配体(例如包含结合IL-13的免疫球蛋白单可变域的配体)的量。剂量之间的间隔可为任何所需的时间量。本文所用“互补的”是指当两个免疫球蛋白域属于形成关关连对(cognate pair) 或关连组的结构家族或来自这样的家族并保留该特征。例如，抗体的\域和\域是互补的； 两个Vh域不是互补的，两个\域不是互补的。互补域可存在于免疫球蛋白超家族的其它成员中，例如T细胞受体的Va和V0 (或γ和δ)域。人工合成结构域例如基于蛋白支架的结构域(其除非经改造成结合表位否则并不结合表位)，是非互补的。类似地，基于(例如)免疫球蛋白结构域和纤连蛋白结构域的两个结构域不是互补的。本文所用“免疫球蛋白”是指保留了抗体分子的免疫球蛋白折叠特征的多肽家族， 其包含两个β折叠和通常保守的二硫键。免疫球蛋白超家族成员涉及体内细胞和非细胞相互作用的多个方面，包括在免疫系统中的广泛作用(例如，抗体、T细胞受体分子等)、涉及细胞粘附(例如ICAM分子)及细胞内信号传导(例如受体分子，例如PDGF受体)。本发明适用于具有结合域的所有免疫球蛋白超家族分子。在一个实施方案中，本发明涉及抗体。
本文所用“域”是指独立于蛋白其它部分，保留其四级结构的折叠蛋白结构。一般而言，域负责蛋白的离散功能性质，并且在很多情况下可添加、移除或转移至其它蛋白而不丢失蛋白剩余部分的功能和/或域的功能。单个抗体可变域意指包含抗体可变域的序列特征的折叠的多肽域。因此其包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如其中一个或多个环被并非具有抗体可变域特征的序列代替；或者被截短的或包含N端或C端延伸物的抗体可变域，以及保留了全长域的至少一部分结合活性和特异性的可变域的折叠片段。因此，各个配体包含至少两个不同的域。术语“文库”是指异质多肽或核酸的混合物。文库由各自具有单一多肽或核酸序列的成员组成。在这种程度上，文库与库(r印ertoire)同义。文库成员之间的序列差别是文库中存在的多样性的原因。文库可呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可呈转化有核酸文库的生物体或细胞(例如细菌、病毒、动物细胞或植物细胞等)的形式。任选地，各个生物体或细胞包含仅一个或有限个文库成员。有利地，将核酸掺入表达载体中，以便允许由所述核酸编码的多肽的表达。在一个方面，文库可呈宿主生物体群的形式，各自生物体以核酸形式包含一个或多个拷贝的含文库的单个成员的表达载体，其可被表达以产生其相应的多肽成员。因此，宿主生物体群具有编码遗传多样性多肽变体的大库的潜力。本文所用“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab' )2、Fv、 二硫键连接的Fv、SCFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双抗体)，不论来自天然产生抗体的任何物质或由重组DNA技术制备的；不论分离自例如血清、B细胞、杂交瘤、 转染瘤、酵母或细菌。本文所述“抗体”是被本发明结合域结合的分子。典型地，抗原被抗体配体结合并能够在体内引起抗体应答。其可为例如多肽、蛋白、核酸或其它分子。一般而言，将本发明的双特异性配体选择用于针对两个特定靶标(例如抗体)的靶标特异性。在传统的抗体及其片段的情况中，由可变环(L1、L2、L3*H1、H2、H;3)限定的抗体结合位点能够结合抗原。“表位”为一般被免疫球蛋白VH/\对结合的结构单元。表位限定了抗体的最小结合位点，并且因此代表具有抗体特异性的靶标。在单域抗体的情况下，表位表示被分离的可变域结合的结构单元。“通用框架”是指单一抗体框架序列，其对应于如Kabat ( " Sequences of Proteins of Immunological Interest " , US Department of Health and Human Services)所限定的序列保守的抗体区，或对应于由Chothia和Lesk, (1987) J. MoI. Biol. 196 :910-917限定的人种系免疫球蛋白库或结构。本发明提供了单个框架或这样的框架组的用途，这已被发现允许几乎任何结合特异性仅通过高可变区的变化而衍生化。措词“半衰期”是指配体的血清浓度在体内例如由于配体的降解和/或双特异性配体通过天然机制的清除或隔离，而减少50%花费的时间。本发明的配体在体内是稳定的， 并且其半衰期通过结合至抵抗降解和/或清除或隔离的分子而增加。典型地，这样的分子为本身在体内具有长半衰期的天然存在的蛋白。若配体的功能活性在体内保留的时间比对半衰期增加分子不具有特异性的相似配体长，则该配体的半衰期增加。因此，将对HSA和两个靶标分子有特异性的配体，与其中不存在对HSA的特异性(即不结合HSA但结合另一种分子)的相同配体进行比较。例如，其可结合细胞上的第三靶标。通常半衰期增加10%、 20%、30%、40%、50%或更多。半衰期在 2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x 或更大的范
11围内的增加是可能的。作为备选地，或者另外地，半衰期在高达30X、40X、50X、60X、70X、80X、 90xU00xU50x的范围内的增加是可能的。本文所用术语“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性”或“非常高严格性”条件描述用于核酸杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指南可参见Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6，其以整体在此引作参考。在该参考文献中描述了含水和不含水的方法，可使用任其一方法。特定杂交条件在本文中是指如下条件(1)低严格性杂交条件在约45°C下，于6X的氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 中，接着在至少50°C下在0. 2X SSC、0. 1% SDS中洗涤两次(对于低严格性条件洗涤的温度可提高至55°C) ； (2)中等严格性杂交条件在约45°C下，6X SSC中，接着在60°C下在0. 2X SSC、0. 1% SDS中洗涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件在约45°C下，6X SSC中，接着在 65°C下在0. 2X SSC、0. 1% SDS中洗涤一次或多次；和任选地(4)非常高严格性杂交条件为在65°C下，0. 5M磷酸钠、7%SDS，随后在65°C下在0. 2X SSC、0. 1 % SDS中洗涤一次或多次； 除非另外指出，否则非常高严格性条件(4)为优选条件和应使用的条件。与本文公开的序列相似或同源(例如至少约70%的序列同一性)的序列也是本发明的部分。在一些实施方案中，氨基酸水平上的序列同一性可为约80%、85%、90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在核酸水平上，序列同一性可为约 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高。 或者，当核酸区段在选择性的杂交条件(例如非常高严格性杂交条件)下与链的互补序列杂交时，则存在基本同一性。核酸可存在于整个细胞中、细胞裂解液中或以部分纯化或基本纯的形式存在。两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”或“相似性”的计算(所述术语在本文可互换使用)按如下进行。将序列针对最佳对比目的进行比对(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一条或两条中引人空位用于最佳比对，并且非同源序列可出于对比目的而忽略)。在一个实施方案中，针对对比目的进行比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少约30%、任选至少约40%、任选至少约50%、任选至少约60%、和任选至少约70%、 80%、90%或100%。然后将相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一个序列中的位置被与第二个序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置是完全相同的(本文所用氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数目的函数，同时考虑用于最佳比对两个序列而需要弓I人的空位数目和各个空位长度。如本文定义的氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性任选使用 BLAST 2 kquences 算法用缺省参数(Tatusova，Τ· Α·等，FEMS Microbiol Lett, 174 187-188(1999))准备和确定。或者，应用BLAST算法O. 0版)用于序列比对，其中将参数
BUVST(B￡isic Local Alignment Search Tool)blastp> blastn>
blastx、tblastn和tblastx采用的启发式搜索算法；这些程序使用Karlin和Altschul， 1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6) :2264-8的统计方法，将显著性分配给其发现结果。除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同(例如在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中)。 将标准方法用于分子、遗传和生物化学方法(通常参见Sambrook等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第二片反· (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y.禾口 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第四版，John Wiley & Sons，Inc.其在此引作参考)和化学方法。本文所用术语“IL-13的拮抗剂”或“抗IL-13的拮抗剂”等是指结合IL-13并可抑制IL-13的(一种或多种)功能的物质(例如分子、化合物)。例如，IL-13的拮抗剂可抑制IL-13与IL-13的受体的结合和/或抑制通过IL-13的受体介导的信号转导。因此， IL-13介导的过程和细胞应答可用IL-13拮抗剂抑制。本文所用“肽”是指经由肽键连接在一起的约2-约50个氨基酸。本文所用“多肽”是指经由肽键连接在一起的至少约50个氨基酸。多肽通常包含三级结构并折叠成功能域。如本文所用，“对蛋白酶降解抵抗”的肽或多肽(例如域抗体(dAb))当在适合蛋白酶活性的条件下与蛋白酶温育时，基本不被蛋白酶降解。多肽(例如dAb)在以下情况下是基本不被降解的当在适合蛋白酶活性的温度(例如在37°C或50°C )下与蛋白酶温育约 1小时后，不超过约25%、不超过约20%、不超过约15%、不超过约14%、不超过约13%、不超过约12%、不超过约11%、不超过约10 %、不超过约9%、不超过约8%、不超过约7%、不超过约6 %、不超过约5 %、不超过约4 %、不超过约3 %、不超过约2 %、不超过约1 %的蛋白或基本没有蛋白被蛋白酶降解。蛋白降解可利用任何合适的方法，例如通过SDS-PAGE或通过本文描述的功能测定(例如配体结合)来评价。本文所用“展示系统”是指其中多肽或肽的集合可用于根据所需特征例如物理、化学或功能特征进行选择的系统。所述展示系统可为多肽或肽的合适库(例如在溶液中，固定化于合适的支持体上)。所述展示系统还可为利用细胞表达系统(例如在例如转化的、 感染的、转染的或转导的细胞中核酸文库的表达以及在细胞表面上编码的多肽的展示)或非细胞表达系统(例如乳液区室化和展示)的系统。示例性的展示系统将核酸的编码功能和由核酸编码的多肽或肽的物理、化学和/或功能特征联系起来。当应用这样的展示系统时，可选择具有所需物理、化学和/或功能特征的多肽或肽并可容易地分离或回收编码所选择的多肽或肽的核酸。连接核酸的编码功能和多肽或肽的物理、化学和/或功能特征的许多展示系统为本领域已知，例如噬菌体展示(噬菌体展示，例如噬菌粒展示)、核糖体展示、乳化区室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、在质粒上的展示、共价展示等(参见例如EP 0436597 (Dyax)、美国专利第6，172，197号(McCafferty等)、美国专利第 6，489，103 号(Griffiths 等)·)。本文所用“库”是指由氨基酸序列多样性为特征的多肽或肽的集合。库的各个成员可具有共同的特征，例如共同的结构特征(例如共同的核心结构)和/或共同的功能特征(例如与结合共同配体(例如通用性配体或靶配体，IL-13)的能力)。本文所用“功能的”描述具有生物活性例如特异的结合活性的多肽或肽。例如，术语“有功能的多肽”包括通过其抗原结合位点结合靶抗原的抗体或其抗原结合片段。本文所用“通用性配体”是指结合大部分(例如几乎所有)既定库的功能成员的配体。通用性配体(例如共同通用性配体)可结合既定库的许多成员，即使成员可能不具有针对共同靶配体的结合特异性。通常，多肽上的功能性通用性配体结合位点的存在情况 (如结合通用性配体的能力所表明)提示多肽是正确折叠的和有功能的。通用性配体的合适的实例包括超抗原、结合表达在库的大部分功能性成员上的表位的抗体等。“超抗原”是指与免疫球蛋白超家族的成员在与这些蛋白的靶配体结合位点不同的位点上相互作用的通用性配体的本领域术语。葡萄球菌肠毒素是与T细胞受体相互作用的超抗原的实例。结合抗体的超抗原包括G蛋白，其结合IgG的恒定区(Bjorck和 Kronvall, J. Immunol. , 133 :969(1984))；结合 IgG 的恒定区和 Vh 域的 A 蛋白(Forsgren 和 Sjoquist，J. Immunol. ,97 :822(1966))；结合 Vl 域的 L 蛋白(Bjorck, J. Immunol, 140 194(1988))。本文所用“抗体形式”是指任何合适的多肽结构，其中可掺入一个或多个抗体可变域以便将针对抗原的结合特异性赋予该结构。很多合适的抗体形式为本领域已知，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体轻链和 /或轻链的同二聚体和异二聚体、前述任何一种的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链 Fv(ScFv)、二硫键合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段)、单个抗体可变域(例如 dAb、VH、VHH、^和前述任何一种的修饰形式(例如通过聚乙二醇或其它合适的聚合物的共价连接来修饰的或人源化Vhh)。本文使用的“流体动力学大小”是指基于分子通过水溶液的扩散的分子(例如蛋白分子、配体)的表观大小。蛋白通过溶液的扩散或运动可经处理以推导蛋白的表观大小， 其中大小由蛋白颗粒的“斯托克斯半径，，或“流体动力学半径”给出。蛋白的“流体动力学大小”取决于质量和形状(构象)两者，从而使得基于蛋白的整体构象，具有相同分子量的两种蛋白可能具有不同的流体动力学大小。本文所指术语“竞争”意指第一靶标(例如IL-13)与其关连靶标结合域(例如免疫球蛋白单可变域)的结合，在特异性针对所述关连靶标的第二结合域(例如免疫球蛋白单可变域)存在的情况下被抑制。例如，结合可在空间上被抑制，例如通过结合域的物理封闭或通过结合域的结构或环境的变化使得其对靶标的亲和力或亲合力减少。参见 W02006038027关于如何进行竞争性ELISA和竞争性BiaCore实验以确定第一和第二结合域之间的竞争的详述，其详述在此引作参考以提供用于本发明的明晰的公开内容。本发明人认识到，D0M10-53-474(SEQ ID NO 1)中第28位(Kabat编号)的突变提供对IL-13结合更强烈得多的dAb衍生物。还可产生另外的优点，例如人和至少一种非人的灵长类IL-13(例如食蟹猴和/或猕猴)之间的交叉反应性。此外，还可在原核细胞中产生良好的表达。因此，在一个方面，本发明提供了一种包含以下氨基酸序列的抗白细胞介素-13(IL-i;3)的免疫球蛋白单可变域，所述氨基酸序列除与D0M10-53-474(SEQ ID NO: 1)相比具有1、2、3、4或5个氨基酸改变之外，与D0M10-53-474(SEQ ID N0:1)相同， 其中所述单可变域在依照Kabat编号的观位具有缬氨酸，任选其中所述单可变域不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。我们在本文还提及术语“dAb” (域抗体)。dAb为“免疫球蛋白单可变域”。本发明人还认识到，具有序列基序XGX' X"(其中G在依照Kabat编号的M位并且X = H或K;X' =G或K ；X" = K或I)的D0M10-53-474dAb衍生物，对IL-13的结合更强烈得多。还可产生另外的优点，例如人和至少一种非人的灵长类IL-13(例如食蟹猴和 /或猕猴)之间的交叉反应性。此外，还可产生在原核细胞中表达提高的优点。
因此，在第二个方面，本发明提供了一种包含以下氨基酸序列的抗白细胞介素-13(IL-i;3)的免疫球蛋白单可变域，所述氨基酸序列除与D0M10-53-474(SEQ ID NO 1) 相比具有1、2、3、4或5个氨基酸改变之外，与D0M10-53-474相同，并且其中所述单可变域具有序列XGX' X"，其中依照Kabat编号G在M位并且X = H 或 K ；X' =G 或K;X" =K或I并且任选其中所述单可变域不由D0M10-53-616(SEQ ID NO : 组成。在第二个方面的一个实施方案中，所述可变域在依照Kabat编号的观位具有缬氨酸。在第二个方面的一个实施方案中，所述单可变域包含KGGK ；XGKI ；或HGKI ；其中G(或KGGK的第一个G)在依照Kabat编号的M位。在第二个方面的一个实施方案中，单可变域的⑶R2(依照Kabat)具有序列 SIDW[Z]TYYADSVKG，其中[Z]选自如上定义的 XGX' X"、KGGK、XGKI 禾口 HGKI。在任一方面中，所述可变域可任选在30、53、55和56位(依照Kabat编号)中的一个或多个位置具有氨基酸改变(对比D0M10-53-474(SEQ ID NO :1))。所述可变域任选a)在30位(依照Kabat编号)具有脯氨酸，和/或b)在53位(依照Kabat编号)具有赖氨酸，和/或c)在55位(依照Kabat编号)具有甘氨酸或赖氨酸，和/或d)在56位(依照Kabat编号)具有异亮氨酸或赖氨酸。在一个实施方案中，所述单可变域在55位(依照Kabat编号)具有赖氨酸并在56 位(依照Kabat编号)具有异亮氨酸。在一个方面，本发明提供了抗白细胞介素-13(IL_i;3)的免疫球蛋白单可变域，其中CDR(例如由Kabat所确定的)与D0M10_53_474(SEQ ID NO 1)的CDR完全相同并且其中所述单可变域包含在依照Kabat编号的28位含缬氨酸。任选地，所述单可变域的氨基酸序列与D0M10-53-474(SEQ ID NO :1)相比具有1、2、3、4或5个氨基酸改变，其中一个或多个改变任选在⑶R例如依照Kabat或Chothia的⑶R2中。任选所述单可变域不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。在一个方面，本发明提供了抗白细胞介素-13(IL_i;3)的免疫球蛋白单可变域， 其中除所述单可变域包含如上定义的SIDW[Z]TYYADSVKG、XGX' X"、KGGK, XGKI或HGKI 基序之外，CDR (例如由Kabat所确定的)与D0M10_53_474 (SEQ ID NO 1)的CDR完全相同。任选地，所述单可变域在依照Kabat编号的观位具有缬氨酸。任选所述单可变域不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。在另一个方面，本发明提供了抗白细胞介素-13(IL-i;3)的免疫球蛋白单可变域，其中所述可变域为 D0M10-53-546 (SEQ ID NO :2)、D0M10-53-567 (SEQ ID NO 3)、D0M10-53-568 (SEQ ID NO 4)或 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。在另一个方面， 本发明提供了抗白细胞介素-13(IL-i;3)的免疫球蛋白单可变域，其中所述可变域为 D0M10-53-546(SEQ ID NO :2)、D0M10-53_567 (SEQ ID NO 3)或D0M10-53-568(SEQ ID NO:4)。本发明的一个方面提供了由D0M10-53-546(SEQ ID NO :6)、D0M10-53-567 (SEQ ID NO 7), D0M10-53-568 (SEQ ID NO 8)或 D0M10-53-616 (SEQ ID NO 9)的核苷酸序列编码的抗白细胞介素-13(IL-i;3)免疫球蛋白单可变域。任选所述单可变域不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。本发明的一个方面提供了特异性地结合人IL-13和至少一种非人的灵长类IL-13 的抗白细胞介素-13(IL-13)免疫球蛋白单可变域。例如，所述可变域特异性地结合人 IL-13和食蟹猴(Cynomolgusmonkey)和/或猕猴IL-13和/或狒狒IL-13，例如人和食蟹猴的IL-13或人和猕猴的IL-13或人和狒狒的IL-13或人、猕猴和食蟹猴的IL-13。 所述单可变域可任选为本发明的任何前述方面中的单可变域。任选所述单可变域不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。在一个实施方案中，所述可变域以约5nM或更小、任选约4nM或更小、约3nM或更小、或者约2nM或更小、或者约InM或更小的解离常数(Kd)与人 IL-13和各种非人的灵长类IL-13结合。在一个实施方案中，可变域(i)以约InM或更小、 任选约500pM或更小、任选约250pM或更小、任选约150pM或更小、任选约IOOpM或更小、任选约 InM-约 ΙΟρΜ、约 InM-约 50pM 或约 InM-约 70pM、任选约 500pM_ 约 ΙΟρΜ、约 500pM_ 约 50pM 或约 500pM-约 70pM、任选 250pM-约 ΙΟρΜ、约 250pM_ 约 50pM 或约 250pM_ 约 70pM、任选约 150pM-约 ΙΟρΜ、约 150pM-约 50pM 或约 150pM_ 约 70pM、或任选约 IOOpM-约 ΙΟρΜ、约 IOOpM-约50pM或约IOOpM-约70pM的解离常数(Kd)结合人IL-13 ；禾口 (ii)以5nM或更小、 任选4、3、2或InM或更小、任选5_lnM的解离常数(Kd)结合非人(例如食蟹猴、猕猴或狒狒)IL_13。在一个实施方案中，另外或作为备选地，所述单可变域在依照Kabat编号的观位含有缬氨酸。在一个实施方案中，另外或作为备选地，所述单可变域包含序列XGX' X"， 其中依照Kabat编号G在M位并且X = H或 K;X' =G 或K;X"= K 或 I。在一个实施方案中，另外或作为备选地，所述可变域a)在30位(依照Kabat编号)具有脯氨酸，和/或b)在53位(依照Kabat编号)具有赖氨酸，和/或c)在55位(依照Kabat编号)具有甘氨酸或赖氨酸，和/或d)在56位(依照Kabat编号)具有异亮氨酸或赖氨酸。在一个实施方案中，另外或作为备选地，所述可变域在55位(依照Kabat编号) 具有赖氨酸并在56位(依照Kabat编号)具有异亮氨酸。本发明的单可变域，在所有方面是有利的，因为其展示了一个或多个以下优点⑴针对人IL-13的良好效价(比D0M10-53-474效价更好)；(ii)针对食蟹猴IL-13的良好效价(比D0M10-53-474效价更好)；(iii)针对猕猴IL-13的良好效价(比D0M10-53-474效价更好)；(iv)针对人和非人的灵长类(例如食蟹猴、猕猴或狒狒)IL_13的良好效价(比 D0M10_53_474 效价更好)；(ν)针对人、食蟹猴和猕猴IL-13的良好效价(比D0M10-53-474效价更好)；
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(vi)在原核细胞中良好的表达(任选优于D0M10-53-474)；(vii)对人 IL-13 的良好中和(优于 D0M10-53-474)；(viii)对食蟹猴IL-13的良好中和(优于D0M10-53-474)；(ix)对猕猴IL-13的良好中和(优于D0M10-53-474)；(χ)对人和非人的灵长类(例如食蟹猴、猕猴或狒狒)IL_13的良好中和(优于 D0M10-53-474)；(xi)对人、食蟹猴和猕猴IL-13的良好中和(优于D0M10-53-474)；(xii)在多于一个种类(species)的灵长类IL-13 (任选地，人IL-13和食蟹猴 IL-13和/或猕猴IL-13，例如人IL-13和食蟹猴IL-13 ；或人IL-13和猕猴IL-13 ；或人 IL-13和狒狒IL-13)之间的交叉反应性；和(xiii)蛋白酶稳定性(任选地，胰蛋白酶稳定性)。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振法例如通过Biacore 可确定 (i)-(v)的优点。在一个实施方案中，更好的效价通过更好的解离常数(Kd)示出。在一个实施方案中，优点(Vi)可通过在大肠杆菌中的表达来确定。在一个实施方案中，本发明的单可变域表达良好(在大肠杆菌中至少!Mg/升例如至少 5、10、15、20mg/升)。在一个实施方案中，本发明的单可变域在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酵母(Saccharomyces)中表达良好。在一个实施方案中，优点(vii)-(xi)可通过ELISA或标准HEKSTAT测定确定的中和作用来确定。在一个实施方案中，中和通过EC5tl示出。在一个实施方案中，优点(xii)可通过ELISA、Biacore 或标准HEK STAT测定确定。在一个实施方案中，交叉反应性通过解离常数(Kd)来表示。在一个实施方案中，优点(xiii)可如下确定在PBS缓冲液中，按dAb 胰蛋白酶为25 1的比将0. 3mg/ml单可变域与胰蛋白酶(例如胰蛋白酶活性> 5000单位/mg)混合。在30摄氏度下温育M小时后，确定温育后残留的有活性dAb的存在情况。在一个实施方案中，有活性的dAb的存在情况用残留的dAb活性百分比确定，这通过表面等离子体共振(例如Biacore )确定。M小时后至少20% (例如至少30%、40% 或50%)的活性百分比表示蛋白酶稳定的dAb。在另一个实施方案中，蛋白酶稳定的dAb 的存在情况利用ELISA确定，其中在温育后蛋白酶稳定的可变域在ELISA中具有的OD45tl读数至少为0. 404。在另一个实施方案中，有活性的dAb的存在情况由在温育后dAb是否特异性结合A蛋白或L蛋白来确定。在另一个实施方案中，有活性的dAb的存在情况通过凝胶电泳来确定，在温育后蛋白酶稳定的可变域在凝胶电泳中基本表现为单一条带。在一个实施方案中，本发明的单可变域具有优点(iv)和(X)。在一个实施方案中， 本发明的单可变域具有优点(V)和(Xi)。任选所述单可变域不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的单可变域用于本文公开的任何用途、 任何优点、任何疾病或病况的任何治疗和/或预防。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的单可变域在制备IL-13拮抗剂中的用途，用于本文公开的任何用途、任何优点、任何疾病或病况的任何治疗和/或预防。这些陈述为引入本文的权利要求中提供明确的基础。如通过经由表面等离子体共振(例如Biacore )确定的其对IL-13结合的解离常数(Kd)所表明，本发明的单可变域(D0M10-53-M6、D0M10-53-567、D0M10-53-568 和 D0M10-53-616)显示针对人和食蟹猴(cyno)两者IL-13良好的效价。本发明的单可变域比 D0M10-53-474有效得多。D0M10-53-567和D0M10-53-568对人和食蟹猴IL-13具有最好的效价。本发明的单可变域(D0M10-53-546、D0M10_53_567、D0M10-53-568和 D0M10-53-616)显示在多于一个种类的灵长类IL-13之间的交叉反应性。在一个方面，本发明提供用于提供在多于一个种类的灵长类IL-13之间、任选在以下IL-13种类之间交叉反应的单可变域的单可变域人和非人的灵长类IL-13、任选(i)人和食蟹猴IL-13种类、 ( )人和猕猴IL-13种类、(iii)人、食蟹猴和猕猴IL-13种类、或(iv)人和狒狒IL-13种类。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域在制备在多于一个种类的灵长类IL-13 之间、任选在以下IL-13种类之间交叉反应的IL-13拮抗剂中的用途人和非人的灵长类 IL-13、任选⑴人和食蟹猴IL-13种类、(ii)人和猕猴IL-13种类、(iii)人、食蟹猴和猕猴IL-13种类或(iv)人和狒狒IL-13种类。所述可变域特异性地结合人和非人的灵长类 IL-13(在实例中，人、食蟹猴和猕猴IL-13种类被可变域结合)。这是尤其有用的，因为药物开发通过需要在非人的灵长类系统例如食蟹猴和猕猴中测试先导药物侯选者，然后在人中测试该药物。提供可结合人和其它灵长类IL-13种类的药物允许在这些系统中测试结果， 并对使用相同药物的数据进行并列比较。这避免了需要寻找针对非人IL-13起作用的药物和针对性人IL-13起作用的单独药物的复杂性，还避免了对使用非完全相同的药物比较人和非人的灵长类中的结果的需要。任选地，免疫球蛋白单可变域对至少一种非人的灵长类(例如短属猴和/或猕猴和/或狒狒)IL_13的结合亲和力和对人IL-13的结合亲和力相差不多于10、50、100、500 或1000倍。在一个方面，本发明提供本发明单可变域，用于提供以下免疫球蛋白单可变域， 其对至少一种非人的灵长类(例如短属猴和/或猕猴和/或狒狒)IL-13的亲和力和对人 IL-13的结合亲和力相差不超过10、50、100、500或1000倍。在一个方面，本发明提供了依据本发明的单可变域在用于制备IL-13拮抗剂中的用途，其中免疫球蛋白单可变域对至少一种非人的灵长类(例如短属猴和/或猕猴和/或狒狒)IL-13的亲和力和对人IL-13的结合亲和力相差不超过10、50、100、500或1000倍。本发明的单可变域(D0M10-53-546、D0M10-53-567、D0M10-53-568和 D0M10-53-616)可中和多于一个种类的灵长类IL-13。在一个方面，本发明提供本发明的单可变域，用于中和多于一个种类灵长类IL-13，任选用于中和(i)人和食蟹猴IL-13种类、 ( )人和猕猴IL-13种类、(iii)人、食蟹猴和猕猴IL-13种类、或(iv)人和狒狒IL-13 种类。在一个方面，本发明提供本发明单可变域在制备IL-13拮抗剂中的用途，所述拮抗剂用于中和多于一个种类的灵长类IL-13，任选用于中和(i)人和食蟹猴IL-13种类、 ( )人和猕猴IL-13种类、(iii)人、食蟹猴和猕猴IL-13种类、或(iv)人和狒狒IL-13 种类。如以下的实施例所示,在ELISA或HEK STAT测定中D0M10-53-M6、D0M10-53-567、 D0M10-53-568和D0M10-53-616显示中和所有形式的被测试IL-13 (人、食蟹猴和猕猴 IL-13)。D0M10-53-546、D0M10-53-567 和 D0M10-53-568 显示出比 D0M10-53-474 更好地对人、食蟹猴和猕猴IL-13的中和效价。D0M10-53-616对于食蟹猴和猕猴IL-13是比 D0M10-53-474更有效得多的中和剂，并且对人IL-13也是大致相当的。单可变域(D0M10-53-567和D0M10-53-568)是尤其蛋白酶稳定的。在一个方面， 本发明提供了本发明的单可变域用于提供蛋白酶稳定的单可变域或IL-13拮抗剂。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域在制备用于提供蛋白酶稳定的IL-13拮抗剂中的用途。蛋白酶稳定性如下确定以25 1的dAb 胰蛋白酶比例于PBS缓冲液中，将0. 3mg/ml的单可变域与胰蛋白酶(例如，胰蛋白酶活性> 5000单位/mg)混合。在30摄氏度下温育M小时后，确定温育后残留的有活性dAb的百分比(例如使用Biacore )。24小时后有至少20% (例如至少30^^40%或50% )的百分比活性表明为蛋白酶稳定的dAb。对W02008149143作出参考。该申请的全部公开内容在此引作参考，以便在本文中提供对蛋白酶抗性的多肽和dAb ；用于选择这些物质的方法(包括可使用的不同蛋白酶和选择条件的公开内容)；这些物质的用途；含这些物质的组合物、配体和产品；这样的多肽和dAb的优点的进一步公开。这些公开内容明确包括在本公开内容中并形成本公开内容的部分，以用于本发明中。多肽和肽在包括工业应用在内的许多应用中已变成越来越重要的物质，并用作医用剂、治疗剂和诊断剂。然而，在某些生理状态，例如炎症状态(例如C0PD)和癌中，组织、 器官或动物(例如在肺中，肿瘤中或附近)中存在的蛋白酶的量可能增加。蛋白酶的这种增加可导致内源蛋白以及给予以治疗疾病的治疗肽、多肽和蛋白的加速降解和失活。因此， 一些具有体内用途(例如用于治疗、诊断或预防哺乳动物例如人的疾病)潜能的物质仅具有有限的功效，这是因为它们被蛋白酶快速降解和失活。蛋白酶抗性多肽提供了若干优点。例如，蛋白酶抗性多肽在体内比蛋白酶敏感的物质保持活性长，因此，保持功能持续足以产生生物效应的时间。存在对改良方法以选择抵抗蛋白酶降解并且还具有所需的生物活性的多肽的需要。特别有用的是，提供对胃肠道(GI 道)和/或肺系的液体和组织中存在的蛋白酶抵抗的肽和多肽，该系统包括肺。GI道和肺系均是用于哺乳动物例如人中疾病和不利病况的部位；蛋白酶抗性肽和多肽药物在该情况下应是有利的。本发明的单可变域(D0M10-53-546和 D0M10-53-616)比 D0M10-53-474 显示出在原核细胞中好得多的表达水平。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域(例如 D0M10-53-546和D0M10-53-616)，用于提供在原核细胞中具有的表达比D0M10-53-474的表达更好的单可变域。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域(例如D0M10-53-M6 和D0M10-53-616)在制备IL-13拮抗剂中的用途，其中所述单可变域在原核细胞中具有比 D0M10-53-474的表达更好的表达。在本发明的任何前述方面的一个实施方案中，单可变域特异性地结合人、食蟹猴和猕猴IL-13。特异性结合通过10微摩尔或更少、任选1微摩尔或更少的解离常数Kd 来表示。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可通过合适的试验来确定，包括例如 Scatchard分析和/或竞争性结合试验，例如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法例如 ELISA和夹心竞争测定法，及其不同的变体。结合亲和力任选使用表面等离子体共振(SPR)和Biacore (Karlsson等，1991)、利用Biacore系统(Uppsala，Sweden)来确定。所述Biacore系统使用表面等离子体共振(SPR, Welford K. 1991，Opt. Quant. Elect. 23 :1 ；Morton 禾口 Myszka，1998，Methods in Enzymology 295 268)以监控实时的生物分子相互作用，并使用以下表面等离子体共振， 其可检测由于远至300nm远的表面的折射率(refrative index)变化所致的玻璃支持体上的金薄膜表面的光的共振角度的变化。Biacore分析常规地得到结合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数和亲和力常数。结合亲和力通过使用Biacore表面等离子体共振系统(Biacore，Inc.)评价结合速率常数和解离速率常数得到。生物传感器芯片依照生产商 (Biacore)的说明书针对靶的共价偶合来活化。接着将靶稀释和注射至芯片上以得到固定化材料的响应单元的信号。因为共振单元(RU)的信号与固定化材料的质量成比例的，这表示基质上固定化的靶密度的范围。解离数据拟合至单址(one-site)模型得到k。ff+/_s. d.(测量的标准差)。对各个解离曲线计算拟一级速率常数(Kd’ s)，并以蛋白浓度的函数作图以得到k。n+/_s. e.(拟合的标准误差)。用于结合的平衡解离常数Kd' s根据Sra测量结果计算为k。ff/k。n-。在本发明的任何前述方面的一个实施方案中，在标准HEK STAT测定中，可变域以约 0. 1-约 2. OnM、任选约 0. 2-约 2. OnMj^J 0. 3-约 1. 5nM、约 0. 2-约 1. OnM 或约 0. 3-约 1. OnM的EC5tl中和人IL-13。在一个方面，本发明提供用于中和人IL-13的本发明可变域， 在标准HEK STAT测定中具有的EC50为约0. 1-约2. OnM、任选约0. 2-约2. OnM、约0. 3-约
I.5nM、约0.2-约LOnM或约0.3-约1. OnM。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域在制备IL-13拮抗剂中的用途，其中所述可变域或拮抗剂在标准HEKSTAT测定中以约 0. 1-约 2. OnM、任选约 0. 2-约 2. OnMj^JO. 3-约 1. 5nM、约 0. 2-约 1. OnM 或约 0. 3-约 1. OnM 的EC5tl中和人IL-13。在本发明的任何前述方面的一个实施方案中，所述可变域在标准HEK STAT测定中以约1-约20nM、任选约1-约15nM、约2-约15nM或约2-约11. 5nM的EC5tl中和猕猴IL-13。 在一个方面，本发明提供用于中和猕猴IL-13的本发明单可变域，在标准HEKSTAT测定中具有的EC5tl为约1-约20nM、任选约1-约15nM、约2-约15nM或约2-约11. 5nM。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域在制备IL-13拮抗剂中的用途，其中所述可变域或拮抗剂在标准HEK STAT测定中以约1-约20nM、任选约1-约15nM、约2-约15nM或约2-约
II.5nM 的 EC50 中和猕猴 IL-13。在本发明的任何前述方面的一个实施方案中，所述可变域在标准HEK STAT测定中以约1-约20nM、任选约5-约15nM或约5-约IOnM的EC5tl中和食蟹猴IL-13。在一个方面， 本发明提供用于中和食蟹猴IL-13的本发明单可变域，在标准HEK STAT测定中具有的EC5tl 为约1-约20nM、任选约5-约15nM或约5-约ΙΟηΜ。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域在制备IL-13拮抗剂中的用途，其中所述可变域或拮抗剂在标准HEK STAT测定中以约1-约20nM、任选约5-约15nM或约5-约IOnM的EC5tl中和食蟹猴IL-13。标准HEK STAT测定的实例如下⑴将抗IL-13dAb (或者含抗IL_13dAb的拮抗剂)与6ng/ml IL-13在37°C下、 5% CO2中温育一小时；(i i)将温育的混合物于微量滴定板中加入至含切104HEKBlue -STAT6细胞 (转染有STAT6基因和分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报道基因的HEK293细胞)每孔的DMEM(Dulbecco氏改进的Eagle培养基)；(iii)在37摄氏度下、5%二氧化碳中将平板温育M小时；(iv)检测报道基因产物并定量。在步骤(i)中，任选利用等体积的dAb和重组IL-13进行预温育。任选的是，dAb利用l/21og稀释液从400nm的顶浓度(测定中的2X终浓度)滴定以得到8个点的剂量响应曲线，接着将其与IL-13温育。在步骤(iv)中，任选将培养基上清与QuantiBlue (Invivogen) 混合并在640nm处读取吸光度。抗IL_13dAb活性导致STAT6活化的减少和与IL-13刺激相比A64tl的相应减少。 EC50值可利用技术人员已知的技术计算。"HEK 293细胞”是指命名为293(ATCC编号CRL-1573)的人胚肾细胞系或其衍生物。例如，293/SF细胞(ATCC编号CRL-1573. 1)为已适应在无血清培养基中生长的HEK 293 细胞。本发明中还考虑适应在其它培养条件中生长的HEK 293细胞，或任何类型的HEK 293 细胞或衍生物。HEK-Blue STAT6细胞稳定表达在融合至四个STAT6结合位点的IFNi^最小启动子控制下的报道基因分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。还参见Loignon等，“Mable high volumetric production of glycosylated human recombinant IFNalpha2b in HEK293 cells (糖苷化人重组IFNa 2b在HEK293细胞中的稳定高容量生产)”，BMC Biotechnology 2008,8 :65关于改造HEK293细胞和合适构建体的详述，该构建体可适合于改造转染有 STAT6基因和分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报道基因的HEK293细胞。在一个方面，本发明提供了包含本发明的抗IL-13免疫球蛋白单可变域的白细胞介素-13(IL-13)拮抗剂。任选所述拮抗剂并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。任选所述拮抗剂并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述拮抗剂并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)，任选其中所述mAb为抗IL_4mAb或抗 IL-5mAb。在一个实施方案中，所述拮抗剂与D0M10-53-M6 (SEQ ID NO :2)、 D0M10-53-567(SEQ ID NO :3)、D0M10-53_568 (SEQ ID NO 4)或D0M10-53-616(SEQ ID N0: 5)竞争与IL-13结合。任选所述拮抗剂并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。任选所述拮抗剂并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述拮抗剂并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)，任选其中所述mAb 为抗 IL_4mAb 或抗 IL_5mAb。 在一个实施方案中，所述IL-13为人IL-13。在另一个实施方案中，所述IL-13为食蟹猴 IL-13。在另一个实施方案中，所述IL-13为猕猴IL-13。在一个实施方案中，所述拮抗剂与 D0M10-53-546(SEQ ID NO :2)、D0M10-53_567(SEQ ID NO :3)、D0M10-53_568(SEQ ID NO :4) 或 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)竞争结合人 IL-13 和食蟹猴 IL-13。在另一个实施方案中，所述拮抗剂与D0M10-53-M6 (SEQ ID NO :2)、 D0M10-53-567(SEQ ID NO :3)、D0M10-53-568(SEQ ID NO 4)或 D0M10-53_616(SEQ ID NOj)竞争结合人IL-13、食蟹猴IL-13和猕猴IL-13。任选所述拮抗剂并不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。任选所述拮抗剂并不包含 D0M10-53-616 (SEQ ID N0: 5)。任选所述拮抗剂并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616(SEQ ID NO 5), 任选其中所述mAb为抗IL-4mAb或抗IL_5mAb。在一个方面，本发明提供用于肺部递送的本发明任何抗IL-13单可变域(例如D0M10-53-616)或拮抗剂、组合物或融合蛋白。在一个方面，本发明提供了抗IL-13单可变域或拮抗剂或融合蛋白用于向患者的肺部递送。在一个方面，本发明提供了本发明的任何抗IL-13单可变域(例如D0M10-53-616)或拮抗剂、组合物或融合蛋白在制备用于肺部递送的药物中的用途。在一个方面，本发明提供了本发明的任何抗IL-13单可变域(例如 D0M10-53-616)或拮抗剂、组合物或融合蛋白在制备用于向患者肺部递送的药物中的用途。 在一个实施方案中，可变域本身或者拮抗剂或融合蛋白的部分对leucozyme和/或胰蛋白酶有抗性。本发明提供了治疗、抑制或预防其它肺病的方法，例如慢性阻塞性肺病(COPD)或肺炎。可依照本发明治疗、抑制或预防的其它肺病包括例如囊性纤维化病和哮喘(例如类固醇抵抗型哮喘)。因此，在另一个方面，本发明是用于治疗、抑制或预防肺病(例如囊性纤维化病、哮喘)的方法，所述方法包括向有需要哺乳动物给予治疗有效剂量或治疗有效量的本发明多肽、融合蛋白、单可变域(例如D0M10-53-616)、拮抗剂或组合物。在特定的实施方案中，所述多肽、融合蛋白、单可变域(例如D0M10-53-616)、拮抗剂或组合物经由肺部递送例如通过吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)或通过系统递送(例如胃肠外、静脉内、肌内、腹腔内、皮下)给予。在本发明的另一个方面，提供包含本发明任何多肽、单可变域(例如 D0M10-53-616)、组合物或拮抗剂和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。此外，本发明提供了利用本发明的任何多肽、单可变域(例如D0M10-53-616)、组合物或拮抗剂治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述疾病为癌症或炎性疾病，如类风湿性关节炎、哮喘或克罗恩氏病(Crohn，s disease)。在本发明的一个方面，将本发明的任何多肽、单可变域(例如D0M10-53-616)、组合物或拮抗剂提供用于治疗和/或预防人中IL-13介导的病况。在另一个方面，提供多肽、 单可变域、组合物或拮抗剂在制备用于治疗或预防人中IL-13介导的病况中的用途。在另一个方面，提供治疗和/或预防人患者中IL-13介导的病况的方法，所述方法包括将本发明的任何多肽、单可变域(例如D0M10-53-616)、组合物或拮抗剂给予所述患者。在一个实施方案中，所述IL-13介导的病况为呼吸病况。在一个实施方案中，所述IL-13介导的病况选自肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、伴有嗜酸粒细胞增多的肺浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化病、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺动脉血栓栓塞、胸膜病症、纵隔病症、隔膜病症、通气不足、换气过度、睡眠性呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉沉着病、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭性肺炎球菌病、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺病、肺孢子虫病、 肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多病X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿肺病、结节病和韦格纳氏 (Wegener' s)肉芽肿病。本发明的一个方面提供了包含本发明的多肽、单可变域(例如D0M10-53-616)、组合物或拮抗剂的肺部递送装置。所述装置可为吸入器或鼻内给药装置。本发明的配体(例如多肽、单可变域、组合物或拮抗剂)可抑制IL-13与 IL-13Ra 1和/或IL-13Ra 2的结合、抑制IL-13的活性、和/或在基本不抑制IL-13与IL-13Ra 1和/或IL-13Ra 2的结合的情况下抑制IL-13的活性。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域(例如D0M10-53-616)在制备IL-13拮抗剂中的用途，所述IL-13拮抗剂用于抑制IL-13与IL-13Ra 1和/或IL_13Ra 2的结合、抑制IL-13的活性、和/或在基本不抑制IL-13与IL_13Ra 1和/或IL_13Ra 2的结合的的情况下抑制IL-13的活性。在一个实施方案中，结合IL-13的配体(例如，免疫球蛋白单可变域)抑制IL-13 与IL-13受体(例如IL-13Ra l、IL-13Ra 2)的结合，抑制浓度50 (IC50)为彡约ΙΟμΜ、彡约 1μΜ、< 约 100ηΜ、< 约 10ηΜ、< 约 InM、< 约 500ρΜ、< 约 300ρΜ、< 约 IOOpM 或；^约 ΙΟρΜ。 IC50任选利用体外受体结合测定法例如本文所述的测定法确定。还考虑的是，配体(例如免疫球蛋白单可变域)在合适的体外测定中任选抑制 IL-13诱导的功能，中和剂量50(ND50)为彡约10 μ M、彡约ΙμΜ、彡约ΙΟΟηΜ、彡约ΙΟηΜ、彡约 11^、<约50(^]\1、；^约30(^]\1、；^约 100pM、< 约 10pM、< 约 ΙρΜ、< 约 500fM、< 约 300fM、< 约100fM、<约10fM。例如，所述配体在体外测定(例如本文所述的测定)中可抑制IL-13 诱导的TF-I细胞(ATCC登记号CRL-2003)的增殖，其中将TF-I细胞与终浓度为5ng/ml的 IL-13混合。考虑的是，在诸如本文所述的测定等体外测定中，所述配体任选抑制IL-13诱导的B细胞增殖至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%，其中将 Ix IO5个B细胞与10或IOOnm的抗IL_13dAb温育。在本发明的一个方面，提供包含本发明的单可变域的双特异性配体。在更具体的实施方案中，配体具有对IL-4和IL-13的结合特异性，并包含对IL-4具有结合特异性的免疫球蛋白单可变域，所述单可变域与选自公开于W02007085815的抗IL-4域抗体(dAb) 的抗IL-4dAb竞争与IL-4结合，这样的dAb的序列在此以其整体结合用于本发明的双特异性配体。任选所述配体并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)组成。任选所述配体并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)，任选其中所述 mAb 为抗 IL_4mAb 或抗 IL_5mAb。在本发明的所有方面，免疫球蛋白单可变域各自独立选自的抗体重链和轻链单可变域，例如H和V,在一些实施方案中，所述双特异性配体可为以下IgG样形式，其包含对IL-13 的结合特异性具有两个免疫球蛋白单可变域(例如，彼此相同的两个这样的域)和对另一种靶标例如IL-4具有结合特异性的两个免疫球蛋白单可变域。任选所述配体并不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)组成。任选所述配体并不包含 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。 任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616(SEQ ID N0:5)，任选其中所述mAb为抗IL-4mAb或抗IL_5mAb。在一些实施方案中，所述双特异性配体可包含抗体Fc区。任选所述配体并不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)组成。任选所述配体并不包含 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。 任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616(SEQ ID N0:5)，任选其中所述mAb为抗IL-4mAb或抗IL_5mAb。在一些实施方案中，所述双特异性配体可包含IgG恒定区。任选所述配体并不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)组成。任选所述配体并不包含 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。 任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616(SEQ ID N0:5)，任选其中所述mAb为抗IL-4mAb或抗IL_5mAb。在其它实施方案中，任何本文所述配体(例如拮抗剂或单可变域)还包括半衰期延长部分，例如聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含体内增强半衰期的多肽的结合位点的部分。在一些实施方案中，所述半衰期延长部分是包含在体内增强半衰期的多肽的结合位点的部分，其选自亲和体、SpA域、LDL受体A类域、EGF域和avimer。在另外实施方案中，所述半衰期延长部分为聚乙二醇部分。在一个实施方案中， 所述拮抗剂包含与聚乙二醇部分(任选其中所述部分具有大小为约20-约50kDa、任选约 40kDa的直连或支链PEG)连接的本发明单可变域(任选由其组成)。对W004081(^6关于 dAb和结合部分的PEG化的更多详述作出参考。在一个实施方案中，所述拮抗剂由与PEG 相连的dAb单体组成，其中所述dAb单体为本发明的单可变域，任选D0M10-53-M6(SEQ ID NO :2)、D0M10-53-567 (SEQ ID NO :3)、D0M10-53-568 (SEQ ID NO 4)或 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。该拮抗剂可提供用于炎性疾病、肺部病况(例如哮喘、流感或C0PD)或癌症的治疗，并任选用于静脉内给药。在其它实施方案中，所述半衰期延长部分为包含用于血清白蛋白或新生Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段(例如免疫球蛋白单可变域)。本发明还涉及用于治疗或诊断的本发明配体(例如拮抗剂或单可变域)，以及本发明配体在制备用于治疗、预防或抑制本文所述的疾病(例如过变应性疾病、Th2-介导的疾病、哮喘、癌症)的药物中的用途。任选地，所述配体并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5) 组成。任选所述配体并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616 (SEQ ID NO 5),任选其中所述mAb为抗IL_4mAb或抗 IL_5mAb0本发明还涉及本发明的配体(例如拮抗剂或单可变域)用于治疗、抑制或预防Th2 型免疫应答。任选地，所述配体并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。任选所述配体并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb) 的 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)，任选其中所述 mAb 为抗 IL_4mAb 或抗 IL_5mAb。本发明还涉及治疗方法，所述治疗方法包括将治疗有效量的本发明配体(例如拮抗剂或单可变域)给予需要其的受试者。在一个实施方案中，本发明涉及用于抑制Th2型免疫应答的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的本发明配体。任选地，所述配体并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。任选所述配体并不包含D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616 (SEQ ID NO: 5)，任选其中所述mAb为抗IL-4mAb或抗IL_5mAb。在另外实施方案中，本发明涉及治疗哮喘的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的本发明配体(例如拮抗剂或单可变域)。任选地，所述配体并不由 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)组成。任选所述配体并不包含 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。 任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616(SEQ ID N0:5)，任选其中所述mAb为抗IL-4mAb或抗IL_5mAb。在其它实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的本发明配体(例如拮抗剂或单可变域)。任选地，所述配体并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)组成。任选所述配体并不包含 D0M10-53-616 (SEQ ID NO :5)。 任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的D0M10-53-616(SEQ ID N0:5)，任选其中所述mAb为抗IL-4mAb或抗IL_5mAb。本发明还涉及包含本发明的配体(例如拮抗剂或单可变域)和生理上可接受的载体的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，所述组合物包含用于静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、动脉内给药、鞘内给药、关节内给药、皮下给药、肺部给药、鼻内给药、 阴道给药或直肠给药的溶媒。本发明还涉及包含本发明的组合物(例如药物组合物)的药物递送装置。在一些实施方案中，所述药物递送装置包含多种治疗有效剂量的配体。在其它实施方案中，所述药物递送装置选自胃肠外递送装置、静脉递送装置、肌内递送装置、腹膜内递送装置、透皮递送装置、肺部递送装置、动脉递送装置、鞘内递送装置、关节内递送装置、皮下递送装置、鼻内递送装置、阴道递送装置、直肠递送装置、注射器、 透皮递送装置、胶囊、片剂、喷雾器、吸入器、喷洒器、雾化器、弥雾机、干粉吸入器、定量吸入器、定量喷雾器、定量弥雾机、定量喷洒器和导管。本发明的配体提供了几个优点。例如，如本文所述，可将配体定制以具有所需的体内血清半衰期。域抗体比常规抗体小得多，并且可经给予以获得比常规抗体更好的组织渗透。因此，dAb和包含dAb的配体当给予以治疗疾病(例如Th2介导的疾病、哮喘、变应性疾病、癌症(例如肾细胞癌))时，提供了优于常规抗体的优点。例如，哮喘(例如变应性哮喘)可为IgE介导的或非IgE介导的，而对IL-4、IL-13或IL-4和IL-13具有结合特异性的配体可给予以治疗IgE介导和非IgE介导的哮喘。类似地，由于IL-4和IL-13的生物活性的重叠性和相似性，用对IL_4和IL-13具有结合特异性的配体的治疗可给予患者(例如具有变应性疾病(例如变应性哮喘)的患者)以利用单一治疗剂提供优良的治疗。本发明的配体可如本文所述配制。例如，本发明的配体可经形式化以定制体内血清半衰期。若需要的话，所述配体还可包含如本文所述的毒素或毒素部分。在一些实施方案中，所述配体包含表面活性毒素，例如自由基产生剂(例如含硒的毒素)或放射性核素。 在另外的实施方案中，所述毒素或毒素部分是具有对胞内靶标有结合特异性的结合位点的多肽域(例如dAb)。在特定的实施方案中，所述配体为对IL-13 (例如人IL-13)有结合特异性的IgG样形式。本发明还涉及在变应原致敏的受试者中抑制外周血单核细胞(PBMC)的增殖的方法，所述方法包括给予受试者包含任何本发明配体(例如拮抗剂或单可变域)的药物组合物。在一些实施方案中，所述变应原选自屋尘螨、猫变应原、草变应原、霉菌变应原和花粉变应原。本发明还涉及抑制受试者中B细胞的增殖的方法，所述方法包括给予受试者包含本发明配体的药物组合物。任选地，所述配体并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)组成。任选所述配体并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)，任选其中所述mAb 为抗 IL_4mAb 或抗 IL_5mAb。本发明还涉及用于治疗、预防或抑制本文所述的疾病(例如Th2介导的疾病、 变应性疾病、哮喘、癌症)的药物组合物，所述组合物包含本文所述的配体作为活性成分。任选地，所述配体并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)组成。任选所述配体并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述配体并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)，任选其中所述 mAb 为抗 IL_4mAb 或抗 IL_5mAb。在一个方面，本发明提供了包含本发明的单可变域的融合蛋白。所述可变域可与例如肽或多肽或蛋白融合。在一个实施方案中，所述可变域与抗体或抗体片段例如单克隆抗体融合。一般而言，融合可如下来实现通过从单个核酸序列表达融合产物或通过表达包含单可变域的多肽，接着利用常规的技术将该多肽装配成更大的蛋白或抗体形式。任选地，所述融合蛋白并不由D0M10-53-616(SEQ ID NO : 组成。任选所述融合蛋白并不包含D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。任选所述融合蛋白并不包含连接有单克隆抗体(mAb)的 D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)，任选其中所述 mAb 为抗 IL_4mAb 或抗 IL_5mAb。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变域、拮抗剂或融合蛋白包含抗体恒定域。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变域、拮抗剂或融合蛋白包含抗体Fe，任选其中Fc的N端与可变域的C端相连(任选直接相连)。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变域、拮抗剂或融合蛋白包含半衰期延长部分。所述半衰期延长部分可为聚乙二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含体内增强半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。所述半衰期延长部分可为包含用于血清白蛋白或新生 Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。所述半衰期延长部分可为dAb、抗体或抗体片段。在一个实施方案中，提供所述免疫球蛋白单可变域或拮抗剂或融合蛋白以使所述可变域(或拮抗剂或融合蛋白所包含的可变域)还包含聚亚烷基二醇部分。所述聚亚烷基二醇部分可为聚乙二醇部分。进一步的论述在以下提供。在一个实施方案中，本发明的单可变域结合人IL-13的解离常数(Kd)为如通过表面等离子体共振所确定的约10-约150pM、任选约50-约150pM、任选约70-约150pM。在一个方面，本发明提供结合人IL-13的本发明单可变域，解离常数(Kd)为如通过表面等离子体共振所确定的约10-约150pM、任选约50-约150pM、任选约70-约150pM。在一个方面， 本发明提供了本发明的单可变域在制备IL-13拮抗剂中的用途，其中所述可变域或拮抗剂结合人IL-13的解离常数(Kd)为如通过表面等离子体共振所确定的约10-约150pM、任选约50-约150pM、任选约70-约150pM。在一个方面，本发明的单可变域结合食蟹猴IL-13的解离常数(Kd)为如通过表面等离子体共振所确定的约1-约5nM。在一个方面，本发明提供具有如通过表面等离子体共振所确定的约1-约5nM解离常数(Kd)的用于结合食蟹猴IL-13的本发明单可变域。在一个方面，本发明提供了本发明的单可变域在制备IL-13拮抗剂中的用途，其中所述可变域或拮抗剂结合食蟹猴IL-13的解离常数(Kd)为如通过表面等离子体共振所确定的约1-约 5nM。在一个实施方案中，将本发明的单可变域(例如D0M10-53-616)提供为dAb单体， 任选未形式化的(例如未PEG化或半衰期延长的)或与PEG相连，任选作为干粉制剂，任选用于通过吸入(例如肺部递送)递送给患者，任选用于治疗和/或预防肺部病况(例如哮喘、COPD或流感)。在一个实施方案中，将本发明的单可变域提供为dAb单体(未PEG化或半衰期延长的)，任选用于治疗和/或预防肺部病况(例如哮喘、COPD或流感)。在一个方面，本发明提供本发明任何方面或实施方案的单可变域(例如
26D0M10-53-616)、蛋白、多肽、拮抗剂、组合物或装置，用于提供一个或多个以下目的(以下目的中的两个以上的明确组合在此公开并可为权利要求的主题)⑴有效结合人IL_13(例如具有的解离常数(Kd)为约Inm或更小、任选约500pM 或更小、任选约250pM或更小、任选约150pM或更小、任选约IOOpM或更小；任选约InM至约
10、约50或约70pM；任选约500至约10、约50或约70pM ；任选约250至约10、约50或约 70pM ；任选约150至约10、约50或约70pM ；或任选约100至约10、约50或约70pM)；(ii)有效结合非人的灵长类IL_13(例如食蟹猴、猕猴或狒狒IL-13)(例如，具有的解离常数(Kd)为约5nM或更小、任选约4、约3、约2或约InM或更小、任选约1_约5nM)；(iii)有效结合人IL_13(例如具有的解离常数(Kd)为约InM或更小、任选约 500pM或更小、任选约250pM或更小、任选约150pM或更小、任选约IOOpM或更小；任选约 InM至约10、约50或约70pM ；任选约500至约10、约50或约70pM ；任选约250至约10、约 50或约70pM ；任选约150至约10、约50或约70pM ；或任选约100至约10、约50或约70pM) 和有效结合非人的灵长类IL_13(例如食蟹猴、猕猴或狒狒IL-13)(例如，具有的解离常数 (Kd)为约5nM或更小、任选约4、约3、约2或约InM或更小、任选约1_约5nM)；(iv)有效结合人、食蟹猴和猕猴IL_13(例如结合人IL-13的解离常数(Kd)为约 InM或更小、任选约500pM或更小、任选约250pM或更小、任选约150pM或更小、任选约IOOpM或更小；任选约InM至约10、约50 或约70pM ；任选约500至约10、约50或约70pM ；任选约250至约10、约50或约70pM ；任选约150至约10、约50或约70pM ；或任选约100至约10、约50或约70pM ；并且结合食蟹猴和猕猴IL-13各自的解离常数(Kd)为约5nM或更小、任选约4、约3、约2或约InM或更小、任选约1-约hM)；(ν)在原核细胞中的良好表达(例如至少约:3mg/升的在原核细胞(例如大肠杆菌)中的表达)；(vi)在患者中人IL-13的有效中和，例如使用以下单可变域、蛋白、多肽、拮抗剂或组合物的中和，其在标准HEK STAT测定中以约0. 1-约2. OnM、任选约0. 2-约2. OnM、约 0. 3-约 1. 5nM、约 0. 2-约 1. OnM 或约 0. 3-约 1. OnM 的 EC50 中和人 IL-13 ；(vii)在患者中人IL-13的有效中和，例如使用以下单可变域、蛋白、多肽、拮抗剂或组合物的中和，其在标准HEK STAT测定中以约1-约15nM、任选约5-约15nM或约5-约 IOnM的EC50中和食蟹猴IL-13 ；(viii)在患者中人IL-13的有效中和，例如使用以下单可变域、蛋白、多肽、拮抗剂或组合物的中和，其在标准HEK STAT测定中以约1-约15nM、约2-约15nM或约2-约
11.5nM 的 EC50 中和猕猴 IL-13 ；(ix)对人IL-13和非人的灵长类的有效中和，例如使用以下单可变域、蛋白、多肽、拮抗剂或组合物的中和，其在标准HEK STAT测定中以约0. 1-约2. OnM、任选约0. 2-约 2. OnM、约 0. 3-约 1. 5nM、约 0. 2-约 1. OnM 或约 0. 3-约 1. OnM 的 EC50 中和人 IL-13 ；并且在标准HEK STAT测定中以约1-约20nM、任选约5-约15nM或约5-约IOnM的EC5tl中和非人的灵长类IL-13 ；(χ)提供在多于一个种类的灵长类IL-13 (任选，人和食蟹猴和/或猕猴IL_13，例如人和食蟹猴IL-13或人和猕猴IL-13或人和狒狒IL-13)之间的交叉反应性；和
(xi)提供蛋白酶稳定性(任选胰蛋白酶稳定性)。在一个方面，本发明提供了本发明任何方面或实施方案的单可变域(例如 D0M10-53-616)、蛋白、多肽、拮抗剂、组合物或装置)在提供紧接的上段中(i)-(xi)的一个或多个中的用途。本发明还提供了相应的方法。作出对W02007085815的参考，其公开了抗IL-13免疫球蛋白单可变域。该文件的公开内容在此以其全部内容引入，特别是提供用于抗IL-13单可变域、配体、拮抗剂等的用途、形式、选择方法、制备方法、配制方法和测定，所以这些公开内容可具体和明确地用于本发明的上下文中，包括为引入本公开内容的权利要求中提供明确描述。所述抗IL-13是可为任何合适的免疫球蛋白可变域的免疫球蛋白单可变域，并且任选为人可变域或包含或来自人框架区(例如DP47或DPK9框架区)的可变域。在某些实施方案中，所述可变域基于如本文所述的通用框架。在某些实施方案中，具有对IL-13有结合特异性的结合位点的多肽域(例如免疫球蛋白单可变域)抵抗聚集，可逆地解折叠(参见W004101790，其教导在此引作参考)。核酸分子、载体和宿主细胞本发明还提供编码如本文所述的配体(单可变域、融合蛋白、多肽、双特异性配体和多特异性配体)的分离和/或重组核酸分子。在一个方面，本发明提供编码包含本发明免疫球蛋白单可变域的多肽的分离或重组核酸。在一个实施方案中，所述核酸包含D0M10-53-M6(SEQ ID NO :6)、 D0M10-53-567(SEQ ID NO :7)、D0M10-53-568(SEQ ID NO 8)或 D0M10-53-616(SEQ ID NO 9)的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸包含D0M10-53-M6(SEQ ID NO :6)、 D0M10-53-567 (SEQ ID NO 7)或 D0M10-53-568 (SEQ ID NO 8)的核苷酸序列。在一个方面，本发明提供分离或重组核酸，其中所述核酸包含与 D0M10-53-546(SEQ ID NO :6)、D0M10-53_567(SEQ ID NO :7)、D0M10-53_568(SEQ ID NO :8) 或D0M10-53-616(SEQ ID NO :9)的核苷酸序列有至少99%同一性的核苷酸序列，并且其中所述核酸编码包含与IL-13特异性结合的免疫球蛋白单可变域的多肽。任选地，所述核酸并不由核苷酸序列D0M10-53-616(SEQ ID NO 9)组成或包含核苷酸序列D0M10-53-616 (SEQ ID NO 9)。在一个方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。在一个方面，本发明提供了包含本发明核酸或所述载体的宿主细胞。提供制备包含免疫球蛋白单可变域的多肽的方法， 所述方法包括将宿主细胞保持在适于表达所述核酸或载体条件下，从而制备包含免疫球蛋白单可变域的多肽。任选地，所述方法还包括以下步骤分离所述多肽和任选产生变体例如突变的变体，其在标准HEK STAT测定中具有比分离的多肽改良的亲和力(Kd)、对IL-13中和的EC5tl。本文称为“分离的”核酸是已从其起源来源的基因组DNA或细胞RNA的核酸(例如如其存在于细胞或核酸的混合物例如文库中)中分离出来的核酸，并且包括通过本文所述的方法或其它合适的方法得到的核酸，包括基本纯的核酸、通过化学合成以及通过生物方法和化学方法的组合制备的核酸以及分离的重组核酸(参见例如Daugherty，B. L.等， Nucleic Acids Res. , 19(9) :2471-2476(1991) ；Lewis, Α. P.和 J. S. Crowe, Gene, 101 : 297-302(1991))ο
本文称为“重组的”核酸为已通过重组DNA方法制备的核酸，包括通过依靠人工重组的方法的程序(例如聚合酶链反应(PCR)和/或使用限制性内切酶克隆至载体中)产生的核酸。在某些实施方案中，所述分离和/或重组核酸包含编码如本文所述的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含以下氨基酸序列，其与本文公开的结合IL-13的dAb的氨基酸序列(例如 D0M10-53_546(SEQ ID NO:2) ；D0M10-53-567 (SEQ ID NO:3) ；D0M10-53-568 (SEQ ID NO 4)；或D0M10-53-616(SEQ ID NO :5))有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91 %、至少约92 %、至少约93 %、至少约94 %、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98%或至少约99%氨基酸序列同一性。核苷酸序列同一性可在编码所选抗IL-13dAb 的核苷酸序列全长内进行测定。本发明还提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，所述载体为包含可操作地与本发明重组核酸连接的一种或多种表达控制元件或序列的表达载体。本发明还提供了包含本发明的重组核酸分子或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质粒、噬粒)、表达控制元件、宿主细胞和用于制备本发明的重组宿主细胞的方法为本领域所熟知，并且在本文进一步描述实例。合适的表达载体可含有许多组分，例如复制起点、选择标记基因、一种或多种表达控制元件例如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子)和/或一种或多种翻译信号、 信号序列或前导序列等。若存在有表达控制元件和信号序列，可通过载体或其它来源提供。 例如，编码抗体链的克隆的核酸的转录控制序列和/或翻译控制序列可用于指导表达。启动子可提供用于在所需的宿主细胞中表达。启动子可为组成型或诱导型的。例如，启动子可以可操作地与编码抗体、抗体链或其部分的核酸连接，使得其指导所述核酸的转录。可获得许多用于原核宿主(例如用于大肠杆菌的Iac启动子、tac启动子、T3启动子、T7启动子)和真核宿主(例如猿猴病毒40的早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)的合适启动子。此外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记，和在复制型表达载体的情况下还包含复制起点。编码赋予抗生素抗性或药物抗性的产物的基因是常用选择标记，并可用于原核细胞(例如内酰胺酶基因(氨苄西林抗性)、用于四环素抗性的 Tet基因)和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨卡西林、或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许在许多宿主中用甲氨喋呤来选择。编码宿主营养缺陷型标记的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、HIS;3)常用作酵母的选择标记。还考虑使用病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体和能够整合至宿主细胞基因组内的载体，例如逆转录病毒载体。用于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇khnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P. methanol!ca)、巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的合适的表达载体为本领域所熟知。合适的宿主细胞可为原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 (B. subtilis)和/或其它合适的细菌；真核细胞，例如真菌细胞或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母、曲霉(Aspergillussp.)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉胞菌(Neurospora crassa))，或其它低等真核细胞和高等真核生物的细胞， 例如来自昆虫(例如果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(W0 94/26087(0' Connor))、哺乳动物(例如COS细胞，例如COS-I (ATCC登记号CRL-1650)和C0S-7 (ATCC登记号 CRL-1651)、CHO (例如 ATCC 登记号 CRL-9096、CHO DG44 (Urlaub, G.和 Chasin，LA.，Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77 (7) :4216-4220 (1980))) ,293 (ATCC 登记号 CRL-1573)、HeLa(ATCC 登记号 CCL-2)、CV1 (ATCC登记号 CCL-70)、W0P (Dailey, L.等，J. Virol, 54 :739-749 (1985)、 3T3、293T (Pear, W. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，90 :8392-8396 (1993)), NSO 细胞、SP2/0、HuT 78细胞等或植物(例如烟草)的细胞。(参见例如Ausubel，F.M.等编辑.Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学的现有方案)，Greene Publishing Associates 和 John Wiley & Sons Inc. (1993)·)。在一些实施方案中，宿主细胞为分离的宿主细胞并且不是多细胞有机体(例如植物或动物)的部分。在某些实施方案中，宿主细胞为非人宿主细胞。本发明还提供了制备本发明的配体(例如双特异性配体、多特异性配体)的方法， 所述方法包括将含有本发明重组核酸的重组宿主细胞保持在适于所述重组核酸表达的条件下，从而表达所述重组核酸并产生配体。在一些实施方案中，所述方法还包括分离所述配体。对W0200708515，161页第M行至189页第10行关于适用于本发明实施方案的公开内容的详述作出参考。因此该公开内容在此引作参考，如同其明确出现在本公开内容的原文中一样并涉及本发明的实施方案，并对引入以上权利要求中的公开内容提供明晰的支持。这包括提供以下详述的W0200708515，161页第M行至189页第10行中示出的公开内容“基于免疫球蛋白的配体的制备O^r印aration of Immunoglobulin Based Ligands) ”、“文库载体系统(Library vector systems) ”、“文库构建(Library Construction)，，、“组合单可变域(Combining Single Variable Variable Domains)，，、“配体的表征(Characterisation of Ligands) ”、“配体的结构(Structure of Ligands) ”、“骨架(Skeletons)”、“蛋白支架(Protein Scaffolds) ”、“用于构建配体的支架(Scaffolds for Use in Constructing Ligands)，，、"正规序列的多样性(Diversification of the Canonical kquence) ” 和“治疗和诊断组合物和用途(Therapeutic and diagnostic compositions and uses) ”，以及对“可操作地连接”、“天然的”、“预防”、“抑制”、“治疗”、“变应性疾病”、“Th2介导的疾病”、“治疗有效剂量”和“有效的”的定义。形式增大的半衰期在免疫球蛋白、特别是抗体和最特别地小尺寸的抗体片段的体内应用中是有用的。这样的片段(Fv、二硫键合的FV、Fab、SCFV、dAb)经历被身体的快速清除； 因此，尽管它们能够快速到达身体的大多数部分，并且快速产生并更易处理，但其体内应用因其在体内仅仅短暂存留而受限。本发明的一个实施方案通过提供在体内半衰期增大的配体和因此配体的功能性活性在体内存留更长的时间来解决该问题。药代动力学分析和确定配体半衰期的方法对于本领域的技术人员是熟悉的。 详述可参见Kenneth，A等药物的化学稳定性药剂师手册(Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists)禾口 Peters 等，药代动力学分析实用方法(Pharmacokinetc analysis :A Practical Approach) (1996)。还对“药代动力学 (Pharmacokinetics)，，，M Gibaldi 禾口 D Perron,由 Marcel Dekker 出版，第 2Rev. ex 版 (1982)作出参考，该文献描述了药代动力学参数，例如ta半衰期和t β半衰期和曲线下面积(AUC)。半衰期(t1/2a和和AUC可根据配体的血清浓度对时间的曲线确定。例如 WinNonlin 分析包(可购自 Pharsight Corp.，Mountain View, CA94040, USA)可用于对曲线建模。第一阶段(α阶段)中配体在患者中主要经历分布，具有一些消除。第二阶段(β 阶段)是当配体已分布并且血清浓度随着配体从患者中清除而减小的末期。ta半衰期是第一阶段的半衰期，而ti3半衰期是第二阶段的半衰期。因此，在一个实施方案中，本发明提供了配体或包含本发明的配体的组合物，其具有的ta半衰期的范围为15分钟或更长。 在一个实施方案中，该范围的下端是30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、 6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外，或者备选地，本发明的配体或组合物具有的t α半衰期的范围大至12小时并包含12小时。在一个实施方案中，该范围的上端为11、 10、9、8、7、6或5小时。合适的范围的实例为1-6小时、2-5小时或3-4小时。在一个实施方案中，本发明提供配体(多肽、dAb或拮抗剂)或包含本发明配体的组合物，其具有的ti3半衰期的范围为约2. 5小时或更长。在一个实施方案中，该范围的下端为约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约10小时、约11小时或约12小时。此外，或备选地，本发明的配体或组合物具有的t β半衰期的范围为大至21天并包含 21天。在一个实施方案中，该范围的上端为约12小时、约M小时、约2天、约3天、约5天、 约10天、约15天或约20天。在一个实施方案中，本发明的配体或组合物具有的ti3半衰期的范围为约12-约60小时。在另一个实施方案中，其范围在约12-约48小时。在又一个实施方案中，其范围在约12-约沈小时。此外或作为以上标准的备选，本发明提供配体或包含本发明配体的组合物，其具有的AUC值(曲线下面积)的范围为约lmg*min/ml或更多。在一个实施方案中，该范围的下端为约5、约10、约15、约20、约30、约100、约200或约300mg · min/ml。此外或备选地， 本发明的配体或组合物具有的AUC的范围大至约600mg -min/ml0在一个实施方案中，该范围的上端为约500、约400、约300、约200、约150、约100、约75或约50mg 'min/ml 在一个实施方案中，本发明的配体具有的AUC的范围选自以下约15-约150mgmin/ml、约15-约 IOOmg · min/ml、约 15-约 75mg · min/ml 禾口约 15-约 50mg · min/ml。本发明的多肽和dAb和包含这些多肽和dAb的拮抗剂可经形式化以具有较大的流体动力学大小，例如通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区或通过缀合至抗体结构域。例如将多肽、dAb和拮抗剂形式化为抗体的较大抗原结合片段或抗体(例如形式化为Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab‘ )2、IgG、 scFv)ο本发明配体(例如dAb单体和多聚体)的流体动力学大小可利用本领域熟知的方法确定。例如，可利用凝胶过滤层析确定配体的流体动力学大小。用于确定配体的流体动力学大小的合适凝胶过滤基质例如交联琼脂糖基质是熟知的并易于得到。配体形式的大小(例如与dAb的单体相连的PEG部分的大小)可视所需的应用而变。例如，当配体意在离开循环并进入外周组织时，所需的是保持配体的流体动力学大小低，以促进从血流中外渗。或者，当所需的是使配体保持在系统循环中持续较长的时期时， 可增大配体的大小，例如通过形式化为Ig样蛋白。ii丄寸靶向 曾大体内半衰其月的抗JC或表位的半衰其月延长
配体的流体动力学大小及其血清半衰期，还可通过将本发明的IL-13结合多肽、 dAb或拮抗剂缀合或缔合至结合本文所述增大体内半衰期的抗原或表位的结合域(例如抗体或抗体片段)来增大。例如，IL-13结合剂(例如多肽)可缀合或连接至抗血清白蛋白或抗新生Fc受体抗体或抗体片段，例如抗SA或抗新生Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv ；或缀合或连接至抗SA亲和体或抗新生Fc受体亲和体或抗SA avimer、或包含选自但不限于以下的支架的抗SA结合域CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、亲和体、avimer, GroEl和纤连蛋白 (参见W02008096158关于这些结合域的公开内容，其域和其序列在此引作参考并形成本文公开内容的部分)。缀合是指将包含本发明多肽、dAb或拮抗剂的的组合物连接(共价或非共价地)至结合血清白蛋白的结合域。增大体内血清半衰期的合适多肽包括例如转铁蛋白受体特异性配体-神经药理学作用剂融合蛋白(参见美国专利第5，977，307号，其教导在此引作参考)、脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如可溶性转铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1 (IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2 (IGF 2)受体、胰岛素受体、凝血因子X、α 1-抗胰蛋白酶和HNF Ia。增大血清半衰期的合适的多肽还可包括α-l糖蛋白(血清类粘蛋白； AAG)、α -1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α -1微球蛋白(HC蛋白；AIM)、抗凝血酶III (ATIII)、脱脂载脂蛋白A-l(Ap0 Α-l)、脱脂载脂蛋白B (Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3 (C3)、 补体成分C4(C4)、C1酯酶抑制剂(C1INH)、C反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血红素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a) (Lp (a))、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白；PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。来自胞外基质的合适蛋白包括例如胶原、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原是胞外基质的主要蛋白。目前已知约15种胶原分子，存在于身体中的不同部分，例如存在于骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中的I型胶原(占身体胶原的90%)或存在于软骨、脊间盘、脊索和眼睛的玻璃体液中的II型胶原。来自血液的合适蛋白包括例如血浆蛋白(例如纤维蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原(例如纤维蛋白原Α、纤维蛋白原B)、血清淀粉样A蛋白、触珠蛋白、抑制蛋白、遍在蛋白、子宫球蛋白和β-2微球蛋白)、酶和酶抑制剂(例如纤维蛋白溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α -1抗胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂)、免疫系统的蛋白例如免疫球蛋白蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(K/λ))、转运蛋白(例如视黄醇结合蛋白、α "I微球蛋白)、防卫素(例如β -防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1和嗜中性粒细胞防卫素2、嗜中性粒细胞防卫素3)等。血脑屏障或神经组织中存在的合适的蛋白包括例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸盐转运蛋白等。增强体内血清半衰期的合适的多肽还包括定位于肾的蛋白(例如多囊蛋白、IV型胶原、有机阴离子转运蛋白Kl、Heymann氏抗原)、定位于肝的蛋白(例如醇脱氢酶、G250)、 定位于肺的蛋白(例如结合IgA的分泌成分)、定位于心脏的蛋白(例如HSP 27，其与扩张型心肌病相关)、定位于皮肤的蛋白(例如角蛋白)；骨特异性蛋白如形态发生蛋白(BMP)， 它们是显示成骨活性的蛋白的转化生长因子β超家族的亚类(例如ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、 ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8)；肿瘤特异性蛋白(例如滋养层抗原、赫赛汀(herceptin)受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B，其可存在于肝和脾中)。
合适的疾病特异性蛋白包括例如仅表达于活化T细胞上的抗原，包括LAG-3 (淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白配体(0PGL ；参见Nature 402，304-309 (1999) )、0X40 (TNF受体家族的成员，表达于活化T细胞上并在产生I型人T细胞白血病病毒(HTLV-I)的细胞中特异性地增量调节；参见Immunol. 165(1) :263-70 (2000))。合适的疾病特异性蛋白还包括例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白、人FtsH、 人AFG3L2、鼠ftsH;和血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-I)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-a (TGF α)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、血管生成素、白细胞介素_3 (IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、中期因子 (midkine)血小板衍生生长因子BB (PDGF)和CXXXC趋化因子(fractalkine)。提高体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白例如热休克蛋白(HSP)。HSP通常存在于细胞内。当其在胞外被发现时，这表明细胞已死亡并溢出其内容物。当由于创伤、 疾病或损伤而发生该非程序性细胞死亡(坏死)时，胞外的HSP引发免疫系统的应答。与胞外HSP结合可导致将本发明的组合物定位于疾病位置。涉及Fc转运的合适蛋白包括例如Brambell受体(也被称为FcRB)。该Fc受体具有两个功能，这两个功能均潜在可用于递送。所述功能为(1)将IgG经胎盘从母体转运至胎儿，(2)保护IgG免于降解从而延长其血清半衰期。认为所述受体从内体回收IgG(参见 Holliger 等，Nat Biotechnol 15(7) :632-6 (1997) ·)。结合血清白蛋白的dAb本发明在一个实施方案中提供结合IL-13的多肽或拮抗剂(例如包含抗 IL-13dAb (第一 dAb)的双特异性配体)和结合血清白蛋白(SA)的第二 dAb，如通过表面等离子体共振所确定的，所述第二 dAb结合SA的Kd为约InM-约1、约2、约3、约4、约5、约 10、约 20、约 30、约 40、约 50、约 60、约 70、约 100、约 200、约 300、约 400 或约 500 μ M(即 χ 1(T9-5x I(T4M)、或约 IOOnM-约 10 μ Μ、或约 1-约 5 μ M 或约 3-约 70ηΜ 或约 IOnM-约 1、约 2、约3、约4或约5 μ Μ。例如通过表面等离子体共振所确定的约30-约70ηΜ。在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振所确定的，所述第一 dAb (或dAb单体)结合SA (例如HSA) 的Kd大致为约1、约50、约70、约100、约150、约200、约300nM或约1、约2或约3 μ M。在一个实施方案中，对于包含第一抗SA dAb和针对IL-13的第二 dAb的双特异性配体，所述第二 dAb对其靶标的亲和力(例如通过表面等离子体共振(例如利用BiaCore)确定的Kd 和/或K。ff)为针对SA的第一 dAb的亲和力的约1-约100000倍(例如约100-约100000 倍、或约1000-约100000倍、或约10000-约100000倍)。在一个实施方案中，所述血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。例如，第一 dAb结合SA的亲和力大致为约10 μ M，而第二 dAb结合其靶标的亲和力为约ΙΟΟρΜ。在一个实施方案中，所述血清白蛋白是人血清白蛋白 (HSA)。在一个实施方案中，第一 dAb结合SA(例如HSA)的Kd大致为约50、例如约70、约 100、约 150 或约 200nM。双特异性配体的详述参见 W0030(^609、W004003019、W02008096158 和 W004058821。本发明的配体在一个实施方案中可包含以下dAb，如通过表面等离子体共振所确定的，该dAb结合血清白蛋白(SA)的Kd为约InM-约1、约2、约3、约4、约5、约10、约20、 约30、约40、约50、约60、约70、约100、约200、约300、约400或约500 μ M(即χ约1(Γ9-约5x I(T4M)、或约IOOnM-约10 μ Μ、或约1-约5 μ M或约3-约70ηΜ或约IOnM-约1、约2、约 3、约4或约5 μ Μ。例如通过表面等离子体共振所确定的约30-约70ηΜ。在一个实施方案中，如通过表面等离子体共振确定的，所述第一 dAb (或dAb单体)结合SA (例如HSA) Kd大致为约1、约50、约70、约100、约150、约200、约300nM或约1、约2或约3 μ M。在一个实施方案中，所述第一 dAb和第二 dAb通过接头相连，例如1-4个氨基酸或1-3个氨基酸或大于 3个氨基酸或大于4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的接头。在一个实施方案中，将较长接头(大于3个氨基酸)用于提高效价(拮抗剂中一种或两种dAb的Kd)。在所述配体和拮抗剂的特定实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并与选自以下的 dAb竞争结合白蛋白MSA-16、MSA-26(对于这些序列的公开内容参见W004003019，所述序列及其核酸配对物在此引作参考并形成本文的公开内容的一部分)，D0M7m-16(SEQ ID NO :473)，D0M7m_12(SEQ ID NO :474)，D0M7m_26(SEQ ID NO 475), D0M7r-l(SEQ ID NO :476)，D0M7r_3(SEQ ID NO :477), D0M7r_4(SEQ ID NO: 478)，D0M7r-5(SEQ ID NO :479)，D0M7r_7(SEQ ID NO :480)，D0M7r_8(SEQ ID NO:
481)，D0M7h-2(SEQIDNO 482)，D0M7h-3(SEQ ID NO :483)，D0M7h_4(SEQIDNO484)，D0M7h-6 (SEQIDNO:485)， D0M7h-l(SEQIDNO:486)， D0M7h-7(SEQIDNO487),D0M7h-22(SEQIDNO:489)， D0M7h-23(SEQIDNO:490)， D0M7h-24(SEQIDNO:491)，D0M7h-25(SEQIDNO:492)， D0M7h-26(SEQIDNO:493), D0M7h-21(SEQIDNO494)，D0M7h-27(SEQIDNO:495)， D0M7h-8(SEQIDNO :496)， D0M7r-13(SEQIDNO497)，D0M7r-14(SEQIDNO:498)， D0M7r-15(SEQIDNO:499)， D0M7r-16(SEQIDNO:500)，D0M7r-17(SEQIDNO:501)，D0M7r-18(SEQIDNO:502)，D0M7r-19(SEQIDNO503)，D0M7r-20(SEQIDNO:504)， D0M7r-21(SEQIDNO:505)， D0M7r-22(SEQIDNO:506)，D0M7r-23(SEQIDNO:507)，D0M7r-24(SEQIDNO:508), D0M7r-25(SEQIDNO:509)，D0M7r-26(SEQIDNO:510)， D0M7r-27(SEQIDNO:511)， D0M7r-28(SEQIDNO512)，D0M7r-29(SEQIDNO:513)，D0M7r-30(SEQIDNO:514), D0M7r-31(SEQIDNO515)，D0M7r-32(SEQIDNO 516)，D0M7r-33(SEQID NO :i517)(对于这些序列的公开内容参见
W02007080392，所述序列及其核酸配对物在此引作参考并形成本文的公开内容的一部分； 本段的SEQ ID NO为W02007080392中所出现的那些)， dAb8 (dAblO) , dAb 10，dAb36, dAb7r20 (D0M7r20)，dAb7r21 (D0M7r21)， dAb7r22 (D0M7r22)，dAb7r23 (D0M7r23)，dAb7r24 (D0M7r24)，dAb7r25 (D0M7r25)， dAb7r26(D0M7r26)，dAb7r27(D0M7r27)，dAb7r28(D0M7r28)，dAb7r29(D0M7r29)， dAb7r29 (D0M7r29)，dAb7r31 (D0M7r31)，dAb7r32 (D0M7r32)，dAb7r33 (D0M7r33)， dAb7r33(D0M7r33)，dAb7h22(D0M7h22)，dAb7h23(D0M7h23)，dAb7h24(D0M7h24)， dAb7h25(D0M7h25)，dAb7h26(D0M7h26)，dAb7h27(D0M7h27)，dAb7h30(D0M7h30), dAb7h31(D0M7h31), dAb2 (dAbs 4，7，41)，dAb4, dAb7, dAbll, dAb12(dAb7ml2), dAb13(dAb 15)， dAbl5, dAbl6(dAb21, dAb7ml6)， dAbl7, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 (dAb26,dAb7m26)，dAb27,dAb30(dAb35)，dAb31,dAb33, dAb34,dAb35, dAb38(dAb54)， dAb41, dAb46(dAbs 47,52and56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7ml6,dAb7m26,dAb7rl(DOM 7rl)，dAb7r3(D0M7r3)，dAb7r4(D0M7r4)，dAb7r5(D0M7r5)， dAb7r7(D0M7r7)，dAb7r8(D0M7r8)，dAb7rl3(D0M7rl3)，dAb7r14(D0M7r14)，dAb7rl5 (D0M7rl5)，dAb7r16 (D0M7r16)，dAb7r17 (D0M7r17)，dAb7r18 (D0M7r18)， dAb7rl9(D0M7rl9)，dAb7hl(D0M7hl)，dAb7h2(D0M7h2)，dAb7h6(D0M7h6)，dAb7h7(D0M7h7)， dAb7h8(D0M7h8)，dAb7h9(D0M7h9)，dAb7hlO(DOM7hlO)，dAb7hl1(D0M7hl 1)， dAb7hl2(D0M7hl2)，dAb7hl3 (D0M7hl3)，dAb7hl4 (D0M7hl4)，dAb7pl(D0M7pl)，禾口 dAb7p2 (D0M7P2)(对于这些序列的公开内容参见W02008096158，所述序列及其核酸配对物在此引作参考并形成本文的公开内容的一部分)。dAb后的括号中显示备选名，例如dAb8 具有备选名dAblO，即dAb8(dAblO)。在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，并包含与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约 97%、或至少约98%、或至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列MSA-16、MSA_26、D0M7m-16 (SEQ ID NO :473)、D0M7m_12 (SEQ ID NO :474)、D0M7m_26 (SEQ ID NO :475)、D0M7r-l (SEQ ID NO :476)、D0M7r-3 (SEQ ID NO :477)、D0M7r-4 (SEQ ID NO 478)、D0M7r-5 (SEQ ID NO :479)、D0M7r-7 (SEQ ID NO :480)、D0M7r-8 (SEQ ID NO :481)、
D0M7h-2(SEQIDNO:482)、D0M7h-3(SEQIDNO:483)、D0M7h-4(SEQIDNO:484)、D0M7h-6 (SEQIDNO :485)、D0M7h-l (SEQIDNO:486)、D0M7h-7(SEQIDNO:487)、D0M7h-22(SEQIDNO:489)、D0M7h-23(SEQIDNO:490)、D0M7h-24(SEQIDNO:491)、D0M7h-25(SEQIDNO:492)、D0M7h-26(SEQIDNO:493)、D0M7h-21(SEQIDNO:494)、D0M7h-27(SEQIDNO:495)、D0M7h-8(SEQIDNO :496)、D0M7r-13(SEQIDNO:497)、D0M7r-14(SEQIDNO:498)、D0M7r-15(SEQIDNO:499)、D0M7r-16(SEQIDNO:500)、D0M7r-17(SEQIDNO:501)、D0M7r-18(SEQIDNO:502),D0M7r-19(SEQIDNO:503)、D0M7r-20(SEQIDNO:504)、D0M7r-21(SEQIDNO:505)、D0M7r-22(SEQIDNO:506)、D0M7r-23(SEQIDNO:507)、D0M7r-24(SEQIDNO:508)、D0M7r-25(SEQIDNO:509)、D0M7r-26(SEQIDNO:510)、D0M7r-27(SEQIDNO:511)、D0M7r-28(SEQIDNO:512)、D0M7r-29(SEQIDNO:513)、D0M7r-30(SEQIDNO:514)、D0M7r-31(SEQIDNO:515)、D0M7r-32(SEQ ID NO :516)、D0M7r_33(SEQ IDNO:517)(本段的 SEQ ID NO为W02007080392
中所出现的那些)，dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、 dAb7h22,dAb7h23,Ab7h24、Ab7h25,Ab7h26、dAb7h27,dAb7h30、dAb7h3UdAb2,dAb4、dAb7、 dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAb 16, dAbl7、dAb 18, dAb 19, dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、 dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、lAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、 dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、 dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、 dAb7hl4、dAb7pl和 dAb7p2。例如，结合人血清白蛋白的dAb可包含以下氨基酸序列，其与以下氨基酸序列具有至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99% 的氨基酸序列同一性D0M7h-2(SEQ ID NO :482)、D0M7h_3 (SEQ ID NO :483)、D0M7h-4 (SEQID NO 484)、D0M7h-6 (SEQ ID NO :485)、D0M7h_l (SEQ ID NO :486)、D0M7h_7 (SEQ ID NO 487)、D0M7h-8(SEQ ID NO :496)、D0M7r_13(SEQ ID NO :497)、D0M7r_14(SEQ ID NO :498)、 D0M7h-22 (SEQ ID NO :489)、D0M7h_23 (SEQ ID NO :490)、D0M7h_24 (SEQ ID NO :491)、 D0M7h-25 (SEQ ID NO :492)、D0M7h_26 (SEQ ID NO :493)、D0M7h_21 (SEQ ID NO :494)或 D0M7h-27 (SEQ ID NO :495)(本段的 SEQ ID NO 为 W02007080392 中所出现的那些)，或者dAb8、dAblO、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、 dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb 11、dAb 12、dAb 13、dAb 15、dAb 16、dAb 17、 dAbl8、dAb 19, dAb2U dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30、dAb31、dAb33、 dAb34, dAb35, dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7hl、 dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hl0、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 或 dAb7hl4。在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，并包含与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约 97%、或至少约98%、或至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列D0M7h-2 (SEQ ID NO :482)、D0M7h_6 (SEQ ID NO :485)、D0M7h_l (SEQ ID NO: 486)、D0M7h-7 (SEQ ID NO :487)、D0M7h_8 (SEQ ID NO :496)、D0M7h_22 (SEQ ID NO :489)、 D0M7h-23 (SEQ ID NO :490)、D0M7h_24 (SEQ ID NO :491)、D0M7h_25 (SEQ ID NO :492)、 D0M7h-26 (SEQ ID NO :493) ,D0M7h-21 (SEQ ID NO :494)、D0M7h_27 (SEQ ID NO :49 (本段的SEQ ID NO为W02007080392中所出现的那些)，dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、 dAb2, dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h 10、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。在更特定的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白&VKdAb并具有选自以下的氨基酸序列D0M7h-2(SEQ ID NO :482)、D0M7h_6(SEQ ID NO :485)、D0M7h_l(SEQ ID NO :486)、 D0M7h-7 (SEQ ID NO :487)、D0M7h_8 (SEQ ID NO :496)(本段的 SEQ ID NO 为 W02007080392 中所出现的那些)，dAb2, dAb4、dAb7、dAb38、dAb4UdAb54, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。在更特定的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白的Vh dAb并具有选自dAbn^O 和dAbni31的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，dAb是dAWhll或dAb^iH。在其它的实施方案中，dAb、配体或拮抗剂结合人血清白蛋白并包含任何前述氨基酸序列的一个、两个或三个⑶R，例如dAb^ill或dAb^iH的一个、两个或三个⑶R。结合血清白蛋白的合适的骆驼科Vhh包括TO 2004/041862 (Ablynx N. V.)和 W02007080392中公开的那些(所述Vra序列及其核酸配对物在此引作参考并形成本文的公开内容的一部分)，例如序列A(SEQ ID NO :518)、序列B(SEQ ID NO :519)、序列C(SEQ ID NO :520)、序列 D (SEQ ID NO :521)、序列 E (SEQ ID NO :522)、序列 F(SEQ ID NO :523)、序列 G (SEQ ID NO :524)、序列 H (SEQ ID NO :525)、序列 I (SEQ ID NO :5 )、序列 J (SEQ ID N0: 527)、序列K(SEQ ID NO :5 )、序列L(SEQ ID NO :5 )、序列M(SEQ ID NO :530)、序列N(SEQ
36ID NO :531)、序列 0(SEQ ID NO :532)、序列 P (SEQ ID NO :533)、序列 Q(SEQ ID NO :534)， 这些序列编号与W02007080392或WO 2004/041862 (Ablynx N. V.)中引用的那些对应。在某些实施方案中，骆驼科Vra结合人血清白蛋白，并包含与W02007080392中公开的ALBl或 SEQ ID NO :518-534中的任一个具有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约 95 %、或至少约96 %、或至少约97 %、或至少约98 %、或至少约99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，这些序列编号与W02007080392或WO 2004/041862中引用的那些对应。在一些实施方案中，配体或拮抗剂包含以下抗血清白蛋白dAb，其与本文公开的任何抗血清白蛋白dAb竞争结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)。在备选实施方案中，拮抗剂或配体包含对IL_13(例如人IL-13)有特异性的结合部分，其中所述部分包含如W02008096158中所述的非免疫球蛋白序列，这些结合部分、其制备方法和选择方法(例如从多种多样的文库)及其序列的公开内容在此作为本文公开内容的一部分引作参考。半衰期延长部分(例如白蛋白)的缀合在一个实施方案中，(一个或多个)半衰期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)与本发明的IL-13结合多肽、dAb或拮抗剂缀合或缔合。适合用于IL-13结合形式的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的实例描述于WO 2005077042中，其公开内容在本文引作参考并形成本文的公开内容的一部分。特别地，以下白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体可用于本发明SEQ ID N0:1(如公开于WO 2005077042中的，该序列明确通过参考引入本公开内容中)；包含WO 2005077042中SEQ ID NO 1的第1-387位氨基酸或由所述氨基酸组成的白蛋白片段或变体；包含选自以下的氨基酸序列的白蛋白、或其片段或变体(a)W0 2005077042中 SEQ ID NO 1 的第 M-61 位氨基酸；(b)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 76-89 位氨基酸；(C)WO 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 92-100 位氨基酸；(d)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 170-176 位氨基酸；(e)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 247-252 位氨基酸；(f)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第洸6_277 位氨基酸；(g)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 280-288 位氨基酸；(h)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 362-368 位氨基酸；(i)TO 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 439_447 位氨基酸；(j)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 462-475 位氨基酸；(k)W0 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 478-486 位氨基酸和(I)WO 2005077042 中 SEQ ID NO 1 的第 560-566 位氨基酸。用于IL-13结合形式的合适白蛋白、片段和类似物的另外实例描述于WO 03076567中，其公开内容在本文引作参考并形成本文的公开内容的一部分。特别地，以下的白蛋白、片段或变体可用于本发明如WO 03076567中例如在图3中所述的人血清白蛋白(该序列信息明确通过参考引入本公开内容中)；由具有式分子量为66，500的585个氨基酸的单条非糖基化多肽链组成的人血清白蛋白(HA)(参见 Meloun 等，FEBS Letters 58:136(1975) ；Behrens 等，Fed. Proc. 34 591 (1975) ；Lawn 等，Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981) ；Minghetti 等，J. BiolChem. 267 6 747(1986))；如Weitkamp等，Ann. Hum. Genet. 57 =219(1973)中所述的白蛋白的多态变体或类似物或片段；如EP 322094中所述的白蛋白片段或变体，例如HA (1-373)、HA (1-388)、 HA (1-389)、HA (1-369)和 HA (1-419)和在 1-369 和 1-419 之间的片段；如EP 399666中所述的白蛋白片段或变体，例如HA(1-177)和HA(1_200)和在 HA(I-X)之间的片段，其中X是178-199的任何数目。在将(一种或多种)半衰期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于形式化本发明的IL-13结合多肽、dAb和拮抗剂时，可使用任何合适的方法缀合， 例如通过与IL-13结合部分(例如抗IL-13dAb)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中所述融合蛋白作为单条多肽链被编码，所述多肽链具有位于IL-13 结合部分的N端或C端的半衰期延长部分。或者，部分之间可通过使用肽接头(例如WO 03076567或WO 2004003019中所述的肽接头)来实现缀合(这些接头的公开内容在本公开内容中引作参考以提供用于本发明的实例)。典型地，提高体内血清半衰期的多肽是体内天然存在并抵抗内源机制的降解或移除的多肽，所述机制从有机体(例如人)中移除不需要的物质。例如，提高体内血清半衰期的多肽可选自来自胞外基质的蛋白、存在于血液中的蛋白、存在于血脑屏障或神经组织中的蛋白、定位于肾、肝、肺、心脏、皮肤或骨的蛋白、应激蛋白、疾病特异性蛋白或涉及Fc转运的蛋白。在整个该公开内容中所述的本发明的实施方案中，在本发明的拮抗剂或配体中代替使用抗IL-13 “dAb”，考虑的是技术人员可使用包含结合IL-13的本发明dAb的一个或多个或全部3个⑶R的多肽或域(例如⑶R移植至合适的蛋白支架或骨架例如亲和体、SpA 支架、LDL受体A类域或EGF域上)。将该公开内容作为整体相应地理解为提供使用这样的域代替dAb的拮抗剂的公开内容。在该方面，参见W02008096158，其公开内容引作参考。因此在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含具有对IL-13的结合特异性的免疫球蛋白单可变域或域抗体(dAb)或者呈合适形式的这类dAb的互补决定区。所述拮抗剂可为由这样的dAb组成或基本由这样的dAb组成的多肽。所述拮抗剂可包含呈合适形式(例如抗体形式(例如IgG样形式、scFv、Fab、Fab'、F(ab' )2))的dAb (或dAb的CDR)的多肽，或包含结合IL-13的dAb和结合另一种靶蛋白、抗原或表位(例如血清白蛋白)的第二 dAb的双特异性配体。本发明的多肽、dAb和拮抗剂可形式化为本领域已知的多种合适的抗体形式，例如 IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、 抗体重链和/或抗体轻链的同二聚体和异二聚体、前述任何的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(SCFv)、二硫键合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段)、单可变域 (例如VH、VL)、dAb、前述任何的修饰形式(例如通过聚亚烷基二醇(聚乙二醇、聚丙二醇、 聚丁二醇)或其它合适的多聚体的共价连接修饰的)。在一些实施方案中，本发明提供了 IgG样形式的配体(例如抗IL-13拮抗剂)。这样的形式具有IgG分子的常规四链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可变区(Vh 和或VJ已被本发明的dAb代替。在一个实施方案中，可变区(2fVH区和2个\区)各自被dAb或单可变域代替，其中至少之一为本发明的抗IL-13dAb。包含于IgG样形式中的一种或多种dAb或一种或多种单可变域可具有相同的特异性或不同的特异性。在一些实施方案中，所述IgG样形式是四价的并且可具有一种(仅抗IL-13)、两种(例如抗IL-13和抗 SA)、三种或四种特异性。例如，所述IgG样形式可为单特异性的并且包含具有相同特异性的4个dAb ；双特异性的并且包含具有相同特异性的3个dAb和具有不同特异性的另一个 dAb ；双特异性的并包含具有相同特异性的2个dAb和具有常见但不同的特异性的2个dAb ； 三特异性的并包含具有相同特异性的第一 dAb和第二 dAb、具有不同特异性的第三dAb和与第一、第二和第三dAb具有不同 特异性的第四dAb ；或四特异性的并包含各自具有不同特异性的四个dAb。可制备IgG样形式的抗原结合片段(例如Fab、F(ab' )2、Fab'、Fv、SCFv)。 在一个实施方案中，所述IgG样形式或抗原结合片段可对IL-13是单价的。若需要补体激活和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能，则所述配体可为IgG样形式。若需要的话，所述IgG样形式可包含突变的恒定区(变体IgG重链恒定区)以使与Fc受体的结合和/或固定补体的能力最小化(参见例如Winter等，GB 2，209，757B ；Morrison等，WO 89/07142 ； Morgan 等，WO 94/29351，1994 年 12 月 22 日)。本发明的配体(例如多肽、dAb和拮抗剂)可形式化为融合蛋白，其包含与第二免疫球蛋白单可变域直接融合的第一免疫球蛋白单可变域。若需要的话，这样的形式还可包含半衰期延长部分。例如，所述配体可包含与第二免疫球蛋白单可变域直接融合的第一免疫球蛋白单可变域，所述第二免疫球蛋白单可变域直接与结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变域融合。总体而言，具有对靶标有结合特异性的结合位点的多肽域的方向，以及配体是否包含接头是设计选择的问题。然而，一些方向、含或不含接头可提供比其它方向更好的结合特征。本发明包括所有方向(例如dAbl-接头-dAb2 ;dAb2-接头-dAbl)，具有提供所需结合特征的方向的配体可通过筛选容易鉴定。本发明的多肽和dAb (包括dAb单体、二聚体、三聚体)可连接至抗体Fc区，包括 CH2域和Ch3域中一个或两个，和任选绞链区。例如，编码作为单个核苷酸序列连接至Fc域的配体的载体可用于制备这样的多肽。此外本发明提供了前述dAb单体的二聚体、三聚体和多聚体。含毒素部分或毒素的配,体本发明还涉及包含毒素部分或毒素的配体(例如抗IL_13dAb、dAb单体)。合适的毒素部分包括毒素(例如表面活性毒素、细胞毒素)。所述毒素部分或毒素可使用任何合适的方法连接或缀合至配体。例如，所述毒素部分或毒素可直接或经由合适的接头共价结合配体。合适的接头可包括不可切割或可切割的接头，例如包含用于细胞的酶(例如细胞酯酶、细胞蛋白酶例如组织蛋白酶B)的切割位点的pH可切割接头。这样的可切割接头可用于制备在配体内化后可释放毒素部分或毒素的配体。可使用很多用于将毒素部分或毒素连接或缀合至配体的方法。所选的具体方法应视待连接或缀合的毒素部分或毒素和配体而定。如果需要的话，可使用含有末端官能团的接头以连接配体和毒素部分或毒素。通常，缀合通过将含反应官能团(或经修饰以含反应官能团)的毒素部分或毒素与接头或直接与配体反应来实现。通过使含(或被修饰以含)化学部分或官能团的毒素部分或毒素反应来形成共价键，所述化学部分或官能团可在合适的条件下与第二化学基团反应从而形成共价键。若需要的话，可使用任何合适的方法将合适的反应化学基团添加至配体或接头上(参见例如Hermanson，G. Τ.，Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego，CA (1996).)。许多合适的反应化学基团组合为本领域已知，例如胺基可与亲电子基团例如甲苯磺酸盐/酯、甲磺酸盐/酯、卤素(氯、溴、 氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等反应。巯基可与马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基 (acrylolyl)、吡啶基、二硫化物、5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛官能团可与含胺或酰胼的分子偶联，叠氮基可与三价磷基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺连接。将活化基团引入分子的合适的方法为本领域已知(参见例如Hermanson，G. Τ.， Bioconjugate Techniques，Academic Press San Diego，CA(1996))0
合适的毒素部分和毒素包括例如美坦生类化合物(例如美登醇，例如DM1、DM4)、 紫杉烷、刺孢霉素、倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。美坦生类化合物可为例如美登醇或美登醇类似物。美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳环(例如C-19-脱氯的、C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基)的那些和在其它位置具有修饰(例如C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、 014-羟甲基或乙酰氧基甲基丄-15-羟基/酰氧基、(-15-甲氧基、(-184-脱甲基、4，5-脱氧的)的那些。美登醇及美登醇类似物参见例如美国专利第5，208，020号和第6，333，410 号，其内容在此引作参考。利用例如3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(也被称作 4-(2_吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(或SPP)、4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-a-(2-吡啶二硫代)_甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丁酸酯(SDPB)、2-亚氨基硫杂环戊烷(iminothiolane)、或S-乙酰基琥珀酸酐，美登醇可与抗体和抗体片段偶联。紫杉烷可为例如紫杉酚、泰索帝或新型紫杉烷(参见例如WO 01/38318)。刺孢霉素可为例如溴复合的刺孢霉素(例如α、β或Y溴复合物)和碘复合的刺孢霉素(例如α、β或Y碘复合物)或其类似物和模拟物。溴复合的刺孢霉素包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、 J2-BR 和 K1-BR。碘复合的刺孢霉素包括 11-1、12-1、13-1、Jl-I、J2-1、Ll-I 和 K1-BR。刺孢霉素及其突变体、类似物和模拟物参见例如美国专利第4，970，198号、第5，264，586号、 第5，550，246号、第5，712，374号和第5，714，586号，其各自的内容在此引作参考。倍癌霉素类似物(例如KW-2189、DC88、DC89 CBI-TMI)和其衍生物参见例如美国专利第5，070，092 号、美国专利第5，187，186号、美国专利第5，641，780号、美国专利第5，641，780号、美国专利第4，923，990号和美国专利第5，101，038号，其各自的内容在此引作参考。其它毒素的实例包括但不限于抗代谢药(例如甲氨喋呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如氮芥、塞替派 (thioepa)苯丁酸氮芥、CC-1065(参见美国专利第5，475，092号、第5，585，499号、第 5，846，545号)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和落莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼)、蒽环类(例如柔红霉素 (前称道诺霉素)和多柔比星)和抗生素(例如更生霉素(前称放射菌素)、博来霉素、光神霉素、丝裂霉素、嘌罗霉素、氨曲霉素(AMC))、倍癌霉素及其类似物或衍生物，以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉酚、auristatins (例如auristatin E)和美坦生类化合物及其类似物或同系物。毒素还可为表面活性毒素，例如为自由基产生剂(例如含硒的毒素部分)或含放射性核素的部分的毒素。合适的含放射性核素的部分包括例如含放射性碘(131I或125I)、 钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi 或 213Bi)、铟(111In)、锝("mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(S1Cr)、氯(36Cl)、钴(57Co 或58Co)、 铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)的部分。 毒素可为来自细菌来源的蛋白、多肽或肽，例如白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE) 和植物蛋白，例如将蓖麻毒蛋白的A链(RTA)、核糖体灭活蛋白(RIP)白树毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒蛋白和商陆毒蛋白(dodecandron)考虑用作毒素。设计以结合、破坏、促进负责产生特定靶蛋白的mRNA的降解或阻止所述mRNA的产生的核酸的反义化合物也可用作毒素。反义化合物包括反义RNA或DNA、单链或双链的、寡核苷酸或其类似物，其可特异性地与各个mRNA种类杂交并阻止该mRNA种类的转录和/或RNA加工和/或所编码多肽的翻译，从而实现将各自编码多肽的量减少。Ching 等，Proc. Natl. Acad ScL U. S. Α. 86 10006-10010 (1989) ；Broder 等，Ann. Int. Med. 113 604-618(1990) ；Loreau 等，FEBS Letters 274:53-56(1990)；有用的反义疗法包括例如 Veglin (VasGene)和 0GX-011(Oncogenix)。毒素还可为光活化物质。合适的光活化物质包括基于卟啉的材料例如卟吩姆钠、绿卟啉、二氢卟酚E6、血卟啉衍生物本身、酞菁、初紫红素(etiopurpurin)、德卟啉 (texaphrin)等。毒素可为结合细胞内靶标的抗体或抗体片段，例如结合细胞内靶标的dAb (细胞内抗体)。这样的抗体或抗体片段(dAb)可被定向于限定的亚细胞区室或靶标。例如，所述抗体或抗体片段(dAb)可结合选自以下的细胞内靶标erbB2、EGFR、BCR-ABL、p21RaS、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7、8(1-2、？53、细胞周期蛋白E、ATF-1/CREB、HPV16 E7、HP1、IV型胶原酶、组织蛋白酶L以及Kontermann，R. Ε.，Methods, 34 163-170 (2004)中所述的其它靶标，该文献以全部内容在此引作参考。W02007085815的实例在此引作参考以提供可同等地应用于本发明配体的相关测定、形式和实验的细节。测定IL-13IL-13 夹心 ELISA将MAXISORPtII (高蛋白结合 ELISA 板，Nunc，Denmark)用 2. 5 μ g/ml 的包被抗体 (Module Set,Bender MedSystems，Vienna，Austria)包被过夜，接着用含0· (体积比) Tween 20的PBS洗涤一次，随后用含0. 5 % (质量体积比)BSA和0.05% (体积比)Tween 20的PBS封闭。将板再次洗涤，随后加入150pg/ml的混合有DOMlOdAb (即抗IL_13dAb) 系列稀释液的IL-13 (GSK)或仅IL-13。将板洗涤两次，随后利用缀合了生物素的检测抗体 (Module Set, Bender MedSystems)和通过随后的过氧化物酶标记的链霉亲和素(Module Set,Bender MedSystems)检测IL-13与捕获抗体的结合情况。最后将板洗涤三次，接着与 TMB底物(KPL，Gaithersburg，USA)温育，通过加入HCl终止反应并在450nm处读取吸光度。 抗IL-13dAb的活性导致IL-13结合的减少并因而相对于仅IL-13的对照在吸光度方面减少了。利用8200细胞检测系统的IL-13受体结合测定(RBA)将SPHER0 羊抗人IgG(H&L)聚苯乙烯颗粒(0. 5%质量体积比)(羊抗人颗粒， Spherotech, Libertyville,USA)用 20 μ g 的 IL_13Ra 1/Fc 嵌合体或 IL-13R a 2/Fc 嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,USA)包被 过夜。接着将以下试剂混合于384孔黑边透明底的 FMAT板(Applied Biosystems,Foster City,USA)中含DOM-IOdAb或0. 1% (质量体积比) BSA的PBS的系列稀释液；0. 5 μ g/ml生物素化的抗IL-13抗体(R&D Systems) ；0. 25 μ g/ml STREPTAVIDIN ALEXA FLU0R 647 缀合物(荧光探针，Molecular Probes, Invotrogen Ltd, Paisley, UK) ； lOng/ml 重组人 IL-13 (R&D Systems)；和 IL_13R2/Fc 包被颗粒的 1 10 稀释液。将板温育7小时后在8200细胞检测系统(Applied Biosystems)中读值。IL-13与受体包被的颗粒的结合导致形成复合物，这被8200作为荧光事件检测到。抗IL-13dAb的活性导致IL-13结合的减少并因而相对于仅IL-13的对照在荧光事件方面减少了。IL-13细胞测定分离的dAb可检测其抑制IL-13诱导的培养TF-I细胞(ATCC 商品目录号 CRL-2003)的增殖的能力。简言之，将含40000个TF-I细胞的无酚红RPMI培养基(Gibco， Invitrogen Ltd,Paisley,UK)放置于组织培养微量滴定板的孔中，并混合终浓度为5ng/ml 的IL-13 (R&D Systems,Minneapolis, USA)和待检测的dAb的稀释液。将混合物在37°C、5% CO2下温育72小时。随后加入CELLTITER 96 试剂(用于确定生活力的比色试剂，Promega， Madison,USA)并通过检测490nm处的吸光度定量每孔中的细胞数。抗IL_13dAb的活性导致细胞增殖的减少和产生比仅IL-13相应更低的A49tlt5BIAC0RE 解离速率筛选包被有链霉亲和素的SA芯片(Biacore)用约500RU生物素化的IL-13 (R&D Systems，Minneapolis，USA)包被。将含可溶性dAb的上清按1 5稀释于运行缓冲液中。 将50-100μ 1的稀释上清以50μ 1/分的流速注入，接着5分钟的解离相。将具有相对于母体提高的解离速率的克隆通过肉眼鉴定，或通过利用BIAevaluation软件v4. 1 (Biacore)测量。用抗IL_13dAb 竞争 BIAC0RE 这些实验可在BIAC0RE 3000仪器(表面等离子体共振仪，Biacore)上，利用包被有链霉亲和素的SA芯片(Biacore)进行，该芯片与约400RU生物素化的IL_13(R&D Systems)偶联。将分析物以30 μ 1/分的流速在HBS-EP运行缓冲液(Biacore)中流过包被有抗原的贯流分析池(flow-cell)，其具有针对空白贯流分析池的线内参照。将第一 dAb 注入，然后利用Biacore的共注入功能立即将第二 dAb注入。该竞争方案通常可用于评价检测抗体或片段与已知dAb(或其它的抗体多肽)对结合IL-13的竞争。竞争和表位作图IL_13dAb的表位作图为了确定抗IL_13dAb的表位特异性，可进行Biacore竞争实验。将dAb注入，随后立即将第二 dAb注入。若一种(第二)dAb并不结合与其它的(第一)dAb结合的IL-13，这提示这些dAb结合相同的表位。该竞争方案通常可用于评价测试抗体或片段与已知dAb (或其它抗体多肽)对结合IL-13的竞争(和表位作图)。稍加修改的BIAcore方案是可以的， 其中将第一 dAb注入在IL-13的表面上，然后将高亲和力结合dAb以高浓度(5 μ Μ)注入使 IL-13表面饱和，最后将dAb再次注入。若用高亲和力dAb饱和之前与之后的结合之间有差异，则表位至少部分重叠。IL-13诱导的B细胞增殖
血液可从正常献血者中 收集。PBMC使用Ficoll梯度分离。随后将B细胞使用B 细胞阴选试剂盒(EasyS印Negative分离试剂盒，Stem Cell Technologies Inc)分离。纯度(任选超过98% )可通过流式细胞术并用⑶3、⑶4、⑶8、⑶14、⑶19和⑶23染色来确定。接着在存在IL-13(10ng/ml)的情况下将B细胞按IxlO5个细胞/孔放置于包被有经辐照的CD40L+L细胞的板中。将培养物温育5天并在最后的18小时加入3 [H]胸苷。在培养基开始时以10或IOOnM加入抗IL-13dAb。B细胞增殖测定之前已表明⑶40L能够激活细胞对IL-13的响应。事实上供体可经测试以表明当其B细胞与经辐照的CD40L+L细胞和渐增加浓度的IL-13温育时的剂量依赖性增殖。可使用单独B细胞或单独转染有⑶40L的L细胞作为阴性对照。抗IL-13dAb的加入可评价以观察这是否导致供体IL-13诱导的B细胞增殖的抑制。作为说明，对于抑制性dAb (参见W02007085815)，在IOnM和IOOnM的浓度下平均抑制率分别为80%和100%。用3 μ g/ml的阳性对照抗IL_13mAb (R&D)也观察到B细胞增殖的完全抑制。不结合IL-13的对照dAb不能抑制这种B细胞增殖。IL-13 结合 IL-13R α 2 的抑制在竞争测定中，抗IL_13dAb可检测其抑制IL-13与IL_13Ra 2的结合的能力。与变体IL_13(R130Q)的结合IL-13 的遗传变体与哮喘(Heinzmann 等.Hum MoI Genet. (2000)9549-59)和支气管高反应性(Howard 等，Am, J. Resp. Cell Molec. Biol. (2001)377-384)的风险增加有关。因此为了确定抗IL-13dAb是否能够结合变体IL-13(R130Q)，TF-I的增殖测定可用变体IL-13(R130Q)和渐增量的dAb进行。结合所述变体的dAb能够抑制变体IL-13诱导的 TF-I增殖，ND50值为例如约0. 5-10nM。猕猴和食蟹猴IL-13的交叉反应性dAb的所需要求会是与猕猴和食蟹猴IL-13的交叉反应性。为了该目的，在TF-I 细胞增殖测定中可检测dAb，其中将细胞用人IL-13(5ng/ml，P印rotech)、猕猴IL_13(5ng/ ml, R&D systems)或食蟹猴IL-13 (含内部表达的食蟹猴IL-13的上清的1 4000稀释液) 刺激。dAb的剂量决定该设定中的ND50。IL-4IL-4受体结合测定(RBA)将MaxiSorp 板(高蛋白结合 ELISA 板，Nunc，Denmark)用 0. 5 μ g/ml 的重组人 IL-4R/Fc (R&D Systems,Minneapolis,USA)包被过夜。将孔用含 0. 1 % (体积比)Tween 20 的PBS洗涤三次，随后用PBS洗涤三次，再用含2% (质量体积比)BSA的PBS封闭。将板再次洗涤，随后加入lOng/ml混合有抗IL-4dAb的系列稀释液的生物素化IL_4 (R&D Systems) 或IL-4。IL-4的结合情况用过氧化物酶标记的抗生物素抗体(Stratech，SohamjK)检测， 接着用TMB底物(KPL，Gaithersburg, USA)显影。反应通过加入HCl终止并在450nm处读取吸光度。抗IL-4dAb的活性导致与受体结合的IL-4减少并因而相对于仅IL-4的对照在吸光度方面减少了。IL-4细胞测定分离的dAb可检测其抑制IL-4诱导的培养TF-I细胞(ATCC 商品目录号CRL-2003)增殖的能力。简言之，将含40000个TF-I细胞的无酚红RPMI培养基(Gibco， Invitrogen Ltd, Paisley, UK)放置于组织培养微量滴定板的孔中并混合终浓度为lng/ml 的IL-4(R&D Systems,Minneapolis,USA)和待检测的dAb的稀释液。将混合物在37°C、5% CO2中温育72小时。随后加入CellTiter 96 试剂(用于确定生活力的比色试剂，Promega， Madison, USA)，通过检测490nm处的吸光度定量每孔中的细胞数。抗IL_4dAb的活性导致细胞增殖的减少和产生比仅IL-4相应更低的A49(1。
用抗IL-4dAb 的竞争 BIAC0RE 这些实验可在BIAC0RE 3000仪器上，用包被有链霉亲和素的SA芯片(表面等离子体共振仪，Biacore)进行，该芯片偶联有约400RU的生物素化IL_4 (R&D Systems) 0将分析物以30 μ 1/分的流速在HBS-EP运行缓冲液(Biacore)中流过包被有抗原的贯流分析池，其具有针对空白贯流分析池的线内参照。将第一 dAb注入，然后使用Biacore的共注入功能立即将第二 dAb注入。该竞争方案通常可用于评价测试抗体或片段与已知dAb (或其它抗体多肽)对结合IL-4的竞争。
实施例实施例1 :D0M10先导dAb的诜择D0M10-53-546将D0M10_53_546 抗 IL-13 域抗体(dAb)从线内融合文库(in-line fusion library)中分离，所述文库针对人IL-13作为分离针对IL-4和IL-13的双靶向分子的尝试而选择。将 IL-4 结合 dAb D0M9-112-210 与 IL-13 结合 dAb D0M10-53-409 用 ASTKGPS 接头连接，以制得 D0M9-112-210-ASTKGPS-D0M10-53-409。D0M9-112-210 和 D0M10-53-409 公开于W02007085815中。ASTKGPS接头公开于W02007085814中。将D0M9 dAb保持恒定，并制备D0M10-53-409的十二个文库，其各自使D0M10-53-409的三个残基跨越所有三个CDR 和CDR周围的框架残基而多样化，以选择具有更好效价和更好表达的线内融合物。这些文库利用掺入NNS密码子以使残基多样化的寡核苷酸制得。NNS密码子通过用任何20种氨基酸或总计32个密码子之内的单个终止密码子的取代，来提供靶残基的随机化。N表示所有四种核苷酸A、T、G和C之一，S表示G或C。使用这些寡核苷酸进行的初次PCR接着利用组装PCR组装。组装PCR(也被称为“穿入(pull-through)”或SOE (通过重叠延伸的剪接)PCR)允许利用两种初次PCR产物的互补末端，在无需消化或连接的情况下将两种初次 PCR产物(一种多样化的，一种恒定的)联合在一起。将线内融合文库经受2轮用包被了链霉亲和素的磁珠(Dynal，Norway)和IOnM 生物素化人IL-13接受的选择。用五倍摩尔过量的EZ-Link Sulf0-NHS-LC-生物素试剂(Pierce, Rockford, USA)的使 IL-13 生物素化(Henderikx 等，2002，Selection of antibodies against biotinylated antigens (ff")(寸L^Uft原白勺Jity[本D · Antibody Phage Display =Methods and protocols (抗体噬菌体展示方法和方案)，0' Brien 和 Atkin 编辑，Humana Press)。将第2轮的产物克隆至pD0M5载体(图1)中。pD0M5是在LacZ启动子控制下、基于PUC 119的表达载体。dAb在上清中的表达通过在N端融合通用的GAS前导信号肽(参见W02005093074)来确保。此外，在dAb的C端添加c_myc标签。在转化大肠杆菌HB2151细胞后，在0. 5ml/孔补充有100 μ g/ml羧苄西林的过夜表达自诱导培养基(高水平蛋白表达系统，Novagen)中，在程序设定为950rpm、30°C和80%湿度的高速infors振荡器中，于 96深孔板中表达克隆2天。接着将板在4000rpm下离心20分钟，将上清按1/5稀释于HBS 缓冲液中并在Biacore 上针对与1500Ru Protein A CM5芯片的结合进行筛选，以选择具有提高的表达的克隆。依照生产商的建议，通过伯胺偶联将A蛋白偶联于CM5芯片上(胺偶联试剂盒，Biacore, GE healthcare])。将样品在Biacore上以50 μ 1/分的流速运行。 使用pH 2，0. IM甘氨酸使表面再生返回至基线。接着在30°C下，于50ml过夜表达自诱导培养基中将具有提高的表达的任何克隆表达48小时，在通过离心G，000rpm，20分钟)使细胞沉淀后，将上清在4°C下与流线型-A蛋白珠粒(Amersham Biosciences，结合能力5mg dAb/mL珠粒)温育过夜。接着将珠粒包装为滴柱(drip column)，用10个柱体积的PBS洗涤，将结合的dAb在0. IM甘氨酸-HCl，pH 2. 0中洗脱。在用IM Tris_HCl，pH 8. 0中和后， 蛋白纯度通过在12%丙烯酰胺Tris-甘氨酸胶(Invitrogen)上的SDS-PAGE后的目视分析估计。利用根据氨基酸组成计算的消光系数，在^Onm处测量蛋白浓度和收率(按mg/L 细菌培养物)。具有提高的表达的克隆在Biacore上分析与200Ru生物素化人IL-13链霉亲和素芯片的结合，以评价效价。从这些文库中选择出的最有效克隆为D0M9-112-210-AST KGPS-D0M10-53-M6(来自其中框架残基观_30是多样化的文库)，其显示与D0M9-112-210 -ASTKGPS-D0M10-53-409相似的表达水平，但对IL-13具有提高的效价。接着将D0M10臂 D0M10-53-546作为单体克隆入pD0M5载体中。D0M10-53-546的DNA序列和氨基酸序列总结于图2和图3中。D0M10-53-567在选择对食蟹猴IL-13效价提高的dAb的尝试中，将D0M10_53_567从对 D0M10-53-474(该dAb公开于W02007085815中)的易错文库的生物素化食蟹猴(cyno) IL-13进行的选择中分离。依照生产商的指南(目录号200550)，使用用来自Mratagene 的利用Mutazyme DNA聚合酶的GeneMorph PCR诱变试剂盒，制得D0M10-53-474的易错文库。D0M10-53-474易错文库的2轮选择分别用IOnM和5nM食蟹猴IL-13进行。将第2轮的产物克隆至PD0M5载体中，在如上说明的96孔深孔板中表达于大肠杆菌HB2151细胞中。 将板离心，将上清按1/5稀释于HBS缓冲液中并在Biacore上的200Ru食蟹猴IL-13链霉亲和素芯片上进行筛选，以寻找相对于D0M10-53-474与食蟹猴IL-13的结合提高的克隆。 D0M10-53-567被选作对食蟹猴IL-13和人IL-13具有提高的结合动力学的克隆。DNA序列和氨基酸序列总结于图2和图3中。D0M10-53-568在进一步提高D0M10-53-567的效价的尝试中，将有效抗IL_13dAb D0M10-53-386 (该 dAb 公开于 W02007085815 中)的 CDR2 利用组装 PCR 引入 D0M10-53-567 中，以得到D0M10-53-568，并克隆至pD0M5载体中。DNA序列和氨基酸序列总结于图2和图 3中。D0M10-53-616在进一步提高D0M10-53-M6的效价的尝试中，将有效dAbD0M10-53_386的CDR2 利用组装PCR引入以代替D0M10-53-M6的CDR2，从而得到D0M10-53-616，并克隆至pD0M5 载体中。DNA序列和氨基酸序列总结于图2和图3中。
实施例2 序列分析 如图4所示，D0M10-53-546相对于D0M10-53-474在5个位置具有氨基酸改变。 ⑶RlN端的两个框架突变在28位(T至V)和30位(A至P)，和⑶R2的三个残基突变在54 位(H 至 K)、56 位(E 至 G)和 57 位(V 至 K)。D0M10-53-567 与 D0M10-53-474 仅在 28 位有一个氨基酸不同(T至V)。D0M10-53-568也具有该突变，但其另外还在CDR2中具有两个氨基酸改变，在56位 (E至K)和57位(V至I)。D0M10-53-616具有与D0M10-53-568 —样的所有三个突变并且另外在30位氨基酸被改变(A至P)。28位从苏氨酸到缬氨酸的氨基酸变化对于所有四种 dAb是常见的。包括D0M10-53-474在内的所有这些dAb具有相同的⑶Rl和⑶R3。所有编号依照Kabat。实施例3 =DOMlOdAb的表汰和效价如我们下文所证实，新型dAb比D0M10-53-474更有效。此外，新型dAb对于在人和非人的灵长类IL-13之间的结合是种属交叉反应的(和有效的IL-13中和剂交叉种类)。 这使新型dAb非常可用作药物和作为药物开发的基础以治疗和/或预防IL-13介导的病况和疾病，因为这样的开发往往需要在人中测试之前在非人的灵长类物种中测试候选先导物，这是因为非人的灵长类被认为是人的良好模型并为指导人中的随后研究提供数据。为了进行上述抗IL_13D0M10dAb的并列对比，将其克隆至不含myc标签的pD0M5 载体中，转化至Machl化学感受态细胞(Invitrogen)中并在如上说明的过夜表达自诱导培养基中的50ml培养物中表达。蛋白利用如上说明的流线型A蛋白纯化并通过SDS PAGE评价纯化的蛋白。简言之，对于SDS PAGE，混合5μ1 WdAbUSyl的H2O和6 μ 1的样品缓冲液并在90°C下温育10分钟，并随后在冰上停留2分钟，然后将20 μ 1的样品上样至SDS PAGE胶上。结果显示所有dAb的纯制品。DOMlOdAb的表达水平总结于表1中。D0M10-53-546和D0M10-53-616的表达水平比D0M10-53-474和其它检测的新型dAb的表达水平好得多。
权利要求
1.一种包含以下氨基酸序列的抗白细胞介素-13(IL-i;3)的免疫球蛋白单可变域，所述氨基酸序列除与D0M10-53-474(SEQ ID NO :1)相比具有1、2、3、4或5个氨基酸改变之外，与D0M10-53-474相同，其中所述单可变域在依照Kabat编号的28位具有缬氨酸，其中所述单可变域不为D0M10-53-616(SEQ ID NO :5)。
2.一种包含以下氨基酸序列的抗白细胞介素-13(IL-i;3)的免疫球蛋白单可变域，所述氨基酸序列除与D0M10-53-474(SEQ ID NO :1)相比具有1、2、3、4或5个氨基酸改变之外，与D0M10-53-474相同，其中所述单可变域具有序列XGX' X"，其中G在依照Kabat编号的M位并且X = H或 K ； V =G 或 K; X" = K 或 I其中所述单可变域不为D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)。
3.权利要求2的单可变域，其中所述可变域在依照Kabat编号的28位具有缬氨酸。
4.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域在30、53、55和56位(依照 Kabat编号)中的一个或多个位置具有氨基酸改变(对比D0M10-53-474(SEQ ID NO :1))。
5.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域在30位(依照Kabat编号)具有脯氨酸。
6.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域在53位(依照Kabat编号)具有赖氨酸。
7.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域在55位(依照Kabat编号)具有甘氨酸或赖氨酸。
8.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域在56位(依照Kabat编号)具有异亮氨酸或赖氨酸。
9.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域在55位(依照Kabat编号)具有赖氨酸并在56位(依照Kabat编号)具有异亮氨酸。
10.一种抗白细胞介素-13 (IL-13)的免疫球蛋白单可变域，所述可变域为 D0M10-53-546(SEQ ID NO :2)、D0M10-53_567 (SEQ ID NO 3)或D0M10-53-568(SEQ ID NO: 4)。
11.一种抗白细胞介素-13 (IL-13)的免疫球蛋白单可变域，所述可变域由 D0M10-53-546(SEQ ID NO :6)、D0M10-53_567 (SEQ ID NO 7)或D0M10-53-568(SEQ ID NO: 8)的核苷酸序列编码。
12.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域特异性地结合人、食蟹猴和猕猴 IL-13。
13.前述权利要求中任一项的单可变域，其中在标准HEKSTAT测定中所述可变域以 0. 1-2. OnM 的 EC50 中和人 IL-13。
14.前述权利要求中任一项的单可变域，其中在标准HEKSTAT测定中所述可变域以 1-20ηΜ 的 EC50 中和猕猴 IL-13。
15.前述权利要求中任一项的单可变域，其中所述可变域在标准HEKSTAT测定中以 1-20ηΜ的EC5tl中和食蟹猴IL-13。
16.一种白细胞介素_13(IL-13)拮抗剂，所述拮抗剂包含前述权利要求中任一项的抗 IL-13免疫球蛋白单可变域。
17.权利要求16的拮抗剂，其中所述拮抗剂与D0M10-53-546(SEQ ID NO :2)、 D0M10-53-567(SEQ ID NO :3)、D0M10-53_568(SEQ ID NO :4)或D0M10-53-616(SEQ ID NO: 5)竞争结合IL-13。
18.用于肺部递送的权利要求16或17的拮抗剂或包含D0M10-53-616(SEQID NO 5) 的白细胞介素-13(IL-13)拮抗剂。
19.权利要求16或17的拮抗剂或包含D0M10-53-616(SEQID NO 5)的白细胞介素-13(IL-13)拮抗剂在制备用于肺部递送的药物中的用途。
20.用于治疗或预防人中IL-13介导的病况的权利要求16或17的拮抗剂。
21.权利要求16或17的拮抗剂在制备用于治疗或预防人中IL-13介导的病况中的用途。
22.—种治疗和/或预防人患者中IL-13介导的病况的方法，所述方法包括将权利要求16或17的拮抗剂或包含D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)的白细胞介素_13 (IL-13)拮抗剂给予所述患者。
23.权利要求20的拮抗剂、权利要求21的用途或权利要求22的方法，其中所述IL-13 介导的病况是呼吸病况。
24.权利要求23的拮抗剂、用途或方法，其中所述IL-13介导的病况选自肺部炎症、 慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、伴有嗜酸粒细胞增多的肺浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化病、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺动脉血栓栓塞、胸膜病症、纵隔病症、隔膜病症、通气不足、换气过度、睡眠性呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主病、肺癌、变应性鼻炎、变态反应、石棉沉着病、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭性肺炎球菌病、流感、非结核性分枝杆菌、胸腔积液、尘肺病、肺孢子虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉着症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多病X、肺动脉高压、肺诺卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病、类风湿肺病、结节病和韦格纳氏肉芽肿病。
25.一种肺部递送装置，所述装置包含权利要求16、17、18、20、23或M的拮抗剂或包含 D0M10-53-616(SEQ ID NO 5)的白细胞介素-13 (IL-13)拮抗剂。
26.权利要求25的装置，其中所述装置为吸入器或鼻内给药装置。
27.一种双特异性配体，所述配体包含权利要求1-15中任一项的可变域。
28.一种分离或重组核酸，所述核酸编码包含权利要求1-15中任一项的免疫球蛋白单可变域的多肽。
29.权利要求观的核酸，其中所述核酸包含D0M10-53-546(SEQ ID NO 6)、 D0M10-53-567(SEQ ID NO :7)、D0M10-53_568 (SEQ ID NO 8)或D0M10-53-616(SEQ ID NO: 9)的核苷酸序列。
30.一种分离或重组核酸，其中所述核酸包含与D0M10-53-M6(SEQ ID NO :6)、 D0M10-53-567(SEQ ID NO :7)、D0M10-53_568(SEQ ID NO 8)或D0M10-53-616(SEQ ID NO: 9)的核苷酸序列有至少99%同一性的核苷酸序列，并且其中所述核酸编码包含特异性结合IL-13的免疫球蛋白单可变域的多肽。
31.一种载体，所述载体包含权利要求观、四或30的核酸。
32.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求观、四或30的核酸或者权利要求31的载体。
33.一种制备包含免疫球蛋白单可变域的多肽的方法，所述方法包括将权利要求32的宿主细胞保持在适合所述核酸或载体表达的条件下，从而制备包含免疫球蛋白单可变域的多肽。
34.权利要求33的方法，所述方法还包括分离所述多肽并任选制备变体或突变的变体，其在标准HEK STAT测定中具有比所述分离的多肽提高的亲和力和/或对IL-13中和的EC500
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-15中任一项的免疫球蛋白单可变域或权利要求16、17、18、20、23或对中任一项的拮抗剂以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
36.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1-15中任一项的单可变域。
37.一种分离或重组核酸，所述核酸编码权利要求36的融合蛋白。
38.权利要求1-15中任一项的免疫球蛋白单可变域或权利要求16、17、18、20、23或对中任一项的拮抗剂或权利要求36的融合蛋白，包含抗体的恒定域。
39.包含抗体Fc的权利要求38的可变域、拮抗剂或融合蛋白，任选其中所述Fc的N-端与所述可变域的C-端连接(任选直接连接)。
40.权利要求1-15中任一项的免疫球蛋白单可变域或权利要求16、17、18、20、23或M 中任一项的拮抗剂或权利要求36的融合蛋白，其中所述可变域还包含半衰期延长部分。
41.权利要求40的可变域、拮抗剂或融合蛋白，其中所述半衰期延长部分为聚乙二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或者包含提高体内半衰期的多肽结合位点的抗体或抗体片段。
42.权利要求41的可变域、拮抗剂或融合蛋白，其中所述半衰期延长部分为包含血清白蛋白或新生Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。
43.权利要求40的可变域、拮抗剂或融合蛋白，其中所述半衰期延长部分为dAb、抗体或抗体片段。
全文摘要
本发明公开了对白细胞介素-13(IL-13)或对IL-4和IL-13具有结合特异性的配体。本发明还公开了使用这些配体的方法。具体而言，本发明描述了这些配体在治疗IL-13介导的病况例如肺部病况(例如变应性哮喘)中的用途。所述配体具有强力的IL-13结合动力学。本发明描述了在人IL-13和一种或多种灵长类IL-13之间有交叉反应性的配体。配体在原核细胞中良好表达。
文档编号A61P11/00GK102292351SQ200880132756
公开日2011年12月21日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年11月26日
发明者西尔瓦 I·德, M·奥弗卡, 维尔德特 R·M·T·德 申请人:杜门蒂斯有限公司, 葛兰素集团有限公司