专利名称：：金黄色葡萄球菌中的ssrA在金葡菌感染防治中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及金葡菌中的一种tmRNA-ssrA的应用，具体而言，本发明涉及ssrA作为反义RNA，作用于金葡菌色素合成相关的关键基因，调控金葡菌的色素合成，从而影响金葡菌抗宿主免疫的能力，及其在金葡菌感染的防治领域的用途。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(金葡菌，Staphylococcusaureus)是人类的一种重要病原菌，能够引起肺炎、心内膜炎、烧伤及战伤感染、败血症、中毒性休克等多种严重感染。更为严重的是，抗生素的滥用导致金葡菌耐药性不断增强，如1961年发现的对13-内酰胺类抗生素耐药的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，1997年发现的耐糖肽类抗生素的耐糖肽金葡菌(GISA)，2002年IO月又发现了耐万古霉素的金葡菌(VRSA)。2007年10月，KlevensRM等报道了2005年美国MRSA的感染人数超过9万人，感染率为31.8/100，000，死亡率为6.3/100，000，死亡人数超过HIV感染的死亡人数。由于耐药性的问题，金葡菌感染所致脓毒血症的防治不仅是现代创伤外科和危重病医学面临的棘手难题，也是微生物学领域亟待研究解决的热点课题之一。对于金葡菌所致感染的防治，传统的思路是通过抑菌、杀菌和疫苗接种，但是在已揭示金葡菌基因表达谱的今天，深入探索金葡菌致病机理及其调控因素可能创建一条新的有效抗感染途径。金葡菌表面的金黄色是分类学的一个经典指标，其色素由一系列的类胡萝卜素类化合物组成，其中st即hyloxanthin是其主要的组成成分。研究结果表明，金葡菌表面的色素与细菌的致病性明显相关[ChamberlainNRetal(1991)InfectI匪n59:4332-4337]。金葡菌表面的色素合成主要由CrtM和CrtN两种蛋白参与[WielandB.C.etal(1994)JBacteriol176:7719-7726]。LiuGY等人构建了crtM的突变体菌株，通过突变体菌株和野生型菌株的比较发现，金葡菌表面的色素具有明显的抗氧化能力，而这种抗氧化能力可以使细菌抵抗中型粒细胞的杀伤作用，提高细菌本身的致病性[LiuGYetal(2005)JExpMed202:209-215]。rsbUVWsigB系统能够金葡菌色素的合成，BischofTM等人的研究结果表明转录起始因子SigB能够上调crt丽操纵子的表达，其突变体菌株的色素合成明显降低[PalmaMetal.(2001)InfectImmun69:7858-7865，BischoffMPetal.(2004)JBacteriol186:4085-4099]。ssrA又称为tmRNA和10saRNA，在细菌内高度保守，其主要的生物学功能是通过行使tRNA和mRNA的双重功能，在合成停滞或者中断的蛋白质末端延伸出一段多肽，完成翻译，释放核糖体。该肽段能够被蛋白酶识别，从而使修饰的蛋白被迅速降解[KarzaiAetal.(2000)NatStructBiol7:449-455]。SmpB(smallproteinB)是ssrA发挥其生物学功能的关键蛋白质[KarzaiAWetal.(1999)EMB0J18:3793-3799.]。申请人:在通过基因突变的方法来研究ssrA的生物学功能的过程中发现，虽然由于金葡菌8325-4中的rsbU基因突变，导致其表面色素受，但是AssrA突变体菌株颜色明显的加深，而AsmpB突变体菌株颜色与野生型相同。相对于野生型菌株，该突变体抗氧化能力明显增强，并且其抗人中性粒细胞杀伤的能力明显增强。通过序列分析，发现ssrA132—147这一区段与crt的SD序列互补，而凝胶阻滞实验证实ssrA132—147和crtMN的5—UTR之间的存在相互作用，说明ssrA可能影响crtMN的翻译。前面的实验表明SmpB不参与ssrA对色素合成的调控作用，申请人尝试寻找是否有其它蛋白参与。而构建的RNA伴侣分子Hfq蛋白的突变体菌株颜色也明显的加深，表明Hfq蛋白参与调控色素合成，而细菌色素光谱分析结果显示AssrA和Ahfq两株突变体表型相同。同样，Ahfq突变体抗氧化能力和在人中性粒细胞中的存活能力均明显增强。而免疫共沉淀结果表明，ssrA与crtMN的5—UTR之间的相互作用必需Hfq蛋白参与。有报道表明，SigB蛋白参与调控色素合成的作用[KullikLetal(1998)JBacteriol180:4814-4820]。申请人发现，AssrA和Ahfq两株突变体中sigB表达水平均升高，提示ssrA和Hfq蛋白可能调控sigB表达。序列分析结果显示，ssrA138—154这一区段与sigB的SD序列互补，而凝胶阻滞实验证实ssrA138—154和sigB的5—UTR之间的存在相互作用，而ssrA132—147则无这种作用，ssrA还可能通过影响sigB的翻译，从而影响crtMN的转录。而免疫共沉淀结果表明，ssrA与sigB的5—UTR之间的相互作用必需Hfq蛋白参与。至此，申请人不仅验证了金葡菌中的ssrA具有调控菌体表面色素合成的功能，而且还阐明了其中的生物学机制，即ssrA在伴侣分子Hfq蛋白辅助下，通过与crtMN的5—UTR结合以影响crtMN的翻译，或与sigB的5—UTR结合以影响crtMN的转录，由此完成了本发明。
发明内容具体地，本发明提供了1.金葡菌中一种tmRNA-ssrA在金葡菌感染的防治中的应用。其特征在于ssrA为序列表所示的315个碱基长的RNA。2.权利要求1中的RNA序列，具有ssrA的第132-147位碱基。3.权利要求1中的RNA序列，具有ssrA的第138-154位碱基。4.权利要求1中的RNA序列，ssrA可以是体外化学合成的，也可以是通过体外转录或其他分子生物学方法制备的。5.权利要求2中的RNA序列，ssrA的第132-147位碱基可以是体外化学合成的，也可以是通过体外转录或其他分子生物学方法制备的。6.权利要求3中的RNA序列，ssrA的第138-154位碱基可以是体外化学合成的，也可以是通过体外转录或其他分子生物学方法制备的。7.权利要求1、2、3中的RNA序列在制备抗金葡菌感染的疫苗中的用途。8.权利要求1、2、3中的RNA序列在制备治疗金葡菌感染的药物中的用途。图1:表示野生型、突变体AssrA和As,B菌株颜色。图2:表示野生型、突变体AssrA和Ahfq的单氧敏感实验结果。图3:表示野生型、突变体AssrA和Ahfq的双氧敏感实验结果。图4:表示野生型、突变体AssrA和Ahfq的人中性粒细胞存活实验。图5:表示ssrA132—147与crt5—UTR序列分析结果。图6:表示ssrA132—147和crtMN的5—UTR作用的凝胶阻滞实验结果。图7:表示野生型、突变体AssrA和Ahfq菌株颜色。图8:表示野生型、突变体AssrA和Ahfq的细菌色素光谱分析结果图9:表示ssrA、crtMN的5—UTR与Hfq蛋白三者作用的免疫共沉淀实验结果。图10:表示突变体AssrA和Ahfq中sigB表达水平的实时定量PCR结果。图11:表示ssrA138—154与sigB5—UTR序列分析结果。图12:表示ssrA132—147、ssrA138—154和sigB的5—UTR作用的凝胶阻滞实验结果。图13:表示ssrA、sigB的5—UTR与Hfq蛋白三者作用的免疫共沉淀实验结果。图14:表示ssrA调控色素合成的可能机制示意图。具体实施例方式为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。实施例1、金葡菌突变体菌株的构建根据拟突变基因上下游各长500800bp序列分别设计引物(见表l)，再通过PCR的方法扩增得到这两段序列；经过重叠PCR将这两段序列扩增为1，OOObp的序列并引入酶切位点KpnI。将经KpnI酶切的卡那基因插入到上述序列中，再将此序列通过EcoRI和SalI连入穿梭载体pAUL-A中，产生质粒pAUL-A-A。将pAUL-A-A电转化S.aureusRN4220,先置于30。C培养，再42。C培养，通过卡那抗性筛选，得到基因组发生同源重组N4220-ARN4220。利用噬菌体tp11裂解ARN4220培养物，将裂解上清加入S.aureus8325-4培养物中，37t:孵育lh，再进一步通过42。C温度和卡那抗性筛选，获得S.aureus8325-4基因组发生双交换的重组菌。进一步通过突变体的基因组PCR、PT-PCR、WesternBlot等方法验证是否该基因发生了突变。利用此方法获得了突变体AssrA、AsmpB和Ahfq，其中AssrA和Ahfq菌体颜色较野生型明显变深(见图1，7)。培养S.aureus8325-4、AssrA和Ahfq至静止期，离心，收集菌体，甲醇萃取，取上清进行连续可波长扫描，测定其光吸收值。结果显示，野生型无明显吸收峰，AssrA和Ahfq的最大吸收波长相同，峰值也接近(见图8)，表明它们表面为数量相近的同一色素。2、氧敏感实验单氧敏感实验是将金葡菌以PBS稀释为0.5X108/ml，加入24孔板，每孔2ml，再加入终浓度0.1iig/ml的亚甲基蓝，放置于距100瓦光源10cm处，37t:孵育1.5h，涂板测定细菌存活数。双氧敏感实验是将将金葡菌以PBS稀释，以PBS稀释为1X107ml，加入24孔板，每孔2ml，再加入终浓度1.5%的H^，37t:孵育lh，加入浓度为1，OOOU/ml的过氧化氢酶(购自Sigma公司)以清除剩余的11202，涂板测定细菌存活数。与野生型菌株相比，突变体AssrA和Ahfq细菌存活数明显增加，即其抗氧能力明显增强(见图2，3)。3、中性粒细胞存活实验利用Histopaque分离液(Sigma公司)从健康成人全血中分离出中性粒细胞。细菌培养物离心，收集沉淀，PBS洗涤两次，用RPMI1640(含10%FCS)稀释菌体至4.5X107/ml。取100ill菌液与3X105中性粒细胞混合，700g离心5min，置于37°C(5%C02)温箱培养lOmin，加入终浓度400iig/ml的庆大霉素以杀死细胞外的细菌。再继续培养45min，离心沉淀中性粒细胞，PBS洗涤两次，O.02%TritonX裂解，涂板测定细菌存活数。结果显示，与野生型相比，突变体AssrA和Ahfq细菌存活数明显增多，即其抗人中性粒细胞杀伤的能力明显增强(图4)。4、实时定量PCR检测sigB的表达水平细菌总RNA利用Triazol试剂(Invitrogen公司)提取，取80加入10U无RNA酶的DNaseI(Promega公司)、10ii1DNaseI缓冲液，在100ii1体系中37"C反应30min。取2illRNA进行1.2%甲醛变性胶电泳，以检测RNA的完整性。反转录体系为25y1，其中总RNAIPg，六聚寡核苷酸随机引物(TaKaRa公司)500ng，5iUof5X第一链缓冲液，2iU5mMdNTP，20URNasin(TaKaRa公司)，1ii1反转录酶M-MLV(Promega)，65。C反应10min。实时定量PCR体系为25iil，其中12.5ii12XSYBR染料(GenePharma公司)，0.3iiM基因特异的上下游引物(见表1)，1Pl模板。其中样品管的模板为cDNA，阴性对照的模板为去离子水，标准管的模板是以100500ng基因组DNA为模板、利用基因特异的引物扩增目的基因的PCR产物。循环参数为95。C10min，94。C30s变性，58。C30s退火，72。C40s延伸。每个扩增的基因均测定其溶解曲线，以确定PCR产物的特异性。与野生型相比，突变体AssrA和Ahfq中sigB表达水平明显提高(图10)，表明ssrA、Hfq蛋白可能参与sigB的表达调控。5、凝胶阻滞实验通过序列分析，发现ssrA132—147与crtMN的5—UTR、ssrA138—154与sigB的5—UTR分别互补(见图5，11)。crtMN和sigB的5—UTR通过将体外转录的方法制备。设计合成引物(见表1)，扩增编码crtMN和sigB的5—UTR基因序列，将其连接入pMD20T(TaKaRa公司)，BamHI酶切，成为线性化质粒。以其为模板，利用SP6RNA聚合酶(TaKaRa公司)进行体外转录。获得的RNA片段利用6%聚丙烯酰胺变性胶纯化，溶于T丽缓冲液(20mMTris-acetatepH7.5，2mMMgC12，100mMNaCl)中，95。C孵育2min，冰浴2min，37。C孵育30min使其正确折叠。ssrA132—147(具体序列为ACAGCAUUUCCUAUG，SEQIDNO:1)禾PssrA138—154(具体序歹lj为AUUUCCUAUGUGCUGUU，SEQIDNO:2)为化学合成(Takara公司)，5'端进行了生物素标记。上述RNA分子溶于TMN缓冲液，通过90。C2min，再4。Clmin，20。C15min，使其完全变性。生物素标记的ssrA132—147、ssrA138—154分别与crtMN和sigB的5—UTR37°ClOmin孵育。样品中加入上样缓冲液，8%聚丙烯酰胺天然胶100V电泳，4t:2h。将胶转移至尼龙膜上，LightShiftChemiluminescentEMSAKit(Pierce公司)显影。结果显示，ssrA132—147与crtMN的5—UTR、ssrA138—154与sigB的5—UTR能够特异结合(见图6，12)。6、免疫共沉淀实验ssrA(SEQIDNO:3)、crtMN的5—UTR(SEQIDNO:4)、sigB的5—UTR(SEQIDNO:5)通过体外转录制备，方法同上。根据S.aureus8325-4中hfq基因设计、合成引物(见表1)，以S.aureus8325-4基因组为模板，PCR扩增该序列，同时在5'端和3'端分别引入酶切位点NdeI和HindIII。经NdeI和HindIII双酶切，与表达载体pET28a连接，转化E.coliBL21(DE3)。重组菌的序列测定结果表明，hfq基因序列(SEQIDNO:6)按阅读框架正确插入载体pET28a中，故重组表达的蛋白氨基酸序列也应与Hfq蛋白一致(SEQIDNO:7)。重组菌经IPTG诱导表达Hfq蛋白，Ni-NTA螯合树脂(QIEGEN公司)纯化，获得了纯度约为95X的Hfq蛋白。50iilTMN缓冲液中加入ssrA10iig、Hfq蛋白2iig混合，37"孵育15min，再与15iUNi2+螯合树脂(Novagen公司)室温孵育15min。总RNA(O.lyg/yl，50ill)或crtMN/sigB的5—UTR(O.01yg/yl，50yl)加入上述混合物，室温孵育5min。TMN缓冲液洗涤树脂三次，树脂结合的RNA在25iU体系中反转录，42t:lh;PCR扩增反转录产物中的ssrA、crtMN/sigB的5—UTR。结果表明，ssrA与crtMN/sigB的5—UTR结合需要Hfq蛋白的参与。综上可知，本申请通过一系列生物学实验验证了金葡菌中的ssrA具有调控菌体表面色素合成的功能，而且还阐明了其中的生物学机制，由此完成了本发明。表l:引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>〈211>228〈212>DNA〈213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcussureus)〈400>4TACTTGAGCTATACTACACAATTTATTTATCTGCATCGMGGGTCGGCCAATTTTCTMT60TTATTMTGGTATGTCATCCATTGTTATTTATGTTTTTTACTMMTTTTCATCCMTCT120TGGAMCAMCGCATCGTTATGGTGTAGTTGMTGGAMGGTCGTCMTATTCTATATCT180AAAGAACAATAAATCAAGGTAATGGCATTTCAATATAGGAGGACTAGT228〈210>5〈211>300〈212>DNA〈213>金黄色葡萄球菌(Staphuylococcusaureus)〈400>5TAMGGTGACAGTTTTGATTATGAMCMCTAMTCMMATAGGTCCTTACGATAMGA60CGMMTATAGACTTTTTACGCGMGGTGGCCTAGGTTTATTTTTMTCGMTCTTTMT120GGATGMGTCACAGTATATAMGMTCTGGTGTGACMTCAGTATGACTAAGTATATAM180MMGAGCAGGTGCGAMTAATGGCGAMGAGTCGAMTCAGCTMTGMATTTCACCTG240AGCAMTTMCCMTGGATTAMGMCACCMGMMTMGMTACAGATGCACAGGATA300〈210>6〈211>234〈212>DNA〈213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〈400>6ATGATTGCMACGMMCATCCMGACAMGCACTAGAGAATTTTAMGCAMCCAMCT60GMGTMCTGTATTCTTTCTAMCGGTTTCCAMTGAMGGTGTTATTGAAGMTACGAC120MGTATGTCGTMGCTTAMTTCTCMGGCAMCMCACTTGATTTACMACATGCGATC180AGCACTTATACAGTAGAMCTGMGGTCMGCATCTACTGAMGTGMGAATM234〈210>7〈211>77〈212>DNA〈213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〈400>7MetlieAlaAsnGluAsnlieGinAspLysAlaLeuGluAsn1510PheLysAlaAsnGinThrGluValThrValPhePheLeuAsn151620GlyPheGinMetLysGlyVallieGluGluTyrAspLysTyr253035ValValSerLeuAsnSerGinGlyLysGinHisLeulieTyr404550LysHisAlalieSerThrTyrThrValGluThrGluGlyGin556065AlaSerThrGluSerGluGlu7075〈210〉8〈211>31〈212>DNA〈213〉引物〈400>8gggaattccatetgattgcaaacgaaaacat31〈210>9〈211>31〈212>DNA〈213〉引物〈400>9gggaattccatatgattgcaaacgaaaacat31〈210>10〈211>17<212>DNA〈213〉引物〈400〉10gcctaatacatgcaagt17〈210>11〈211>18〈212>DNA〈213〉引物〈400〉11catgttatccggcattag18〈210>12〈211>20〈212>DNA〈213〉引物〈400>12tacttgagctatactacaca20〈210>13〈211>20〈212〉DNA〈213〉引物0156]〈400〉130157]actagtcctcctatattgaa0158]〈210>140159]〈211>180160]〈212>DNA0161]<213>引物0162]〈400>140163]gacttggtgaatcgttgc0164]〈210>15:0165]〈211>19:0166]〈212>DNA:0167]〈213〉引物:0168]〈400>15:0169]ctatgattggtgatgcttc:oi70]〈210>16:0171]〈211>20:0172]<212〉DNA:0173]〈213〉引物:0174]〈400>16:0175]ttatgtgctaatgccgacgc〈210>17〈211>18〈212>DNA〈213〉引物〈400>17朋ccg朋tgccg朋cc朋〈210>18〈211>32〈212>DNA〈213〉引物〈400>18catccggaattcccaatcatagc鄉tgga〈210>19〈211>31〈212>DNA〈213>引物〈400>19tcacttggtaccctgtcggactccttttac〈210>2018192018ac32t31<211>32〈212>DNA〈213〉引物〈400〉20cgacagggtacc朋gtg肪g肌〈210>21〈211>32〈212〉DNA〈213〉引物<400〉21acacgcgtcgaccaaataaaggtgttactt〈210>22〈211〉28〈212〉DNA<213>引物〈400>22catccggaattcat朋aagt〈210〉23〈211〉31〈212>DNA〈213〉引物〈400〉23cgtccggtacctccatgaacgtccccg肌at<210〉24〈211>31〈212>DNA〈213〉引物〈400〉24atgg3ggteccggacgcgggttcaaatcccg〈210>25<211〉28〈212〉DNA[0227:〈213〉引物[0228:〈400>25[0229:3C3Cgcgtcgacg朋gtegtgtegttgc10/10页323228313128权利要求金葡菌中一种tmRNA-ssrA在金葡菌感染的防治中的应用。其特征在于ssrA为具有SEQIDNO1的核苷酸序列的RNA。2.权利要求1中的RNA序列，具有ssrA的第132-147位碱基(具体的核苷酸序列为SEQIDNO2)。3.权利要求1中的RNA序列，具有ssrA的第138-154位碱基(具体的核苷酸序列为SEQIDNO3)。4.权利要求1中的RNA序列，ssrA可以是体外化学合成的，也可以是通过体外转录或其他分子生物学方法制备的。5.权利要求2中的RNA序列，ssrA的第132-147位碱基可以是体外化学合成的，也可以是通过体外转录或其他分子生物学方法制备的。6.权利要求3中的RNA序列，ssrA的第138-154位碱基可以是体外化学合成的，也可以是通过体外转录或其他分子生物学方法制备的。7.权利要求1、2、3中的RNA序列在制备抗金葡菌感染的疫苗中的用途。8.权利要求1、2、3中的RNA序列在制备治疗金葡菌感染的药物中的用途。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，涉及金葡菌中的一种tmRNA-ssrA的应用。通过对ssrA生物学功能的研究发现，它能够作为反义RNA，作用于金葡菌色素合成相关的关键基因crt基因和sigB基因的SD序列，从而影响金葡菌抗宿主免疫的能力。因此，ssrA在金葡菌感染的防治领域有良好的应用前景。文档编号A61K48/00GK101711878SQ20091008079公开日2010年5月26日申请日期2009年3月30日优先权日2009年3月30日发明者刘玉,吴娜,杨光,董洁,邵宁生,高亚萍申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所