专利名称：：一种从沙棘籽中提取生物碱的方法及其活性成分抗心血管疾病的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及提取分离沙棘籽生物碱有效成分的方法及其抗心血管疾病活性的应用。属于沙棘属植物资源的开发利用
技术领域：
。
背景技术：
：沙棘籽为胡颓子科(Elaeanaeeae)沙棘属(Hippophae)植物果实的籽。沙棘具有抗氧化、提高免疫力的功能。据报道沙棘籽乙醇提取物可提高小鼠红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和小鼠全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活性，并能降低小鼠肝脏过氧化脂质含量；沙棘籽乙醇提取物可以清除HO*,抑制HO所致的丙二醛的产生，减少HO所致的红细胞溶血，降低HO所致线粒体肿胀程度，具有抗HO，所致的氧化损伤的作用；同时沙棘籽乙醇提取物能显著提高小鼠(雌，雄)的碳廓清能力，增强小鼠T淋巴细胞活性，促进溶血素的形成，具有提高小鼠免疫力的功能。有关沙棘籽乙醇提取物抗心肌缺血损伤的研究国内尚未见报道，国外有关的研究也很少。我们在对不同种沙棘籽粕提取物进行研究时，发现其不但有较好的抗氧化活性，也具有很好的抗心肌缺血活性。为充分利用沙棘资源、为缺血性心脏病患者提供更多的治疗途径，进一步开发沙棘果实中的籽，生产抗心肌缺血损伤产品很有必要。参考文献1.廉永善，陈学林.沙棘属植物的系统分类.沙棘，1996,9(1):15-24.2.黄辁，史玲芳，王士坤，等.沙棘种植技术与开发利用[M].北京:金盾出版社，1998，1-17,113-123.3.李根前，唐德瑞，赵一庆.沙棘属植物资源与开发利用.沙棘，2000,(6):22-25.4.于倬德，敖复，廉永善.中国沙棘属植物的起源、分类、群落和资源.沙棘，1993,(3):19-24.5.廉永善等.沙棘属植物生物学和化学[M].兰州:甘肃科学技术出版社,2001:80115.6.BeveridgeT，LiTSC，OomahBD.Seabuckthornproducts:manufactureandcomposition.JAgricFoodGhem，1999,47，3480-3488.7.R6schD,BergmannM，KnorrD,"a/.Structure-antioxidantefficiencyrelationshipsofphenoliccompoundsandtheircontributiontoantioxidantactivityofseabuckthornjuice.JAgricFoodChem,2003，51，4233-4329.8.GaoX，OhlanderM,JeppssonN，etal.Changesinantioxidanteffectsandtheirrelationshiptophytonutrientsinfruitsofseabuckthorn(HippophaerhamnoidesL)duringmaturation.JAgricFoodChem，2000,48:1485—90.9.廉永善.沙棘属植物天然产物及其主要生理药理功能.沙棘，2005,18(3):5-16.
发明内容本发明的目的是针对上述现状，提供一种从沙棘籽中提取生物碱的方法及其活性成分抗心血管疾病的应用。为达上述目的，本发明采用如下的技术方案依次包括如下内容1、材料沙棘果实中脱油后的籽粕，包括柳叶沙棘、江孜沙棘、肋果沙棘、西藏沙棘、沙棘、棱果沙棘6个种和中国沙棘、云南沙棘、中亚沙棘、蒙古沙棘4个亚种之任意一种沙棘果实中的籽。2、有效成分的提取A、制备沙棘籽提取物浓縮液以沙棘籽粕为原料，按料液质量比沙棘籽粕乙醇溶液为1:6加入质量浓度10%~70%的乙醇溶液，在3070。C的温度中提取1~2小时，离心分离出提取液；渣再按料液比1:6加入10%~70%的乙醇，在5060'C的温度中提取12小时，离心分离出提取液；渣再按料液比1:6加入10%70%的乙醇，在5060。C的温度中提取12小时，共提取三次，合并提取液，浓縮至少量液体，得沙棘籽提取物浓縮液；B、制备沙棘籽生物碱粗提物取沙棘籽提取物浓縮液，在搅拌下加入23倍体积的乙酸乙脂，然后静止56小时，分馏出乙酸乙脂；再在搅拌下加入23倍体积的乙酸乙脂，然后静止6~8小时，分馏出乙酸乙脂，反复多次直至乙酸乙脂相无色时止；合并乙酸乙脂相在65'C以下减压浓縮至无乙酸乙脂味，得沙棘籽生物碱粗提物；3、有效成分的分离C、制备沙棘籽生物碱取沙棘籽生物碱粗提物上样至AB—8型大孔树脂柱，先用1倍柱体积水洗涤，再用3倍柱体积质量浓度10%~30%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓縮，得沙棘籽生物碱组分。4、沙棘籽生物碱活性成分的化学组成活性成分A:2-甲基-6-羟基-9-乙胺基色胺，分子式:CuN20,H"分子量:202;活性成分B:5-羟基-8-乙羟基色胺，分子式:Ch)1^02Hu分子量:177;活性成分C:5-羟基-8-乙胺基色胺，分子式:d。N20jHu分子量:176。5、从沙棘籽中提取的生物碱的应用，其活性成分应用于抗心血管疾病，心肌细胞缺氧/复氧会导致缺血损伤，细胞存活率明显下降，用沙棘籽生物碱组分干预后心肌细胞存活率显著提高，从而减低心血管疾病的发生。表1.沙棘籽生物碱活性成分对缺血心肌细胞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2沙棘籽生物碱对缺血/再灌注损伤心肌细胞中LDH，CK含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*尸<0.05wcontrolgroup,**尸<0.01wcontrolgroup;#尸<0.05vsI/Rgroup,ffffP<0.05wI/Rgroup。本发明的有益效果提取的沙棘籽生物碱其活性成分应用于抗心血管疾病，有较好的抗心肌缺血活性，对缺血心肌细胞损伤有很好的保护作用。图1活性成分A的^-NMR图。图2活性成分A的13C-NMR图。图3活性成分A的DEPT图。图4活性成分A的MS图。图5活性成分B的^-NMR图。图6活性成分B的13C-NMR图。图7活性成分B的DEPT图。图8活性成分B的MS图。图9活性成分C的iH-NMR图。图IO活性成分C的"C-NMR图。18.3和58.4为残留的乙醇信号。图11活性成分C的DEPT图。图12活性成分C的MS图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1:将1.0kg沙棘籽粕置于10升三角瓶中，用6升10%的乙醇，在70。C提取1小时，离心分离出提取液，渣再加入6升10%的乙醇，搅拌提取2小时，提取温度为70°C，提取三次。离心分离除去残渣，浓縮。浓縮液在搅拌下加入3倍体积的乙酸乙脂，然后静止5小时，分馏出乙酸乙脂，再在搅拌下加入3倍体积的乙酸乙脂，然后静止6小时，分馏出乙酸乙脂。反复多次直至乙酸乙脂相无色时止。合并乙酸乙脂相在65。C以下减压浓縮至无乙酸乙脂味，得沙棘籽生物碱粗提物。将沙棘籽生物碱粗提物上大孔树脂(型号AB-8)层析柱(60X600mm)，先用水洗脱，再用10%乙醇洗脱，收集10%乙醇洗脱液，浓縮到无乙醇止。置于真空干燥箱内，控制温度50-60。C，干燥3小时，得沙棘籽生物碱成分。实施例2:将10kg沙棘籽粕置于100升提取罐中，用60升70%的乙醇，在30。C提取l小时，离心分离出提取液，渣再加入60升70%的乙醇，在30。C的温度下搅拌提取2小时，离心分离除去残渣，共提取三次。合并清液浓縮。浓縮液在搅拌下加入2倍体积的乙酸乙脂，然后静止5小时，分馏出乙酸乙脂，再在搅拌下加入3倍体积的乙酸乙脂，然后静止6小时，分馏出乙酸乙脂。反复多次直至乙酸乙脂相无色时止。合并乙酸乙脂相在65t:以下减压浓缩至无乙酸乙脂味，得沙棘籽生物碱粗提物。将沙棘籽生物碱粗提物上大孔树脂(型号AB-8)层析柱(8X100cm)，先用水洗脱，再用30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，浓缩到无乙醇止。置于真空干燥箱内，控制温度50-60。C，干燥3小时，得沙棘籽生物碱成分。实施例3:将50kg沙棘籽粕置于500升提取罐中，用300升50%的乙醇，在50。C提取l小时，离心分离出提取液，渣再加入300升50%的乙醇，在5(TC的温度下搅拌提取2小时，离心分离除去残渣，共提取三次。合并清液浓縮到十分之一体积。浓縮液在搅拌下加入2倍体积的乙酸乙脂，然后静止5小时，馏出乙酸乙脂，再在搅拌下加入3倍体积的乙酸乙脂，然后静止6小时，分馏出乙酸乙脂。反复多次直至乙酸乙脂相无色时止。合并乙酸乙脂相在65。C以下减压浓縮至无乙酸乙脂味，得沙棘籽生物碱粗提物。将沙棘籽生物碱粗提物上大孔树脂(型号AB-8)层析柱(20X180cm)，先用水洗脱，再用20%乙醇洗脱，收集20%乙醇洗脱液，浓縮到无乙醇止。置于真空干燥箱内，控制温度50-60。C,干燥3小时，得沙棘籽生物碱成分。权利要求1、从沙棘籽中提取生物碱的方法，其特征在于依次包括如下步骤A、制备沙棘籽提取物浓缩液以沙棘籽粕为原料，按料液质量比沙棘籽粕∶乙醇溶液为1∶6加入质量浓度10％～70％的乙醇溶液，在30～70℃的温度中提取1～2小时，离心分离出提取液；渣再按料液比1∶6加入10％～70％的乙醇，在50～60℃的温度中提取1～2小时，离心分离出提取液；渣再按料液比1∶6加入10％～70％的乙醇，在50-60℃的温度中提取1～2小时，共提取三次，合并提取液，浓缩至少量液体，得沙棘籽提取物浓缩液；B、制备沙棘籽生物碱粗提物取沙棘籽提取物浓缩液，在搅拌下加入2～3倍体积的乙酸乙脂，然后静止5～6小时，分馏出乙酸乙脂；再在搅拌下加入2～3倍体积的乙酸乙脂，然后静止6～8小时，分馏出乙酸乙脂，反复多次直至乙酸乙脂相无色时止；合并乙酸乙脂相在65℃以下减压浓缩至无乙酸乙脂味，得沙棘籽生物碱粗提物；C、制备沙棘籽生物碱取沙棘籽生物碱粗提物上样至AB-8型大孔树脂柱，先用1倍柱体积水洗涤，再用3倍柱体积质量浓度10％～30％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，得沙棘籽生物碱组分。2、根据权利要求1所述的从沙棘籽中提取生物碱的方法，其特征在于所述A步骤中沙棘籽粕，选用柳叶沙棘、江孜沙棘、肋果沙棘、西藏沙棘、沙棘、棱果沙棘6个种及中国沙棘、云南沙棘、中亚沙棘、蒙古沙棘4个亚种之任意一种沙棘果实中的籽。3、根据权利要求1所述的从沙棘籽中提取生物碱的方法，其特征在于所得沙棘籽生物碱组分的活性成分包括活性成分A活性成分B活性成分C活性成分A:2-甲基-6-羟基-9-乙胺基色胺，活性成分B:5-羟基-8-乙羟基色胺，活性成分C:5-羟基-8-乙胺基色胺。4、权利要求l所述方法从沙棘籽中提取的生物碱的应用，其特征在于其活性成分应用于抗心血管疾病，心肌细胞缺氧/复氧会导致缺血损伤，细胞存活率明显下降，用沙棘籽生物碱组分千预后心肌细胞存活率显著提高，从而减低心血管疾病的发生。全文摘要一种从沙棘籽中提取生物碱的方法及其活性成分抗心血管疾病的应用，属于沙棘属植物资源的开发利用
技术领域：
。本发明包括A.以沙棘籽粕为原料，用乙醇溶液提取三次，合并提取液，浓缩，得沙棘籽提取物浓缩液；B.取沙棘籽提取物浓缩液，用乙酸乙酯萃取，分馏出乙酸乙酯，直至乙酸乙酯相无色时止；合并乙酸乙酯相减压浓缩，得沙棘籽生物碱粗提物；C.取沙棘籽生物碱粗提物上样至AB-8型大孔树脂柱，先用1倍柱体积水洗涤，再用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，得沙棘籽生物碱组分。提取的沙棘籽生物碱的应用，其活性成分应用于抗心血管疾病，心肌细胞缺氧/复氧会导致缺血损伤，用沙棘籽生物碱组分干预后心肌细胞存活率显著提高，从而减低心血管疾病的发生。文档编号A61K36/185GK101612176SQ20091018142公开日2009年12月30日申请日期2009年6月29日优先权日2009年6月29日发明者唐年初,徐德平,梅金龙,胡长鹰,赵晨伟申请人:江南大学