专利名称：：针对RMP基因的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学与生物医药
技术领域：
，具体涉及一种针对RMP基因的RNA千扰技术。
背景技术：
：RMP(RPB5-MediatingProtein)最早是1995年Cheong等181采用Far-Westingblotting方法，以32P标记的重组人RPB5探针从人肝癌细胞株HepG2的cDNA文库中筛査得到，其基因定位于人染色体19ql2;它是RNA聚合酶II(RNAPII)第5亚基RPB5的调节蛋白(参见DelgermaL，HayashiN,DorjsurenD，et.al.MolCellBiol，2004，24(19):8556-8566.)。发明人之前参与了对RMP的原始研究工作(参见MolecularandCellularBiology18:7546-7555，1998);并发现了RMP对基因转录的抑制作用依赖于转录因子TFIIF,阐明了RMP与转录因子TFIIF的结合是RMP对转录抑制作用所必须的条件(参见CellResearch2003,13(2)111-120;MolCellBiol.2006，26(l):250-60;ActaPhysiologicaSinica.200658(6):521陽528)，力R]VIP^细胞中的功能研究奠定了坚实的基础。目前，对于RMP的研究主要集中在分子机制水平，例如RMP作为RPB5的调节蛋白，可以通过与后者的特异性结合调节RNAPII的转录活性，抑制多种基因的转录表达；特别是RMP能抑制HBx蛋白对多种相关顺式作用元件的激活，HBx蛋白则在HBV感染宿主细胞导致癌变过程中发挥重要作用，而HRx蛋白具有诱导癌细胞的功能，RMP可拮抗HBx蛋白(参见①DelgermaL，HayashiN，DorjsurenD，et.al.MolCellBiol，2004，24(l9):8556-8566.②DorjsurenD，LinY，WeiW,etal.MolCellBiol，1998，18(12):7546-7555.)。从线虫到人的RMP基因是髙度保守的，人及鼠的多种组织中均可检测到不同水平的RMPmRNA，提示RMP具有重要的生物学意义。RMP拮抗HBx蛋白对基因转录的激活作用，以及RMP/IJRI调控细胞周期和维持DNA的稳定性的功能均提示RMP与肿瘤，尤其与肝癌具有重要联系。但由于目前对人类RMP的功能研究非常有限，还不清楚RMP与肿瘤发生、发展的关系及其对肿瘤细胞生物学功能的影响。
发明内容本发明目的是提供一种针对RMP的siRNA。为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种针对RMP的siRNA，所述siRNA的正义链序列为5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3'，反义链为5，-UUUAUCAGCUAGCAAAUCCTT-3'。上述siRNA经BlastSearch检索确认与RMP以外的人类已知基因序列无同源性；使用前将互补的RNA链进行退火获得双链RNA分子。siRNA是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA。上述siRNA干扰的耙序列位于RMP基因的mRNA编码序列的第484到502个碱基之间，即5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAA-3'。本发明的另一目的是提供所述针对RMP的siRNA的应用。上述针对RMP的siRNA在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明的实施例中，应用上述针对RMP的siRNA抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长，具体包括以下步骤(1)转染前24小时将SMMC-7721细胞制成细胞悬液，以4乂105个/每孔接种于6孔板，置37'C、5。/。C02培养箱，转染时细胞应达到40%70%的融合度；(2)转染液的制备按照每一孔用量A液用无血清RPMI1640培养基稀释6ul上述针对RMP的siRNA至250H1;B液用无血清RPMI1640培养基稀释5"1Lipofectamine至250U1;轻轻混合A、B两液，室温放置30min;(3)转染用无血清RPMI1640培养基漂洗六孔板中的肝癌细胞两次，各孔分别加入500U1无血清RPMI1640培养液，把步骤(2)制备的转染液缓缓加入各孔中.，(4)37"，5%<202条件下培养6h后每孔补加含20%小牛血清的RPMI1640培养液lml继续培养，18h后换入新鲜完全培养基。本发明的另一目的是提供一种载有针对RMP基因的siRNA重组载体。本发明的实施例提供了一种载有针对RMP基因的siRNA重组载体，具体包括以下步骤-用BamHI和BbsIp双酶切GPU6/Neo载体，连接上述siRNA的正义链的寡核苷酸模板，得到重组载体pGPU6-Neo-RMP-484。上述技术方案中，siRNA干扰的靶序列位于RMP基因的mRNA编码序列的第484到502个碱基之间，即5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAA-3'。上述技术方案中，GPU6/Neo载体带有neo基因，可赋予细胞G418抗性。进一步的技术方案中，应用重组载体pGPU6-Neo-RMP-484制备治疗肝癌的药物。本发明的实施例中，应用上述重组载体pGPU6-Neo-RMP-484抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长，具体包括以下步骤(1)转染前24小时将SMMC-7721细胞制成细胞悬液，以4乂105个/每孔接种于6孔板，置37C、5%(:02培养箱，转染时细胞应达到40%70%的融合度；(2)转染液的制备按照每一孔用量A液用无血清RPMI1640培养基稀释6U1上述重组载体pGPU6-Neo-RMP-484至250U1;B液用无血清RPMI1640培养基稀释5U1Lipofectamine至250Ul;轻轻混合A、B两液，室温放置30min;(3)转染用无血清RPMI1640培养基漂洗六孔板中的肝癌细胞两次，各孔分别加入5001U无血清RPMI1640培养液，把步骤(2)制备的转染液缓缓加入各孔中；(4)37",5。/。C02条件下培养6h后每孔补加含20%小牛血清的RPMI1640培养液lml继续培养，18h后换入新鲜完全培养基。进一步的技术方案中，转染72h后换入含G418浓度为600ng/ml的完全培养基继续培养，经5周左右可看到形成明显的细胞克隆。由于本发明明确了RMP基因是一种癌基因，并且通过siRNA干扰技术干扰RMP基因在肝癌细胞中的表达，从而抑制了肝癌细胞的增殖，因此，本发明的另一目的是提供一种治疗肝癌的药物，所述药物包括针对RMP基因的siRNA。优选的技术方案中，所述药物包括针对RMP基因的siRNA，所述siRNA干扰的靶序列位于RMP基因的mRNA编码序列的第484到502个碱基之间，第484到502个碱基为5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAA-3，。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1、本发明使用RNA干扰技术，成功获得针对RMP基因的siRNA，所述siRNA能有效地干扰RMP基因的表达，通过RT-PCR检测，在稳定干扰RMP的细胞株中，RMP基因的干扰效率可达到(83.67±2.56)%;2、本发明应用Lipofectamine2000介导法将siRNA转染入SMMC-7721细胞，并筛选出阳性克隆，结果显示，RMP基因被干扰后能明显降低SMMC-7721细胞的生长增殖速率，抑制率可达到(74.33±0.58)%。3、本发明明确了RMP基因是一种癌基因，并且通过siRNA干扰技术干扰RMP基因在肝癌细胞中的表达，从而抑制了肝癌细胞的增殖。图1、实施例四中重组siRNA表达载体结构示意图2、实施例四中载体表达的siRNA结构示意图3、实施例三中RMP与GAPDH的凝胶电泳的灰度比值柱状图4、实施例五中三种SMMC-7721细胞株中RMPmRNA的表达柱状图5、实施例六中三株SMMC-7721细胞生长曲线图6、实施例七中三种细胞株的异质粘附曲线图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一，RMPsiRNA序列的设计和制备根据NCBI数据库中RMP(GeneBank编号NM134447)cDNA碱基序列，设计并合成了3对RMP的siRNA;其中，第1对siRNA的正义链序列为5'國GGUAGAUAAUGACUAUAAUTT-3',反义链为5'AUUAUAGUCAUUAUCUACCTT-3'。第2对siRNA的正义链序列为5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3',反义链为5，-UUUAUCAGCUAGCAAAUCCTT-3'。第3对siRNA的正义链序列为5'-AGAGGGUUUCAAAGUUUAATT-3，，反义链为5，-UUAAACUUUGAAACCCUCUTT-3'。上述siRNA经BlastSearch检索确认与RMP以外的人类已知基因序列无同源性；同时合成与目的基因无同源性的阴性对照FAM-NC-siRNA(带有FAM荧光标记，以检测转染效率)；使用前将互补的RNA链进行退火获得双链RNA分子。实施例二，脂质体介导的RMPsiRNA转染(1)细胞培养肝癌SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基，置于5%C02培养箱中37'C培养。细胞长至90%左右时用胰酶消化传代。(2)转染前一天将肝癌SMMC-7721细胞制成细胞悬液，以4xl()S个/每孔接种于6孔板，置37'C、5y。C02培养箱，转染时细胞应达到40%70%的融合度。(3)分组将实施例一中所得三种siRNA分别设为RMPsiRNA1^3弁三个干扰序列组、同时设立阴性干扰对照组、转染试剂对照组及细胞对照组，每组设两个副孔。(4)转染液的制备(每一孔用量)A液用无血清RPMI1640培养基稀释6plsiRNA至250fil;B液用无血清RPMI1640培养基稀释5plLipofectamine至250^1。轻轻混合A、B两液，室温放置30min。(5)转染用无血清RPMI1640培养基漂洗六孔板中的细胞两次，各孔分别加入500jd无血清RPMI1640培养液，把步骤(4)制备的转染液缓缓加入各孔中。(6)置37'C、5%C02条件下培养6h后每孔补加含20%小牛血清的RPMI1640培养液lml继续培养。18h后换入新鲜完全培养基。实施例三，RMPsiRNA最佳序列的筛选，RT-PCR检测SMMC-7721细胞RMP基因的表达(1)实施例二中转染48h后分别收集空白对照组、转染siRNA组(1#、2#、3#号siRNA转染组)，按操作说明，用Trizol分别提取总RNA,紫外分光光度计定量后，cDNA的合成采用逆转录试剂盒，据操作说明书逆转录，然后进行PCR扩增。RMP扩增产物为501bp，引物序列上游5'-CAGACTCTCATACTCCTTGTC-3',下游5'-GCAGCACTGCTTTCACTAGTG-3';GAPDH扩增产物为240bp,引物序列上游5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3',下游5'-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3，。扩增条件94'C预变性5min，然后94°C30s，56"30s,72"C45s,共30个循环，最后72"C延伸10min。取5filPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像分析电泳条带光密度值，以RMP与GAPDH条带灰度比值半定量RMPmRNA的表达水平。RMP与GAPDH的凝胶电泳的灰度比值结果显示(参见图3):转染1、2、3号siRNA后48h的SMMC-7721细胞RMP基因表达水平与阴性干扰对照组、转染试剂对照组和细胞对照组相比较均有降低，其中2号干扰序列效果最为明显，表明第2对siRNA效果最优。实施例四，重组载体为pGPU6-Neo-RMP-484的构建及稳定细胞系的筛选(1)根据瞬时转染的结果，序列5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3'被用于构建针对RMP基因的siRNA,pGPU6/Neo载体含有BamHI和BbsI两个酶切位点，酶切后可连接表达目的siRNA的寡核苷酸模板；载体结构和目的siRNA见图1、2。所得重组载体为pGPU6-Neo-RMP-484，同时还构建了pGPU6-Neo-GAPDH、pGPU6-Neo-NC两种重组载体，作为干扰鉴定的对照。核苷酸片段位于mRNA第484到503个碱基之间；此外该载体携带的neo基因赋予细胞G418抗性。(2)确定G418的筛选浓度，将细胞按4"05个/每孔接种细胞于6孔板中，24h后加入含不同G418浓度的PRMI1640完全培养基，G418浓度梯度为200jig/ml、400ng/ml、600jig/ml、800fig/ml,放入培养箱持续培养，在此期间每孔细胞不传代，且G418浓度维持不变，10-14天时观察能使几乎全部细胞悬浮死亡的最小G418浓度既可用于筛选阳性细胞克隆的G418浓度。结果为持续观察10天后发现，能使单个空中细胞全部死亡的最小G418浓度为600jig/ml。(3)采用脂质体转染的方法，在SMMC-7721细胞中分别转染重组载体pGPU6-Neo-RMP-484、pGPU6-Neo-GAPDH、pGPU6-Neo-NC,具体包括以下步骤①转染前24小时将SMMC-7721细胞制成细胞悬液，以4乂105个/每孔接种于6孔板，置37"、5y。C02培养箱，转染时细胞应达到40%70%的融合度；②转染液的制备按照每一孔用量A液用无血清RPMI1640培养基稀释61M上述重组载体中的一种至250U1;B液用无血清RPMI1640培养基稀释5ti1Lipofectamine至250U1;轻轻混合A、B两液，室温放置30min;(D转染用无血清RPMI1640培养基漂洗六孔板中的肝癌细胞两次，各孔分别加入500!U无血清RPMI1640培养液，把步骤(2)制备的转染液缓缓加入各孔中；④37'C，5。/。C02条件下培养6h后每孔补加含20%小牛血清的RPMI1640培养液lml继续培养，18h后换入新鲜完全培养基。(4)转染72h后换入含G418浓度为600lig/ml的完全培养基继续培养，经5周左右可看到形成明显的细胞克隆，此时重新换成新鲜无G418的培养基，适时扩增即得到稳定干扰RMP基因的稳定细胞株。其中稳定转染pGPU6-Neo-RMP-484的细胞系命名为shRNA-SMMC-7721,稳定转染pGPU6-Neo-NC的细胞系命名为NC-SMMC-7721。实施例五，RT-PCR检测各稳定细胞系中相应干扰基因的表达RT-PCR方法参考实施例三。据公式计算出干扰抑制率干扰组抑制率(％)=(l—shRNA-SMMC-7721组平均相对灰度值/SMMC-7721细胞对照组平均相对灰度值)X100%。结果显示RT-PCR法检测各稳定细胞系中相应干扰基因的表达水平，干扰组RMP基因抑制率可达(83.67±2.56)%,其凝胶电泳结果如图4。实施例六，MTT比色法检测细胞体外生长抑制率取对数生长期细胞，以5乂103个/每孔接种细胞于96孔板。以实施例四所得的2种稳定细胞系，即阴性对照组(pGPU6-Neo-NC)及稳定干扰RMP细胞组(pGPU6-Neo-RMP-484);设细胞对照组(SMMC-7721)。分别于铺板第1、2、3、4、5、6天时加入10U15mg/ml的MTT溶液，入细胞培养箱中作用4h，之后每孔加入100Ul10%的SDS-HC1，作用3-6h。第6天时酶标仪570nm处测定吸光度(OD)值。细胞增殖抑制率(％)=(1-实验组OD57()/对照组ODs7。)X100。/。，每组设3个平行孔，取平均值作为1次实验结果，并重复实验3次。MTT法检测稳定细胞株的增殖抑制情况，根据公式计算得知稳定转染重组载体pGPU6-Neo-RMP-484、pGPU6-Neo-NC细胞株及SMMC-7721细胞6天后增殖抑制率分别为(74.33±0.58)%、(39.67±0.58)%和(34.33±1.15)%,表明转染后细胞的增殖速度低于对照组，并且转染RMPsiRNA真核表达载体细胞株的增殖抑制率随时间的延长而增加。其细胞生长曲线见图5。实施例七，细胞粘附能力的检测(MTT比色法)将三种细胞株制成细胞悬液按1X105/mL接种至96孔细胞培养板中，每组设3个复孔，37'C、5。/"C02条件下培养，分别在lh、2h、3h后弃上清，PBS洗涤弃去尚未粘附的肿瘤细胞，后续方法同MTT。酶标仪测定各孔吸光度(OD)值，统计并分析计算细胞相对黏附率相对黏附率(％)=(每小时各孔OD值/对照OD值)X100X。结果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果如图6显示与NC-SMMC-7721和SMMC-7721细胞株比较，shRNA-SMMC-7721细胞株的相对粘附率在各个时间段均有明显升高，而NC-SMMC-7721和SMMC-7721细胞株之间无明显差异。实施例八，体外划痕试验检测细胞迁移能力将三种细胞株NC-SMMC-7721细胞株、SMMC-7721细胞株和shRNA-SMMC-7721细胞株接种于6孔板中培养，待细胞基本铺满，用无菌200Ul枪头于细胞层中纵向划痕，形成宽度均匀一致的划痕，造成培养细胞伤口模型，此时倒置显微镜下拍照测定宽度，作为划痕后零时。位于划痕缘每间隔0.5mm标定三个测量点，测量每一个点垂直于划痕方向的宽度，计算三点的均值作为实验的初始划痕宽度值。以后每天测定一次，至创面基本愈合。结果显示NC-SMMC-7721和SMMC-7721细胞随着时间的增加，划痕的宽度由于细胞的迁移渐渐变窄，与此相比，shRNA-SMMC-7721细胞的转移能力明显降低，造成的细胞伤口后第六天仍可见明显的划痕。权利要求1.一种治疗肝癌的药物，其特征在于，所述药物包括针对RMP基因的siRNA。2.根据权利要求1所述治疗肝癌的药物，其特征在于，所述药物包括针对RMP基因的siRNA,所述siRNA干扰的靶序列位于RMP基因的mRNA编码序列的第484到502个碱基之间，第484到502个碱基为5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAA-3'。3.—种针对RMP的siRNA,其特征在于所述siRNA的正义链序列为5'-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3，，反义链为5，隱UUUAUCAGCUAGCAAAUCCTT-3'。4.权利要求3所述针对RMP的siRNA在制备治疗肝癌的药物中的应用。5.—种载有针对RMP基因的siRNA重组载体，其特征在于所述重组载体为pGPU6-Neo-RMP-484,其制备方法具体包括以下步骤用BamHI和BbsIp双酶切GPU6/Neo载体，连接权利要求3所述siRNA的正义链的寡核苷酸模板，得到重组载体。6.权利要求5所述重组载体pGPU6-Neo-RMP-484在制备治疗肝癌的药物中的应用。全文摘要本发明公开了针对RMP基因的siRNA及其应用，所述siRNA的正义链序列为5’-GGAUUUGCUAGCUGAUAAATT-3’，反义链为5’-UUUAUCAGCUAGCAAAUCCTT-3’，且成功构建了pGPU6-Neo-RMP-484真核表达载体，同时应用Lipofectamine2000介导法将siRNA转染入SMMC-7721细胞，并获得稳定的阳性克隆，利用RNA干扰技术阻断RMP基因的表达，从而抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖；因此，本发明所述的siRNA和所述pGPU6-Neo-RMP-484表达载体可以用来制备治疗肝癌的药物。文档编号A61K48/00GK101612406SQ20091018133公开日2009年12月30日申请日期2009年7月1日优先权日2009年7月1日发明者敏李,杨慧翠,沈百荣,蒋敬庭,魏文祥申请人:苏州大学