专利名称：由搅拌工艺获得浓缩多酚提取物的方法
技术领域：
本发明涉及开发酿造工业副产品的领域。尤其是，本发明提供了来源于酿造工艺的浓缩多酚提取物的制备方法，以及用于这些显示出显著特性的提取物的一些应用。
背景技术：
啤酒由经过不同处理的谷类(主要是大麦，可以添加其他谷类，如小麦、大米或者玉米)制备。啤酒生产主要包括以下步骤-制麦芽这个步骤用来激活大麦中的酶，在酿造期间该酶将淀粉转变为糖。大麦是富含不溶性淀粉的坚硬谷类，通过以下连续的三个步骤将其转变成易碎的和富含可溶性化合物的麦芽浸泡，在其期间谷粒吸收水分；发芽；焙干，用于终止发芽。-酿造被碾碎的麦芽与2至3倍于其体积的水在称作“麦芽浆桶”的容器中混合；这个工序称作“煮浆(mashing)”。在不同的温度阶段下蒸煮2至6个小时，麦芽变成麦芽汁。在这个操作期间，含在麦芽中的淀粉被转变成糖。如果使用非麦芽谷类(原谷粒)，可以在另一个容器中平行进行相同的操作。然后上述全部酿造物被混合以便形成麦芽汁。在过滤池中进行第一次过滤，除去谷类外壳，麦芽汁变成“液体”。然后整个被转移进啤酒花锅中，在其中麦芽汁在100°c下蒸煮1至2个小时，并且以每升1至2g的比例添加啤酒花。啤酒花赋予啤酒苦味和香味，并且借助于它的消毒性能而便于它的贮藏。通过延伸，术语“酿造”通常表示啤酒的整个生产过程(包括发酵)。-发酵麦芽汁在设定发酵温度的交换器中冷却，用酵母接种麦芽汁，酵母将糖类转变成乙醇、香味和二氧化碳。发酵持续几个星期，并且是在巨大的发酵罐中进行的。使用不同的酵母，取决于想要的啤酒的种类；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae)类型的顶发酵酵母用于淡色啤酒类型(ale-type)的啤酒，然而葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)类型的底层发酵菌株用于窖藏啤酒类型(lager-type)的啤酒。-老化然后过滤混合物以便生成“生啤酒”，将其放置在0°C下的老化桶中。在其中熟化几个星期，以便产生储存的淡色啤酒。在这个阶段，随着酵母和寒冷的作用，啤酒慢慢地精制并获得了它的酒香和它的口味(注意在现代酿酒中第二次发酵并不是系统地进行的)。-过滤过滤的目的是，通过除去悬浮着的残存的酵母和胶体颗粒，用来提高啤酒的清澈度和亮度。通过硅藻土滤器过滤啤酒，硅藻土是由变成化石的硅藻(海洋微生物)组成的矿质粉末。这个过滤步骤并不是足够的。这是因为，即使在过滤后，啤酒冷却时也会变得混浊，并且随着啤酒的贮藏该混浊会长久存在。这个混浊是通过多酚和蛋白的结合形成的， 导致了不溶性化合物的产生。为了避开这个问题，通过将啤酒流过树脂PVPP (聚乙烯聚吡咯烷酮)而从啤酒中除去不想要的多酚。聚乙烯聚吡咯烷酮是任意交联的聚[1-(2-氧基-1-吡咯烷基)乙烯]。它是在腐蚀性的催化剂或者N，N' - 二乙烯基咪唑啉酮存在下， 通过N-乙烯基-2-吡咯烷酮的聚合产生的。它的化学式是(C6H9N0)n。这时，通过用氢氧化钠洗涤并且排出洗脱液，它是可以再生的。多酚(或者酚类化合物)是植物界有特异性的分子。基本结构元素是直接连接一个或多个自由羟基或者另一个化学功能基团中的羟基的苯环。有多于8000个化合物符合这个定义。根据它们的特性它们被划分为不同的类别酚酸、类黄酮、鞣酸类和木酚素，它们和异黄酮一起被称作植物雌激素。这些化合物被用于工业，尤其是由于它们的颜色和抗氧化特性。
发明内容
在本文中，发明人研究了在啤酒生产结束时从啤酒中回收排出的多酚的可能性。 由于它们的一般的生物学特性(抗氧化、杀生物性、抗炎症的等等特性)，实际上多酚可以在不同的领域被研究·化妆品·食物加工/保健食品领域·植物疗法 兽医学·药剂学。当前市场上用的多酚提取物是来源于下列植物的化合物橄榄、咖啡、可可、茶叶、 葡萄、葡萄酒、苹果、大豆、藻类、黑醋栗或者松树皮。发明人也研究了发酵步骤后来自啤酒生产过程的多酚提取物在不同的应用中的优点。具体地说，酚类化合物已经经历了制麦芽、酿造和发酵的作用，这些过程可能导致它们结构的改变(与蛋白质、多糖的结合，部分氧化和聚合)。这些改变有影响它们特性的风险，尤其是它们的抗氧化特性。令人惊奇的是，发明人已经证明，来源于酿造过程(广义上的理解)的多酚显示了出色的抗氧化特性。因此，本发明首先涉及将部分纯化的啤酒用作原材料用于制备富含多酚的提取物的应用。这里术语“部分纯化的啤酒”指的是比如通过硅藻土滤器的过滤(其它方法，尤其是根据离心法，也已经被描述用于这个目的)，除去酵母、植物碎屑和胶体颗粒后制备的啤酒。术语“富含多酚的提取物”或者“多酚提取物”或者“多酚浓缩物”在此处指的是任何形式(液体或固体)的植物提取物，对于液体形式，其多酚总含量最少是5%，优选最少10%; 对于固体形式，其多酚总含量最少是50%，优选最少60%至80%甚至更多。根据本发明，可以用比如福林一乔卡梯奥(R)Iin-Ci0caIteu)方法(EBC标准)来测定浓缩物中多酚含量 (Folin and Ciocalteu,1927)。一种用于获得来源于酿造过程的多酚提取物的方法，该方法至少包括一个将部分纯化的啤酒与可吸附多酚的树脂相接触的步骤，继之以回收所述树脂上被吸附的多酚的步骤。该方法也是本发明的一部分。当然，此处词语“酿造过程”应当理解为它的广泛含义，指的是啤酒生产过程。可以被用于实现这个方法的树脂的例子是聚乙烯聚吡咯烷酮PVPP。在树脂与部分纯化的啤酒相接触之后将吸附在树脂上的多酚“回收”的步骤包括将这些多酚从上述树脂上解吸附，放置于保证它们稳定性的条件下，以及在适当的时候被浓缩和/或被纯化。这个步骤可以比如通过使用第二树脂来进行，以便在多酚从第一树脂上解吸附后回收这些多酚。在本发明的优选的实施方式中，第二树脂是疏水性且非离子型的，并允许利用有机溶剂使多酚解吸附。根据本发明的一个优选实施方式，进行以下的步骤(i)使部分过滤的啤酒与聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)树脂相接触；(ii)用碱性溶液洗涤聚乙烯聚吡咯烷酮；(iii)使聚乙烯聚吡咯烷酮的洗涤液与可吸附多酚的第二树脂相接触；(iv)使多酚从第二树脂上解吸附；(ν)将多酚浓缩。这些不同的步骤的一些优选的实施方式在下面将详细描述。这些详细的实施方式可以以连续的或者分批的方法被单独地或者被组合地使用。在步骤(ii)中，聚乙烯聚吡咯烷酮可以经过氢氧化钠的两次洗涤；在该情况下， 只有来自于第一次洗涤的氢氧化钠溶液或者在适当时此溶液的一部分被用于步骤(iii) 中。优选地，氢氧化钠浓度在和2%之间，更加优选，它是大约1.6%。当然，可以用另一种碱性溶液来代替氢氧化钠。在利用碱性溶液将多酚解吸附后，该溶液优选被快速中和，甚至被酸化，以免多酚降解。在分批的方法中这是特别有利的。这是因为，在连续方法中，可以减少多酚保留在碱性溶液中的时间，以便消除多酚在碱性介质中降解的问题，因此，可选择用中和或者酸化步骤来消除此问题。正如在下面试验部分所描述的，在步骤(ii)结束时，磷酸特别适用于中和或者酸化碱性溶液。用于步骤(iii)中的第二树脂，优选是疏水性且非离子型的吸附性聚合树脂， 优选芳香族的聚合树脂。作为这种树脂的非限制性的例子，可以关注来自于Rohm&Haas S. Α. S.公司的Amberlite XAD 1180树脂，以及它的食品型(Amberlite FPX 68)，这是一种用于饮料工业特别是用于提取类黄酮的大交联的吸附树脂。也可以使用Amberlite FPX66树脂，其与FPX 68相比，可以回收更小的分子。在步骤(iii)和(iv)之间优选地可以增加用水溶液洗涤第二树脂的步骤。优选地，在步骤(iv)中通过在树脂上流过乙醇或者另一种有机溶剂溶液进行解吸附。然后通过比如蒸发有机溶剂将多酚进行浓缩。被浓缩的溶液可以被冻干或者被干燥， 以便得到一种粉末并且提高多酚浓缩物的稳定性。当前，聚乙烯聚吡咯烷酮是唯一能够吸附多酚的树脂，并且被列入欧洲啤酒生产认可的工艺助剂列表中。然而，这个列表也有被修正的可能性。因此根据本发明可以设想上述方法的变型，其中将部分过滤的啤酒直接与可吸附多酚的树脂相接触，并通过有机溶剂使多酚解吸附。为此，可以优选使用疏水性且非离子型的吸附树脂，优选芳香族树脂，例如上述XAD 1180,FPX 68和FPX 66。这种变型不需要再生氢氧化钠及中和酸的步骤，减少盐的量并且能提高多酚的提取率和纯度。本发明的另一个方面是可以通过上述方法制备的多酚浓缩物。这些多酚经历的酿造过程中不同步骤赋予它们最初的特性，尤其是富含儿茶酚和表儿茶酸的组合物及聚合物。根据本发明的浓缩物可以呈固体形式比如粉末形式，或者液体形式比如水溶液或乙醇溶液或者在甘油中。根据本发明的多酚浓缩物可以被用于制备抗氧化剂组合物，无论该组合物的用途是什么。尤其是，本发明的浓缩物的抗氧化特性使得它们成为化妆品成分的极好的候选物。实际上这些浓缩物可被添加至多种化妆品中，例如皮肤润肤霜或者保湿乳液、用于清洗或者冲洗皮肤或者头发的溶液、面膜、化妆品等等。本发明的浓缩物由于它的抗氧化性、滋润和刺激特性，可以作为活性产物被合并入化妆品中，也可以作为试剂用于有助于化妆品贮存。根据本发明，化妆品当然可以被配制用于局部施用，而且也可以被配制成胶囊、锭剂、 糖浆或者其他形式用于口服。事实上发明人已经在培养的皮肤模型上证明了与表皮细胞接触的多酚在皮肤质量上的有益效果。本发明的化妆品尤其是可以被用于滋润肌肤和/或防止或者减缓其衰老。通过显示，包含0.25%至0.5%之间的富含多酚的固体提取物(包含大约80%多酚)的化妆品组合物可以被优选地用于这些显示中。根据本发明的另一个特别的方面，来源于酿造过程的多酚被用于保健食品组合物例如功能性食品或者食品增补剂中。术语“功能性食品”指的是可以作为正常食品被食用的膳食制品，尽管它提供的益处要优于常规的营养品。因此包含可以根据本发明制备的多酚的功能性食品是本发明的不可分割的部分。本发明的功能性食品的非限制性的例子，可以包括果汁、苏打水及其他不含乙醇的饮料、谷类产品、酸奶和牛奶制品、巧克力块、人造黄油及其他可涂抹的油脂、小点心等等。除了它们在健康方面有益特性之外，本发明的多酚可以作为防腐剂被用于食品中，比如用于替代某些合成产品例如维生素C、BHA (叔丁基-4-羟基茴香醚)和BHT (丁基化羟基甲苯)。包含根据本发明制备的多酚的食品增补剂也是本发明的一部分。这些增补剂可以呈比如胶囊、粉末或者片剂的形式。当然，它们可以包含其它活性成份，例如抗氧化剂维生素(尤其是C和E)、B组维生素、维生素D、钙、镁、ω-3脂肪酸、磷脂、植物提取物等等。在下文的实验性的实施例中举例说明本发明的多酚浓缩物的特别用途，是用于制备能提高个体认知能力水平的组合物。术语“认知能力水平”此处指的是广义的记忆、学习能力、推理，而且指的是集中注意力、关注力、抵抗压力的能力、反应速度等等。根据另一个方面，本发明涉及通过利用上述方法制备的多酚浓缩物用于制备抗衰老组合物的用途。尤其是，这种组合物可用于限制或者延缓大脑衰老的后果，例如记忆力丧失、痴呆等等。这种抗衰老的组合物计划给人或者动物使用。可以设想上述所有的给药形式可用于这种组合物。通过显示，本发明的多酚可以以每天100至400mg的比例给药于一个成年人。除了上述的实施方式，本发明还包括其他实施方式，并不限于下面的试验性的实施例和附图。
图1.聚乙烯聚吡咯烷酮过滤/再生的原理图。
图2.存在于再生溶液中的多酚与PH的函数。
图3.随着时间的过去多酚总量的变化。
图4.抗氧化剂活性的变化与温度的函数。
图5.再生期间多酚含量的变化。
图6.中试图。
图7. 5次再生期间的多酚含量。
图8.用另一种树脂XAD代替聚乙烯聚吡咯烷酮的原理图。
图9.试验期间的大鼠的体重变化(平均值士SEM)
图10,.摄食量(g/kg/d)(平均值士 SEM)。
图11,.摄水量(g/kg/d)(平均值士 SEM)。
图12,.试验适应期10分钟期间压按两个杠杆的总次数(平均值士SEM)。
图13,.试验适应期10分钟期间区分活动杠杆和不活动杠杆(平均值士SEM)。
图14,.试验期20分钟期间压按两个杠杆的总次数(平均值士SEM)。
图15,.试验期20分钟期间区分活动杠杆和不活动杠杆(平均值士SEM)。
图16,.在达到平台区之前的迟延时间(秒)(平均值士SEM)。
图17,.在第0天(A)和第6天(B)未治疗的外植体的显微观察。
图18,.在第6天，用含有视黄醇(A)的制剂或者用赋形剂(B)治疗的外植体的显微观察。
图19,.第6天GAG染色后的显微观察对照(A)、参照(B)、局部地用0. 5%的多酚
治疗(C)以及用介质中0.025%的多酚治疗。图20.第6天层粘连蛋白-5免疫标记后的显微观察对照(A)、参照(B)、局部地用0.5%的多酚治疗(C)以及用介质中0.025%的多酚治疗。图21.第6天胶原蛋白-III免疫标记后的显微观察对照(A)、参照(B)、局部地用0.5%的多酚治疗(C)以及用介质中0.025%的多酚治疗。图22.第6天胶原蛋白IV免疫标记后的显微观察对照(A)、参照(B)、局部地用 0.5%的多酚治疗(C)以及用介质中0.025%的多酚治疗。图23.样品中的黄烷醇(Flavolol)和酚酸组合物(％重量)。
具体实施例方式实施例实施例1 实验室试验1. 1 背景啤酒过滤过程分两步进行1.流过硅藻土滤器并且去除残存固体颗粒(“部分过滤”的啤酒)，2.通过聚乙烯聚吡咯烷酮，啤酒中多酚浓度大约减少40%至50%。被过滤的啤酒随后被储存然后被包装。当啤酒离开硅藻土滤器时，添加聚乙烯聚吡咯烷酮至部分被过滤的啤酒中。聚乙烯聚吡咯烷酮吸附多酚，然后保留在聚乙烯聚吡咯烷酮滤膜上。用1.6%的热氢氧化钠冲洗滤膜(两部分120hL)，使得除去多酚以及将聚乙烯聚吡咯烷酮再生用于下次使用成为可能。第一部分氢氧化钠被送至纯化站，第二部分被回收并且在下一次再生中被再次使用。聚乙烯聚吡咯烷酮的使用和再生如图1所示。在下面的实施例中，“再生溶液”表示第一部分氢氧化钠(氢氧化钠1)。1. 2再牛溶液中多酚的稳定件在不同条件(pH、时间、温度)下测定再生溶液中多酚的稳定性。在每个条件下在不同的时间，在采集的5个样品上测定多酚的总量。在采样和第一次测定之间经过两个小时。图2显示了 pH对多酚保存的影响。经过2小时，在未酸化的氢氧化钠中多酚的损失大于55%。当碱性溶液离开聚乙烯聚吡咯烷酮滤膜时，碱性溶液应当被立即中和或者被酸化以便被可以利用。温度在3和80°C之间没有影响。图3给出了在9天期间内在再生溶液中多酚总量的变化。在离开聚乙烯聚吡咯烷酮滤膜时，直接进行再生溶液的采样。调节样品并且立即用商品酸进行酸化。测试以下的条件·酸度· pH在2禾口 3之间的被酸化的样品，· pH = 13的未处理的氢氧化钠样品 被使用的酸的本质-磷酸(H3PO4)-盐酸(HCl)·温度-20°C、4°C或者 20°C。该图显示1.当用磷酸酸化溶液时，88%的多酚被保存直至第9天。2.优选使用磷酸而不是盐酸。3.碱性溶液被立即中和以便保存多酚(已在上文论述)。4.与这些条件无关，多酚会经历转化。这个现象被描述于葡萄酒中的多酚情形 (Tubaro等人，1999)。它看起来是多酚的二聚体(Brouillard等人，1997)。5.温度的影响(4°C与20°C比较)是很小的。随后通过多酚溶液的抗氧化剂活性测定温度对多酚稳定性的影响(图4)。在不同的温度(在35和75°C之间)下保存同样溶液的样品10、20或30分钟。通过DPPH方法 (Brand-Williams等人，1995)测定抗氧化剂活性。图4显示1.抗氧化剂活性(2. Ilg水溶性维生素E eq/g多酚)在20和75°C之间是稳定的。2.观察到的差异(士5% )与试验的变化相关，是不显著的。注意在40和70°C之间以中试批次确定了这些结果。1. 3富含多酚的提取物的试验室生产为了测定啤酒的酚类组合物，McMurrough等人用乙酸乙酯在脱气啤酒上进行提取，然后通过HPLC分析提取物(McMurrough等人，1984)。通过这个技术进行第一次提取， 以便提取再生溶液中的多酚。
因此通过进行以下流程，从聚乙烯聚吡咯烷酮再生氢氧化钠溶液中提取多酚1.用HCl酸化氢氧化钠溶液至pH 2，2.添加乙酸乙酯(氢氧化钠/乙酸乙酯比值1/1. 5，ν/ν)，3.搅拌2小时，转速300-500rpm，然后留下静置2小时并且进行相分离，4.有机相的回收、蒸发和冻干。表2中概括了被制备的提取物的特征(A列)。以前的方法可以制备纯度是77%的多酚。另一方面，提取率较低(大约37%)。 试验了其他的条件以便提高提取率。修改涉及·ρΗ(1 和 7 之间)， 提取溶液(乙醚、二氯甲烷)，·添加氯化钠以便改进有机相和水相分离。表2中概括了被制备的提取物的特征(B列)。整体上讲，当使用这些变化时，提取率变至32%。制备的提取物比以前包含更多的盐，多酚效价仅42%。因此不同的变量并没有提高提取技术的效率。为了开发更大量回收多酚的方法，在与适用于现有工厂的工业生产和设想的应用更和谐的条件下，设想了其他的用于多酚脱盐和浓缩的技术。这些可能性被概括在表1中。表1.建议的浓缩和除盐的方法
权利要求
1.一种获得来源于酿造过程的多酚提取物的方法，该方法至少包括一个使部分纯化的啤酒与可吸附多酚的树脂相接触的步骤，继之用以回收被吸附到所述树脂上的多酚的步骤，所述回收步骤包括使用有机溶剂使多酚从吸附多酚的疏水性非离子型树脂上解吸附的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，回收多酚的步骤包括以下步骤(i)对通过树脂与部分纯化的啤酒相接触而吸附到所述树脂上的多酚的解吸附； ( )使所述多酚吸附到不同于第一树脂的第二树脂上，所述第二树脂是疏水性且非离子型的，以及(iii)使用有机溶剂使吸附到所述第二树脂上的多酚解吸附。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述部分纯化的啤酒与可吸附多酚的疏水性非离子型树脂相接触。
4.如权利要求1和2所述的方法，包括以下步骤(i)使部分过滤的啤酒与聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)树脂相接触； ( )用碱性溶液洗涤聚乙烯聚吡咯烷酮；(iii)使聚乙烯聚吡咯烷酮的洗涤液与可吸附多酚的第二树脂相接触，所述第二树脂是疏水性且非离子型的；(iv)将多酚从第二树脂上解吸附； (ν)将多酚浓缩。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中，所述聚乙烯聚吡咯烷酮经受氢氧化钠的两次洗涤，其中只有来自第一次洗涤的氢氧化钠溶液用于步骤(iii)。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在进行步骤(iii)之前，用于洗涤聚乙烯聚吡咯烷酮的碱性溶液被中和或者被酸化。
7.如权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，所用的第二树脂是疏水性且非离子型的、芳香族的、吸附性聚合树脂。
8.如权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(iii)和(iv)之间，用水溶液洗涤第二树脂。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述部分过滤的啤酒与可吸附多酚并且可以用有机溶剂使多酚解吸附的树脂相接触，所述树脂是疏水性且非离子型的、芳香族的、 吸附性聚合树脂。
10.一种通过如权利要求1至9中任一项所述的方法获得的多酚浓缩物。
11.一种化妆品，其包含如权利要求10所述的多酚浓缩物。
12.—种功能性食品，其包含如权利要求10所述的多酚浓缩物。
13.一种食品增补剂，其包含如权利要求10所述的多酚浓缩物。
14.如权利要求11所述的化妆品的用途，用于滋润肌肤和/或防止或者减缓其衰老。
15.如权利要求10所述的多酚浓缩物的用途，用于制备抗氧化剂组合物。
16.如权利要求15所述的用途，用于制备用以提高个体认知能力水平的化合物。
17.如权利要求15所述的用途，用于制备抗衰老组合物。
18.如权利要求16或权利要求17所述的用途，用于限制或者延缓大脑衰老的后果。
全文摘要
本发明提出获得来自于搅拌工艺的浓缩多酚提取物的方法，通过部分纯化的啤酒与可吸附多酚的树脂相接触的步骤，继之以将吸附在上述树脂上的多酚回收的步骤。本发明也涉及这样获得的具有显著特性的提取物，以及这些提取物的一些应用。
文档编号A61K8/97GK102307983SQ200980122428
公开日2012年1月4日 申请日期2009年4月10日 优先权日2008年4月11日
发明者让-伊夫斯·马尔波, 让-弗朗索瓦·多里亚, 贝南·塔伊德 申请人:科诺布格啤酒公司