在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物的制作方法

专利名称：在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物的制作方法
在生理PH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血
糖素类似物相关申请的交叉引用本申请要求下列优先权2008年6月17日提交的美国临时专利申请号 61/073，193，2008年7月3日提交的美国临时专利申请号61/078，165和2008年8月20日 提交的美国临时专利申请号61/090，415。每个申请的公开内容均明确地通过引用的方式全 文并入本文。
背景技术：
前胰高血糖素原(pre-proglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组 织中被处理以形成多个不同的胰高血糖素原衍生的肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样 肽-I(GLP-I)、胰高血糖素样肽-2 (GLP-I)和胃泌酸调节素(OXM)，它们参与众多生理学功 能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空和肠生长，以及食物摄入的调节。胰高血糖素 是四个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸33至61，而GLP-I作为37个氨基 酸的肽产生，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸72至108。当血糖水平降得太低以致于不能为身体活动提供足够能量时，发生低血糖症。在 成人或10岁以上的儿童中，低血糖症较不常见，除非是作为糖尿病治疗的副作用，但是它 可以来源于其它药物治疗或疾病、激素或酶缺乏、或肿瘤。当血糖开始下降时，由胰腺产生 的激素胰高血糖素向肝脏发出信号，使肝脏分解肝糖原并释放葡萄糖，使血糖水平朝着正 常水平升高。因此，普遍认为胰高血糖素在葡萄糖调节中的作用是抵消胰岛素的作用并维 持血糖水平。但是对于糖尿病而言，这种针对低血糖症的胰高血糖素响应可能被破坏，使葡 萄糖水平难以恢复至正常范围。低血糖症是威胁生命的事件，其需要立即进行医疗关注。给予胰高血糖素是已经 建立起来的治疗急性低血糖症的药物治疗，它可以在给药数分钟内恢复葡萄糖的正常水 平。当胰高血糖素用于低血糖症的急性医疗处理时，将晶体形式的胰高血糖素溶解于弱酸 缓冲液，并通过肌肉内注射该溶液。虽然该治疗是有效的，但方法很麻烦，且对于某些半昏 迷状态的人员有危险。因此，需要这样一种胰高血糖素类似物，其保持母体分子的生物学表 现但在相关的生理条件下具有足够的溶解性和稳定性，从而其可以预先配制为即用型注射 溶液。另外，鼓励糖尿病患者维持接近正常的血糖水平以延迟或预防微血管并发症。该 目标的实现通常需要强化胰岛素治疗。在努力达到该目标的过程中，医生曾遇到过他们的 糖尿病患者中的低血糖症的频率和严重性显著升高的问题。因此，需要改善的药物和方法 来治疗糖尿病，所述药物和方法相对于目前的胰岛素治疗而言，较不容易诱导低血糖症。如本文所述，提供了高效力的胰高血糖素激动剂，其在适合商用的药物组合物中 在生理pH时具有升高的生物物理稳定性和水溶性。原始胰高血糖素在生理PH范围内既不 可溶也不稳定，因此，其必须作为干燥产品生产，需要复原和立即使用。本文描述的胰高血 糖素类似物具有增强的物理性质，这使其特别适合用于目前应用原始激素的目前的医疗环境中。根据一个实施方式，这些化合物可以用于制备用于治疗低血糖症的预先配制的即用 型注射溶液。或者，胰高血糖素激动剂可以与胰岛素一起给药以缓冲胰岛素的效应，以便允 许更稳定地维持血糖水平。另外，下文详细描述了包含本文公开的修饰的胰高血糖素肽的 组合物的其它有益用途。发明简述本发明的一个实施方式提供了胰高血糖素肽，其保持胰高血糖素受体的活性并相 对于原始胰高血糖素肽(SEQ ID NO :1)表现出改善的溶解性。原始胰高血糖素在水溶液 中，特别是在生理PH时溶解性差，倾向于随时间发生聚集和沉淀。相反，相对于原始胰高血 糖素，本发明的一个实施方式的胰高血糖素肽在25°C在6-8的pH，或6-9的pH，例如在pH 为7时，在M小时后表现出至少2倍、5倍或更高的溶解性。在一个实施方式中，胰高血糖素肽保持原始胰高血糖素的至少10%、20%、30%、 40%,50%,60%,70%,75%的活性、80%的活性、85%的活性、或90%的活性(按照胰高血 糖素肽的EC50相对于胰高血糖素的EC50的反比计算，例如使用大体上如实施例13中描述 的测定法通过cAMP的产生来测定)。在一个实施方式中，本发明的胰高血糖素肽具有等于 或大于胰高血糖素的活性(与本文的“效力”一词同义使用)。在一些实施方式中，胰高血 糖素肽保持多达约100%、1000 %、10，000%、100，000 %或1，000，000 %的原始胰高血糖素 活性。胰高血糖素通常具有大约10A的原始GLP-I在GLP-I受体上的活性。GLP-I (7-36) 酰胺(SEQ ID NO 57)或GLP-1 (7-37)酸(SEQ ID NO 58)是GLP-1的生物学有效形式，它 们在GLP-I受体上具有基本上相同的活性。相对于GLP-I受体，胰高血糖素对于胰高血糖 素受体也具有10至20倍高的选择性(选择性按照胰高血糖素对于胰高血糖素受体的EC50 相对于胰高血糖素对于GLP-I受体的EC50的反比计算)。例如，在某测定中，胰高血糖素对 于胰高血糖素受体的EC50是0. 22nM并且胰高血糖素对于GLP-I受体的EC50是3. 85nM，则 计算的选择性是17. 5倍。可以通过例如使用大体上如实施例13描述的测定法通过cAMP 的产生来测定活性。在一些实施方式中，本发明的胰高血糖素肽表现出小于大约5%、4%、 3 %、2 %或1 %的原始GLP-I在GLP-I受体上的活性，和/或相对于GLP-I受体而言，其对 于胰高血糖素受体的选择性是大于约5倍、10倍、或15倍。例如，在一些实施方式中，本发 明的胰高血糖素肽表现出小于5%的原始GLP-I在GLP-I受体上的活性，并且相对于GLP-I 受体而言，其表现出对于胰高血糖素受体的大于5倍的选择性。本发明的任何胰高血糖素肽还可能另外表现出改善的稳定性和/或减少的降解， 例如，在25 °C在M小时后保持至少95%的初始肽。在一些实施方式中，本发明的胰高血糖 素肽表现出改善的稳定性，从而在至少20°C (例如21 °C、22°C、23°C、M°C、25°C、洸°C、至少 27. 5°C、至少30°C、至少；35°C、至少40°C、至少50°C )以及小于100°C、小于85°C、小于75°C， 小于或70°C的温度，在溶液中1周或更长时间(例如，2周、4周、1个月、2个月、4个月、6个 月、8个月、10个月、12个月)之后，通过紫外线(UV)检测器在^Onm可以检测到至少75 % (例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、大于95%，直至100% )浓度的肽，或者 小于大约25% (例如，小于20%、小于15%、小于10%，小于5%、4%、3%、2%、1%、直至 0%)的降解的肽。根据一个实施方式，提供了具有改善的溶解性的胰高血糖素肽，其中通过氨基酸替换和/或添加对所述肽进行修饰，所述氨基酸替换和/或添加向所述肽的C-末端部分引 入带电的氨基酸，在一个实施方式中，是在SEQ ID NO :1的位置27的C-末端的位置。任选 地，可以在C-末端部分引入1个、2个或3个带电的氨基酸，在一个实施方式中，是在(相对 于)位置27的C-末端。根据一个实施方式，位置观和/或四的原始氨基酸被替换为带 电的氨基酸，和/或1至3个带电的氨基酸被添加到肽的C-末端，在位置四之后。在示例 性实施方式中，所述带电的氨基酸中的1个、2个或全部是带负电的。可以对胰高血糖素肽 进行另外的仍允许它保留胰高血糖素活性的修饰，例如保守性替换。根据一个示例性实施方式，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO 11的氨基酸序列，或其 类似物，所述类似物相对于原始胰高血糖素含有1至3个另外的氨基酸修饰，或它的胰高血 糖素肽激动剂类似物。SEQ ID NO :11代表修饰的胰高血糖素肽，其中原始蛋白的位置观 的天冬酰胺残基替换为天冬氨酸。在另一个示例性实施方式中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO 38的氨基酸序列，其中原始蛋白的位置观的天冬酰胺残基替换为谷氨酸。其它示例性 实施方式包括SEQ ID NO :24、25、26、33、35、36和37的胰高血糖素肽。根据另一个实施方式，提供了在胰高血糖素受体上具有增强的效力的胰高血糖素 肽，其中所述肽包含在原始胰高血糖素(SEQ ID NO 1)位置16上的氨基酸修饰。通过非限 制性举例方式，这样的增强的效力可以通过以下列氨基酸替换位置16的天然存在的丝氨 酸来提供谷氨酸或其它带负电的具有4个原子长度的侧链的氨基酸，或谷氨酰胺、高谷氨 酸或高半胱氨酸中的任一个，或具有包含至少一个杂原子(例如N、0、S、P)的侧链和具有 大约4个(或3-5个)原子长度的侧链的带电的氨基酸。以谷氨酸替换位置16的丝氨酸 使胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性增强至少2倍、4倍、5倍、直至大于10倍。在一 些实施方式中，相对于GLP-I受体，胰高血糖素肽保持对于胰高血糖素受体的选择性，例如 至少5倍、10倍、或15倍的选择性。可以通过向肽连接亲水性部分进一步改善前述任意化合物的溶解性。弓丨入这样的 基团还会延长作用时间，例如，按照循环中的延长的半衰期来度量。在一个实施方式中，亲 水性部分是聚乙二醇(PEG)链或其它水溶性聚合物，其共价连接至所述胰高血糖素肽的位 置16、17、21、24、四、40上的一个或多个氨基酸残基、C-末端延伸内的氨基酸残基或C-末 端氨基酸的侧链。在一些实施方式中，在该位置的原始氨基酸替换为具有适合与亲水性部 分交联的侧链的氨基酸，以促进亲水性部分与肽的连接。示例性的氨基酸包括Cys、Lys, Orn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)。在其它实施方式中，在C-末端向肽添加经 修饰为包含亲水性基团的氨基酸。根据一个实施方式的聚乙二醇链的分子量介于大约500 至大约40，000道尔顿的范围。在一个实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约500至大 约5，000道尔顿的范围。在一个另实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约10，000至大 约20，000道尔顿。在其它示例性实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约20，000至大 约40，000道尔顿。根据一些实施方式，本文公开的胰高血糖素肽被修饰为包含酰基或烷基，例如对 于天然存在的氨基酸而言不是原始的(non-native)酰基或烷基。酰基化或烷基化可以增 加循环中的胰高血糖素肽的半衰期，可以有利地延迟在胰高血糖素和/或GLP-I受体上的 作用起始和/或延长作用的持续时间，和/或提高对诸如DPP-IV的蛋白酶的抗性。酰基化 或烷基化还可以增强肽在中性PH的溶解性。如本文所示，酰基化之后，维持了(如果没增强)胰高血糖素肽在胰高血糖素受体和GLP-I受体上的活性。在一些方面，胰高血糖素肽通过间隔子共价连接到酰基或烷基，所述间隔子是例 如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔子或疏水性双官能间隔子。在一些方面，在通过间 隔子使肽酰基化之后，观察到在GLP-I和胰高血糖素受体上的活性增强。在选择的方面，诸 如，例如，当肽缺少分子内桥(例如，共价分子内桥)的时候，相对于那些其中酰基不通过间 隔子连接到肽上的酰基化的肽而言，在通过间隔子使肽酰基化之后，观察到在GLP-I和胰 高血糖素受体上的活性的进一步增强。根据一些实施方式，间隔子是氨基酸或具有长度为 3至10个原子(例如6至10个原子)的氨基酸或肽骨架结构的二肽。根据一些具体实施 方式，间隔子和酰基或烷基的总长度是14至28个原子，例如17至28个，19至沈个原子， 19至21个原子。用于增强胰高血糖素活性目的的合适的间隔子在本文中另有详细描述。 在一些实施方式中，本文描述的的酰基化或烷基化的肽还包含选择性地降低在GLP-I受体 上的活性的修饰，例如位置7的Thr的修饰，例如以缺少羟基的氨基酸如氨基丁酸(Abu)或 Ile替换位置7的Thr ；删除在位置27或观的氨基酸的C-末端的(一个或多个)氨基酸 (例如删除位置观和四的氨基酸中的一个或两个)，从而产生长度为27或观个氨基酸的 肽。可以在亲水性部分连接的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置进行胰高血糖 素肽的酰基化或烷基化。在一些实施方式中，本发明提供了修饰为包含共价连接至胰高血糖素肽的位置10 的氨基酸的酰基或烷基的胰高血糖素肽。胰高血糖素肽还可以在胰高血糖素肽的位置10 的氨基酸和酰基或烷基之间包含间隔子。在一些实施方式中，所述酰基是脂肪酸或胆汁酸 或其盐，例如C4至C30脂肪酸、C8至CM脂肪酸、胆酸、C4至C30烷基、C8至CM烷基、或 包含胆汁酸的留(steroid)部分的烷基。间隔子是具有结合酰基或烷基的适当的反应性基 团的任意部分。在示例性的实施方式中，间隔子包含氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔 子例如氨基聚(烷氧基)羧酸基团(amino poly (alkyloxy) carboxylate)，或疏水性双官 能间隔子。在一些实施方式中，间隔子选自 ^Ρ、Glu、Asp、Cys和包含NH2(CH2CH2O)n(CH2) fflC00H的间隔子，其中m是1至6的任意整数，η是2至12的任意整数。这样的酰基化或烷 基化的胰高血糖素肽还可以包含亲水性部分，任选为聚乙二醇。前述任意胰高血糖素肽可 以包含两个酰基或两个烷基，或其组合。本发明还包括所述胰高血糖素激动剂的药学上可接受的盐。在其它示例性实施方式中，可以通过向胰高血糖素肽的羧基末端添加第二个肽而 对任意前述化合物进行进一步修饰以改变其药学特性。在一个实施方式中，胰高血糖素肽 通过肽键共价结合至第二个肽，其中所述第二个肽包含选自SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 和SEQ ID NO 22的序列。在一些实施方式中，位置1或2的修饰可以增加肽对二肽基肽酶IV(DPP IV)切割 的抗性。例如，位置2的氨基酸可以替换为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基 丝氨酸、N-甲基丙氨酸或氨基异丁酸。或者或另外，位置1的氨基酸可以替换为D-组氨酸 (D-His)、去氨基组氨酸(desaminohistidine)、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、 N-甲基组氨酸、α -甲基组氨酸、咪唑乙酸、或α，α -二甲基咪唑乙酸(DMIA)。观察到位置2的修饰(例如位置2的AIB)以及在一些情况下位置1的修饰(例如位置1 WDMIA)可降低胰高血糖素活性，有时显著降低；令人惊奇的是，胰高血糖素活性 的这种降低可以通过胰高血糖素的C-末端部分(大约是氨基酸12-29)中的α-螺旋结构 的稳定化得以恢复。在一些实施方式中，稳定化是通过位置“i”和“i+4”的氨基酸之间的 共价键实现的，其中i是12至25的任意整数。在一些具体实施方式
中，“i”和“i+4”是12 和16，16和20，或，20和24，或，M和28。在一些实施方式中，该共价键是位置16的谷氨 酸和位置20的赖氨酸之间的内酰胺桥。在示例性实施方式中，桥或接头的长度是大约8个 (或大约7-9个)原子。在其它实施方式中，稳定化是通过位置“j”和“j+3”的氨基酸之间 的共价键实现的，其中j是12至27的任意整数。在示例性实施方式中，桥或接头的长度是 大约6个(或大约5-7个)原子。在其它实施方式中，稳定化是通过位置“k”和“k+7”的 氨基酸之间的共价键实现的，其中k是12至22的任意整数。在一些实施方式中，该共价键 是分子内桥而非内酰胺桥。例如，合适的形成共价键的方法(即形成共价分子内桥的方法) 包括下列的任一个或多个烯烃复分解(olefin metathesis)、基于羊毛硫氨酸的环化、二 硫桥或修饰的含硫桥的形成、使用α，ω-二氨基烷烃系绳(diaminoalkane tethers)、金 属-原子桥的形成和其它的肽环化方式。在其它实施方式中，通过非共价键(即非共价的分子内桥)使螺旋稳定化，包括但 不限于氢键、离子相互作用和盐桥。在本发明的其它实施方式中，胰高血糖素肽的C-末端部分(大约是氨基酸12-29) 中的α-螺旋结构的稳定化通过在保持想要的活性的位置上故意引入一个或多个α， α -双取代氨基酸来实现。在一些实施方式中，胰高血糖素肽的位置16、17、18、19、20、21、 M或四中的1个、2个、3个、4个或更多个被α，α -双取代氨基酸替换。例如，以氨基异 丁酸(AIB)替换胰高血糖素肽的位置16提供了不存在盐桥或内酰胺时的稳定的α-螺旋。 这样的肽在本文中被认为是不含分子内桥的肽。在具体的方面，通过引入一个或多个α， α -双取代氨基酸而不引入共价的分子内桥例如内酰胺桥、二硫桥来实现α -螺旋的稳定 化。这样的肽在本文中被认为是不含共价的分子内桥的肽。在一些实施方式中，位置16、 20,21或M中的1个、2个、3个、或更多个被AIB替换。因此，在一些实施方式中，本发明提供了具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖 素肽，其包含以下氨基酸序列Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO :39)，其中具有 1 至 3 个氨基酸修 饰，其中Xl和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对二肽基 肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性(或增加对其的抗性)，其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸基团)、-Asn-COOH, Asn-Thr-COOH和 Y-C00H，其中Y是1至2个氨基酸，并且，其中分子内桥，优选共价键，将位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链连接起 来，其中i是12、16、20或对。在一些实施方式中，分子内桥是内酰胺桥。在一些实施方式中，SEQ ID NO :39的 位置i和i+4的氨基酸是Lys和Glu，例如Glul6和Lys20。在一些实施方式中，Xl选自 D-His, N-甲基-His、α-甲基-His、咪唑乙酸、去氨基-His、羟基-His、乙酰基-His、高组氨酸和α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。在其它实施方式中，Χ2选自D4er、D_Ala、Gly、 N-甲基-Ser、Val和α氨基异丁酸(AIB)。在一些实施方式中，胰高血糖素肽在氨基酸位 置16、17、20、21、Μ、29、40中的任意位置、C-末端延伸内或C-末端氨基酸共价连接至亲水 性部分。在示例性实施方式中，该亲水性部分共价连接至这些位置中的任意位置上的Lys、 Cys、0rn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基。示例性的亲水性部分包括聚乙二醇(PEG)，例 如，分子量为大约1，000道尔顿至大约40，000道尔顿，或大约20，000道尔顿至大约40，000 道尔顿。在其它实施方式中，本发明提供了具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖素肽， 其包含以下氨基酸序列Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO :39)，其中Xl和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对二肽基 肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性(或增加对其的抗性)，其中胰高血糖素肽的位置16、20、21和对中的1个、2个、3个、4个或更多个被α， α-双取代氨基酸替换，并且其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸基团)、-Asn-COOH, Asn-Thr-COOH和 Y-C00H，其中Y是1至2个氨基酸。前述胰高血糖素肽或类似物的示例性的另外的氨基酸修饰包括位置7的Thr替 换为缺少羟基的氨基酸例如Abu或lie，任选地，所述替换与包含共价连接至(任选地，通过 间隔子)酰基或烷基(其中所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸而言不是原始的)的侧 链的氨基酸的替换或添加相联合，位置12的Lys被Arg替换；位置15的Asp被Glu替换； 位置16的Ser被Thr或AIB替换；位置20的Gln被kr、Thr、Ala或AIB替换；位置21的 Asp被Glu替换；位置M的Gln被kr、Thr、Ala或AIB替换；位置27的Met被Leu或Nle 替换；位置28的Asn被带电的氨基酸替换；位置28的Asn被选自LyS、Arg、HiS、ASp、Glu、 半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸替换；位置28被Asn、Asp或Glu替换；位置28被 Asp替换；位置观被Glu替换；位置四的Thr被带电的氨基酸替换；位置四的Thr被选自 Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸替换；位置四被Asp、Glu 或Lys替换；位置四被Glu替换；在位置四之后插入1-3个带电的氨基酸；在位置30 (即 在位置四之后)插入Glu或Lys ；任选地在位置31插入Lys ；向C-末端添加SEQ ID NO 20，任选地，其中位置四的氨基酸是Thr或Gly ；替换为或添加共价连接至亲水性部分的氨 基酸；或其组合。在另一个示例性实施方式中，可以通过修饰SEQ ID NO=I的位置15的氨基酸对前 述任意的肽进行进一步修饰以改善稳定性，以便减少该肽随时间的降解，特别是在酸性或 碱性缓冲剂中的降解。在示例性的实施方式中，位置15的Asp替换为谷氨酸、高谷氨酸、半 胱氨酸或高半胱氨酸。或者，可以通过修饰SEQ ID NO 1的位置16的氨基酸对本文描述的任意胰高血糖 素肽进行进一步修饰以改善稳定性。在示例性的实施方式中，位置16的Ser替换为Thr或 AIB，或者上文描述的增强在胰高血糖素受体上的效力的任意氨基酸替换。这样的修饰减少 Aspl5-Serl6之间的肽键的切割。
在胰高血糖素受体上的维持的或增强的活性可以通过以谷氨酰胺类似物修饰位 置3的Gln来实现。例如，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽可以显示出原始 胰高血糖素(例如SEQ ID NO :1)在胰高血糖素受体上的大约5%、大约10%、大约20%、大 约50%或大约85%或更高的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰 高血糖素肽可以显示出相应的胰高血糖素肽(其与包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的 氨基酸序列，除了位置3的修饰的氨基酸之外)(例如SEQ ID NO 69或SEQ ID NO 70)在 胰高血糖素受体上的大约20 %、大约50 %、大约75 %、大约100 %、大约200 %或大约500 % 或更高的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽表现出 在胰高血糖素受体上的增强的活性，但该增强的活性不超过原始胰高血糖素或相应的胰高 血糖素肽(其与包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的氨基酸序列，除了位置3的修饰的氨 基酸之外)的活性的 1000%、10，000%、100，000%或 1,000, 000% O在一些实施方式中，所述谷氨酰胺类似物是天然存在的或非天然存在的包含结构 I、II或III的侧链的氨基酸
权利要求
1.一种具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖素肽，其包含(i)SEQ ID N0:1的氨基 酸序列，其中位置16、20、21和对中的1个、2个、3个或全部氨基酸被替换为α，α -双取 代氨基酸。
2.权利要求1的胰高血糖素肽，其包含(a)在胰高血糖素肽的位置16上的氨基异丁酸(AIB)，(b)在胰高血糖素肽的位置20上的AIB，(c)在胰高血糖素肽的位置21上的AIB，(d)在胰高血糖素肽的位置M上的AIB，(e)在胰高血糖素肽的位置16和20上的AIB，(f)在胰高血糖素肽的位置16和M上的AIB，(g)在胰高血糖素肽的位置20和M上的AIB；或(h)在胰高血糖素肽的位置16、20和M上的AIB。
3.权利要求2的胰高血糖素肽，其包含在胰高血糖素肽的位置16上的AIB。
4.权利要求1-3任一项的胰高血糖素肽的类似物，其包含另外的氨基酸修饰，其中所 述胰高血糖素肽包含(i)在胰高血糖素肽位置27的氨基酸的C-末端的至少一个带电的 氨基酸；( )胰高血糖素肽的位置3的氨基酸替换为谷氨酰胺类似物；或(iii) (i)和(ii)■~ 者 ο
5.权利要求4的胰高血糖素肽类似物，其包含选自下列的至少一个氨基酸修饰 位置观的Asn替换为带电的氨基酸；位置28的Asn替换为选自LyS、Arg、HiS、ASp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置28替换为Asn、Asp或Glu ； 位置28替换为Asp ； 位置28替换为Glu ； 位置四的Thr替换为带电的氨基酸；位置四的Thr替换为选自LyS、Arg、HiS、ASp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置29替换为Asp、Glu或Lys ； 位置四替换为Glu ；在位置四之后插入1-3个带电的氨基酸；在位置四之后插入Glu或Lys ；在位置四之后插入Gly-Lys或Lys-Lys ；位置3的Gln替换为包含结构I、II或III的侧链的氨基酸
6.权利要求4或5的类似物，还包含选自下列的至少一个氨基酸修饰 位置20的Gln替换为Ala、Ser或Thr ；位置24的Gln替换为Ala、Ser或Thr ；向C-末端添加SEQ ID NO 20的氨基酸序列，其中位置四的氨基酸是Thr或Gly ；及其组合。
7.权利要求6的类似物，其包含SEQID NO :71-74任一项的氨基酸序列。
8.权利要求4-7任一项的类似物，还包含亲水性部分。
9.权利要求8的类似物，其中所述亲水性部分共价连接至类似物的氨基酸位置16、17、 20、21、对或四中的任意位置或C-末端氨基酸。
10.权利要求8或9的类似物，其中所述亲水性部分共价连接至LyS、CyS、0rn、高半胱 氨酸或乙酰基-苯丙氨酸。
11.权利要求8至10任一项的类似物，其中所述亲水性部分是聚乙二醇(PEG)。
12.权利要求11的类似物，其中所述PEG的分子量是大约1，000道尔顿至大约40，000 道尔顿。
13.权利要求12的类似物，其中所述PEG的分子量是大约20，000道尔顿至大约40，000道尔顿。
14.权利要求4至13任一项的类似物，其还包含(i)位置1的His替换为非原始氨 基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性；(ii) 位置2的Ser替换为非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽酶 IV(DPP-IV)切割的敏感性；或(iii)⑴和(ii) 二者。
15.权利要求14的类似物，其中位置1的His替换为D-His、N-甲基-His、α-甲 基-His、咪唑乙酸、去氨基-His、羟基-His、乙酰基-His、高组氨酸、或α，α-二甲基咪唑 乙酸(DMIA)。
16.权利要求15的类似物，其中位置1的His替换为DMIA。
17.权利要求14至16任一项的类似物，其中位置2的Ser替换为D_Ser、D_Ala、Gly、 η-甲基-Ser、Val或α -氨基异丁酸(AIB)。
18.权利要求4至17任一项的类似物，其包含含有共价连接至酰基或烷基的侧链的氨 基酸，其中所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸而言不是原始的。
19.权利要求18的类似物，其中与酰基或烷基连接的氨基酸是类似物的位置10的氨基 酸或C-末端氨基酸。
20.权利要求18或19的类似物，其中所述酰基或烷基通过间隔子连接至氨基酸的侧链。
21.权利要求18-20任一项的类似物，其中所述酰基是C4至C3tl脂肪酰基或者所述烷基是(；至 C30焼基。
22.权利要求4-21任一项的类似物，其还包含选自下列的氨基酸修饰 位置7的Thr替换为缺少羟基的氨基酸；删除在位置27的氨基酸的C-末端的1或2个氨基酸； C-末端α羧酸基团； 及其组合。
23.权利要求22的类似物，其中所述缺少羟基的氨基酸是Ile或氨基丁酸(Abu)。
24.权利要求4-23任一项的类似物，其还包含选自下列的氨基酸修饰 位置10的Tyr替换为Phe或Val ；位置12的Lys替换为Arg ； 位置15的Asp替换为Glu ； 位置16的Ser替换为Ilir ； 位置20的Gln替换为Ala或AIB ； 位置21的Asp替换为Glu; 位置M的Gln替换为Ala或AIB ； 位置27的Met替换为Leu或We ； 删除位置27-29的氨基酸； 删除位置观-29的氨基酸； 删除位置四的氨基酸；向C-末端添加SEQ ID NO 20的氨基酸序列，其中位置四的氨基酸是Thr或Gly ；及其组合。
25.一种具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖素肽，其包含SEQ ID N0:77的氨基酸序列，其中位置3的Xaa是包含结构I、II或III的侧链的氨基酸
26.权利要求25的胰高血糖素肽，其中X是NH或Y是NHR4。
27.权利要求25或沈的胰高血糖素肽，其中R1是Cch2烷基或C1杂烷基。
28.权利要求25-27任一项的胰高血糖素肽，其中R2是NHR4或C1烷基。
29.权利要求25- 任一项的胰高血糖素肽，其中R4是H或C1烷基。
30.权利要求25的胰高血糖素肽，其中位置3的Xaa是包含以下侧链的氨基酸 ⑴结构 I 并且 R1 是 CH2-S, X 是 NH, R2 是 CH3 (C (Acm)；(ii)结构I 并且 R1 是 CH2, X 是 NH, R2 是 CH3 (Dab (Ac))；(iii)结构I并且Rl是CO烷基，X是NH，R2是NHR4，并且R4是H(Dap(脲))；(iv)结构II 并且 Rl 是 CH2, Y 是 NHR4, R4 是 CH39 (Q(Me)；(ν)结构III并且Rl是CH2，并且结构III的R4是Η(Μ(0))；或 (vi)结构 I 并且 R1 是 CH2-CH2, X 是 ΝΗ，并且 R2 是 CH3 (Orn (Ac))。
31.权利要求25-30任一项的胰高血糖素肽的类似物，其中所述胰高血糖素肽包含(i) 连接位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链的分子内桥，其中i是12、16、20或M ； (ii)在位置16、20、21和M中的1个位置、2个位置、3个位置或全部位置的α，α -双取 代氨基酸；或(iii)⑴和( ) 二者。
32.权利要求31的类似物，其中所述α，α-双取代氨基酸是ΑΙΒ。
33.权利要求32的类似物，其中AIB位于胰高血糖素肽的位置16。
34.权利要求31至33任一项的类似物，其中所述胰高血糖素肽包含选自下列的氨基酸 修饰位置1的His替换为非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽 酶IV(DPP-IV)切割的敏感性；位置2的Ser替换为非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽 酶IV(DPP-IV)切割的敏感性；位置7的Thr替换为Abu或Ile ； 位置10的Tyr替换为Phe或Val ； 位置12的Lys替换为Arg ； 位置15的Asp替换为Glu ； 位置16的Ser替换为Thr或AIB ； 位置20的Gln替换为Ala或AIB ； 位置21的Asp替换为Glu ； 位置M的Gln替换为Ala或AIB ； 位置27的Met替换为Leu或We ； 删除位置27-29的氨基酸； 删除位置观-29的氨基酸； 删除位置四的氨基酸；向C-末端添加SEQ ID NO 20的氨基酸序列，其中位置四的氨基酸是Thr或Gly ； 替换为或添加包含共价连接至酰基或烷基的侧链的氨基酸，其中所述酰基或烷基对于 天然存在的氨基酸而言不是原始的； 及其组合。
35.权利要求34的类似物，其中所述胰高血糖素肽包含SEQID NO :62-67和69-74任一项的氨基酸序列。
36.权利要求31-35任一项的类似物，其包含共价连接至任意位置16、17、20、21、对和 29的氨基酸或C-末端氨基酸的亲水性部分。
37.权利要求36的类似物，其中所述亲水性部分是PEG。
38.权利要求34-37任一项的类似物，其中所述酰基或烷基共价连接至位置10的氨基酸或C-末端氨基酸的侧链。
39.权利要求34-38任一项的类似物，其中所述酰基是C4至C3tl脂肪酰基或者所述烷基 是(；至 C30焼基。
40.权利要求34-39任一项的类似物，其中所述酰基或烷基通过间隔子连接至氨基酸 的侧链。
41.权利要求40的类似物，其中所述胰高血糖素肽在位置7包含缺少羟基的氨基酸。
42.权利要求41的类似物，其中所述缺少羟基的氨基酸是Abu或lie。
43.一种具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖素肽，其包含以下氨基酸序列 Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO :39)，其中具有 1 至 3 个氨基酸修饰，其中Xl和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽 酶IV(DPP-IV)切割的敏感性，其中Z选自-C00H、-Asn-C00H、Asn-Thr-COOH和Y-C00H，其中Y是1至2个氨基酸，并且，其中内酰胺桥将位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链连接起来，其中i是12、16、20或 24。
44.权利要求43的胰高血糖素肽，其中SEQID NO 39的位置i和i+4的氨基酸是Lys 和 Glu。
45.权利要求44的胰高血糖素肽，其中位置16的氨基酸是Glu且位置20的氨基酸是Lys。
46.权利要求43-45任一项的胰高血糖素肽，其中Xl选自D_His、N-甲基-His、α-甲 基-His、咪唑乙酸、去氨基-His、羟基-His、乙酰基-His、高组氨酸、和α，α-二甲基咪唑 乙酸(DMIA)。
47.权利要求46的胰高血糖素，其中Xl是DMIA。
48.权利要求43至47任一项的胰高血糖素肽，其中Χ2选自D4er、D-Ala,Gly、η-甲 基-Ser、Val和α -氨基异丁酸(AIB)。
49.权利要求43至48任一项的胰高血糖素肽，其中Z是Asn-Thr-COOH。
50.权利要求43至48任一项的胰高血糖素肽，其中Z是Asn-COOH。
51.权利要求43至48任一项的胰高血糖素肽，其中Z是-C00H。
52.权利要求43至51任一项的胰高血糖素肽，其中胰高血糖素肽在氨基酸位置16、17、20、21、M或四中的任意位置或在C-末端氨基酸共价连接至亲水性部分。
53.权利要求52的胰高血糖素肽，其中所述亲水性部分共价连接至LyS、CyS、0rn、高半 胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸。
54.权利要求52或53的胰高血糖素肽，其中所述亲水性部分是聚乙二醇(PEG)。
55.权利要求M的胰高血糖素肽，其中所述PEG的分子量是大约1，000道尔顿至大约 40，000道尔顿。
56.权利要求M的胰高血糖素肽，其中所述PEG的分子量是大约20，000道尔顿至大约 40，000道尔顿。
57.权利要求43-56任一项的胰高血糖素肽，其在人类胰高血糖素受体上具有大约IOnM或更低的EC50，如在过表达胰高血糖素受体的HEK293细胞中通过测定cAMP诱导的测 定法在体外所测。
58.一种具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖素肽，其包含以下氨基酸序列Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO :39)，其中Xl和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽 酶IV(DPP-IV)切割的敏感性(或增加对其的抗性)，其中胰高血糖素肽的位置16、20、21和M中的1个、2个、3个或全部氨基酸替换为α， α -双取代氨基酸，其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸基团)、-Asn-COOH, Asn-Thr-COOH和 Y-C00H，其中Y是1至2个氨基酸，并且，任选地，其中所述胰高血糖素肽在任意氨基酸位置16、17、20、21、Μ或四或在C-末端 氨基酸共价连接至亲水性部分。
59.权利要求58的胰高血糖素肽，其包含(a)在胰高血糖素肽的位置16上的AIB，(b)在胰高血糖素肽的位置20上的AIB，(c)在胰高血糖素肽的位置21上的AIB，(d)在胰高血糖素肽的位置M上的AIB，(e)在胰高血糖素肽的位置16和20上的AIB，(f)在胰高血糖素肽的位置16和M上的AIB，(g)在胰高血糖素肽的位置20和M上的AIB；或(h)在胰高血糖素肽的位置16、20和M上的AIB。
60.权利要求58或59的胰高血糖素肽，其中Xl选自D-His、N-甲基-His、α-甲 基-His、咪唑乙酸、去氨基-His、羟基-His、乙酰基-His、高组氨酸、和α，α-二甲基咪唑 乙酸(DMIA)。
61.权利要求60的胰高血糖素肽，其中Xl是DMIA。
62.权利要求58-61任一项的胰高血糖素肽，其中Χ2选自D-kr、D-Ala,Gly、η-甲 基-Ser、Val和α -氨基异丁酸(AIB)。
63.权利要求58-62任一项的胰高血糖素肽，其中Z是Asn-Thr-COOH。
64.权利要求58-62任一项的胰高血糖素肽，其中Z是Asn-COOH。
65.权利要求58-62任一项的胰高血糖素肽，其中Z是-C00H。
66.权利要求58-65任一项的胰高血糖素肽，其中所述亲水性部分共价连接至Lys、 Cys, Orn、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸。
67.权利要求58-66任一项的胰高血糖素肽，其中所述亲水性部分是聚乙二醇(PEG)。
68.权利要求67的胰高血糖素肽，其中所述PEG的分子量是大约1，000道尔顿至大约 40，000道尔顿。
69.权利要求67的胰高血糖素肽，其中所述PEG的分子量是大约20，000道尔顿至大约 40，000道尔顿。
70.权利要求58-69任一项的胰高血糖素肽，其在人类胰高血糖素受体上具有大约IOnM或更低的EC50，如在过表达胰高血糖素受体的HEK293细胞中通过测定cAMP诱导的测 定法在体外所测。
71.权利要求43或权利要求58的胰高血糖素肽的类似物，其具有胰高血糖素激动剂活 性并且还包含选自下列的氨基酸修饰位置10的Tyr替换为Phe或Val ； 位置12的Lys替换为Arg ； 位置15的Asp替换为Glu ； 位置16的Ser替换为Thr或AIB ； 位置20的Gln替换为Ala或AIB ； 位置21的Asp替换为Glu; 位置M的Gln替换为Ala或AIB ； 位置27的Met替换为Leu或We ； 位置28的Asn替换为带电的氨基酸；位置28的Asn替换为选自LyS、Arg、HiS、ASp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置28替换为Asn、Asp或Glu ； 位置28替换为Asp ； 位置28替换为Glu ； 位置四的Thr替换为带电的氨基酸；位置四的Thr替换为选自LyS、Arg、HiS、ASp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置29替换为Asp、Glu或Lys ； 位置四替换为Glu ；在位置四之后插入1-3个带电的氨基酸； 在位置30插入Glu或Lys ； 在位置31插入Lys ； 或其组合。
72.权利要求71的类似物，其还包含下列氨基酸修饰中的一个或组合 位置3的Gln替换为包含结构I、II或III的侧链的氨基酸
73.权利要求43或58的胰高血糖素肽的类似物，其具有胰高血糖素激动剂活性并且包 含下列氨基酸修饰中的一个或组合位置3的Gln替换为包含结构I、II或III的侧链的氨基酸
74. SEQ ID NO 1的胰高血糖素肽的类似物，其具有胰高血糖素激动剂活性并且包含 (a)至少一个选自下列的氨基酸修饰 位置观的Asn替换为带电的氨基酸；位置28的Asn替换为选自LyS、Arg、HiS、ASp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置28替换为Asn、Asp或Glu ； 位置28替换为Asp ； 位置28替换为Glu ； 位置四的Thr替换为带电的氨基酸；位置四的Thr替换为选自LyS、Arg、HiS、ASp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置29替换为Asp、Glu或Lys ； 位置四替换为Glu ；在位置四之后插入1-3个带电的氨基酸； 在位置四之后插入Glu或Lys ； 在位置四之后插入Gly-Lys或Lys-Lys ； 或其组合；以及选自组A或组B的至少一个氨基酸修饰，或其组合；其中所述组A是选自下列的氨基酸修饰位置15的Asp替换为Glu，和位置16的Ser 替换为Thr或AIB;并且其中所述组B是选自下列的氨基酸修饰位置1的His替换为非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽 酶IV(DPP-IV)切割的敏感性，位置2的Ser替换为非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对于二肽基肽 酶IV(DPP-IV)切割的敏感性，位置10的Tyr替换为Phe或Val ； 位置12的Lys替换为Arg ； 位置20的Gln替换为Ala或AIB ； 位置21的Asp替换为Glu; 位置M的Gln替换为Ala或AIB ； 位置27的Met替换为Leu或We ； 删除位置27-29的氨基酸； 删除位置观-29的氨基酸； 删除位置四的氨基酸； 或其组合。
75.权利要求74的类似物，其还包含下列氨基酸修饰中的一个或组合 位置3的Gln替换为包含结构I、II或III的侧链的氨基酸
76.权利要求74或75的类似物，其中内酰胺桥将位置I的氨基酸和位置i+4的氨基酸 的侧链连接起来，其中i是12、16、20或24。
77.权利要求74-76任一项的类似物，其中类似物的位置16、20、21和M的1个、2个、 3个或全部的氨基酸替换为α，α-双取代氨基酸。
78.权利要求77的类似物，其中所述α，α-双取代氨基酸是ΑΙΒ。
79.权利要求78的类似物，其包含SEQID NO 76的氨基酸序列。
80.包含SEQID NO :40-56任一项的氨基酸序列的胰高血糖素肽。
81.包含SEQID NO 40的氨基酸序列的胰高血糖素肽。
82.前述权利要求任一项的胰高血糖素肽或类似物，其中，当胰高血糖素肽或其类似物 缺少亲水性部分时，所述胰高血糖素肽或其类似物显示出至少大约20%的原始胰高血糖素 在胰高血糖素受体上的活性。
83.前述权利要求任一项的胰高血糖素肽或类似物，其中，当胰高血糖素肽或其类似物 缺少亲水性部分时，所述胰高血糖素肽或其类似物显示出不高于大约0.5%的原始GLP-I 在GLP-I受体上的活性。
84.包含通过接头连接的两个肽的二聚体，其中所述两个肽中至少有一个是权利要求 1-3、25-30、43-70和80-83任一项的胰高血糖素肽或权利要求4H 31-42和71-79任一项 的类似物。
85.权利要求84的二聚体，其中所述二聚体是同型二聚体。
86.权利要求84或85的二聚体，其中所述接头选自双官能巯基交联剂和生物功能性胺 交联剂。
87.一种缀合物，其包含缀合部分和权利要求1-3、25-30、43-70和80-83任一项的胰高 血糖素肽、权利要求4-M、31-42和71-79的类似物、权利要求84-86任一项的二聚体，或其组合。
88.一种融合肽，其包含融合至包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的肽的权利要求 1-3,25-30,43-70和80-83任一项的胰高血糖素肽、权利要求4H31-42和71-79的类似 物、或权利要求84-86任一项的二聚体。
89.一种药物组合物，其包含权利要求1-3、25-30、43-70和80-83任一项的胰高血糖 素肽、权利要求4-M、31-42和71-79的类似物、权利要求84-86任一项的二聚体、权利要求 87的缀合物、权利要求88的融合肽、或其组合，以及药学上可接受的载体。
90.一种用于向有此需要的患者给予胰高血糖素激动剂的药盒，所述药盒包括权利要 求89的药物组合物和用于给予患者所述药物组合物的装置。
91.权利要求90的药盒，其中所述装置包括注射器和针，其中所述药物组合物预先包 装在所述注射器内。
92.一种在有此需要的患者中引起肠道的暂时性麻痹的方法，所述方法包括给予患者 权利要求89的药物组合物，给药量可有效引起患者的肠道暂时性麻痹。
93.一种在有此需要的患者中减少体重增加或引起体重下降的方法，所述方法包括给 予患者权利要求89的药物组合物，给药量可在患者中有效减少体重增加或引起体重下降。
94.一种在有此需要的患者中治疗或预防低血糖症的方法，所述方法包括给予患者权 利要求89的药物组合物，给药量可在患者中有效治疗或预防低血糖症。
95.一种在有此需要的患者中稳定血糖水平的方法，其中所述患者正处于包含施用胰 岛素的治疗方案中，所述方法包括给予患者权利要求89的药物组合物，给药量可有效稳定 患者的血糖水平。
96.权利要求95的方法，其中所述药物组合物还包含胰岛素。
全文摘要
本发明公开了具有改善的溶解性和/或半衰期而仍然保持胰高血糖素激动剂活性的修饰的胰高血糖素肽。通过将原始氨基酸替换为带电的氨基酸和/或向肽的羧基末端添加带电的氨基酸对胰高血糖素肽进行修饰。可以通过聚乙二醇化或通过添加选自SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23的羧基末端肽或通过这二者对修饰的胰高血糖素激动剂进行进一步修饰，以进一步增强胰高血糖素激动剂类似物的溶解性。
文档编号A61K38/00GK102088989SQ200980127066
公开日2011年6月8日 申请日期2009年6月16日 优先权日2008年6月17日
发明者D·L·斯米利, J·戴, J·沙贝内, M·迪马基, R·D·迪马基 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司