专利名称：靶向病原性单核细胞的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及免疫学、白细胞生物学、炎症、癌症、血管疾患和医药领域。更具体地，本发明涉及决定治疗选择的方法、评估治疗效力的方法，和靶向疾病相关白细胞而不导致高发病率或全身性免疫抑制的方法。背景白细胞(leukocytes)，或白细胞(white blood cells)，是保护机体免受炎性疾病和毒素侵害的免疫系统的细胞。人类中有几种不同的且功能各异的白细胞的种类，但所有白细胞都来源于共同的骨髓源性多能干细胞。在健康人中每毫升血液中有大约8X IO6个白细胞。这些白细胞由嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞组成。单核细胞级分仅占所有白细胞的大约2-8%。在十九世纪中期医师首次观察到巨噬细胞，当时这些细胞在战场伤口中被描述且与慢性炎症领域相关。此后这些细胞的大量研究揭示了单核细胞-巨噬细胞系统发挥一些关键的功能在组织的维持和修复中；免疫调节；和在病原体的控制和消除中。单核细胞仅在血液中暂时停留。在骨髓中发育后，单核细胞在血流中循环，在那里它们的半衰期为几天。在急性炎症反应期间，半衰期可能仅为几个小时。单核细胞由血液迁出进入到组织中与细胞体积的增大和表明RNA强表达的较大、较浅染色的细胞核有关。这些组织渗入型的细胞被称作巨噬细胞(或组织细胞)。这些细胞是吞噬性的和移动的。当单核细胞在不同的组织中定居时，它们可在那里持续数年。在脾中，巨噬细胞参与衰老红细胞的再循环；在皮肤中(朗氏细胞(Langerhans cells))，它们参与表皮的角质化；在肝中(Kupfer细胞)，它们管理着毒素的降解；在动脉的内膜中(泡沫细胞)，它们参与动脉粥样硬化斑块的形成；在关节中，它们分化成参与关节的维持的细胞(A型滑膜细胞)；在淋巴结中，它们作为抗原呈递细胞行使功能(树突细胞)，刺激适应性免疫应答；在骨中，它们调节骨量的再吸收(破骨细胞)；而在中枢神经系统中(神经胶质细胞)，它们作为岗哨细胞发挥作用并参与神经内分泌稳态。单核细胞和它们分化的细胞过去普遍被称为网状内皮系统。虽然这种叫法不再普遍，但这种命名法强调了单核细胞在组织和器官系统的稳态中的多种作用。单核细胞为在组织中行使其众多功能，首先必须从血管中离开并进入组织。为实现该目的，单核细胞一旦被激活后，黏着在血管壁的内皮细胞上并外渗、或渗透形成血管壁的细胞基质。这种外渗过程并不是单核细胞独有的。黏着的分子机制涉及黏着分子CDlla、 CDllb、CDllc/CD18，对几乎所有单核细胞以及淋巴细胞和嗜中性粒细胞是共同的。因为白细胞外渗到组织中是许多疾病过程中的第一步，所以利用抗体进行了阻止该过程的尝试。但需要特别注意的是不能造成该过程的全身性阻碍。被称为白细胞黏附缺陷(LAD)的人类遗传病，是CD11/CD18系统的缺陷，导致了严重的免疫抑制。患有LAD的个体如果不受保护免受病原体的侵害会死于机会性感染。因此对该过程非常有选择性的阻碍是可接受的。一种这样的治疗涉及抗体依法利珠单抗(Efalizumab)的使用，该抗体靶向⑶11c，⑶Ilc在诸如T淋巴细胞的某些白细胞亚群上以⑶Ilc/⑶18表达。但是，还未设计出选择性阻碍单核细胞功能的方法。与其他白细胞相区别的是，单核细胞代表着独特的细胞划分。单核细胞本身是功能上多样的细胞群体。在人类中，这些群体基于细胞表面标记的表达可通常分为两组(1) 定义为⑶14高表达的主要群体(⑶14++)和( 定义为⑶14和⑶16共表达的次要群体 (⑶14+⑶16+)。后者称为单核细胞的促炎性亚群且与包括动脉粥样硬化、癌症、类风湿性关节炎和阿尔茨海默病的大量炎症相关疾病有关。已尝试了从患者中去除促炎性⑶14+⑶16+单核细胞的涉及白细胞去除 (Ieukocytopheresis)的治疗策略。例如，⑶14+⑶16+单核细胞的体外消除成功治疗了馈疡性结肠炎(Kanai 等人.hflamm. Bowel Dis. 2007 Mar ； 13 (3) :284-90) 然而，该方法对患者导致了高发病率和风险，并不适宜于慢性病的治疗。并且，白细胞去除并不是 CD14+CD16+单核细胞高度选择性的，而是消除绝大部分的单核细胞群体。因此，白细胞去除并不适宜于治疗需要持续的、长期的消除的疾病，因为这预期会导致危险的免疫抑制。而需要靶向⑶14+⑶16+的高度选择性方法。优选的方法将是利用特异性下调CD14+CD16+促炎性单核细胞亚群功能的剂选择性地靶向该亚群。迄今为止，还未鉴定出任何精确靶向这些细胞的实用方法。虽然这些细胞的特征是CD14和CD16表面蛋白的表达，但是这些并不适于靶向治疗。因为CD14由所有的单核细胞以及诸如嗜中性粒细胞的其他细胞群体所表达，所以它不是合适的靶标。对 CD14表达细胞的整个群体的功能进行调节将导致不可接受的严重免疫抑制的风险。靶向 ⑶16 (FcgRIII)也并不合适，因为它除在单核细胞上表达外，还在包括B淋巴细胞和T淋巴细胞的其他大量重要的免疫细胞上表达。因此，缺乏靶向这些CD14+CD16+单核细胞的良好标记。概述本发明基于白细胞介素-la (IL-Ια)在人类中在促炎性的、疾病相关的 ⑶14+⑶16+单核细胞亚群上表达的发现。重要地，因为IL-I α表现为几乎仅在这种单核细胞亚群上表达，IL-I α代表着靶向⑶14+⑶16+单核细胞亚群的理想标记。并且，这个发现允许通过评估CD14+CD16+单核细胞的水平或功能性而对消除这种病原性细胞或在这种细胞类型中调节IL-Ia的功能的剂的有效性进行监测。因此，本发明以包括以下步骤的方法为特征(a)向人类受试者施用调节IL-Ia 的功能或表达的剂；和(b)确定这种施用是否调节受试者中CD14+/CD16+的量或功能。该方法还可包括首先确定受试者是否具有促成疾病或病理性疾患的量的CD14+/CD16+单核细胞和/或是否受试者的CD14+/CD16+单核细胞的功能属性促成疾病或病理性疾患的步骤。本发明还以包括以下步骤的方法为特征(a)确定人类受试者是否具有促成疾病或病理性疾患的量的CD14+/CD16+单核细胞；和(b)向人类受试者施用调节IL-I α的功能或表达的剂。这种方法还可包括步骤(c)确定这种施用是否调节受试者中⑶14+⑶16+单核细胞的量。还在本发明内的是包括以下步骤的方法(a)确定人类受试者的CD14+/CD16+单核细胞的功能属性是否促成疾病或病理性疾患；和(b)向人类受试者施用调节IL-I α的功能或表达的剂。这种方法还可包括步骤(c)确定这种施用是否调节受试者中⑶14+⑶16+ 单核细胞的功能。在这些方法中，调节IL-I α的功能或表达的剂可以是干扰IL_1 α结合IL_1 α受体的剂或调节编码IL-I α的核酸的转录或翻译的水平的剂。例如，剂可以是特异性结合 IL-Ia或IL-Ia受体的抗体(Ab)。Ab可以是当向受试者施用时降低受试者中⑶14+⑶16+ 单核细胞的量或功能的抗体。Ab可以是单克隆抗体(mAb)，例如，特异性结合IL_1 α的mAb。抗体可以是人类 Ab,比如特异性结合IL-I α的单克隆人类IgGl (例如，具有包括SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列的轻链的抗体；或具有包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列的轻链的抗体)。在这些方法中，调节IL-I α的功能或表达的剂还可以是提高受试者中与IL_1 a 或IL-I α受体特异性结合的Ab的浓度的疫苗，或降低或调节受试者中IL-I α表达的核酸。人类受试者可以是患有与CD14+CD16+单核细胞的异常功能或水平相关的病状的人。例如，病状可以是炎性病症或自身免疫性病症，诸如癌症、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎或炎性肠病。人类受试者还可以是在剂施用之前外周血中具有异常高水平的CD14+CD16+ 单核细胞白细胞(例如，在全血分类计数中为白细胞总数的至少1.5%)的人，或在剂施用后外周血白细胞中具有正常或低于正常水平的CD14+CD16+单核细胞(例如，在全血分类计数中低于白细胞总数的1.5%)的人。人类受试者还可以是在剂施用之前外周血单核细胞中具有异常高水平的CD14+CD16+单核细胞(例如，单核细胞的至少10%是CD14+CD16+)的人。在这些方法中，确定这种施用是否调节受试者中⑶14+⑶16+单核细胞的量或功能的步骤可包括在施用前和施用后确定受试者的CD14+CD16+单核细胞的量(例如，数量、 全血分类计数中白细胞总数的百分比、浓度和/或与诸如CD14++单核细胞的其他血细胞的比例)和/或在施用前和施用后评估受试者的CD14+CD16+单核细胞的功能(例如，评估与诸如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)等内皮细胞的结合)。除非另外指定，否则本文所用的所有技术术语具有与本发明所属领域中一般技术人员所通常理解的相同的含义。生物学术语的常规理解定义可见于Rieger等人，Glossary of Genetics Classical and Molecular (遗传学词汇表经典的和分子的)，第5版， Springer-Verlag :New York, 1991 ；禾口 Lewin, Genes V (基因 V), Oxford University Press New York，1994。术语“抗体”的意思是免疫球蛋白以及通过完整的免疫球蛋白的酶促消化制备的或通过分子生物学中的技术制备的免疫球蛋白的任何部分或片段。该术语还指含有免疫球蛋白(或其部分或片段)的混合物比如抗血清。如本文所用的，术语“人类抗体，，或“人类Ab，，通常指在人类中为基本上非免疫原性的免疫球蛋白(Ig)。
如本文所用的术语“特异性结合”，当涉及多肽(包括Ab)或受体时，指在蛋白和其他生物制品的混杂群体中确定蛋白或多肽或受体的存在的结合反应。因此，在指定条件下 (例如，就抗体而言的免疫分析条件)，具体的配体或Ab结合其特定的“靶标”并且不以大量与样品中存在的其他蛋白或在生物体中可能与配体或抗体接触的其他蛋白相结合。通常， 与第二种分子“特异性结合”的第一种分子对于第二种分子具有大于大约105(例如，106、 IO7UO8UO9UOiciUO11和IO12或以上)升/摩尔的平衡亲和常数。当提到诸如Ab的蛋白分子时，“纯化的”意思是与天然伴随这些分子的组分分离。 典型地，当Ab或蛋白为以重量计至少约10% (例如，9%、10%、20%、30%、40%、50%、 60%,70%,80%,90%,95%,98%,99%,99. 9%禾口 100% )地不含非 Ab 蛋白或与之天然缔合的其他天然存在的有机分子时，Ab或蛋白是纯化的。纯度可通过任何适合的方法测量， 例如，柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析或其他适宜的方法。在除其天然存在的细胞类型以外的细胞类型中产生的化学合成的蛋白或其他重组蛋白为“纯化的”。以下描述了适宜的方法和材料，虽然与本文所描述的相似或相同的方法和材料可用于本发明的实践或检验。本文所提到的所有出版物以其整体通过引用并入。如有冲突， 将以本说明书包括定义为准。此外，以下所讨论的特定实施方案仅为例证性的而非限制性的。详述本发明包括用于评估向人类受试者施用IL-Ia靶向剂是否调节受试者中 CD14+CD16+单核细胞的功能或量的方法。以下所描述的优选的实施方案示出了这些方法的适应性改变。但是，从这些实施方案的描述，本发明的其他方面可基于以下提供的描述来制备和/或实践。一般方法本文描述了涉及常规免疫学和分子生物学技术的方法。免疫学方法(例如，用于抗原-Ab复合物的检测和定位的分析、免疫沉淀、免疫印迹及类似方法)是本领域公知的并且在诸如Current Protocols in Immunology (现代免疫学实验方案)，Coligan等人，编辑， John Wiley & Sons，New York的方法学论著中描述。分子生物学的技术在诸如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，第 2 版，第 1-3 卷，Sambrook 等人，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 2001 ； Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验方案)，Ausubel 等人，编辑，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York 的论著中详细描述。Ab 方法在Handbook of Therapeutic Antibodies (治疗性抗体手册)，Dubel，S.，编辑，Wiley-VCH， 2007中描述。血细胞分析的方法在Flow Cytometry (流式细胞术)，David Keren, American Society for Clinical Pathology (美国临床病理学会)；第 4 版，2007 和 Lichtman 等人， Williams Hematology (威廉姆斯血液学)，McGraw-Hi 11 Professional ；第 7 版，2005 中描述。调节IL-I α的功能和/或表达的剂本发明的多种方法以向人类受试者施用调节IL-I α的功能或表达的剂的步骤为特征。可以使用调节IL-I α的功能或表达的任何适宜的剂。所述剂，举例来说，可以是结合IL-I α的剂、干扰IL-I α结合IL_1 α受体的剂，或调节编码IL_1 α的核酸的转录或翻译水平的剂。为数众多的这种剂是公知的，或可通过有经验的技术人员利用本文的教导或本领域中的知识而制备。这些包括特异性结合IL-I α或IL-I α受体的抗体(由此其阻碍了与IL-Ia的结合)、提高受试者中这种抗体的浓度的疫苗、IL-I α结合蛋白比如IL-Ia 受体和其变体(例如，片段或氨基酸取代突变体)、结合IL-I α的核酸(例如，适体)、特异性结合IL-I α的小的有机分子、降低或调节IL-I α表达的核酸，和以上的两种或更多(例如，2、3、4、5或更多)种的组合。抗体在本发明的方法中有用的抗体包括那些，当将其施用给受试者时，调节(例如，降低)受试者中⑶14+⑶16+单核细胞的量或功能的抗体。因为⑶14+⑶16+单核细胞也表达 IL-I α，可使用特异性结合IL-I α或IL_1 α受体的Ab来调节这种单核细胞的功能或量。 抗IL-I α抗体或抗IL-I α受体Ab可以是多克隆的或是单克隆的。为避免非预期反应，在本发明的方法中使用的Ab优选地是人源化的或更优选地是人类的。本发明的方法优选地使用人类mAb，该人类mAb包括(i)对人类IL-Ia表现出非常高结合亲和力的抗原结合可变区和(ii)通过Clq结合有效激活补体系统并且与几种不同的Fc受体有效结合的恒定区。人类Ab优选地为IgGl。抗体的Ka优选地为至少ΙΧΙΟ 1 或更高(例如，高于1 X IO10M"1)。人类Ab可包括包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列的轻链；或具有包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO 4的氨基酸序列的轻链的抗体。虽然一般较不优选，嵌合的抗IL-I α mAb (例如，“人源化的”mAb)，即具有来源于不同动物种类的不同部分的抗原结合分子(例如，小鼠Ig的可变区与人类Ig的恒定区融合)，也可用于本发明。这种嵌合抗体可通过本领域公知的方法来制备。例如，Morrison 等人，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA, 81 :6851,1984 ；Neuberger 等人，Nature，312 :604， 1984 ；Takeda等人，Nature, 314 :452，1984。同样地，可通过本领域公知的方法对抗体进行人源化。例如，具有所需结合特异性的单克隆抗体可以是商业上人源化的，或如美国专利第 5，693，762号；第5，530，101号；或第5，585，089号中所描述的。优选地，为保证高滴度的Ab可以最小的副作用施用给受试者，可用于本发明的 mAb 组合物为至少 0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、95、96、97、98、99、99. 9或更高的重量百分比纯的(排除任何赋形剂)。Ab组
合物可仅包括mAb的单一类型(S卩，由单一克隆的B淋巴细胞系产生的mAb)或可包括mAb 的两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)不同类型的混合物。为改进或增强它们的功能，可将Ab与诸如细胞毒素的另一种分子轭合。IL-Ia 特异性Ab可以与一种或多种细胞毒素轭合以更有效地杀伤表达IL-I α的细胞。用于本发明的细胞毒素可以是能够轭合mAb的任何细胞毒性剂(例如，在与细胞接触后能够杀伤细胞的分子)。细胞毒素的例子包括，但不局限于，放射性核素(例如，35S、14C、32P、125I、131I、 ixiYJ9Zr JcilTL1U88Re^Ciu213Bi和211At),轭合放射性核素和化疗剂。细胞毒素的另外的例子包括，但不局限于，抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤(MTX)、氟达拉滨 (fludarabine)等)、抗微管剂(例如，长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、 秋水仙碱(colchicine)、紫杉烷类(taxanes)(比如紫杉酚(paclitaxel)和紫杉萜 (docetaxel))等)、烷化剂(例如，环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、双氯乙亚硝脲(BCNU)等)、钼剂(例如，顺钼(也称作cDDP)、碳钼、奥沙利钼(oxaliplatin)、JM-216、CI-973等)、蒽环类(例如，阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)等)、抗生素剂(例如，丝裂霉素-C)、拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)和喜树碱(camptothecins)或其他细胞毒性剂比如蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素(diptheria toxin (DT))、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin (ΡΕ)) A, PE40、相思豆毒蛋白 (abrin)、阜草毒蛋白(saporin)、美国商陆病毒蛋白(pokeweed viral protein)、溴化乙锭、糖皮质激素、炭疽毒素(anthrax toxin)和其他。参见，例如，美国专利第5，932，188号。疫苗在所述方法中，调节(例如，抑制)IL_la的功能或表达的剂还可以是提高受试者中与IL-I α特异性结合的抗体的浓度的疫苗。适宜的疫苗可包括药学上可接受的载体中的IL-I α的免疫原性形式。还可包括佐剂比如铝盐。IL-Ia的免疫原性形式可包括完整的蛋白或这种蛋白的肽片段。为增强免疫反应，IL-I α的免疫原性形式可以与诸如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)或假单胞菌外毒素的载体蛋白相轭合。可以收集疫苗施用而产生的Ab并按以上所描述的进行使用。调节IL-I α的蛋白和模拟物通过直接靶向而调节IL-Ia表达和/或功能的蛋白的例子包括IL_1受体 (IL-IR)，比如IL-1RI、IL-1RII和其IL-I α结合变体(例如，其重组形式、片段、模拟物、突变体和轭合物)。IL-IR的可溶形式因其易于施用而是优选的。能够间接调节IL-I α表达和/或功能的蛋白的例子包括能够与单核细胞相关的IL-I α竞争诸如IL-IR的结合配体的蛋白(例如，不转导激活信号的那些蛋白)。这些可包括修饰的非激活的IL-I α (包括原IL-I α、膜相关IL-I α和重组IL_1 α )、修饰的非激活的IL-I β (包括原IL-I β和成熟 IL-I β )、IL-I 受体拮抗物(IL-IRa ；包括可溶 IL-IRa, icIL-lRal 和 icIL-lRall)，和它们的变体。蛋白(包括Ab)变体可通过本领域公知的多种技术来生成。例如，IL-I α、IL_1 β、 IL-IRa和IL-IR变体可通过诱变来制备，比如通过导入离散点突变、或通过平截。突变能够生成与这些蛋白的功能活性基本相同的蛋白变体，或仅具有这些蛋白的功能活性的亚群的蛋白变体。其他可生成的蛋白变体包括抗蛋白酶剪切的那些蛋白，例如，由于突变改变了蛋白酶靶标序列。肽的氨基酸序列中的改变是否产生了具有天然蛋白的一种或多种功能活性的蛋白变体，可易于通过检验变体的天然蛋白功能活性而确定。调节IL-I α表达或功能的以上这些的非肽模拟物或化学修饰形式也可以被使用。参见，例如，Freidinger等人的 P印tides =Chemistry and Biology (肽化学和生物学)，G. R. Marshall 编辑，ESCOM Publisher =Leiden, Netherlands, (1988) ；Ewenson 等人(1986)J. Med. Chem. 29 295 ； Ewenson 等人的 Peptides !Structure and Function (月太结构禾口功能)(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium(第9届美国肽专题讨论会会议录))；Nagai等人 (1985) Tetrahedron Lett 26 :647 ；Sato 等人(1986) J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1 :1231)； Gordon 等人(1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 126 :419 ；禾口 Dann 等人(1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 134 :71。前述这些也可通过与诸如糖基基团、脂质、磷酸盐、乙酰基基团及类似的其他化学基团形成共价键或聚集轭合物从而被化学修饰以生成衍生物。蛋白的共价衍生物可通过将化学基团连接到蛋白的氨基酸侧链上的官能团或多肽的N-末端的或C-末端的官能团上而制备。为改进或增强它们的功能，前述的剂还可与诸如以上所列的细胞毒素中的一种或多种的另外的分子相轭合。调节IL-I α的核酸调节IL-Ia的表达/活性的剂还可以是核酸。例如，核酸可以是编码IL_1 α蛋白的有义核酸(例如，导入到细胞中可提高细胞IL-I α活性)。核酸还可以是与编码IL-I α 的mRNA杂交从而抑制翻译并降低蛋白表达的反义核酸。在本发明中使用的反义核酸分子是在细胞条件下以抑制IL-I α蛋白表达的方式，例如，通过抑制转录和/或翻译，与编码 IL-Ia蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如，结合)的那些。结合可以通过常规碱基对互补，或，例如，在与DNA双链体结合的情况下，通过在双螺旋的大沟中的特异性相互作用来进行。反义构建物可作为表达质粒来递送，当其在细胞中被转录时，产生与编码IL-I a 蛋白的细胞mRNA的至少一个独特的部分互补的RNA。可选地，反义构建物可采用离体生成的寡核苷酸探针的形式，当将其导入到表达IL-I α蛋白的细胞中时，通过与编码IL-I α蛋白的mRNA和/或基因组序列杂交而导致IL-I α蛋白表达的抑制。这种寡核苷酸探针优选地是对诸如核酸外切酶和/或核酸内切酶的内源性核酸酶具有抗性的修饰的寡核苷酸， 因此在体内是稳定的。用作反义寡核苷酸的示例性的核酸分子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物(参见，例如，美国专利第5，176，996号；第5，264, 564号和第 5，256，775 号)。可在体内将核酸分子递送到表达IL-I α的细胞中。已开发出用于将DNA或RNA 递送到细胞中的大量方法。例如，可通过诸如电穿孔、脂质体介导的转染、CaCl介导的转染的标准技术或通过基因枪的使用将这种分子直接导入到靶位点。可选地，可使用设计为靶向目的细胞的修饰的反义分子(例如，与特异性结合靶标细胞表面表达的受体或抗原的肽或抗体连接的反义分子)。因为经常难以达到足以抑制内源性mRNA翻译的反义分子的细胞内浓度，优选的方法利用重组的DNA构建物，其中将反义寡核苷酸置于强启动子(例如，CMV 启动子)的调控之下。利用这样的构建物转化细胞会导致足量的单链RNA的转录，该单链 RNA将与内源性IL-I α转录物形成互补碱基对且因此阻止IL-I a mRNA的翻译。还可使用设计为催化裂解IL-I a mRNA转录物的核酶分子以阻止IL_1 a mRNA的翻译和IL-I α蛋白的表达(参见，例如，PCT专利公开第WO 90/11364号，1990年10月4日公开；Sarver 等人，Science 247 1222-1225，1990 和美国专利第 5，093，246 号)。优选地对核酶进行工程改造以使裂解识别位点位于IL-I α mRNA的5'端；即，提高效率并使非功能性的mRNA转录物的胞内积聚最小化。可利用载体将本发明的核酶递送到细胞。利用定向的同源重组可通过使IL-I α基因或其启动子失活或“敲除” IL_1 α基因或其启动子而降低内源性的IL-Ia基因表达。参见，例如，Kempin等人，Nature 389 802(1997) ；Smithies 等人，Nature 317 :230-234,1985 ；Thomas 和 Capecchi, Cell 51 503-512,1987 ；和Thompson等人，Cell 5 :313_321，1989。例如，可使用突变体，即侧翼具有内源性IL-I α基因(IL-Ια基因的编码区或调控区)同源DNA的非功能性的IL_1 α基因变体(或完整的无关DNA序列)，且具有或不具有选择性标记物和/或负向选择性标记物， 来转染细胞以在体内表达IL-I α蛋白。可选地，可通过靶向与IL-I α基因的调控区(S卩，IL_1 α启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列以形成在靶标细胞中阻止IL-I α基因转录的三螺旋结构从而降低内源性的 IL-I α 基因表达。(通常参见，Helene，C，Anticancer Drug Des. 6(6) =569-84, 1991 ；Helene, C,等人，Ann. N. Y. Acad. Sci. 660 :27-36,1992 ；禾口 Maher，L. J. ，Bioassays 14(12) :807-15,1992) ο还可利用RNA干扰(RNAi)技术进行IL-I α基因表达的抑制。结合IL-I α的核酸(适体)本发明中还可使用通过重复几轮选择而被工程改造(例如，通过SELEX ；通过指数富集的配体系统进化)为结合IL-I α的适体或核酸物质来调节IL-I α的功能。抗特异性标记物的适体的制备和使用的方法在例如以下中描述，美国专利第5，670，637号；第 6，331，398 号和第 5，270，163 号；第 5，567，588 号。调节IL-I α表达/功能的小分子小分子(通常是有机小分子)也可调节IL-I α表达或功能。可使用已知具有抗炎作用的小分子诸如皮质甾类、环氧合酶抑制物、利诺胺(linomide (roquinimex (罗喹美克)))、沙利度胺(thalidomide)、己酮可可碱(pentoxifylline)和金雀异黄素 (genistein)0其他分子可通过筛选小分子库来鉴定以鉴定出在单核细胞中调节(上调或下调)IL-I α表达的那些分子。确定剂的施用是否调节受试者中CD14+CD16+单核细胞的量本发明的一种方法以确定调节IL-I α表达和/或功能的剂的施用是否调节受试者中CD14+CD16+单核细胞的量的步骤为特征，该方法可包括在施用前和施用后确定受试者的CD14+CD16+单核细胞的量(例如，数量、全血分类计数中白细胞的百分比、浓度、与诸如CD14++单核细胞的其他血细胞的比例)。可通过任何适宜的方法确定施用前和施用后受试者的CD14+CD16+单核细胞的量。例如，可从人类受试者中分离外周血单核细胞(PBMC) 且然后利用对CD14和CD16特异性的抗体对其进行流式细胞术处理。还可对外周血细胞离心以浓缩细胞，并且可用免疫组织化学技术来鉴定和定量⑶14+⑶16+群体。确定剂的施用是否调节受试者中CD14+CD16+单核细胞的功能本发明的一种方法以确定IL-Ia靶向剂的施用是否调节受试者中CD14+⑶16+ 单核细胞的功能的步骤为特征，该方法可包括在施用前和施用后评估受试者的CD14+CD16+ 单核细胞的功能。可通过任何适宜的方法确定施用前和施用后受试者的CD14+CD16+单核细胞的功能。例如，可从人类受试者中收集的外周血单核细胞中分离CD14+CD16+单核细胞。可利用黏附在人造膜基质上的人脐静脉内皮细胞将分离的单核细胞进行体外的结合和跨内皮迁移分析。参见，例如，Kingin 等人，(1991)Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA,88 7200-7203。可进行许多不同的分析以确定⑶14+⑶16+单核细胞的功能特性。可对从患者中分离的白细胞在体外诱导促炎级联反应的能力进行检验。刺激滑膜细胞以上调MCP-I表达的能力、或刺激由EL-4T淋巴细胞系产生IL-2的能力就是两种这样的分析。这些细胞因子的诱导依赖于CD14+CD16+单核细胞，因此这些方法提供了确定目的为降低外周血中这些细胞的促炎活性的治疗的有效性的手段。为建立循环单核细胞的生物学和其从血液迁移到组织中的模型，在体外利用已建立的细胞培养技术联合使用聚碳酸酯滤器分析(transwell分析)对这种迁移进行研究是本领域的标准技术。将原代内皮细胞源(例如，HUVEC)接种在聚碳酸酯滤器(支持基质)上进行培养直到其形成汇合的单细胞层。像这样，这种方法模拟了血管维管结构的内皮。 从人类血液中分离感兴趣的输入细胞(白细胞)，并然后将其施加到transwell装置的上部室中。孵育阶段之后，除去transwell插入物并从下部室中收集迁移的细胞以进行分析。 可使用流式细胞术分析计算迁移细胞的百分比并按照细胞表面蛋白标记物确定它们的分化表型。跨越诸如HUVEC的内皮障碍的白细胞的体外迁移可足以引发细胞分化。在白细胞中，已证明单核细胞穿越内皮细胞单细胞层的迁移足以诱导它们分化成巨噬细胞或不成熟的树突细胞。将在Medium 200 (Cascade Biologies)中培养的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC ； BD Biosciences)接种在含有预覆盖纤连蛋白的微孔聚碳酸酯膜(孔径5μπι)的transwell 装置(Corning)的上部室中。将多孔膜顶部的HUVEC内皮细胞培养至汇合(由相差光学显微镜所确定)并对其紧密缝隙连接的形成和随之生理学屏障的形成(由被动染色扩散所确定)进行分析。将不同种类的输入细胞加到上部室中。输入细胞可以是通过红细胞的简单裂解从正常外周血中分离的全白细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和嗜中性粒细胞)；或利用Histopaque-1077通过单一步骤密度离心分离的外周血单核细胞(PBMC ；淋巴细胞和单核细胞)；或仅为单核细胞，利用46% Percoll通过第二步密度离心分离，或可选地按照本领域(MiltenyiBiotec)通过免疫磁珠消除非单核细胞而分离。简言之，在单核细胞的情况下，将PBMC以1.0X IO6个细胞接种在transwell装置的上部室中的HUVEC单细胞层上，并在37°C下在标准CO2孵育箱中使之结合1-2小时。未结合的PBMC通过PBS温和洗涤而除去。使剩余的细胞迁移2-3天，然后移除transwell上部室(含有HUVEC单细胞层和未迁移的细胞)，并收集下部室中的迁移细胞以进行分析。通过离心沉淀细胞，并且此时可用单克隆抗体对细胞染色以确定细胞表型和亚型(例如，CD14+CD16+单核细胞/巨噬细胞对比⑶19+B淋巴细胞)。在含2%热灭活的胎牛血清的500 μ 1 PBS中重悬细胞，并利用 FACSCalibur流式细胞仪进行分析。除表型分析外，流式细胞术可通过在高流速下收集1分钟的来自每种样品的数据来确定迁移细胞的数量，表示为接种到HUVEC单细胞层上的输入 PBMC数量的百分比。这种方法的改变形式包括用Χ92抗IL-I α Ab与输入细胞预孵育以确定 Χ92抗IL-I α Ab对膜上的IL-I α白细胞迁移的潜在中和作用。膜相关IL_1 α阳性的白细胞将预期与其余的HUVEC细胞上表达的IL-IRl受体连接。根据实验，在单独用IL-I α刺激或用Χ92 Ab与IL-I α预孵育后，利用非酶促试剂(例如，EDTA或Cellstripper [Cellgro]) 可将黏附的HUVEC从培养孔除去，用PBS洗涤，然后通过流式细胞术分析⑶54、⑶62Ε和 ⑶106黏着分子的表达。还可将诸如单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-I)的趋化因子加入到transwell装置的下部室以研究在X92Ab存在或不存在下白细胞的自发迁移和趋化迁移。人类受试者本发明的方法可在任何适宜的人类受试者中进行。然而优选地，受试者是患有与 CD14+CD16+单核细胞的异常水平或功能相关的病症的个体。这样的受试者的例子包括患有与CD14+CD16+单核细胞的异常功能或水平相关的病状的那些，所述病状比如炎性病症、自身免疫性病症、癌症(例如，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病、肺癌、子宫内膜癌或肝癌)、动脉粥样硬化、关节炎(例如，骨关节炎或类风湿性关节炎)、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克罗恩氏病(Crohn' s disease))、外周血管病、脑血管意外(中风)、其中出现慢性炎症的病状、以单核细胞/巨噬细胞浸润的损害为特征的病状、在脑中存在淀粉样蛋白斑的病状(例如，阿耳茨海默氏病)、骨质疏松症、肌萎缩性侧索硬化症或多发性硬化症。
实施例实施例1-流式细胞术实验方法在无菌条件下从健康供体中收集全血。在裂解缓冲液(150mM醋酸铵，0. ImM EDTA)中将2. 5ml的全血稀释10倍。将细胞在缓冲液中置于冰上10分钟，然后在1000G下离心5分钟。在冰冷的FACS缓冲液(通过0. 2 μ m滤器过滤的含1 %奶粉的PBS)中重悬细胞。在FACS缓冲液中洗涤细胞两次。沉淀的细胞在2. 8ml的FACS缓冲液中重悬，用血细胞计数器计数，并按照以下的流程在暗光下加入荧光标记的抗体l)PerCP-Cy5. 5 轭合的抗 CD 14 (eBioscience 亲和纯化的，小鼠抗人类 IgG，κ， no.45-109)2)PE 轭合的抗 CD 16 (eBioscience 亲和纯化的，小鼠抗人类 IgGl, no. 12-0168)3)FITC轭合的抗IL-la(eBioscience 亲和纯化的，小鼠IgGl，抗人类IL-Ia No.11-718)4)FITC 轭合的抗 KLH(eBioscience 亲和纯化的，小鼠 IgGl, κ，no. 11-4714)5)抗 CD 14，抗 CD 166)抗 CD 14，抗 CD 16，抗 IL-Ia7)抗 CD 14，抗 CD 16，抗 IL-la，抗 KLH将在400 μ 1 FACS缓冲液中悬浮的细胞(约1.5Χ IO6个细胞)转移到1.5ml 印pendorf管中并避光放置在冰上。加入抗体(50μ1)并与细胞反应45分钟。然后将细胞进行1000G 5分钟的离心并在1. 5mL的FACS缓冲液中重悬，重复三次从而对细胞进行洗涤，将细胞置于冰上直至用BD FACS分析仪进行分析。结果用抗⑶14和抗⑶16对全外周血细胞(WPBC)染色以鉴定单核细胞的小亚群。利用流式细胞术使用FITC标记的抗IL-I α的特异性单克隆抗体进一步分析 ⑶14+⑶16+WPBC的白细胞介素-Ia的表达。引人注意地，三色FACS分析揭示了几乎所有 IL-I α +染色都实际上与⑶14+⑶16+群体相关。因此，确定血液中的⑶14+⑶16+细胞和细胞的IL-I α +群体在很大程度上是相同的群体。实施例2-细胞相关ILlA的中和ΜΑΒΡ1阻碍E-选择蛋白在ILl-刺激的HUVEC细胞中的表达MABpl能够抑制内皮细胞表面上细胞黏着分子的诱导表达。利用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)作为模型系统已观察到MABPl介导的两种关键黏着分子，CM4 (ICAM-I)和 ⑶62Ε(Ε-选择蛋白)的抑制。当HUVEC不是被可溶的重组人类ILl α刺激而是被通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在工程改造的DG44CH0细胞(GPI-IL1A细胞)上的膜ILl α刺激时， MABpl的效应是最显著的。在代表性的实验中，在单独的Μ-200培养基中，或是存在10 μ g/ mL MABPl的M-200培养基中，或是存在10 μ g/mL D5人类IgGl同种型对照抗体的M-200培养基中，将6孔板中的HUVEC细胞的汇合培养物与5 X IO6个GPI-ILlA DG44细胞共培养过夜。17-20小时后，用Dulbecco PBS彻底洗涤HUVEC单细胞层，且然后通过用CellMripper试剂(Cellgro Mediatech)进行20分钟的非酶促处理使其离壁。利用标准流式细胞术方案立即分析细胞的⑶62E(E_选择蛋白)表达。染色缓冲液包含含有2%热灭活胎牛血清的 Dulbecco PBS0利用PE轭合的小鼠抗人类CD62E单克隆抗体(eBioscience，克隆P2H3)或 PE轭合的小鼠IgGlk同种型对照(eBioscience，克隆P3)按照生产商的说明在室温下在黑暗中以100微升的染色体积对HUVEC细胞进行20分钟的染色。随后在染色缓冲液中进行两次洗涤，然后在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上获得样品。在η = 3的实验中，通过MABPl将HUVEC细胞表面上由膜GPI-ILlA诱导的E-选择蛋白的上调中和至基线水平，基线水平由未受刺激的HUVEC细胞呈现。其他实施方案应理解的是，尽管已结合其详述描述了本发明，前面的描述旨在例证而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围所限定。其他的方面、优点和更改形式在以下权利要求书的范围之内。
权利要求
1.一种方法，该方法包括以下步骤(a)向人类受试者施用调节IL-Iα的功能或表达的剂；和(b)确定这种施用是否调节受试者中CD14+CD16+单核细胞的量或功能。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述调节IL-Iα的功能或表达的剂是干扰IL-I α 结合IL-I α受体的剂。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述剂是与IL-Ia特异性结合的抗体。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体是与IL-Ia特异性结合的单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述单克隆抗体是人类抗体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述人类抗体是IgGl。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述人类抗体具有含有SEQID NO :3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的轻链。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述人类受试者具有与CD14+CD16+单核细胞的异常功能或水平相关的病状。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述病状是炎性病症。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述病状是自身免疫性病症。
11.如权利要求1所述的方法，其中在所述剂施用前所述人类受试者的外周血白细胞的至少1.5%是CD14+CD16+单核细胞，且在所述剂施用后所述人类受试者的外周血白细胞的低于1. 5%是⑶14+⑶16+单核细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述剂的施用导致全血分类计数中CD14+CD16+单核细胞百分比至少10%的降低。
13.如权利要求1所述的方法，其中确定这种施用是否调节所述受试者中CD14+CD16+ 单核细胞的量或功能的所述步骤包括在所述剂施用前和施用后评估所述受试者的 ⑶14+⑶16+单核细胞的功能。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述剂的施用导致CD14+CD16+单核细胞的功能至少10%的降低。
15.一种方法，该方法包括以下步骤(a)确定患有疾病或病理性疾患的人类受试者具有促成所述疾病或病理性疾患的 CD14+/CD16+单核细胞；(b)向所述人类受试者施用调节IL-Iα功能或表达的剂；和(c)确定这种施用是否调节所述受试者中CD14+CD16+单核细胞的量。
16.与IL-Iα特异性结合的抗体用于制备调节受试者中CD14+CD16+单核细胞的量或功能的药物的应用。
全文摘要
本发明基于白细胞介素-1α(IL-1α)在促炎性CD14+CD16+单核细胞亚群上表达的发现。重要地，由于IL-1α表现为几乎仅在这种单核细胞亚群而不在其他白细胞上表达，IL-1α代表着靶向CD14+CD16+单核细胞亚群的理想标记。消除这种病原性细胞或在这种细胞类型中调节IL-1α的功能的剂的有效性可通过评估CD14+CD16+单核细胞的水平或功能性来进行监测。
文档编号A61K39/395GK102209557SQ200980144618
公开日2011年10月5日 申请日期2009年9月14日 优先权日2008年9月12日
发明者J·西马德 申请人:埃克斯生物科技公司