专利名称：含有特异性识别cd38的抗体和环磷酰胺的抗肿瘤组合的制作方法
含有特异性识别CD38的抗体和环磷酰胺的抗肿瘤组合本发明涉及在瘤形成疾病的治疗中在治疗上有用的针对CD38的单克隆抗体和商品名为Cytoxan(或Neosar)的环磷酰胺的组合。⑶38是一种45kD的II型跨膜糖蛋白，具有长的C端胞外结构域和短的N端胞质结构域。⑶38蛋白是一种双功能胞外酶，能催化NAD+转变成环ADP-核糖(cADPR)而且还将CADI3R水解成ADP-核糖。⑶38在许多造血恶性肿瘤中上调且与这些疾病有牵连。特异性识别CD38 的单克隆抗体 38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31 和 38SB39 记载于PCT申请W02008/047M2。所述抗⑶38抗体能够通过三种不同细胞毒性机制来杀死CD38+细胞，即诱导凋亡、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、和补体依赖性细胞毒性(⑶C)。另外，这些抗体能够直接诱导⑶38+细胞凋亡，甚至在没有基质细胞或基质衍生细胞因子存在的情况下。环磷酰胺是一种在化疗中使用的烷化剂。仍然需要新的且有效的能在癌症治疗中使用的药物。现在发现及对于本发明，人源化抗CD38抗体的功效在其与至少一种在抗癌治疗中在治疗上有用的物质组合施用时可得到相当大地改善，所述物质具有与人源化抗CD38 抗体之一相同或不同的机制且在本发明中限定为环磷酰胺。术语“抗体”在本文中以最广义使用，而且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)(任何同种型的，诸如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、和抗体片段。典型的IgG抗体由通过二硫键相连接的两条相同的重链和两条相同的轻链构成。每条重和轻链含有一个恒定区和一个可变区。每个可变区含有三个称作“互补决定区”(CDR)或“高变区”的区段，它们主要负责对抗原的表位的结合。自N端起序贯编号， 它们通常称作⑶R1、⑶R2、和⑶R3。可变区中⑶R以外较高度保守的部分称作“构架区”。如本文中使用的，“VH”或“VH”指抗体的免疫球蛋白重链，包括FV、SCFV、dSFV、Fab、 Fab'或F(ab' )2片段的重链的可变区。提到或“VL”指抗体的免疫球蛋白轻链，包 Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab'或F(ab' )2片段的轻链的可变区。38SB13抗体包含至少一条具有由SEQ ID NO 50组成的氨基酸序列的重链和至少一条具有由SEQ ID NO :38组成的氨基酸序列的轻链，所述重链包含三个序贯具有由SEQ ID NO :1，2和3组成的氨基酸序列的⑶R且所述轻链包含三个序贯具有由SEQ ID NO :4，5和 6组成的氨基酸序列的CDR。38SB18抗体包含至少一条具有由SEQ ID NO 52组成的氨基酸序列的重链和至少一条具有由SEQ ID NO :40组成的氨基酸序列的轻链，所述重链包含三个序贯具有由SEQ ID NO :7，8和9组成的氨基酸序列的⑶R且所述轻链包含三个序贯具有由SEQ ID N0:10,11 和12组成的氨基酸序列的⑶R。38SB19抗体包含至少一条具有由SEQ ID NO 54组成的氨基酸序列的重链和至少一条具有由SEQ ID NO :42组成的氨基酸序列的轻链，所述重链包含三个序贯具有由SEQ ID NO 13,14和15组成的氨基酸序列的⑶R且所述轻链包含三个序贯具有由SEQ ID NO :16， 17和18组成的氨基酸序列的⑶R。38SB30抗体包含至少一条具有由SEQ ID NO 56组成的氨基酸序列的重链和至少一条具有由SEQ ID NO :44组成的氨基酸序列的轻链，所述重链包含三个序贯具有由SEQ ID NO 19，20和21组成的氨基酸序列的⑶R且所述轻链包含三个序贯具有由SEQ ID NO :22， 23和M组成的氨基酸序列的⑶R。38SB31抗体包含至少一条具有由SEQ ID NO 58组成的氨基酸序列的重链和至少一条具有由SEQ ID NO :46组成的氨基酸序列的轻链，所述重链包含三个序贯具有由SEQ ID NO 25, 26和27组成的氨基酸序列的⑶R且所述轻链包含三个序贯具有由SEQ ID NO 28, 29和30组成的氨基酸序列的⑶R。38SB39抗体包含至少一条具有由SEQ ID NO 60组成的氨基酸序列的重链和至少一条具有由SEQ ID NO :48组成的氨基酸序列的轻链，所述重链包含三个序贯具有由SEQ ID NO 31,32和33组成的氨基酸序列的⑶R且所述轻链包含三个序贯具有由SEQ ID NO :34， 35和36组成的氨基酸序列的⑶R。生成38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31、和 38SB39 鼠抗 CD38 抗体的杂交瘤细胞系已经于2006年6月21日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, 10801University Bid, Manassas, VA, 20110-2209，USA)，保藏号分别为 PTA-7667、PTA-7669、PTA-7670、PTA-7666、PTA-7668、和 PTA-7671 (如 W02008/047242 中记载的)。本文使用的术语“人源化抗体”指最低限度含有来源于非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。人源化的目的是降低要导入人中的异种抗体诸如鼠抗体的免疫原性，同时维持抗体的完全的抗原结合亲和力和特异性。人源化的抗体或适合于不受其它哺乳动物排斥的抗体可使用数种技术诸如表面重塑(resurfacing)和⑶R移植(grafting)来产生。如本文中使用的，表面重塑技术组合使用分子模拟、统计分析和诱变来改变抗体可变区的非CDR 表面以类似目标宿主的已知抗体的表面。CDR移植技术涉及将互补决定区(例如小鼠抗体的)替代入人构架域中，例如参见WO 92/22653。人源化嵌合抗体优选如下的情况，恒定区和互补决定区(CDR)以外的可变区基本上或唯独地来源于相应的人抗体区，而CDR基本上或唯独地来源于人以外的哺乳动物。用于抗体表面重塑的策略和方法及其它用于降低抗体在不同宿主内的免疫原性的方法披露于美国专利5，639，641，其整体通过引用结合到本文中。抗体可使用多种其它技术来人源化，包括CDR移植(EP 0 239 400 ；WO 91/09967 ；美国专利号5，530，101 ；和 5，585，089)、镶饰(veneering)或表面重塑(EP 0 592 106 ；EP 0 519 596 ；Padlan Ε. A.， 1991, Molecular Immunology 28(4/5) :489-498 ；Studnicka G.Μ. φ,1994, Protein Engineering, 7 (6) :805-814 ；Roguska Μ. Α.等，1994，PNAS，91 :969-973)、链改组(美国专利号5，565，332)、和鉴定柔性残基(PCT/US2008/074381)。人抗体可通过多种本领域已知方法来准备，包括噬菌体展示法。还可参见美国专利号4，444，887 ；4, 716，111 ；5, 545，806 ； 和 5，814，318 ；及国际专利申请公开号 WO 98/46645 ；WO 98/50433 ；WO 98/24893 ；WO 98/16654 ；WO 96/34096 ；WO 96/33735 ；和 WO 91/10741 (其整体通过引用结合到本文中)。本发明的药物组合的抗⑶38抗体是识别⑶38并通过凋亡、ADCCdP⑶C来杀死 CD38+细胞的人源化抗体。在又一个实施方案中，本发明的人源化抗体能够通过凋亡来杀死所述CD38+细胞，甚至在基质细胞或基质衍生的细胞因子缺失的情况下。此类人源化抗体的一个优选实施方案是人源化的38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31、或38SB39抗体或其表位结合片段。38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31、和 38SB39 抗体的 CDR 通过模拟得到了鉴定，而且它们的分子结构已被预测。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个如下⑶R的人源化抗体或其表位结合片段，所述⑶R具有选自SEQ ID N0:l，2，3，4，5， 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32， 33，34，35和36的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，提供了 38SB13的人源化形式，其包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个序贯具有SEQ ID N0:l，2和3 所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID N0:4，5和6所示氨基酸序列的互补决定区。在另一个优选实施方案中，提供了 38SB18的人源化形式，其包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个序贯具有SEQ ID NO :7，8和9 所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID N0:10，ll和12 所示氨基酸序列的互补决定区。在另一个优选实施方案中，提供了 38SB19的人源化形式， 其包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个序贯具有SEQ ID NO 13,14 和15所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID NO 16,17 和18所示氨基酸序列的互补决定区。在另一个优选实施方案中，提供了 38SB30的人源化形式，其包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个序贯具有SEQ ID NO 19，20和21所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID NO 22，23和M所示氨基酸序列的互补决定区。在另一个优选实施方案中，提供了 38SB31的人源化形式，其包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个序贯具有SEQ ID NO :25,26和27所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID NO :28,29和30所示氨基酸序列的互补决定区。在另一个优选实施方案中，提供了 38SB39 的人源化形式，其包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个序贯具有SEQ ID NO :31,32和33所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID NO 34,35和36所示氨基酸序列的互补决定区。在一个实施方案中，本发明提供了如下的人源化抗体或其片段，其包含具有选自 SEQ ID N0:66和72的氨基酸序列的VH。在一个优选实施方案中，提供了如下的人源化 38SB19抗体，其包含具有SEQ ID NO :66所示氨基酸序列的VH。在另一个优选实施方案中， 提供了如下的人源化38SB31抗体，其包含具有SEQ ID NO :72所示氨基酸序列的VH。在另一个实施方案中，本发明提供了如下的人源化抗体或其片段，其包含具有选自SEQ ID NO :62，64，68和70的氨基酸序列的Vl。在一个优选实施方案中，提供了如下的人源化38SB19抗体，其包含具有选自SEQ ID NO :62和64的氨基酸序列的Vl。在另一个优选实施方案中，提供了如下的人源化38SB31抗体，其包含具有选自SEQ ID NO :68和70的氨基酸序列的八。38SB13、38SB18、38SB19、38SB30、38SB31、和 38SB39 抗体的人源化形式均显示出作为抗癌剂是特别有利的。它们的制备、物理特性和有益药理特性记载于WO 2008/047242, 其整体通过引用结合到本文中。一般地，用于治疗人类的剂量(它取决于随所治疗的受试者而变化的因素)介于口服施用的1和150mg/kg之间或介于静脉内施用的1和150mg/kg 之间。环磷酰胺(Cytoxan )是一种用于治疗多种癌症的氮芥烷化剂。它是一种前药，在肝中被转变成具有化疗活性的活性形式。作为烷化剂，环磷酰胺阻止细胞分裂，主要是通过使DNA链交联，最终导致细胞死亡。环磷酰胺可以口服和胃肠外配制剂得到。本发明的一个方面是一种药物组合物，其包含抗⑶38抗体与至少环磷酰胺的组合。由于药物的活性取决于使用的剂量，因此有可能使用较低的剂量及提高活性同时降低毒性现象。依照本发明的组合的改善的功效可通过测定治疗协同来证明。如果一种组合在治疗上优于以其最大耐受剂量或在动物物种中不会出现毒性的情况中以其最高测试剂量单独使用所研究的最好药剂，那么它表现出治疗协同。此功效可例如通过Io^1细胞杀伤来定量，它是依照下面的公式确定的Iog10 细胞杀伤=T-C (天)/3. 32x Td其中T-C代表肿瘤生长延迟，它是以天计的处理组的肿瘤(T)和对照组的肿瘤 (C)达到预定值(例如Ig)的中值时间，而Td代表以天计的对照动物中肿瘤体积加倍所需要的时间[τ. H. Corbett 等，Cancer, 40 :2660-2680(1977) ；F. M. Schabel 等，Cancer Drug Development,Part B,Methods in Cancer Research, 17 :3-51,New York,Academic Press Inc. (1979)]。如果Iogltl细胞杀伤大于或等于0. 7，那么认为药物是有活性的。如果Ic^ltl 细胞杀伤大于或等于2. 8，那么认为药物是活性很高的。在一些情况中，当处理持续时间超过10天且在组合中所评估的两种化合物间不同时，计算log净细胞杀伤Log10净细胞杀伤=(T-C)-处理持续时间/3. 32x Td。当log净细胞杀伤大于或等于O时，宣告有活性。当Iogltl细胞杀伤大于以其最大耐受剂量或以其最高测试剂量单独施用的最好组分的Iogltl细胞杀伤值时，组合会表现出治疗协同。组合对实体瘤的功效可以下面的方式通过实验来测定在第O天给进行实验的动物(一般是小鼠)皮下双侧移植30至60mg肿瘤碎块。 荷瘤动物基于它们的肿瘤大小来随机化，之后进行各种处理和对照。当肿瘤在移植后达到预定大小时开始化疗，这取决于肿瘤的类型，并每天观察动物。处理期间每天对不同动物组称重，直至达到最大重量减轻及随后发生完全重量恢复。然后每周一次或两次对各组称重， 直至试验结束。测量肿瘤一周1至5次，这取决于肿瘤加倍时间，直至肿瘤达到大约2g，或直至动物死亡(如果这发生在肿瘤达到2g之前)。安乐死或死亡后立即对动物尸检。抗肿瘤活性依照记录的不同参数来测定。以它们的最佳剂量用hu38SB19和环磷酰胺的组合获得的结果示于下文作为例子。因此，本发明还涉及含有依照本发明的组合的药物组合物。组合所包含的组分可同时地、半同时地、分开地、或间隔一段时间地施用以获得组合的最大功效；每次施用的持续时间有可能自快速施用至持续灌注而变化。因此，为了本发明的目的，组合并非唯独地限于通过各组分的物理联合获得的组合，而是还包括容许分开施用(其可以是同时的或间隔一段时间的)的组合。依照本发明的组合物优选是能胃肠外施用的组合物。然而，这些组合物在局限区域疗法(localized regional therapy)的情况中可口服、皮下或腹膜内施用。
用于胃肠外施用的组合物一般是药学可接受的、无菌的溶液或悬浮液，其可任选在使用时根据需要来制备。对于制备非水溶液剂或混悬剂，可使用天然植物油诸如橄榄油、 芝麻油或液体石油(liquid petroleum)或可注射有机酯诸如油酸乙酯。无菌的水溶液可以由产品在水中的溶液组成。水溶液剂适合于静脉内施用，前提是恰当调节PH及使溶液等张，例如用足够量的氯化钠或葡萄糖。灭菌可通过加热或通过任何其它对组合物没有不利影响的手段来进行。组合也可采取脂质体的形式或与载体像环糊精或聚乙二醇联合的形式。 用于口服、皮下或腹膜内施用的组合物优选是水混悬剂或溶液剂。在依照本发明的组合中，其各组份的施用可以是同时的、分开的或间隔一段时间的，尤其有利的是人源化抗CD38抗体的量占组合的10至90% (以重量计)，此含量有可能依照有关物质的性质、寻求的功效和要治疗的癌症的性质而变化。依照本发明的组合在数种类型的癌症的治疗中尤其有用，包括(但不限于)下述 癌(carcinoma)和腺癌(adenocarcinoma)，包括膀胱、乳房/乳腺、结肠、头和颈、前列腺、 肾、肝、肺、卵巢、胰、胃、宫颈、甲状腺和皮肤的，而且包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括多发性骨髓瘤、白血病、急性和慢性淋巴细胞性(或淋巴样)白血病、急性和慢性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非何杰金(Hodgkin)淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤)；髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性髓性(髓样或髓细胞性)白血病、 和前髓细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤、和施旺细胞瘤(schwannoma)； 和其它肿瘤，包括黑素瘤、畸胎瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、和精原细胞瘤，和其它表达 CD38的有待确定的癌症。它们主要对于治疗对常用抗癌剂有抗性的白血病、淋巴瘤和癌症有用，因为本发明的抗CD38抗体具有独特的作用机制。因此，本发明还涵盖上述组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
实施例在此实施例中，在体内证明了本发明的抗⑶38抗体/环磷酰胺组合用于肿瘤生长抑制的有效性。所选择的肿瘤模型是在SCID小鼠中植入的可移植人伯基特(Budkitt)氏淋巴瘤细胞系，即Namalwa模型。HU38SB19在含5%葡萄糖的水中配制。Hu38SB19，作为单一药剂，静脉内施用，一周两次，介于肿瘤植入后第11天和第18天之间。在组合分支中，hu38SB19处理进行至第 35天(组合的最高剂量除外，该处理在第18天出现毒性时停止)。环磷酰胺在含5%葡萄糖的水中配制。环磷酰胺在肿瘤植入后第11天和第15天静脉内施用，一天一次。实验的结果报告于表1。肿瘤加倍时间=1.9天。使用了下面的终点 在诱导彡20%体重减轻或彡10%药物死亡的剂量宣告毒性， 抗肿瘤活性通过计数Iogltl总细胞杀伤=(T-C)/[3. 32x(以天计的肿瘤加倍时间)]来测定(T表示处理小鼠达到IOOOmg的中值时间而C表示对照小鼠达到相同大小的中值时间(15. 7天)；无肿瘤存活者排除在这些计算之外且分开制表)。log总细胞杀伤 < 0. 7宣告无抗肿瘤活性，而log细胞杀伤> 2. 8的处理宣告高度有活性。 无肿瘤存活者(TFS)对应于整个研究持续时间( >最后一次处理后100天)触诊极限(6;3mg)以下的完全消退。 治疗协同如果组合比研究的最好单一药剂更有活性(相差至少1个log细胞杀伤)，那么它具有治疗协同。在观6. lmg/kg/注射的剂量观察到环磷酰胺单独的毒性，5只小鼠中有3例死亡(60% )。因此，环磷酰胺的最高无毒剂量(HNTD)是177. 4mg/kg/注射(总注射剂量= 354. 8mg/kg)。发现177. 4mg/kg/注射剂量高度有活性，log总细胞杀伤为4. 8。关于hu38SB19，产品在40mg/kg/注射的剂量(总剂量120. Omg/kg)得到较好的耐受。没有观察到毒性，这可以通过抗体与鼠CD38没有交叉反应性来解释。log细胞杀伤为 0. 4，指示hu38DB19在这些条件下无活性。286. lmg/kg/注射的环磷酰胺和40mg/kg/注射的hu38SB19的组合是有毒的，6只动物中有3例药物相关死亡(50% )，即与环磷酰胺单独在相同剂量观察到的非常相似。认为177. 4mg/kg/注射的环磷酰胺与40mg/kg/注射的hu38SB19的剂量为HNTD。此剂量展现出20.0的log细胞杀伤和1/6TFS(第196天)，并因此认为是高度有活性的。甚至更低剂量的110. 0mg/kg/注射和68. 2mg/kg/注射的环磷酰胺与40mg/kg/注射的hu38SB19是高度有活性的，log总细胞杀伤分别为15. 7和6. 9。值得注意的是，组合在评估的所有三种剂量水平的抗肿瘤活性比对最好药剂即环磷酰胺(HNTD的log细胞杀伤为4. 8)观察到的大超过一个log细胞杀伤。我们得出结论，此组合显示治疗协同。使用考虑了处理持续时间的log细胞杀伤净值，此治疗协同也得到了清楚地确立(组合的161og净细胞杀伤对比于单独的环磷酰胺的41og净细胞杀伤)。表I :hu38SB19和环磷酰胺(CPA)的组合针对在SCID雌性小鼠中植入的晚期人伯基特氏淋巴瘤Namalwa。
权利要求
1.一种包含特异性识别⑶38的抗体和至少环磷酰胺的药物组合，其中所述抗体能够通过凋亡、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、和补体依赖性细胞毒性(⑶C)来杀死 ⑶38+细胞。
2.权利要求1的组合，其中所述抗体是人源化的抗体。
3.权利要求2的组合，其中所述抗体包含一个或多个具有选自SEQID NO :1，2，3，4，5， 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35和36的氨基酸序列的互补决定区。
4.权利要求3的组合，其中所述抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链具有SEQ ID NO :66所示氨基酸序列且所述重链包含三个序贯具有SEQ ID N0:13，14和 15所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链具有选自SEQ ID NO :62和64的氨基酸序列且所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID NO :16，17和18所示氨基酸序列的互补决定区。
5.权利要求3的组合，其中所述抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链具有SEQ ID NO -J2所示氨基酸序列且所述重链包含三个序贯具有SEQ ID NO 25,26和 27所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链具有选自SEQ ID NO :68和70的氨基酸序列且所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID而28，四和30所示氨基酸序列的互补决定区。
6.特异性识别CD38的抗体在制备用于制备治疗癌症的药物的依照权利要求1的药物组合中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述抗体是人源化的抗体。
8.权利要求7的用途，其中所述抗体包含一个或多个具有选自SEQID NO :1，2，3，4，5， 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35和36的氨基酸序列的互补决定区。
9.权利要求8的用途，其中所述抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链具有SEQ ID NO :66所示氨基酸序列且所述重链包含三个序贯具有SEQ ID N0:13，14和 15所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链具有选自SEQ ID NO :62和64的氨基酸序列且所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID NO :16，17和18所示氨基酸序列的互补决定区。
10.权利要求8的用途，其中所述抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链具有SEQ ID NO :72所示氨基酸序列且所述重链包含三个序贯具有SEQ ID N0:25，26和 27所示氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链具有选自SEQ ID NO 68和70的氨基酸序列且所述轻链包含三个序贯具有SEQ ID而28，四和30所示氨基酸序列的互补决定区。
全文摘要
包含特异性识别CD38的抗体和环磷酰胺的药物组合物。
文档编号A61K39/00GK102264387SQ200980149083
公开日2011年11月30日 申请日期2009年11月27日 优先权日2008年11月28日
发明者P·勒热纳, P·弗里尼奥 申请人:赛诺菲