专利名称：利用华西小石积治疗和预防糖尿病并发症的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及华西小石积(Osteomeles schwerinae)提取物及其系统性级分 (fractions)，其可用作预防和治疗糖尿病并发症的药物组合物以及用于功能性保健食品。
背景技术：
糖尿病是重要的成人疾病之一，在世界范围内引起了我们的关注。最近，韩国的糖尿病患病率达到了 10%，并且随着经济的快速增长还在不断增加。全世界的糖尿病人数量超过了 240，000，000并预期在2025年达到380，000，000。据2009年美国JAMA预测，亚洲将报告预期糖尿病患者总数的60%。目前，糖尿病的发病时间有越来越早的趋势，似乎大都为中年群体。由于寿命的延长，因此很难避免并发症。例如，糖尿病发病10 20年后，几乎每个人体器官都会被损害从而引起糖尿病视网膜病、糖尿病白内障、糖尿病肾病、糖尿病神经病变、心脏病、癌症以及骨质疏松等。慢性糖尿病肾病需要血液透析，并且可能成为晚期肾病的一个重要原因。糖尿病白内障和糖尿病视网膜病引起失明甚至导致死亡。在美国， 25 74岁年龄组失明的主要原因就是糖尿病。例如，60%的糖尿病患者在发病后的15 20年间丧失视力。因此，只要并发症的出现可以被延后5 10年，糖尿病患者及其家庭的生活质量将完全不同，也影响着国家预算本身。引起糖尿病并发症的机制可通过蛋白质非酶糖基化、多元醇途径以及氧化应激等来解释。蛋白质非酶糖基化指的是还原糖和蛋白质的氨基酸基团如赖氨酸残基的缩合反应，其为Maillad反应，不需要酶的介导。此反应的结果是，生成了晚期糖基化终产物 (AGEs)。蛋白质非酶糖基化更加详细地解释为(1)蛋白质的氨基酸基团如赖氨酸残基与还原糖的醛或酮在非酶活性下反应，为亲核加成，生成早期产物席夫碱(schiff kise)，然后靠近席夫碱的酮胺加成物相互通过缩合反应产生可逆的Amadori型早期糖基化产物；以及(2)当高血糖状况比较久时，可逆的Amadori型早期糖基化产物没有进行降解，并且只进行重排产生了不可逆的晚期糖基化终产物。产生的不可逆晚期糖基化终产物与蛋白或脂质偶联或交联，导致不可逆的糖蛋白或糖脂质的生成。与可逆的Amadori型早期糖基化产物不同的是，不可逆的晚期糖基化终产物一旦生成便不发生降解，甚至当血糖水平恢复到正常时也不降解，并且只要存在与晚期糖基化终产物偶联的蛋白质或脂质，其就在组织中积聚，从而导致组织的结构和功能发生异常变化引起并发症(Vinson, J. Α.等，1996，营养生物化学杂志(J. Nutritional Biochemistry) 7 :559-663 ；Smith, P. R.等，1992，Eur. J. Biochem.，210 :729-739)。例如，糖化白蛋白，其为通过葡萄糖和多种蛋白之间反应生成的晚期糖基化终产物中的一种，是慢性糖尿病肾病的一个主要原因。糖化白蛋白比正常白蛋白更容易插入肾小球细胞(glomerular cells)中。高浓度葡萄糖刺激了肾小球系膜细胞(mesangium cells)从而增加了细胞外基质的合成。由于过多的糖化白蛋白引入其中以及增多的细胞外基质，诱发了肾小球纤维化。通过这种机制，肾小球不断损伤，最终需要诸如血液透析或器官移植的特别治疗。当慢性糖尿病持续时，胶原蛋白与晚期糖基化终产物在动脉壁中偶联，并且基膜蛋白也与晚期糖基化终产物在肾小球中偶联，其都在组织中积聚(Brownlee， Μ.等，1986，科学(Sciences)，232，1629-1632)。这种蛋白质非酶糖基化可诱发基膜、血浆白蛋白、晶状体蛋白(lens protein)、纤维蛋白以及胶原蛋白的糖基化，并且由此产生的晚期糖基化终产物引起组织结构和功能的异常变化，导致慢性糖尿病并发症如糖尿病视网膜病、糖尿病白内障、糖尿病肾病及糖尿病神经病变。在高血糖情况下，当产生晚期糖基化终产物时，诱发脂质代谢紊乱，与此同时对抗有毒氧自由基的防御系统变弱而引起氧化应激(Yokozawa，Τ.等，2001，J. of Trad. Med.， 18 :107-112)。因此，蛋白质非酶糖基化与氧化应激机制的关系非常密切。多元醇途径的过程包括以下几个步骤(1)醛糖或酮糖通过醛糖还原酶(AR)还原生成山梨醇；以及O)山梨醇通过脱氢酶氧化产生果糖。在正常情况下，醛糖还原酶对葡萄糖的亲和力非常低。但在高血糖情况下，多元醇途径的第一个酶醛糖还原酶被过度激活，因此过多的血糖转化成了山梨醇和果糖，其在组织中积聚破坏了渗透压平衡，导致并发症。也就是说，增加的渗透压阻止了水分，导致了糖尿病视网膜病、糖尿病白内障以及糖尿病神经病变(糖尿病(Diabetes), Kim 等，韩国糖尿病协会(Korean Diabetes Association)，韩国医学出版社(Korea Medical Book Publisher),483 ；Soulis-Liparota,Τ.等，1995，糖尿病学(Diabetologia)，38 :357-394)。据报道，晚期糖基化终产物能激活人体微血管内皮细胞中多元醇途径的主要
酶--酸糖还原酶(AR) (Nakamura, N.等，2000，Free Radic Biol. Med. ,29 :17-25)。此时，
果糖的非酶糖基化速度约为葡萄糖的10倍。因此，当高浓度的果糖与蛋白质进行偶联时， 加速了晚期糖基化终产物的生成。蛋白质非酶糖基化、多元醇途径以及氧化应激的机制均与引起糖尿病并发症有关。因此，对于延缓、预防或治疗糖尿病并发症来说，抑制晚期糖基化终产物的生成是非常重要的(Brownlee, Μ.等，1988，N. Engl. Med.，318，1315-1321)。合成的蛋白糖基化抑制剂氨基胍为亲核性联氨，其与Amadori产物偶联来阻碍蛋白质的交联，结果抑制晚期糖基化终产物的生成，由此可以延缓或预防糖尿病并发症的发展(Brownlee, M.等，1986，科学(Sciences), 232,1629-1632 ；Edelstein, D.等，1992，糖尿病(Diabetes)，41，26- )。因此，氨基胍被认为是很有前景的预防和治疗糖尿病并发症的合成药物，并且已完成了三期临床试验。然而，由于在长期用药期间观察到的毒性，氨基胍的临床试验已经停止。因此，迫切需要开发一种更安全及更有效的天然药物。因此，本发明的发明人尝试采用天然物质开发一种治疗糖尿病并发症的组合物， 最终发明人通过证实华西小石积提取物及其级分具有抗糖尿病、抗衰老以及抗癌作用而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种组合物，其通过抑制作为引起糖尿病并发症主要原因之一的晚期糖基化终产物的生成和醛糖还原酶的过度活性并表现出抗氧化作用，用于预防、延缓和治疗糖尿病并发症如晶状体纤维变性、视网膜及肾脏病理性异常等，以及提供一种用该组合物治疗糖尿病并发症的方法。
本发明的另一个目的是提供一种预防或延缓衰老、预防或治疗癌症的组合物，其基于晚期糖基化终产物和氧化应激为衰老及癌症的原因而制备，以及提供一种用该组合物预防衰老的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种用于治疗糖尿病并发症及用于预防或延缓衰老的组合物，其包括采用醇、水或其混合物提取的华西小石积(Osteomeles schwerinae)提取物，以及逐级用己烷、乙酸乙酯、丁醇和水对其进行分级处理的级分。
本发明还提供一种利用所述提取物和级分来预防和治疗糖尿病并发症以及预防衰老的方法。
本发明进一步提供一种用于预防和改善糖尿病并发症的功能性保健食品及一种用于预防或延缓衰老的药物组合物和功能性保健食品，其包括所述提取物及级分。
有益效果
相对于传统的糖尿病并发症治疗剂而言，华西小石积提取物是一种安全无毒性的天然提取物，治疗糖尿病并发症非常有效。因此，华西小石积提取物可以有效地用来制备用于预防、延缓和治疗糖尿病并发症的药物组合物和功能性保健食品。
本发明优选实施方案的应用可通过参考附图得到最好的理解，其中
图1是说明华西小石积提取和系统性分级的简图2是华西小石积提取物的HPLC色谱图3是说明在华西小石积提取物中培养28天后通过ELISA法分析的AGE-BSA含量的图表；
图4是说明在华西小石积提取物己烷(HEX)层中培养观天后通过ELISA法分析的AGE-BSA含量的图表；
图5是说明在华西小石积提取物乙酸乙酯(EA)层中培养28天后通过ELISA法分析的AGE-BSA含量的图表；
图6是说明在华西小石积提取物丁醇(BuOH)层中培养观天后通过ELISA法分析的AGE-BSA含量的图表；
图7是说明在华西小石积提取物水层中培养观天后通过ELISA法分析的AGE-BSA 含量的图表；
图8是说明在华西小石积种子提取物中培养观天后通过ELISA法分析的AGE-BSA 含量的图表；
图9是说明华西小石积提取物对AGE-BSA抑制作用的图表；
图10是说明华西小石积提取物对AGE-BSA阻断作用的图表；
图11是说明华西小石积提取物己烷层对AGE-BSA抑制作用的图表；
图12是说明华西小石积提取物己烷层对AGE-BSA阻断作用的图表；
图13是说明华西小石积提取物乙酸乙酯层对AGE-BSA抑制作用的图表；
图14是说明华西小石积提取物乙酸乙酯层对AGE-BSA阻断作用的图表；
图15是说明华西小石积提取物丁醇层对AGE-BSA抑制作用的图表；
图16是说明华西小石积提取物丁醇层对AGE-BSA阻断作用的图表；
图17是说明华西小石积提取物水层对AGE-BSA抑制作用的图表；
图18是说明华西小石积提取物水层对AGE-BSA阻断作用的图表；
图19是说明华西小石积提取物在离体(ex vivo)小鼠晶状体中抗白内障作用的一组照片；
图20是说明华西小石积小枝图表；
图21是说明华西小石积小枝作用的一组照片；
图22是说明华西小石积小枝作用的图表；
图23是说明I型糖尿病动物模型中采用华西小石积提取物治疗后肾功能指标变化的一组图表；
图M是说明I型糖尿病动物模型中采用华西小石积提取物治疗后的肾脏组织学变化的一组照片；㈧PAS(过碘酸-雪夫氏)染色，⑶MaSSOn三色染色；
图25是说明I型糖尿病动物模型中采用华西小石积提取物治疗后的足细胞 (podocyte)损失变化的一组照片；(A)突触足蛋白(synatopodin)染色，(B)WT-I染色；
图沈是说明晚期糖基化终产物(AGEs)表达模式变化(A，C)以及华西小石积提取物治疗后I型糖尿病动物模型中的晚期糖基化终产物受体(RAGE蛋白)(B，D)的一组照片及图表；
图27是说明在I型糖尿病动物模型中考察的华西小石积提取物抗氧化作用的一组照片及图表；
图观是说明I型糖尿病动物模型中华西小石积提取物对视网膜血管周细胞及血管内皮细胞损伤的预防作用的一组照片；
图四是说明华西小石积提取物治疗后I型糖尿病动物模型中涉及视网膜血管细胞损伤的AGEs、iNOS (诱导型一氧化氮合成酶)及NF- κ B表达模式变化的一组照片；
图30是说明在II型糖尿病动物模型(SDT)肾脏中华西小石积提取物的AGEs抑制作用的一组照片及图表；
图31是说明华西小石积提取物治疗后II型糖尿病动物模型中PAS染色的肾脏的一组照片；
图32是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中足细胞损失的预防作用的一组照片及图表；
图33是说明II型糖尿病动物模型(SDT)中华西小石积提取物抗血管生成 (anti-angiogenesis)作用的一组照片；
图34是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中血视网膜屏障损害的预防作用的一组照片；
图35是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中血管周细胞损失和无细胞毛细血管生成的预防作用的一组照片及图表；
图36是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中视网膜血管中晚/叶片提取物在离体小鼠晶状体中抗白内障作用的 /叶片提取物的级分在离体小鼠晶状体中抗白内障 /叶片提取物的级分在离体小鼠晶状体中抗白内障期糖基化终产物积聚的预防作用的一组照片及图表；
图37是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中Muller细胞活性的作用的一组照片；
图38是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中晶状体浑浊的预防作用的一组照片；
图39是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中晶状体纤维变性的预防作用的一组照片；
图40是说明华西小石积提取物对II型糖尿病动物模型(SDT)中的晶状体中醛糖还原酶活性的作用的图表。
具体实施方式
在下文中将详细描述本发明。
本发明提供了一种用于预防和治疗糖尿病并发症的组合物，其包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
糖尿病并发症为糖尿病发展较长时间后产生的症状，其是由糖尿病引起但又完全不同于糖尿病的疾病。所以，判断糖尿病并发症和糖尿病的标准是互不相同的，因此用于糖尿病并发症的治疗剂完全不同于用于糖尿病的制剂。
糖尿病并发症由晚期糖基化终产物(AGEs)和醛糖还原酶的异常活性及增强的氧化应激引起。因此，可通过检测晚期糖基化终产物、醛糖还原酶活性以及抗氧化活性来评价用于糖尿病并发症的候选治疗剂的作用。糖尿病并发症的典型示例有糖尿病视网膜病、糖尿病白内障、糖尿病肾病及糖尿病神经病变。因此，可通过考察对糖尿病视网膜病、糖尿病白内障、糖尿病肾病及糖尿病神经病变的抑制作用来验证候选治疗剂的效果。
本发明中，发明人证实了华西小石积提取物及其级分对糖尿病并发症具有治疗作用，并且还证实了具有对晚期糖基化终产物生成和醛糖还原酶活性的抑制作用以及抗氧化作用。另外，发明人证实了华西小石积提取物具有离体抗白内障作用。本发明人同样证实了华西小石积提取物在I型和II型糖尿病动物模型(图23-40)中对糖尿病视网膜病、糖尿病白内障、糖尿病肾病及糖尿病神经病变的预防、延缓和治疗都是有效的。因此，本发明人通过体外、离体及体内的动物模型实验证实了华西小石积提取物及其级分是很有前景的预防、延缓及治疗糖尿病并发症的候选组合物。
用于本发明的华西小石积为落叶灌木，属蔷薇科。高1 3m，小枝细弱微弯，为红褐色或灰褐色。幼枝密被灰白色柔毛，并且随其生长逐渐脱落。多年生枝为黑褐色。已知该植物的药性平和(smooth and clams)。有效用于清热解毒、收敛止泻、祛风除湿、疮疡肿毒、 咽喉肿痛、泄泻、痢疾、肠风下血、阴挺、风湿痹痛等(中华本草，上海科学出版社，第4卷，第 2677 页；ISBN7-5323-5106-8/R. 1287)。
华西小石积的组合物和生理活性尚未有报道。
可以采用华西小石积的整个植株来得到本发明的华西小石积提取物。优选幼小枝、叶片、或种子，但是植株的其余部分同样可以使用。
本发明的华西小石积提取物可以通过本领域技术人员熟知的传统提取方法制备， 如超声波提取、过滤及回流提取。
本发明的提取物可以采用水、Q C4低级醇或其混合溶剂提取自干燥的华西小石积植株。此时，低级醇优选甲醇或乙醇。
此处采用的溶剂体积为提取物体积的1 10倍，或优选1 5倍。优选的溶剂量为干燥华西小石积量的1 10倍，进一步优选1 5倍量。
本发明的级分由本发明的提取物制备。首先，将本发明的提取物除去溶剂，向残留物中加入水和己烷，然后分离己烷层得到己烷级分。接着，向水层中加入乙酸乙酯然后再分离乙酸乙酯层获得乙酸乙酯级分。除去乙酸乙酯层后，向其中加入丁醇分离丁醇级分。除去丁醇层后，最后得到水层。
为了分析对作为糖尿病并发症标志物的晚期糖基化终产物产生的抑制作用及其治疗效果，本发明人通过采用BSA(牛血清白蛋白)测定果糖及葡萄糖的结合程度。采用已知对晚期糖基化终产物具有优异抑制作用的氨基胍作为阳性对照。在用华西小石积提取物或其级分治疗的实验组中，提取物或其级分显示了高于氨基胍的效果(表2，图3-8)。
为更准确地证实华西小石积提取物及其级分的作用，本发明人考察了其是否可以抑制晚期糖基化终产物和胶原蛋白之间的交联，或其是否可以阻断晚期糖基化终产物和胶原蛋白之间已建立的交联。
将本发明的华西小石积提取物及其级分与已知的作为AGEs交联剂 (cross-linker)抑制剂的氨基胍进行对照。结果证实了从植株叶片、小枝和种子得到的华西小石积提取物及其级分具有优异的交联剂抑制作用(图9、11、13、15和17)。
将本发明的华西小石积提取物及其级分与已知的作为AGh交联剂阻断剂的 ALT-71 KAlteon Inc. ,Ramsey,N)进行对照，结果证实了从植株叶片、小枝和种子得到的华西小石积提取物及其级分具有优异的交联剂阻断作用(图10、12、14、16和18)。
因此，本发明人证实了华西小石积提取物及其级分抑制了晚期糖基化终产物的生成及其与其它蛋白的交联，表明了本发明所述提取物及其级分对糖尿病并发症具有优异的预防和治疗作用。
本发明人进一步考察了华西小石积提取物及其级分是否可以抑制作为糖尿病并发症另一个标志的醛糖还原酶的活性。此时，采用3，3_四亚甲基戊二酸作为比较对照。结果，与传统的醛糖还原酶抑制剂相比，证实了本发明的华西小石积提取物及其级分具有优异的醛糖还原酶抑制作用(见表6)。
华西小石积提取物及其级分的抗氧化作用通过DPPH法测定自由基来考察。结果，本发明的华西小石积提取物及其级分显示出了与作为阳性对照的维生素C、维生素E或 BHT(丁羟甲苯)相同或更高的抗氧化作用(见表7)。
正如上文所述，已证实本发明的华西小石积提取物及其级分具有优异的抑制AGEs 形成的作用——AGEs形成是糖尿病并发症的一个原因并且是评价糖尿病并发症治疗效果的一个指标，还具有抑制与其它蛋白交联的作用，抑制醛糖还原酶活性的作用以及抗氧化作用，因此，可以用作预防、延缓及治疗糖尿病并发症的组合物。
为证实华西小石积提取物及其级分在实际中对糖尿病并发症的治疗作用，发明人进行了离体实验。特别地，发明人考察了华西小石积提取物及其级分对最典型的糖尿病并发症之一糖尿病白内障的抑制作用。糖尿病白内障由木糖诱发，然后用华西小石积提取物及其级分进行治疗。结果，证实了提取物及其级分具有显著的糖尿病白内障治疗效果(图19和图20说明了华西小石积提取物的作用，图21和图22说明了从华西小石积提取物用己烷、乙酸乙酯、丁醇和水各自得到的级分的作用)。特别地，华西小石积提取物在10μ g/ml 的浓度下显示出了优异的抗糖尿病白内障作用(图19和图20)，并且这四种级分在5 μ g/ ml的浓度下同样显示出了优异的抗糖尿病白内障作用(图21和图22)。此外，本发明的华西小石积提取物及其级分在由链脲佐菌素(STZ)诱发的I型糖尿病动物模型和II型糖尿病动物模型SDT(自发性糖尿病torii (spontaneous diabetic torii))大鼠中，对糖尿病白内障、肾病及神经性病变显示出了优异的预防和治疗作用。本发明的华西小石积提取物及其级分的以上作用均高于阳性对照氨基胍(I型糖尿病模型)和二甲双胍(II型糖尿病模型)(图23-40)。
将华西小石积提取物按200mg/kg/天的剂量治疗正常组动物(SD大鼠)一天一次持续8周。给药过程中，没有大鼠死亡。动物血液的ALT和AST水平(肝功能测试指标) 在正常范围内，表明动物肝脏没有受到治疗的影响(见表9)。
本发明的药物组合物包含基于组合物总重量浓度为0. 1 99. 9wt%的本发明的华西小石积提取物及其级分，还可另外包括任何药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明的药物组合物通过与常规使用的稀释剂或赋形剂如填充剂、药效延长剂 (extenders)、粘合剂、润湿剂、崩解剂及表面活性剂进行混合，可制备成口服或肠胃外给药。口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂以及胶囊剂。所述固体制剂的制备通过将本发明的华西小石积提取物与一种或多种合适的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等进行混合。除简单的赋形剂之外，也可以采用润滑剂，如硬脂酸镁、滑石粉等。 口服给药的液体制剂为悬浮剂、溶液剂、乳剂及糖浆剂，并且上述剂型除常规采用的简单稀释剂如水和液体石蜡之外，还可以包括多种赋形剂如润湿剂、甜味剂、芳香剂以及防腐剂。肠胃外给药的制剂为无菌水溶液(sterilized aqueous solutions)、水不溶性赋形剂 (water-insoluble excipients)、悬浮剂、乳剂、冻干制剂以及栓剂。水不溶性赋形剂和悬浮剂除活性化合物或化合物组外，可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、注射用酯如油酸乙酯(ethylolate)等。栓剂除活性化合物或化合物组之外还可以包括wit印sol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可油、月桂油(laurin butter)、甘油明胶等。
本发明的药物组合物的应用对象为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选试验动物如大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、仓鼠、狗和猫，最优选猿类如黑猩猩、大猩猩及人类。
本发明的药物组合物可以通过口服或肠胃外给药。肠胃外给药优选的示例为皮肤外用(external skin application)、直肠给药、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、子宫内注射或脑室内注射。然而，皮肤外用为最优选。
本发明药物组合物的有效剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄以及病情的严重程度来确定。华西小石积提取物的剂量为每天0.01 1000mg/kg，优选每天30 500mg/kg，更优选每天50 300mg/kg，给药频率优选一天1 6次。
本发明的药物组合物可以单独用药或结合外科手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法及生物调节器用药。
本发明还提供了一种用于预防和改善糖尿病并发症的功能性保健食品，其包括作为活性成分的华西小石积提取物及其级分。
本发明的一个优选实施方案中，证实了华西小石积提取物及其级分不仅能有效抑制晚期糖基化终产物的生成(表2，图3-8)、与其它蛋白的交联(图9、11、13、15和17)以及醛糖还原酶的活性(表6，图18-31)，而且还可有效阻断晚期糖基化终产物及蛋白之间已形成的交联(图12、14、16和18)，与此同时还具有抗氧化活性(表7)，表明了其可以有效用于预防和改善糖尿病并发症。
华西小石积提取物按每天200mg/kg的剂量治疗正常组动物(SD大鼠)一天一次持续8周。给药过程中，没有大鼠死亡。动物血液的ALT和AST水平在正常范围内，表明动物肝脏没有受到治疗的影响(见表9)。因此，所述提取物被评价为无生物毒性的安全物质， 其可有效地应用于功能性保健食品中。
本发明的功能性保健食品可另外包括各种香料或天然糖类。上述天然糖类可以为单糖如葡萄糖和果糖、双糖如麦芽糖和蔗糖、多糖如糊精和环糊精以及葡萄糖醇如木糖醇 (Xilytole)、山梨醇和赤藓醇中的一种。除此之外，还可以包括作为甜味剂的天然甜味剂如奇异果甜蛋白和甜菊提取物，以及合成甜味剂如糖精和阿巴斯甜。每100重量份的本发明功能性保健食品中，天然糖的含量优选为0. 01 0. 04重量份，更优选为0. 02 0. 03重量份。
除上述提及的配料外，本发明的功能性保健食品还可以包括多种营养素、维生素、矿物质、香料、着色剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂 (protective colloidal viscosifiers)、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于加入到苏打中的碳酸化器(carbonators)等。本发明的功能性保健食品还可以包括添入了水果果肉的天然果汁、水果饮料和蔬菜饮料。上述所有配料可以单独或一起加入。配料的混合比例实质上不重要，但通常，每100重量份的本发明功能性保健食品中，每一种可加入0. 01 0. 1重量份。
本发明进一步提供了一种用于预防或延缓衰老的药物组合物或功能性保健食品， 其包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
本发明的一个优选实施方案中，考察了华西小石积提取物及其级分的抗氧化作用，结果，本发明的华西小石积提取物及其级分显示出了与传统抗氧化剂、维生素C、维生素 E及BHT(丁羟甲苯)相当或更好的抗氧化作用(见表7)。因此，本发明的华西小石积提取物及其级分可以消除氧化应激——其为衰老的一个直接原因，表明了本发明的提取物可有效地用于制备抑制或延缓衰老的药物组合物或功能性保健食品。
本发明还提供了一种用于预防和治疗癌症的药物组合物或用于预防和改善癌症的功能性保健食品，其包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
晚期糖基化终产物引起癌症的事实已被报道CTokuda H.等，2005，Book of Abstract of 53rd GA Congress joint with SIF，P076)。本发明的一个优选实施方案中，证实了华西小石积提取物或其级分能有效地抑制晚期糖基化终产物的生成(表2，图 3-18)、抑制晚期糖基化终产物和其它蛋白之间的交联、同时阻断已产生的交联(图9-18)。 因此，证实了本发明的提取物可有效地用来制备用于预防和治疗癌症的药物组合物或功能性保健食品。
本发明还提供了一种治疗糖尿病并发症的方法，其包括将药学有效量的华西小石积提取物或其级分施用于糖尿病并发症个体的步骤。
本发明的一个优选实施方案中，本发明的华西小石积提取物或其级分抑制了糖尿病并发症原因之一的晚期糖基化终产物的生成(见表2及图3-18)，并且抑制了糖尿病并发症另一原因的醛糖还原酶的活性(见表6)。通过离体(见图19-22)和体内(见图23-40) 试验，同样证实了本发明的提取物可以有效抑制糖尿病并发症之一的糖尿病白内障。上述结果表明本发明的提取物及其级分可施用于糖尿病并发症个体以治疗所述并发症。
所述治疗方法的对象不仅适用于本发明所用的小鼠，同样适用于其它脊椎动物。 适用的对象优选哺乳动物，更优选如大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、仓鼠、狗和猫这样的实验动物， 最优选猿类如黑猩猩、大猩猩及人类。
本发明的一个优选实施方案中，通过皮肤外用及腹膜内注射进行给药。由于本发明的华西小石积提取物或其级分无细胞毒性，其也可以通过口服或肠胃外来给药。肠胃外给药优选的示例为直肠给药、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、子宫内注射或脑室内注射。然而，皮肤外用为最优选。
本发明药物组合物的有效剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄以及病情的严重程度来确定。
本发明还提供了一种预防糖尿病并发症的方法，其包括将华西小石积提取物或其级分施用于糖尿病个体的步骤。
糖尿病个体中，血糖没有得到适当控制，以至于血液中存在过多的葡萄糖。当过多的葡萄糖长时间在血液中存在时，便生成了晚期糖基化终产物，其引发糖尿病并发症。此时，施用本发明的华西小石积提取物或其级分可以抑制该个体中晚期糖基化终产物的生成，从而预防或延缓糖尿病个体的糖尿病并发症。
本发明还提供了一种抑制和延缓衰老的方法，其包括将华西小石积提取物或其级分施用于糖尿病个体的步骤。
本发明的华西小石积提取物或其级分具有优异的抗氧化作用。因此，施用本发明的华西小石积提取物或其级分可以延迟或抑制糖尿病个体的衰老。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括将华西小石积提取物或其级分施用于癌症个体的步骤，以及一种预防癌症的方法，其包括将华西小石积提取物或其级分施用于个体的步骤。
本发明的华西小石积提取物或其级分可以有效抑制晚期糖基化终产物的生成，因此施用本发明的华西小石积提取物或其级分可以有效预防和治疗癌症个体的癌症。
本发明涉及一种预防或治疗糖尿病并发症、抑制和延缓衰老、或预防或治疗癌症的功能性保健食品，其包括作为活性成分的华西小石积提取物或通过系统性分级得到的各个级分(己烷层、乙酸乙酯层、丁醇层及水层)。所述功能性保健食品可另外包括基于成品可销售性及消费者喜好考虑的其它食品成分。
此外，本发明提供了一种预防和治疗糖尿病并发症的组合物，其包括作为活性成分的含有2-0-乙酰基牡荆素、金丝桃苷及槲皮苷的华西小石积提取物或其级分。
从华西小石积提取物分离得到了化合物如白桦脂酸-3 β -基-咖啡酸酯、白桦脂醇-3β-基-咖啡酸酯、2-0-乙酰基牡荆素、金丝桃苷、槲皮苷、阿福豆苷以及(-)_表儿茶素。每种化合物都被证实能够抑制晚期糖基化终产物的生成以及醛糖还原酶的活性(见表 2和6)。因此，包含所述化合物的华西小石积提取物或其级分可以用作预防和治疗糖尿病并发症的组合物。
本发明实用的及目前优选的实施方案将通过以下实施例、实验例及制备例 (Manufacturing Examples)进行说明。
然而，考虑到公开的内容，本领域技术人员可以在本发明的精神和范围内进行修改及改进。
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本发明使用的华西小石积(蔷薇科)从中国云南获取，并且已将证明样品 (evidence sample) (no. KI0M-0S)保藏于韩国东方医学研究院(Korea Institute of Oriental Medicine)东方医学技术石if究中心(Oriental Medical Technology Research Center) H^^I^^SEff^^^^ (Diabetic Complication Research center)白勺示:Φ室。
将华西小石积的小枝、叶片及种子阴干并切碎，放入含有乙醇的浸提器中。室温下提取2 5次。在40°C减压浓缩提取物得到乙醇提取物。为防止各种成分的降解和水解， 浓缩的温度优选维持在40 45°C。
本发明中，将120g干燥/切碎的华西小石积加入到IL的乙醇中，然后室温下提取 3次。提取物在40°C下减压浓缩。结果，得到12g乙醇提取物。
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将实施例1得到的12g乙醇提取物和0. 5L水及0. 5L正己烷混合，之后分离己烷层。此过程重复3次，然后在40°C下减压浓缩。结果，得到1. ^g己烷级分。
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将实施例1得到的12g乙醇提取物和0. 5L水及0. 5L正己烷混合，之后分离水层。 将水层和0. 5L乙酸乙酯混合，之后分离乙酸乙酯层。此过程重复3次，然后在40°C下减压浓缩。结果，得到3. 75g乙酸乙酯级分。
实施例4 华西小石积枝/叶片提取物的IH丁醇级分的制备
向实施例1得到的乙醇提取物中加入0. 5L水及0. 5L正己烷，之后除去己烷层并向水层加入乙酸乙酯。除去乙酸乙酯层得到水层。将水层和0.5L正丁醇混合，之后得到正丁醇层。此过程重复三次，然后在40°C下减压浓缩。结果，得到4. IOg 丁醇级分。
实施例5 华西小石积枝/叶片提取物的水级分的制备
向实施例1得到的12g乙醇提取物中加入0. 5L水及0. 5L正己烷，之后除去己烷层并向水层加入乙酸乙酯。除去乙酸乙酯层后，向其中加入正丁醇。除去正丁醇层后，在40°C 下进行减压浓缩。结果，得到2. 87g水级分。
实施例6 华西小石积种子提取物的制备
除采用华西小石积种子代替华西小石积小枝和叶片之外，通过如实施例1描述的相同方法制备华西小石积种子提取物。
实施例7 华西小石积提取物的标准化
本发明采用的提取溶剂都为超纯级溶剂(韩国大中化学品&金属有限公司 (Daejung Chemical&Metals Co. , LTD))。用于HPLC的流动相溶剂甲醇(美国飞世尔科技 (Fisher Scientific))及水(美国 J. Τ. Backer)都为 HPLC 级。
本文的HPLC采用1200分析型HPLC系统(安捷伦)，由二元泵(G1312A)、真空脱气机(G1322A)、色谱柱恒温箱(G1316A)、多波长检测器(1365B，MWD)、以及自动进样器 (G13^A)组成。设备的操作以及分析结果的处理采用Chen^tation软件。分析过程采用 Spherex C-18 柱(菲罗门(Phenomenex)，4. 6mmX250, i. d.，5. Om)。
将4kg室温下干燥的华西小石积粉碎，然后在室温下采用99%的乙醇提取24h共三次。过滤和浓缩以后，得到104. 16kg乙醇提取物。将乙醇提取物制成％ig/ml的浓度。将 10 μ 1制备好的乙醇提取物注入到色谱柱后进行HPLC。
将2”-0_乙酰基牡荆素标准品溶解于100%的甲醇中，然后通过二倍稀释法制成用于校准曲线的浓度为100、50、25、10和5μ g/ml的标准品溶液。将金丝桃苷和槲皮苷标准品溶解于100%的甲醇中，然后通过二倍稀释法制成用于校准曲线的浓度为100、50、25、 12. 5和6. 25 μ g/ml的标准品溶液。将用于校准曲线的各个标准品溶液注入色谱柱，然后进行HPLC得到色谱图。通过标定峰数据得到用于定量分析的校准曲线。
HPLC 采用 Spherex C-18 柱(菲罗门(Phenomenex)，4· 6讓X 25O，i. d.，5. Om)。柱温设定为30°C，UV检测器的波长设定为2Mnm。每种样品采用自动进样器进样10 μ 1。流动相为0. 的乙酸和甲醇的混合溶液。流速设定为l.Oml/min。流动相的梯度组成如下 25 45% 甲醇(O 40min) — 45 70% 甲醇 00 55min) — 70 100% 甲醇(55 65min) — 100% 甲醇(65 70min)。
HPLC分析华西小石积提取物的结果如图2和表1所示。可以看出，HPLC色谱图确认了三种类黄酮化合物槲皮苷、金丝桃苷及2”-O-乙酰基牡荆素为三种主要成分(图2)。
因此，华西小石积提取物三种主要成分的含量也同时通过HPLC进行分析。结果， 槲皮苷、金丝桃苷及2”-O-乙酰基牡荆素的含量分别确定为3. 44%U. 58%和0. 54% (表 1)。
表1
权利要求
1.一种用于预防和治疗糖尿病并发症的组合物，包括作为活性成分的华西小石积 (Osteomeles schwerinae)提取物或其级分。
2.根据权利要求1所述的用于预防和治疗糖尿病并发症的组合物，其中所述华西小石积提取物提取自华西小石积的枝、叶片或种子。
3.根据权利要求1所述的用于预防和治疗糖尿病并发症的组合物，其中所述华西小石积提取物采用水、醇或其混合物进行提取。
4.根据权利要求1所述的用于预防和治疗糖尿病并发症的组合物，其中所述级分为己烷级分、乙酸乙酯级分、丁醇级分和水级分中的一种，其通过将华西小石积提取物溶于水中然后逐级采用己烷、乙酸乙酯和丁醇进行系统性分级制备。
5.一种用于预防和延缓糖尿病并发症的功能性保健食品，包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
6.一种用于预防和延缓衰老的药物组合物，包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
7.一种用于预防和延缓衰老的功能性保健食品，包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
8.一种用于预防和治疗癌症的药物组合物，包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
9.一种用于预防和治疗癌症的功能性保健食品，包括作为活性成分的华西小石积提取物或其级分。
10.一种治疗糖尿病并发症的方法，包括将药学上有效剂量的华西小石积提取物或其级分施用于糖尿病并发症个体的步骤。
11.根据权利要求10所述的治疗糖尿病并发症的方法，其中所述华西小石积提取物提取自华西小石积的枝、叶片或种子。
12.根据权利要求10所述的治疗糖尿病并发症的方法，其中所述华西小石积提取物采用水、醇或其混合物进行提取。
13.根据权利要求10所述的治疗糖尿病并发症的方法，其中所述级分通过逐级采用己烷、乙酸乙酯、丁醇和水对华西小石积提取物进行系统性分级获得。
14.一种预防糖尿病并发症的方法，包括将药学上有效剂量的华西小石积提取物或其级分施用于糖尿病个体的步骤。
15.一种预防和延缓衰老的方法，包括将药学上有效剂量的华西小石积提取物或其级分施用于个体的步骤。
16.一种治疗癌症的方法，包括将药学上有效剂量的华西小石积提取物或其级分施用于癌症个体的步骤。
17.一种预防癌症的方法，包括将药学上有效剂量的华西小石积提取物或其级分施用于个体的步骤。
18.华西小石积提取物或其级分在制备糖尿病并发症治疗剂和抗癌剂中的应用。
19.一种用于预防和治疗糖尿病并发症的组合物，包括作为活性成分的含有2-0-乙酰基牡荆素、金丝桃苷和槲皮苷的华西小石积提取物或其级分。
全文摘要
本发明涉及一种用于糖尿病并发症的治疗剂及以其治疗糖尿病并发症的方法，更具体地，涉及一种含有华西小石积(Osteomeles schwerinae)提取物及其级分作为有效成分用于预防和治疗糖尿病并发症的制剂，其中，所述华西小石积提取物及其级分被证实可抑制糖尿病并发症标志物晚期糖基化终产物的形成、抑制醛糖还原酶的活性，具有抗白内障作用以及抗氧化活性。
文档编号A61P35/00GK102481326SQ200980160639
公开日2012年5月30日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者俞男熙, 孙银珍, 张大植, 李俊, 李允美, 郑东昊, 金兰姬, 金周奂, 金正玹, 金温顺, 金真淑, 金英淑, 金赞植 申请人:韩国韩医学研究院