一种鸦胆子总萜提取物及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：一种鸦胆子总萜提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药化学领域，特别涉及一种鸦胆子总萜提取物的制备方法，以及该方法制得的提取物在抗肿瘤、尖锐湿疣、治疗恶性胸腔积液、治疗带状疱疹、抗阿米巴药，治疗抗白血病药物中的应用。
背景技术：
鸦胆子是苦木科植物鸦胆子Brucea javanica(L. )Merr的成熟果实，始载于《本草纲目拾遗》，鸦胆子异名老鸦胆《生草药性务要》，鸦胆、苦榛子《吉云旅钞》，苦参子《纲目拾遗》，鸦蛋子《植物名实图考》，鸭蛋子《医学衷中参西录》，鸭胆子《中药志》，解苦楝《广西中药志》，小苦楝《广西中草药》。主产于我国南方的海南、广东、广西及云南等地。秋季果实成熟时采收，除尽杂质后晒干，其味苦、性寒。归大肠、肝经。《本草纲目》记载鸦胆子可用于治疗痢疾、里急后重和痔疮。历史上我国民间广泛应用鸦胆子治疗阿米巴痢疾等疾病，如张锡纯提倡用鸦胆子治疗痢疾。《医学衷中参西录》卷三日“沧州友人滕玉可，壬寅之岁，设教乡村，于中秋下赤痢，且多鲜血。医治两旬不愈。适愚他出新归，过访之，求为诊治。其脉象洪实，知其纯系热痢。遂谓之日此易治。买苦参子百余粒，去皮，分两次服下即愈矣。翌日愚复他出，二十余日始归。又访之，言曾遍问近处药坊，皆无苦参子。后病益剧，遣人至敝州取来，如法服之， 两次果愈。功效何其神哉。”《医学衷中参西录》“鸦胆子性善良血，止血兼能化化瘀生新。 凡痢之偏于热者用之均有捷效，而以治鲜血之痢，泄血之水痢，则尤效。又善清胃腑之热，胃腑有实热充塞，噤口不食者，服之即可进食。鸭蛋子不但善利下焦，即上焦有虚热者，用之亦妙。此所以治噤口痢而有捷效也。”“凉血解毒，善治热性赤痢，二便因热下血。” “治梅毒及花柳毒淋。捣烂醋调敷疗毒。善治疣。”鸦胆子的含油率为20%左右，含仁率为36%，种仁含油约56. 23%。油中不皂化物1.36% 皂化物为92. 47% .其脂肪酸组成为油酸81. 87%、亚油酸3. 37%、硬脂酸 2. 65%、棕桐酸6. 62%和三酰甘油酯。研究发现鸦胆子油的三甘酯水解后的产物油酸具有很强的抗肿瘤活性，而且亚油酸及共轭亚油酸也具有抗肿瘤活性。鸦胆子中主要化学成分还有苦木内酯及其苷类、类苦木素类、生物碱类、黄酮苷类等成分。鸦胆子苦木内酯及其苷 如鸦胆子苦素，鸦胆子苦醇，去氢鸦胆子醇，鸦胆亭，鸦胆亭醇，鸦胆子苦素E-2-D-葡萄糖苷、鸦胆子苦烯、鸦胆子苦酯内酯，鸦胆子苷，鸦胆子苦苷等。在我国，10%的鸦胆子油乳剂已经在临床上用于治疗消化系统肿瘤，如胃癌、食管癌、原发性肝癌、大肠癌、胰腺癌等。乳剂属于多相动力学不稳定分散体系，在受热、受冷及长期储存过程中均能引起乳析和破裂。渗漏的鸦胆子油毒性大，对胃肠粘膜和血管壁的刺激性也很严重，临床应用中有恶心、厌食等消化道不良反应。并且10 %的鸦胆子油乳剂中主要成分为油酸、亚油酸、棕榈酸等脂肪酸成分，虽然这些成分有报道具有抗肿瘤活性，但其活性普遍不高，易造成不良反应。现今国内申报的关于鸦胆子的专利，全部围绕着鸦胆子油进行。本专利内容采用了一种全新的鸦胆子有效部位，去除了鸦胆子油中的大部分脂肪酸成分，增加了过去鸦胆子油的提取工艺未能提取出来的有效成分，增强了治疗效果，减少了毒副作用。细胞实验证实，采用本工艺制备的鸦胆子总萜提取物的抑瘤活性是鸦胆子油的300倍以上。并且采用新的技术对样品进行精制，极大地减少了细胞毒性。

发明内容
本发明的目的在于提供了一种鸦胆子总萜提取物及其制备方法，该方法采用醇提取，用非极性溶剂萃取，柱分离的方式，得鸦胆子总萜，制备方法简单，确保了有效成分最大程度的保留。本发明的另一目的在于总萜提取物在抗肿瘤、尖锐湿疣、治疗恶性胸腔积液、治疗带状疱疹、抗阿米巴药，治疗抗白血病药物中的应用。本方法采用的技术方案是一种鸦胆子总萜提取物，其总萜含量大于50%。鸦胆子总萜提取物的制备方法是取鸦胆子，用醇提取，合并提取液，回收醇，浸膏可以采用①加水分散后，用非极性溶剂萃取，收集有机溶剂层，浓缩得鸦胆子总萜；②上柱洗脱分离，得鸦胆子总萜；③加水分散后，用非极性溶剂萃取，收集有机溶剂层，浓缩，柱分离，得鸦胆子总萜。所述的鸦胆子可以直接投料或粉碎后投料。所述的提取溶剂可以为浓度在30% -100%的甲醇、乙醇或正丁醇等。所述的提取方法可以为浸渍、渗滤、加热提取等。所述的萃取溶剂可以为乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等。所述的分离柱可以为氧化铝、硅胶、聚酰胺或大孔吸附树脂。所述的用途为鸦胆子总萜提取物在抗肿瘤、尖锐湿疣、治疗恶性胸腔积液、治疗带状疱疹、抗阿米巴药，治疗抗白血病药物中的应用。所述的药物组合物制剂形式可以是胶囊、软胶囊、滴丸、片剂、口服溶液、汤剂、糖浆剂、药酒、煎膏剂、酊剂、浸膏剂、茶剂、颗粒剂及注射剂等。本发明总萜含量在50%以上，总萜主要由四环三萜类组成。鸦胆子总萜含量测定对照品溶液的制备精密称取105°C下干燥至恒重的齐墩果酸对照品8mg，置 IOOml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，即得。(每Iml含齐墩果酸0. 08mg)。供试品溶液的制备取鸦胆子总萜提取物15mg，置IOOml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，即得。标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6ml，分别置具塞试管中，水浴挥去溶剂，冷却，准确加入0. 4ml 5%香草醛-冰醋酸溶液和1. 8ml高氯酸， 混勻，密塞。置70°C恒温水浴中加热20min，取出，冷却至室温，加冰醋酸5ml，摇勻，在540nm 处测定吸光度，以试剂为空白。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。含量测定精密量取供试品溶液0.細1，按标准曲线项下操作，依法测定吸光度， 计算含量。本发明的有益效果是制备方法简便，成本低，纯度高，活性强，毒副作用弱。由于含量高，活性强，杂质少，可以减少服用量，减少毒副作用。更有利于保证药物的安全性、有效性和质量可控性。从原料中制备鸦胆子总萜收率约为0. 5-2%。
具体实施例方式下面通过实施对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好地理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围实施例1 取鸦胆子10kg，粉碎，加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度(1. 30-1. 35)，加2倍水分散，加二氯甲烷萃取四次，每次用量为药液的2倍量，合并萃取液，回收溶剂，上聚酰胺柱，50%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，得鸦胆子总萜。总萜含量86.4%。实施例2 取鸦胆子10kg，加6倍量乙醇，回流提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度(1. 20-1. 30)，加石油醚萃取三次，每次用量为药液的2倍量，合并石油醚液，水液用乙酸乙酯萃取四次，每次用量为药液的2倍量，合并萃取液，回收溶剂，干燥， 得鸦胆子总萜。总萜含量56. 1%。实施例3 取鸦胆子10kg，加18倍量80%乙醇，回流提取3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇， 浓缩至相对密度(1. 15-1. 25)，加石油醚萃取2次，每次用量为药液的3倍量，合并石油醚液，水液用氯仿萃取四次，每次用量为药液的1倍量，合并萃取液，回收溶剂，干燥，得鸦胆子总萜。总萜含量65. 3%。实施例4 取鸦胆子10kg，加15倍量乙醇，回流提取3小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度(1. 25-1. 35)，加石油醚萃取3次，每次用量为药液的3倍量，合并石油醚液， 水液用二氯甲烷萃取3次，每次用量为药液的2倍量，合并萃取液，回收溶剂，上硅胶柱，甲醇-乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，得鸦胆子总萜，总萜含量98. 5%。实施例5 取鸦胆子10kg，加10倍量乙醇，回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度(1. 28-1. 35)，上大孔吸附树脂柱，20%乙醇洗脱，去掉洗脱液，继用 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥，得鸦胆子总萜，总萜含量72. 3%。实验例1 鸦胆子总萜体外对肿瘤细胞的抑制作用材料与方法1、细胞珠人宫颈癌细胞珠Hela(中国医科大学)；红白血病细胞珠K562 (购于 CCTCC)、人乳腺癌细胞株MCF-7 (中科院上海细胞库)。2、药材与试剂鸦胆子、胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、巴氏染液、二甲基亚砜、新生牛血清、注射用盐酸阿霉素、氟尿嘧啶注射液、鸦胆子油注射液等。3、仪器与设备C02培养箱(HH-CP)、超净工作台(SW-CJ-IFD)、倒置显微镜(CKX41-32PH)、酶标仪 (Multiskan MK3)、无菌培养板、SIGMI-14型低速离心机、流式细胞仪(FACSCalib. urBD公
5司)、水浴锅(Senco W201B)等。4、实验内容及方法4. 1细胞复苏细胞冻存管从液氮罐中取出，立即37°C水浴锅中，不断振摇冻存管，使其迅速融解，1000r/min离心5分钟，超净工作台中倒掉上清液后，K562细胞、Hela细胞加少量RPMI1640全培养液于冻存管中，MCF-7细胞加DMEM全培养液，超净台上抖动冻存管，将底部细胞抖松，混勻。转移到无菌培养瓶中(玻璃瓶)，加适量对应的全培养液，冻存管内剩余细胞再用全培养液洗，洗液转入同一培养瓶中，补充一定量的全培养液。吸管吹勻细胞后，置37°C 5% C02中培养。4. 2细胞传代4. 2. 1K562细胞传代将培养M小时细胞液取约0. 5ml，血球计数板中，加台盼蓝染液计数。观察细胞生长情况后，将细胞液转移到无菌离心管中，lOOOr/minS-lOmin，弃上清液，加aiilRPMI1640全培养液(10%小牛血清)离心管中吹勻细胞后。各吸一半细胞液到新培养瓶中，补足RPMI1640全培养液后，继续培养。此细胞传代3次后，细胞在对数生长期内后即可接种到96孔板中。4. 2. 2MCF-7 细胞传代培养瓶中细胞长至瓶底65% -85%时传代。超净台中无菌操作将旧培养液倒入废液容器中，用PBS或D-hanks缓冲溶液洗3次后，倒干洗液，加入几滴0. 25%胰蛋白酶后置显微镜下观察，待细胞收缩突起、变圆时，立即倒转培养瓶，置超净工作台中加DMEM全培养液终止消化，无菌吸管将瓶底细胞吹洗下来，并吹勻。将细胞分到两个培养瓶中，补足培养液后，置5% C02培养箱中培养，每次传代前均计数细胞，待细胞生长至对数生长期时即可进行药物筛选实验。4. 2. 3hela 细胞传代倒置显微镜下观察发现细胞贴壁伸展，生长良好，培养48h，见85 %细胞贴满瓶壁，吸出培养液，加入含EDTA的胰酶消化细胞，见细胞收缩变圆，细胞间隙增大，弃胰酶，用含血清RPMI-1640培养液终止消化，反复吹打，使细胞从瓶壁上脱落，成为细胞悬液，1 2 分装传代继续培养。4. 3 加样4. 3. 1 K562细胞培养对小时后，96孔板中加一定浓度鸦胆子总萜。同时设有阳性对照(阿霉素)、标准对照(不含药物，而有培养液和细胞的孔)、空白对照(仅有培养液， 而无药物和细胞的孔)。药物每个浓度设三个复孔。37°C，5% C02培养箱中培养48h。每个浓度平行3次，重复2次。4. 3. 2MCF-7细胞、hela细胞培养M小时后，96孔板中加一定浓度鸦胆子总萜，同时设标准对照、空白对照和阳性对照5-氟尿嘧啶(5-FU)，药物每个浓度设三个复孔。培养箱中继续培养48h。4. 4细胞染色K562细胞培养48小时后，向96孔板中加入MTT，培养4h后，加入三联液(10% SDS-5%异丁醇-0. Olmol/LHCl)，酶标仪检测。加入三联液后，液体颜色在M小时内比较稳定，置酶标仪中570处测OD值。MCF-7细脆培养4 后，向96孔板中加一定量的三氯乙酸，Ih后，无菌水洗5次，甩干96孔扳的水，并用滤纸吸干，加入SRB染色液，15min后醋酸洗5次，干燥后，加三羟甲基胺基甲烷溶解，置酶标仪中590处测OD值。hela细脆培养4 后，每孔加入ΜΤΤ200μ 1，孵育4h，去上清加入150μ 1 二甲基亚砜(DMSO)，振荡lOmin，按常规方法用酶标仪在490nm处测吸光度(OD)值。4. 6结果测定每个浓度平行3次，重复2次，结果以平均值士标准差表示。抑制率计算公式如下
(标准对照OD值-样品OD值)
抑制率(％)= - X 100%
标准对照OD值式中(标准对照OD值=标准对照测量值-空白对照测量值，样品OD值=样品测量值-空白对照测量值)所得资料用SPSS13. O For windows统计软件分析，数据用I士 s表示，组间比较用 t检验。结果H鸦胆子总萜对本实验用肿瘤细胞均有显著抑制作用，呈明显的量效关系。对 K562细胞抑制作用稍弱，对抑制Hela细胞和MCF-7细胞时鸦胆子总萜显示了较强的作用。 高倍镜下可见细胞呈病理性萎缩和不可逆性损坏，随药物浓度增高，可见细胞周围碎片增多，而阴性对照组未见明显病理改变。实验例2 鸦胆子提取物体外抑瘤作用材料与方法1动物与细胞株清洁级ICR小鼠，体重(21 士2)g，雌雄各半，由山东大学提供小鼠移植性肿瘤肉瘤(S180)、肝癌Ofeps)，均由中国科学院上海药物研究所提供。2 试剂环磷酰胺(CTX)，SOD、MDA试剂盒，切片石蜡，无水乙醇，其它常规化学试剂均为分析纯。3仪器与设备电热恒温水浴箱，电热恒温水浴锅，低速自动平衡离心机，可见光分光光度计，切片机。4实验内容及方法4. 1药物用量及配置试验用药物在成年人(按体重60kg计算)的用量为9-15g.d_l，小鼠口服用药量按公式dB = dA* (RB/RA) * (WA/WB) 1/3计算。dB为小鼠口饲用量(mg. kg-Ι)，dA为人体口服用量(mg/kg) ；RA.人体型系数，为100 ；RB 小鼠体型系数，为59 ；WA 成年人体重，按60Kg 计算；WB 小鼠体重，按21g计算。取体外抑瘤实验效果较好的鸦胆子总萜以0. 9% NaCl配成所需浓度。4. 2体外抑瘤实验
选择肿瘤生长良好的荷瘤小鼠，无菌条件下取出肿瘤，用0.9% NaCl按比例 (S1801 3, Heps 1 4)制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0. ^iil。接种后使用均衡随机法分组(每组雌雄各半，组间平均体重相差不超过Ig)，实验组每组10只， 对照组每组14只。设阴性对照组(溶媒)、阳性对照组(CTX)，鸦胆子总萜给药组各设1、5、 20mg. kg-13个剂量。接种24h后开始灌胃给药，每天固定时间段给药一次并记录小鼠的活动情况，连续10d，术次给药后24h称体重，摘眼球取血后处死，完整剥离肿瘤、肝脏、脾脏、 胸腺等组织。4. 3疗效总体评价分别称取各组小鼠瘤质量及其肝脏、脾脏、胸腺等器官的质量，并计算其抑瘤率和肝脏、脾脏、胸腺指数。4. 4抗氧化指标摘眼球取血，分离得到血清。采用黄嘌呤氧化酶法测定S0D，硫代巴比妥酸法测定 MDA。4. 4血清SOD测定测定原理黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生(02-)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，而SOD则抑制其反应，根据抑制率的高低计算出SOD的含量。4. 5病理观察取各组瘤块组织，脱水透明后石蜡包埋，常规病理切片制备，HE染色，光学显微镜下观察。结果1、小鼠活动情况观察环磷酰胺组小鼠进食量较阴性对照组明显减少，毛发干枯，蓬松、无光泽，且有中度腹泻，体质消瘦，活动迟缓。而鸦胆子总萜组小鼠较阴性对照组活动敏捷，进食量增加。2、疗效总体评价鸦胆子总萜3个剂量组对小鼠S180肿瘤、小鼠H印s肿瘤均有较强的抑制作用，和阴性对照组相比，均有显著性差异。两种肿瘤的抑制作用均以中剂量组(5mg/kg)效果为好。与阴性对照组比较，鸦胆子总萜各处理组小鼠肝、脾、胸腺指数无明显改变，而CTX组脾、胸腺指数明显降低，与阴性对照组比较差异有显著性。3、对荷瘤鼠血清抗氧化功能的影响鸦胆子总萜中剂量组(5mg/kg)作用的S180、Heps荷瘤小鼠血清SOD活力均有升高，MDA水平均下降，与阴性对照组对比均差异有显著性。结果见表1、表2。表1鸦胆子总萜对荷S180小鼠SOD和MDA的影响(χ士s，η = 10)
权利要求
1.一种鸦胆子总萜提取物，其特征在于总萜含量大于50%，其是通过以下方法制备的(1)取鸦胆子，粉碎，用醇类溶剂提取1-8次，每次溶剂用量为原药材重量的1-20倍，每次提取时间为0. 5-10小时，合并提取液，回收溶剂，得总提取物浸膏。( 将上述得到的浸膏加水稀释，用低极性溶剂萃取，收集有机溶剂层，浓缩得浸膏，加水分散，经柱色谱分离， 得鸦胆子总萜提取物。
2.一种鸦胆子总萜提取物的制备方法，其特征在于(1)将鸦胆子粉碎，用0 100%甲醇或乙醇回流提取广8次，每次溶剂用量为药材重量的广20倍，每次提取时间为0. 5^10小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩得浸膏；(2)将上述得到的浸膏加水稀释，加水量为浸膏重量的2 20倍，然后上大孔树脂柱、聚酰胺柱或硅胶柱吸附，浸膏重量与吸附填料体积的比是1 0.5 10，单位g ml，色谱柱径与柱高比为1 广30，大孔树脂和聚酰胺柱依次用水和浓度为5 95%的乙醇洗脱，流速为 0.5 3. 5个柱体积/小时；硅胶柱用石油醚和丙酮5 1混合溶剂洗脱。(3)收集洗脱液，进行减压浓缩或真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，即得鸦胆子总萜提取物。
3.权利要求1所述的一种鸦胆子总萜提取物在制备抗肿瘤、尖锐湿疣、治疗恶性胸腔积液、治疗带状疱疹、抗阿米巴药，治疗抗白血病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将鸦胆子提取物与医学上可接受的辅料混合制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种鸦胆子总萜提取物及其制备方法，一种从鸦胆子中提取分离得到的含有鸦胆子二、三萜及倍半萜类成分的提取物。经药效学及毒理学实验证明，该提取物对多种肿瘤具有较好的治疗作用，有效成分比较明确，有利于保证药物的安全性和有效性。原料提取得率高，成本低，操作简便，适用于工业化生产，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K36/185GK102188459SQ20101012016
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月9日 优先权日2010年3月9日
发明者田玲, 胡清文 申请人:胡清文