专利名称：哺乳动物肝细胞体外组织化培养方法
技术领域：
本发明涉及利用一种新型的特异性培养基质进行肝细胞体外组织化培养。
背景技术：
肝脏是人体的重要器官，肝脏的病变，如肝硬化、肝衰竭等会危及患者的生命。临 床上对肝脏病变晚期的患者实施肝脏移植手术来延缓患者的生命。由于肝脏供体来源的问 题，很多肝病晚期患者因为等不到供体，而终止生命。即便得到供体，接受肝移植的患者，也 要在随后的生活中承担着终身药物免疫抑制的经济负担。随着组织工程学的发展，新的治 疗手段为患者提供了改善和复活肝功能的可行性。 组织工程学是融合了工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本 方法，在体外构建一个有生物活性的种植体，植入体内修复组织缺损，替代器官功能；或作 为一种体外装置，暂时替代器官功能，达到提高生存质量，延长生命活动的目的。组织工程 学是一个跨学科的领域，其将工程和材料科学与医学结合在一起。目标在于恢复受损组织 或改善其功能。其原理是从人或动物体中取出部分组织，体外提取细胞，并进行体外培养 与增殖。然后将其再次移植到体内。与传统的供(受)体移植不同，传统的移植需要供体， 而且移植后需要终身药物免疫抑制。而本方法则提供了能够使用内源(自体)细胞的极其
重要ifc点。 组织工程学技术的应用，其关键就是细胞体外的培养与增殖，这对移植到体内的
细胞是否发挥功能，是极其重要的。目前细胞体外培养方法越来越多，也越来越先进，但存 在的问题是，原生肝细胞在体外培养过程中， 一定时间内较难培养出相当数量的细胞，从而 移植回体内达不到肝细胞的功能。 CN1587392A在聚砜中空纤维丝内进行肝细胞的培养，由于促进肝细胞球状体 的形成需较长时间，而球状体形成的推迟会使肝细胞较快失去分化表型和发生死亡；而 CN101624473A在由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖制备得到的载体中进行肝细胞的培养，此 方法如需进行肝细胞的大规模培养，还需优化微载体制备反应条件。并且上述方法获得的 肝细胞可作用于体外生物反应器，不便于移植到体内形成组织化。为获得一定数量的肝细 胞，使其移植回体达到肝细胞的功能并能组织化，原生肝细胞的体外培养方法的条件控制 非常重要，尤其细胞培养基质的三维结构和形状大小非常关键。
发明内容
本发明提供一种能使肝细胞在体外快速、高效的培养基质，基质的三维结构具有 更大的体表面积比，有利于肝细胞在基质上的粘附，利于肝细胞间的信息传递以及营养、氧 气和代谢物之间的流通，从而提高体外肝细胞培养质量和数量，使移植回体内的肝细胞达 到相应的功能；并且培养基质的形状、大小有利于移植回体内。 —种哺乳动物肝细胞的体外培养方法，其关键是使用经静电纺织成的具有三维多 孔结构的培养基质。
其中，培养基质由胶原蛋白或丝素蛋白，与聚乳酸(PLA)按质量百分比配置成混 合物，利用静电纺织技术制备。 其中，聚乳酸的分子量为10000-150000道尔顿。 其中，胶原蛋白20-40%或丝素蛋白20-40%，聚乳酸为60-80%的混合物溶于二 氯甲烷，制成质量浓度为6_8%的电纺液； 其中，将电纺液加入静电纺织装置中，静电纺织制成直径l-2cm，高度3-4mm的扁 圆柱形基质； 其中，将静电纺织获得的基质用真空干燥方法去除残留的二氯甲烷； 其中，基质体积93-96%为微孔，4-7%为基材； 其中，基质上具有不同大小的孔，孔直径为80iim-500iim之间； 其中，优选基质具有如下的孔径分布，基质上大约4%的孔平均直径在
80-110 ii m ;大约6%的孔平均直径在111-120 ii m ;大约7%的孔平均直径在121-130 y m ;
大约5%的孔平均直径在131-260 iim ;大约5%的孔平均直径在261-300 y m ;大约15%
的孔平均直径在301-340 ii m ;大约6 %的孔平均直径在341-360 y m ;大约10 %的孔平
均直径在361-390 ii m ;大约10%的孔平均直径在391-430 y m ;大约5 %的孔平均直
径在431-460 ii m ;大约15%的孔平均直径在461-480 y m ;大约10%的孔平均直径在
481-500 ii m。合适的孔径大小与分布能提高细胞的培养效率和质量。 其中，基质上孔间相互连通； 其中，基质的消毒用Y射线照射； 其中，所述哺乳动物是人或大鼠。 本发明的有益效果 本发明的方法中使用的微孔结构的基质，其结构利于细胞吸附，有利于细胞间的 相互接触以及氧气、营养物质的传递，使肝细胞在体外高密度培养，并保持细胞生物学活性 及其功能，另外，基质的特殊结构，植入体内后，有利于血管的在基质中攀爬生长、组织化。
具体实施例方式
l，细胞培养基质制备 胶原蛋白20-40%或丝素蛋白20-40%与60_80%的聚乳酸(分子量10000-150000 道尔顿)混合物溶于二氯甲烷，制成质量浓度为6-8 %的电纺液，经静电纺织技术织成直 径为l-2cm，高度为3-4mm的扁圆柱形。真空干燥去除残留二氯甲烷。基质体积93-96% 为微孔，4-7%为基材。孔直径为80um-500um之间，微孔间相互连通。其中，大约4%的孔 平均直径在80-110 ii m ;大约6%的孔平均直径在111-120 y m ;大约7%的孔平均直径在 121-130 ii m ;大约5%的孔平均直径在131-260 ii m ;大约5%的孔平均直径在261-300 y m ; 大约15%的孔平均直径在301-340 ii m ;大约6%的孔平均直径在341-360 y m ;大约10% 的孔平均直径在361-390 ii m ;大约10%的孔平均直径在391-430 y m ;大约5%的孔平均 直径在431-460 ii m ;大约15 %的孔平均直径在461-480 y m ;大约10 %的孔平均直径在 481-500 iim。 2，肝细胞的体外培养 1)取受体(人或大鼠)小部分肝组织，同时抽取50ml血清；
2)肝组织用针头针剌若干小孔，(TC保存在EGTA溶液最多80分钟，直到肝组织由 暗红变成灰白色； 3)用10,1/L HEPE缓冲液(2. 38克HEPES，用蒸馏水溶解并定容至lOOOml， pH7. 2) ， 37"灌注肝组织5-8分钟； 4)用胶原酶/胰蛋白酶溶液(8. 3gNaCl ;0. 5g KC1 ;2. 38克HEPES ;0. 7g CaCl2 2H20 ;500mg胶原酶；7. 5mg胰蛋白酶抑制剂；蒸馏水补至lOOOml， Ph7. 2)37。C灌注 肝组织5-8分钟； 5)剪刀剪切肝组织，用常规方法提取肝细胞； 6)提取的肝细胞悬浮于20ml Williams E和步骤1)获得的血清混合溶液中(体 积百分比为95 : 5)，成为A溶液； 7)取1ml上述含有肝细胞的A溶液，加入经静电纺织制成的具有三维多孔结构的 培养基质中； 8)步骤7)的基质在温度37t:，湿度90-96%，5-8%的C02培养箱中培养2小时， 以便细胞充分附着在基质上；再加入3ml含有肝细胞的A溶液，同样条件下培养至少48小 时； 9)电子显微镜下观察细胞生长情况，镜下可见80%以上为成活的肝细胞，肝细胞 数量大约为2X1()5个； 10)另用锥虫蓝(Trylan Bule)溶液测定细胞活性，活性大于95% ; 11)将培养后的含有肝细胞的基质存放于20ml Williams E和血清混合溶液(体
积百分比为95 : 5)中，37t:保存备用。 3，动物实验 利用上述方法对Lewis鼠进行肝细胞腹腔内移植。移植1和4个月后取出移植物 进行检测移植基质中肝细胞数量，平均每立方毫米体积内，移植后1和4个月分别为3 X 103 和5X103个肝细胞，表现出正常的白蛋白表达，并且形成血管，血管延伸到基质当中。
权利要求
一种哺乳动物肝细胞的体外组织化培养方法，其特征在于细胞培养过程中使用经静电纺织技术制成的具有三维多孔结构的培养基质。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于培养基质由胶原蛋白或丝素蛋白，与聚乳酸(PLA)按质量百分比配置成混合物，利用静电纺织技术制备。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于胶原蛋白20-40%或丝素蛋白20-40%，聚乳酸为60-80%的混合物溶于二氯甲烷，制成质量浓度为6-8%的电纺液。
4. 如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于静电纺织制成直径l-2cm，高度3-4mm的扁圆柱形基质。
5. 如权利要求l-4之一所述的方法，其特征在于基质上具有不同大小的孔，孔直径为80践-500iim之间。
6. 如权利要求1_5之一所述的方法，其特征在于基质上大约4%的孔平均直径在80-110 ii m ;大约6%的孔平均直径在111-120 ii m ;大约7%的孔平均直径在121-130 y m ;大约5%的孔平均直径在131-260 iim ;大约5%的孔平均直径在261-300 y m ;大约15%的孔平均直径在301-340 ii m ;大约6 %的孔平均直径在341-360 y m ;大约10 %的孔平均直径在361-390 ii m ;大约10%的孔平均直径在391-430 y m ;大约5 %的孔平均直径在431-460 ii m ;大约15%的孔平均直径在461-480 y m ;大约10%的孔平均直径在481-500 iim。
7. 如权利要求l-6之一所述的方法，其特征在于基质体积93-96%为微孔，4-7%为基材。
8. 如权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于基质上孔间相互连通。
9. 如权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于将静电纺织获得的基质用真空干燥去除残留的二氯甲烷。
10. 如权利要求1-9之一所述的方法，其特征在于所述哺乳动物是人或大鼠。
全文摘要
一种哺乳动物肝细胞的体外组织化培养方法，使用静电纺织的具有三维多孔结构的肝细胞培养基质。基质直径为1-2mm，厚度3-4mm，基质上具有不同大小的孔，孔直径为80μm-500μm之间，孔孔间相互连通。本发明的方法使人或动物肝细胞在体外培养迅速增殖，保持肝细胞细胞生物学活性及其功能。
文档编号A61L27/26GK101775365SQ201010134109
公开日2010年7月14日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者苑国忠 申请人:苑国忠