专利名称：：来自荜茇的提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药领域，特别涉及来自荜茇的提取物及其制备与应用。
背景技术：
：帕金森病(Parkinson'sDisease,PD)是临床上最常见的神经系统退行性疾病之一。随着我国人口的老龄化，PD的发病率呈上升趋势。美国MS健康网报道，2004年全球用于PD的支出有25亿美金，中国目前有300万PD患者。PD发病后致残率高，已经成为影响我国老年人口健康水平和生活质量的重大社会问题。现代医学治疗帕金森病的手段主要有药物治疗、手术方法、细胞移植、转基因技术等，由于诸多因素限制，目前药物治疗仍是主要方法。目前公认的控制PD临床症状最佳的药物为左旋多巴类药物，但该药物只能改善症状而不能控制PD的进程，随着该药应用时间的延长和剂量的加大，其治疗作用越来越小，毒副反应却越来越大。近年来，人们逐渐把目光投向传统中医药，以期从中寻找出多途径、多靶点治疗帕金森病的新药及新方法。大量研究证实了中药通过保护黑质细胞、提高神经递质含量、抑制氧化应激反应、低兴奋性毒性等作用达到治疗帕金森病的目的，并且有些中药对减少和预防服用左旋多巴等西药副作用也发挥了一定疗效，甚至已经开始从分子生物学角度深入探讨中药作用机制。这些都说明中医药治疗帕金森病已不仅局限于传统的临床观察，而是越来越重视实验研究，从帕金森病发病机制、病理生理及基因学角度去研究其疗效。荜茇药的药味辛、苦，性温。归肝、脾经。活血，利气，止痛。通过化学成分的研究表明该药中含有丰富的生物碱、酰胺类、木脂素类、萜类、甾醇类及其它类的化合物，其中生物碱和酰胺类约35种，尤其是胡椒碱的含量不少于2.5%。文献报道胡椒碱具有镇静、降压、抗惊厥、抗炎、抗氧化和抗抑郁等多方面的生物活性，并可能会成为治疗多种认知障碍的脑代谢改善药，并可明显增加小鼠脑内单胺类神经递质5-HT的含量。文献报道了该药物的镇静、抗惊厥、催眠、降压作用，说明其具有与安神药相类似的作用，这类药物均具有抗震颤麻痹作用，主要药理作用是拮抗或改善帕金森氏综合症样体征。文献中还未见报道荜茇中总生物碱及胡椒碱在帕金森病治疗方面的相关研究。
发明内容本发明的目的在于提供一种来自荜茇的提取物的制备方法。本发明提供的制备方法，包括如下步骤1)取荜茇干燥果实，用重量是所述荜茇干燥果实的8-10倍的70_95%(是体积百分比)乙醇水溶液作为提取剂对所述荜茇干燥果实进行提取，得到提取液；2)将步骤1)得到的提取液浓縮成相对密度为1-1.1的浓縮液；3)将步骤2)得到的浓縮液用水稀释，离心，将离心后的上清液经过D101大孔吸附树脂柱吸附；4)将步骤3)得到的吸附过所述上清液的D101大孔吸附树脂柱用5-15倍柱体积的10-20%乙醇水溶液(体积百分比)洗脱，将洗脱过的D101大孔吸附树脂柱用10-20倍柱体积的60-70%乙醇水溶液(体积百分比)洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，即得到来自荜茇的提取物(命名为提取物E)。在步骤l)中，为了提取充分，荜茇干燥果实可以先粉碎，再提取，上述提取的次数可以为3次，所述提取剂是85%(体积百分比)的乙醇水溶液。在步骤2)中，所述浓縮是在50-7(TC下减压浓縮，优选是在6(TC、真空度0.OlPa下浓縮；所述浓縮液的相对密度是1.08。在步骤3)中，所述稀释是指将步骤2)的浓縮液加水稀释，浓縮液加水后的总重量与所述荜茇干燥果实质量的比例是l:1;所述离心是1000g-2000g下，离心10分钟。在步骤4)中，所述5-15倍柱体积的10-20%乙醇水溶液洗脱优选是10倍柱体积的20%乙醇水溶液洗脱；步骤5)中，10-20倍柱体积的60-70%乙醇水溶液洗脱优选是20倍柱体积的70%乙醇水溶液洗脱。所述步骤5)得到第3至20个柱体积的洗脱液后，可进行干燥，干燥的步骤如下将收集的洗脱液减压浓縮，然后真空冷冻干燥。任一上述的方法制备得到的来自荜茇的提取物(提取物E)也属于本发明的保护范围之内。上述的提取物E在制备预防或治疗帕金森疾病的药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述的提取物E在制备提高体外帕金森病细胞模型的细胞存活率的产品中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述帕金森病细胞模型是100nM的鱼藤酮对SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D细胞系形成的细胞模型。上述的提取物E在提高体外帕金森病细胞模型的细胞存活率的中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述帕金森病细胞模型是100nM的鱼藤酮对SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D细胞系形成的细胞模型；所述提取物E的浓度是12.5-2.Og生药荜茇/ml，优选是12.5-50mg生药荜茇/ml，更优选是25mg生药荜茇/ml或50mg生药荜茇/ml。实验证明先加入药物处理24h后再加入鱼藤酮(终浓度100nM)共培养24h的给药方式保护效果最佳；荜茇醇提物、荜茇水提物均对鱼藤酮损伤的SH-SY5Y细胞(氧化损伤诱导的体外PD模型)均有一定的保护作用，其中50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml等浓度的保护性效果较好，胡椒碱单体5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml的浓度的保护性效果较好，其中荜茇醇提物和荜茇水提物的保护作用较好。为进一步确定荜茇醇提物有效部位的神经保护作用，又采用MTT检测细胞活力，对荜茇醇提物的各种洗脱部位的有效性及其浓度进行了初筛。在SH-SY5Y细胞、SH-SK-N细胞和MN9D细胞中，提取物E对抗鱼藤酮引起的氧化损伤的神经保护药效与鱼藤酮模型组有显著性差异，且药效优于阳性药组。图1为药物对抗鱼藤酮损伤SH-SY5Y细胞的时间窗和浓度窗(100nM浓度，处理24小时观察细胞活力)，其中A，B，C分别是荜茇醇提物，荜茇水提物，和荜茇中提取的胡椒碱单体的不同实验组。图2为在SH-SY5Y细胞系中将初筛出的药物提取物进一步检测神经保护药效，图示为先加提取物24H后，加100nM鱼藤酮处理24小时MTT发检测细胞活力(图2A)，LDH(乳酸脱氢酶)检测试剂盒检测LDH释放率(图2B)，**代表与鱼藤酮组比p<0.01，*代表p<0.05。图3为在SH-SY5Y细胞系中将初筛出的药物提取物进一步检测神经保护药效的细胞形态。图4为在SH-SK-N细胞系中将初筛出的药物提取物进一步检测神经保护药效，图示为先加提取物24H后，加lOOnM鱼藤酮处理24小时MTT发检测细胞活力(图4A)，LDH(乳酸脱氢酶)检测试剂盒检测LDH释放率(图4B)，**代表与鱼藤酮组比p<0.01，*代表p<0.05。图5为在SH-SK-N细胞系中将初筛出的药物提取物进一步检测神经保护药效的细胞形态。图6为在MN9D细胞系中将初筛出的药物提取物进一步检测神经保护药效，图示为先加提取物12H后，加lOOnM鱼藤酮处理12小时MTT发检测细胞活力(图6A)，LDH(乳酸脱氢酶)检测试剂盒检测LDH释放率(图6B)，**代表与鱼藤酮组比p<0.01，*代表p<0.05。图7为在丽9D细胞系中先加提取物12H后，加100nM鱼藤酮处理12小时的细胞形态的结果。图8为提取物E的HPLC的图谱。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。本发明中所用的细胞系如下SH-SY5Y是人源的神经母细胞瘤细胞系，购自ATCC公司(AmericanTypeCultureCollection)货号CRL_2266。SH-SK-N是人源的神经母细胞瘤细胞系，购自ATCC公司(AmericanTypeCultureCollection)货号HTB-ll"1。丽9D是小鼠源的原代胚胎腹侧中脑细胞与小神经母细胞瘤细胞系N18TG2融合形成的杂交瘤细胞系，购自Novartis公司。本发明的试验方法如下检测细胞活力的方法(MTT):是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。借此反应细胞活力(本实验所有MTT购自Sigma公司)。具体步骤1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔lOOiU，细胞密度10000-15000个/孔。2)置37°C、5%C02温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。3)加入待筛样品和处理条件。4)处理完毕后，小心吸去上清，加入lOulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续37。C继续培养4h。6)然后吸掉上清，每孔加入lOOul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。LDH(乳酸脱氢酶)释放率是反应细胞存活的指标LDH(乳酸脱氢酶)是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT(四唑盐类)反应形成紫色的结晶物质，可通过490nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度本实验所用LDH检测试剂盒购自罗氏公司货号Cat.No.11644793001。)具体步骤见说明书。实施例1、对三种药物(荜茇水提物、荜茇醇提物和胡椒碱单体)进行活性筛选—、制备本实施例中荜茇干燥果实是生药，可购自药店。荜茇水提物的制备取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用810倍药材重量的纯化水提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压浓縮，制成2g生药/ml的荜茇水提取物。荜茇醇提物的制备取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用810倍药材重量的95%乙醇溶液提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，于6(TC下减压回收乙醇至无醇，用纯化水制成2g生药/ml的荜茇醇提取物。荜茇中的胡椒碱单体的制备含量大于90%的胡椒碱单体。取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用810倍药材重量的95%乙醇提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，于60°C下减压回收乙醇至无醇浸膏，将浸膏溶于适量的水中完全溶解后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，对二氯甲烷萃取部位回收溶剂得浸膏，用甲醇加热溶解分散，冷却后的不溶物用二氯甲烷溶解，滤去不溶物后的溶液放置，析出晶体，再进行重结晶，得到含量大于90%的胡椒碱。二、活性筛选1、针对步骤一得到的3种药物分别进行最佳给药时间和作用浓度的筛选荜茇醇提物、荜茇水提物及以胡椒碱单体对细胞氧化损伤保护作用的时间窗和浓度窗的确定，采用的细胞株是SH-SY5Y，采用的细胞培养液是DMEM/F12+10%胎牛血清(DMEM/F12培养基可购自Gibco公司，货号12400-024;另外10%胎牛血清是指终浓度为10%，是体积百分数)(所有实验中用的细胞培养液均与这里的培养液相同)。鱼藤酮损伤对照含有lOOnM鱼藤酮的细胞培养液。荜茇醇提物在96孔板中终浓度分别是50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml和6.25mg/ml;荜茇水提物在96孔板中终浓度分别是50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml和6.25mg/ml;胡椒碱单体在96孔板中终浓度分别是20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、l.25ug/ml和0.625ug/ml。三种药物分别进行如下三个实验(每种提取物的成分都不告知实验操作者只给以药物编号，以避免人为主观因素的干扰)A.先加荜茇各种提取物再加鱼藤酮a、接种好的96孔板细胞，除去培养液，加入上述相应浓度的药物，孵育24小时。b、除去药物，加入鱼藤酮(在96孔板中终浓度为100nM)，孵育24小时。正常细胞对照正常SH-SY5Y细胞。然后进行MTT法检测。B.先加鱼藤酮后加药接种好的96iellplate细胞，除去培养液，加入鱼藤酮溶液(在96孔板中终浓度为100nM)，孵育24小时。除去鱼藤酮溶液，加入相应药物提取物溶液，孵育24小时，正常细胞对照组正常SH-SY5Y细胞。然后进行MTT法检测。C.同时加药和鱼藤酮接种好的96孔板细胞，除去培养液，加入相应药物和鱼藤酮溶液(鱼藤酮在96孔板中终浓度为100nM)孵育24小时。正常细胞对照正常SH-SY5Y细胞。鱼藤酮对照100nM鱼藤酮对照。然后进行MTT法检测。2、实验结果结果如图l所示，先加入药物处理24h后再加入鱼藤酮(终浓度100nM)共培养24h的给药方式保护效果最佳；荜茇醇提物、荜茇水提物均对鱼藤酮损伤的SH-SY5Y细胞(氧化损伤诱导的体外PD模型)均有一定的保护作用，其中50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml等浓度的保护性效果较好，胡椒碱单体5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml的浓度的保护性效果较好，其中荜茇醇提物和荜茇水提物的保护作用较好。实施例2、针对荜茇醇提物的各种洗脱部位进行活性筛选为进一步确定荜茇醇提物有效部位的神经保护作用，又采用MTT检测细胞活力，对荜茇醇提物的各种洗脱部位的有效性及其浓度进行了初筛。—、各种洗脱部位的制备荜茇提取物A:取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用810倍药材重量的95%乙醇溶液提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，于6(TC下减压回收乙醇至无醇，制成2g生药/ml的荜茇醇提取物。荜茇提取物B:取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用810倍药材重量的纯化水提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压浓縮，制成2g生药/ml的荜茇水提取物。胡椒碱C(提取物C):含量大于90%的胡椒碱。取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用810倍药材重量的95%乙醇提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，于6(TC下减压回收乙醇至无醇浸膏，将浸膏溶于适量的水中完全溶解后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，对二氯甲烷萃取部位回收溶剂得浸膏，用甲醇加热溶解分散，冷却后的不溶物，用二氯甲烷溶解，滤去不溶物后的溶液放置，析出晶体，再进行重结晶，得到含量大于90%的胡椒碱。总生物碱——各洗脱部位(D、E、J):取荜茇干燥果实，粉碎成粗粉，用810倍药材重量的85%(体积百分比)乙醇溶液提取三次，每次1小时，过滤，合并滤液，于6(TC下减压(真空度0.01Pa)回收乙醇至相对密度为1.08的浓縮液，浓縮液用水稀释，稀释后的质量与荜茇干燥果实的质量比例是l:1，然后在1500g下，离心10分钟。将离心后的上清液经过大孔吸附树脂柱(D101型)吸附，先用10倍柱体积的20%(体积百分比)乙醇洗脱，得到洗脱部位D;然后用20倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，得到洗脱部位为E;最后用85%(体积百分比)乙醇洗脱，收集洗脱液得到洗脱部位J。将各个洗脱部位减压浓縮，真空冷冻干燥，即得荜茇总生物碱的不同洗脱部位(得到提取物D、E和J是固体粉末或膏体，在做细胞筛选前，用前述的细胞培养液配制成2g生药/ml的溶液)。其中提取物E的HPLC的图谱如图8所示，HPLC色谱条件色谱柱AgilentEclipseXDB-C18(5iim，4.6mmX250mm);流动相0.25%甲酸-甲醇(35:65);流速1.OmLmin-1;检测波长:343nm;进样量:20yL;柱温40。C。将上述的各个提取物(A、B、D、E和J)稀释至50mg生药/ml的A1、B1、D1、E1和Jl，然后在此浓度的基础上进行2倍的递比稀释得到25mg生药/ml的A2、B2、D2、E2和J2，还得到12.5mg生药/ml的A3、B3、D3、E3和J3;将提取物C稀释成5ug生药/ml的Cl，2.5ug生药/ml的C2和1.25ug生药/ml的C3。二、活性初步筛选1、实验步骤将荜茇的各种提取物以及稀释后的各个组分，以初筛确定的最佳给药时间点(即接种好的96孔板细胞，除去培养液，先加入荜茇提取物作用24h，再加入鱼藤酮处理24h)，检测细胞活力。其中以不加提取物，只加100nM鱼藤酮处理24小时的组为鱼藤酮模型组；以加入生育酚24h后加入100nm鱼藤酮处理24h的组为阳性药组。2、实验结果结果如表1所示，E组份的3个浓度的提取物对抗鱼藤酮引起的氧化损伤的神经保护药效与鱼藤酮模型组有显著性差异，且药效优于阳性药组。表1.在SH-SY5Y细胞中，细胞活力检测不同提取物对神经细胞的保护作用(药物初筛)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注AA代表与鱼藤酮组比p<0.Ol，且药效优于阳性药组。三、在3种细胞系中对B、C、D、E和J组的活性进一步筛选1、在SH-SY5Y细胞中的活性筛选将B、C、D禾PE四个组分及其各个稀释后的组分分别加入SH-SY5Y细胞系中24h后，再加入lOOnM鱼藤酮处理24h，用MTT法检测活力并且检测LDH释放率。其中设置3个对照组control组为正常细胞对照组，Rotenone组为仅加了lOOnM鱼藤酮处理24小时的鱼藤酮模型损伤组，Tocopherol组为先加入使用浓度为80yg/ml生育酚(阳性药对照组)处理24h，再加鱼藤酮处理24h，检测细胞活力。结果如图2所示，2个浓度的E组分(El和E2)处理下的SH-SY5Y细胞的存活率与鱼藤酮模型组有显著性差异(图2A)，并且2个浓度的E组分(El和E2)处理下的SH-SY5Y细胞的LDH释放率(图2B)与鱼藤酮模型组也有显著性差异。细胞形态的照片如图3所示，其中A:SY5YCell(A代表正常的SH-SY5Y细胞)，B:Tocopherol(B代表在SH-SY5Y细胞中加入Tocopherol处理24h后再加入鱼藤酮100nM处理24h)，C:ExtractE(C代表在SH-SY5Y细胞中加入E组提取物最佳浓度即50mg/ml处理24h后的再加鱼藤酮100nM处理的细胞)，D:Rotenone，100nM(D只加了100nM的鱼藤酮处理24小时的细胞)。由此可见，E组分对抗鱼藤酮引起的氧化损伤的神经保护药效与鱼藤酮模型组有显著性差异。2、在SH-SK-N细胞中的活性筛选将B、C、E禾PJ四个组分及其各个稀释后的组分分别加入SH-SK-N细胞系中24h后，再加入100nM鱼藤酮处理24h，用MTT法检测活力并且检测LDH释放率。其中MTT法检测活力设置3个对照组control组为正常细胞对照组；Rotenone组为仅加了lOOnM鱼藤酮处理24小时的鱼藤酮模型损伤组tocopherol组为先加人使用浓度为80g/ml生育酚(阳性药对照组)处理24h，再加鱼藤酮处理24h，检测细胞活力。而LDH释放率的检测实验还设了另一种阳性药CoQlO:其实一种较公认的抗氧化的线粒体保护剂，是线粒体呼吸链的组成部分。采用了2个浓度20uM和100uM。结果如图4所示，2个浓度的E组分(El和E2)处理下的SH-SKN细胞的存活率与鱼藤酮模型组有显著性差异(图4A)，B、C、E和J组处理下的SH-SKN细胞的LDH释放率均与鱼藤酮模型组也有显著性差异(图4B)。细胞形态的照片如图5所示，其中A:SH-SKNCell(A代表正常的SH-SKN细胞)，B-Tocopherol(B代表在SH-SY5Y细胞中加入Tocopherol处理24h后再加入鱼藤酮100nM处理24h)，C:ExtractE(C代表在SH-SKN细胞中加入E组提取物最佳浓度即50mg/ml处理24h后的再加鱼藤酮100nM处理的细胞)，D:Rotenone，100nM(D只加了100nM的鱼藤酮处理24小时的细胞)。由此可见，E组份对抗鱼藤酮引起的氧化损伤的神经保护药效与鱼藤酮模型组有显著性差异。3、在MN9D细胞中的活性筛选将B、C、E和J四个组分(B，E，J是浓度相同50mg/ml，C是5ug/ml)分别加入MN9D细胞系中12h后，再加入lOOnM鱼藤酮处理12h，用MTT法检测活力并且检测LDH释放率。其中设置4个对照组control组为正常细胞对照组；Rotenone组为仅加了100nM鱼藤酮处理24小时的鱼藤酮模型损伤组tocopherol组为先加人使用浓度为80yg/ml生育酚(阳性药对照组)处理24h，再加鱼藤酮处理24h，检测细胞活力；CoQ10组为先加人CoQ1020uM处理12h再加入鱼藤酮处理12小时MTT法检测细胞活力。结果如图6A所示，B、C、E处理后的丽9D细胞的存活率显著高于与鱼藤酮损伤组有显著差异。而LDH释放率的检测实验设置阳性药CoQlO和生育酚。结果如图6B所示，E组分处理下的MN9D细胞的存活率与鱼藤酮模型组有显著性差异(图6B)，B、E组处理下的SH-SY5Y细胞的LDH释放率均与鱼藤酮模型组也有显著性差巳升°细胞形态的照片如图7所示，其中A:丽9DCell(A代表正常的丽9D细胞)，B:Tocopherol(B代表在MN9D细胞中加入Tocopherol处理12h后再加入鱼藤酮100nM处理12h)，C:ExtractE(C代表在MN9D细胞中加入E组提取物处理12h后的再加鱼藤酮100nM处理的细胞)，D:Rotenone，100nM(D只加了100nM的鱼藤酮处理24小时的细胞)。由此可见，E组份对抗鱼藤酮引起的氧化损伤的神经保护药效与鱼藤酮模型组有显著性差异。权利要求一种来自荜茇的提取物的制备方法，包括如下步骤1)取荜茇干燥果实，用重量是所述荜茇干燥果实的8-10倍的70-95％(是体积百分比)乙醇水溶液作为提取剂对所述荜茇干燥果实进行提取，得到提取液；2)将步骤1)得到的提取液浓缩成相对密度为1-1.1的浓缩液；3)将步骤2)得到的浓缩液用水稀释，离心，将离心后的上清液经过D101大孔吸附树脂柱吸附；4)将步骤3)得到的吸附过所述上清液的D101大孔吸附树脂柱用5-15倍柱体积的10-20％乙醇水溶液(体积百分比)洗脱，将洗脱过的D101大孔吸附树脂柱用10-20倍柱体积的60-70％乙醇水溶液(体积百分比)洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，即得到来自荜茇的提取物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤l)中，所述提取的次数为3次，所述提取剂是85%(体积百分比)的乙醇水溶液；步骤2)中，所述浓縮是在50-7(TC下减压浓縮，优选是在6(TC、真空度0.01Pa下浓縮；所述浓縮液的相对密度是1.08。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤3)中，所述稀释是指将步骤2)的浓縮液加水稀释，浓縮液加水后的总重量与所述荜茇干燥果实质量的比例是l:l;所述离心是在1000g-2000g下，离心10分钟。4.根据权利要求l-3中任一所述的方法，其特征在于步骤4)中，所述5-15倍柱体积的10-20%乙醇水溶液洗脱优选是10倍柱体积的20%乙醇水溶液洗脱；步骤5)中，10-20倍柱体积的60-70%乙醇水溶液洗脱优选是20倍柱体积的70%乙醇水溶液洗脱。5.权利要求1-4中任一所述的方法制备得到的来自荜茇的提取物。6.权利要求5所述的提取物在制备预防或治疗帕金森疾病的药物中的应用。7.权利要求5所述的提取物在制备提高体外帕金森病细胞模型的细胞存活率的产品中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述帕金森病细胞模型是100nM的鱼藤酮对SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D细胞系形成的细胞模型。9.权利要求5所述的提取物在提高体外帕金森病细胞模型的细胞存活率的中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述帕金森病细胞模型是100nM的鱼藤酮对SH-SY5Y、SH-SK-N或MN9D细胞系形成的细胞模型；所述权利要求5所述的提取物的浓度是12.5-2.0g生药荜茇/ml，优选是12.5-50mg生药荜茇/ml，更优选是25mg生药荜茇/ml或50mg生药荜茇/ml。全文摘要本发明公开了来自荜茇的提取物及其制备方法与应用。本发明提供的制备方法如下1)取荜茇干燥果实，用70-95％乙醇溶液提取；2)将步骤1)得到的提取液浓缩至相对密度为1-1.1的浓缩液；3)将步骤2)得到的浓缩液用水稀释，离心，将离心后的上清液经过D101大孔吸附树脂柱吸附；4)将步骤3)得到的吸附过所述上清液的D101大孔吸附树脂柱用20％乙醇洗脱，然后用20倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集第3至20个柱体积的洗脱液，即得本发明所保护的来自荜茇的提取物。在SH-SY5Y细胞、SH-SK-N细胞和MN9D细胞中，本发明的提取物对抗鱼藤酮引起的氧化损伤的神经保护药效与鱼藤酮模型组有显著性差异，且药效优于阳性药组。文档编号A61K36/67GK101791336SQ20101014447公开日2010年8月4日申请日期2010年4月8日优先权日2010年4月8日发明者吴霞,杨慧,毕赢,王年强,罗容申请人:首都医科大学