专利名称：：化合物3,5,2′,4′-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于含有机有效成分的药品.
背景技术：
：痛风(gout)是一种由于嘌呤代谢紊乱产生过多尿酸和/或尿酸排泄减少，尿酸在体内蓄积沉淀所致的一组代谢性疾病。尿酸是人类嘌呤代谢的产物，通常认为高尿酸血症是痛风的标志，据统计约有5%12%高尿酸血症患者最终发展为痛风。在欧洲、北美、日本等地区和国家痛风的发病率较高，但随着我国人民生活水平的提高、寿命的延长、饮食结构的改变、肥胖者的增加，痛风的发病率已较15年前增长了约1530倍，已不再是国人的罕见病。此外，近年的研究发现高尿酸血症不仅是痛风最重要的生化基础，而且与代谢紊乱综合征密切相关，是心血管疾病、高血压、肾脏疾病等独立的危险因素(NakagawaT，HuH.ZharikovS，TuttleKR,ShortRA,Glushakova0，OuyangX，FeigDI,BlockER,Herrera-AcostaJ，eral·Acausalroalforuricacidinructose—indusedmetbolicsyndrome.AmJPhysiol2006，290:F625_F63LHaydenMRandTyagiSC.Uricacid:Anewlookatanoldriskmarkerforcardiovasculardiease，metabolicsyndrome,andtype2diabetesmellitus:Theurateredoxshuttle.Nutrition&metabolism2004，110-25.)，已成为严重威胁人类健康的代谢性疾病，联合国将其列为了21世纪的20大顽症之一。然而，痛风的治疗除抗炎镇痛等对症治疗外，主要依赖于促尿酸排泄药和黄嘌呤氧化酶抑制剂，但传统的促尿酸排泄药(如丙磺舒、苯溴马隆等)常伴随有皮疹、发热、肾脏损害等副作用，而别嘌醇作为临床上最常使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂，也具有肝脏、骨髓毒性和过敏等不良反应，在一定程度上限制了其安全使用。因此，寻找高效低毒的抗高尿酸血症和痛风药物是目前药学研究的一个热点。近年，国内外学者以黄嘌呤氧化酶作为靶点进行了广泛的研究，发现了许多活性化合物，根据其结构大致有嘌呤类似物(如S-azaadeninej-pheylhypoxanthine等)、非嘌呤类似物(如噻唑羧酸衍生物Febuxostat、芳基吡唑衍生物Y-700等)和其他类(如黄酮类、惠酉昆类等)(BorgeslF,FernandesEandRoleiraF.ProgressTowardstheDiscoveryofXanthineOxidaselnhibitors.CurrMedChem2002，9:195-217.王春辉，李松.黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究进展.国外医学药学分册2006，33(5):351-353.)。其中黄酮类化合物作为一类天然产物备受关注，发现槲皮素、桑黄素、杨梅黄酮、山奈酚、黄芩素、葛根素、木犀草素、大豆黄酮甙等均具有黄嘌呤氧化酶抑制活性，但体内降低高尿酸血症动物血尿酸水平的活性不理想，因此，寻找或合成一种体内降尿酸效价较高的新型化合物颇具意义。3，5，2’，4’-四羟基查尔酮是以3，5_二羟基苯甲酸和间苯二酚为原料，经过酯化、甲氧甲基保护或甲基化、酰胼化、氧化、醛酮缩合、脱保护基、0-法呢基化或0-异戊烯基化等步骤，合成得到的查尔酮类化合物。
发明内容本发明目的是在制药中应用化合物3，5，2',4'_四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的药物和保健品，获得一种具有较高活性的治疗高尿酸血症和痛风的药物。本发明通过以下方式实现以化合物3，5，2',4'_四羟基查尔酮<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>3，5，2\4'-四羟基杏尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的药物和保健品。所制备的3，5，2’，4’-四羟基查尔酮明显竞争性抑制黄嘌呤氧化酶活性，其IC50为22.5μmol/L,抑制常数为17.4μmol/L。所制备的化合物3，5，2'，4'-四羟基查尔酮以14·6μπι01/1^(3·98π^/1^)剂量即显著降低氧嗪酸钾或次黄嘌呤诱导的高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平。所制备的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮以灌胃给药1个剂量后即显著降低氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05，0.01)。所制备的3，5，2'，4'-四羟基查尔酮小鼠灌胃给药的最大耐受量大于5.Og/kg。经过大量试验我们发现3，5，2',4'-四羟基查尔酮明显抑制黄嘌呤氧化酶的活性，其IC5tl为22.5μmol/L，系黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂。动物体内实验和研究表明该化合物具有较强的抗痛风作用，14.6ymol/kg(3.98mg/kg)剂量即可以明显降低氧嗪酸钾或次黄嘌呤诱导的高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平，该化合物可以用于制备口服的防治高尿酸血症和痛风药物和保健品。图1为3，5，2',4'-四羟基查尔酮对黄嘌呤氧化酶的抑制作用示意2为别嘌醇对黄嘌呤氧化酶的抑制作用示意图。图3为用Lineweaver-Burk氏作图法求本发明化合物对黄嘌呤氧化酶抑制的动力学常数示意图。以下结合具体实施方式说明本发明。本发明包括但不限于以下具体实施方式。具体实施例方式(一)本发明化合物对黄嘌呤氧化酶抑制的医药功效黄嘌呤氧化酶(EC1.1.3.22)为Sigma公司产品，用焦磷酸钠缓冲液配制成适宜浓度备用。3，5，2',4'-四羟基查尔酮用焦磷酸钠缓冲液配制成系列浓度备用，DMSO助溶。系列浓度的3，5，2',4'-四羟基查尔酮溶液与黄嘌呤氧化酶在25°C孵育15min后，参照文献方法[朱深银，周远大，刘庆山，杜冠华.黄嘌吟氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用.中国药学杂志，2007，42(3):187-190]测定黄嘌呤氧化酶的活性，结果如图2表明3，5，2',4'-四羟基查尔酮对黄嘌呤氧化酶的活性有一定的抑制作用，其IC5tl为22.5μπι01/1，抑制类型为竞争性抑制；并依据Lineweaver-Burk氏作图法求本发明化合物对黄嘌呤氧化酶抑制的动力学常数，其结果如图3所示抑制常数Ki为17.4ymol/L。(二)本发明化合物对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠血尿酸的影响2.1发明化合物降尿酸作用的量效关系体重18_22g健康雄性昆明种小鼠，由昆明医学院实验动物中心提供[实验动物生产许可证号SCXK(滇)2005-2008]。动物随机分为正常对照组、高尿酸血症模型组、本发明化合物分1.0,1.99,3.98三组剂量组和阳性对照组别嘌呤醇1.Omg/kg。受试化合物用5%聚乙二醇配制成适宜浓度，灌胃给药，每天2次，共5个剂量。参照文献[HallIH,ScovilleJP,ReynoldsDJ,SimlotR,DuncanP.Substitutedcyclicimidesaspotencialanti-goutagents.LifeSciences.1990,46:923-1927.StavricB,ClaymanS,GraddREA,HebertD.SomeinvivoeffectsintheratinducedbychlorprothixeneandpotassiumoxonatePharmacologyResearch，1975，7:117_124]采用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾为化学性诱导剂，腹腔注射氧嗪酸钾400mg/kg，造成高尿酸血症小鼠，正常对照组则注射等体积0.5%CMC-Na溶液，注射后Ih灌胃给予末次剂量的供试化合物，2h后拔眼采血，3000rpm离心lOmin，取血清，采用磷钨酸比色法(南京建成生物工程研究所试剂盒)测定血清尿酸水平。结果表明，腹腔注射氧嗪酸钾后动物血清尿酸水平显著升高，与正常对照组相比，有显著性差异，提示模型成功。给予本发明化合物后，血清尿酸水平明显低于模型对照组，且呈现剂量依赖性，与模型对照组相比差异有统计学意义；与等分子的别嘌醇比较，没有显著性差异，提示发明化合物降低尿酸的作用不亚于一线抗痛风药别嘌醇，见下表1所示表1发明化合物灌胃给药对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠尿酸的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>χ士s，η=10，aP<0.05，bP<0.01，与正常对照组相比;CP<0.05，dP<0.01，与模型组相比；与别嘌醇组相比，P>0.05(t-test).2.2本发明化合物降尿酸作用的时效关系雄性KM小鼠，体重1822g，随机分为12组，每组10只，分别为正常对照组、高尿酸模型对照组、发明化合物1、3、7天组、和阳性对照药别嘌醇1、3、7天组；分别灌胃给予等体积溶媒(0.5%CMC-Na)、本发明化合物1.99mg/kg和别嘌醇1.0mg/kg,按IOml/kg每天给药1次。参照文献[HallIH,ScovilleJP，ReynoldsDJ,SimlotR，DuncanP.Substitutedcyclicimidesaspotencialanti-goutagents.LifeSciences.1990，46:923-1927.StavricB，ClaymanS，GraddREA，HebertD.SomeinvivoeffectsintheratinducedbychlorprothixeneandpotassiumoxonatePharmacoIogyResearch，1975，7:117-124]腹腔注射尿酸酶抑制剂氧嗪酸400mg/kg，抑制尿酸酶活性，造成高尿酸血症小鼠，正常对照组则注射等体积0.5%CMC-Na溶液，注射后Ih灌胃给予末次剂量的供试化合物，2h后拔眼采血，3000rpm离心lOmin，取血清，采用磷钨酸法测定血清尿酸水平。结果表明本发明化合物和别嘌醇灌胃给药1个剂量后即显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，与模型对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05,0.01)，给药3天以后，本发明化合物降低高尿酸血症小鼠尿酸的作用弱于别嘌醇，提示本发明化合物的起效时间与别嘌醇类似，而降尿酸的效价若按等摩尔剂量比较，在本实验条件下弱于别嘌醇，见表2。表2本发明化合物灌胃给药降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠尿酸的时效关系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>P40为3，5，2，，4，-四羟基查尔酮.χ士s，n=10,aP<0.05,bP<0.01，与正常对照组相比；ep<0.05，dP<0.01，与模型组相比；fP<0.01与别嘌醇相比(t-test).(三)本发明化合物对次黄嘌呤诱导的高尿酸血症小鼠血尿酸的影响雄性KM小鼠，体重1822g，随机分为正常对照组、高尿酸模型对照组、发明化合物和阳性对照药别嘌醇组，每组10只动物；分别灌胃给予等体积溶媒(0.5%CMC-Na)、发明化合物3.98mg/kg和别嘌醇1.0mg/kg,按10ml/kg每天给药1次，共5次。参照文献方法[陈光亮，徐叔云.高尿酸血症动物模型研究进展[J].中国药理学通报，2004，20(4)369.]采用次黄嘌呤为诱导剂，造成高尿酸血症小鼠模型。灌胃给予动物末次剂量的受试化合物后30min，腹腔注射次黄嘌呤(上海晶纯试剂有限公司)200mg/kg，正常对照组则注射等体积0.5%CMC-Na溶液，30min后拔眼采血，3000rpm离心lOmin，取血清，采用磷钨酸比色法测定血清尿酸水平。结果表明，腹腔注射次黄嘌呤后动物血清尿酸水平显著升高，与正常对照组相比，有显著性差异，提示模型成功。给予发明化合物后，血清尿酸水平明显低于模型对照组，与模型对照组相比差异有统计学意义(表3)。表3本发明化合物灌胃给药对次黄嘌呤诱导高尿酸血症小鼠血清尿酸k平的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>“模型组0.5%CMC-Na""""187.6土丨6.§~...........................3,5，2’，4’-四羟基查尔酮_^98__14.6156.0±12.5::___—别嘌醇1.007ΓT^.9士16注:χ士s，η=10.*Ρ<0.05，**Ρ<0.01，与高尿酸血症模型对照组相比(t-test检验).(四)3，5，2'，4'-四羟基查尔酮初步的毒性和安全性研究选择健康的ICR小鼠20只，雄雌各半，体重18_22g，3，5，2',4'-四羟基查尔酮用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液，按最大浓度、最大体积40ml/kg体重灌胃给药，于上午9时灌胃一次，即为5.0g/kg/d(18.4mmol/kg)，给药后连续观察14天，记录小鼠中毒和死亡情况。灌胃给药后，小鼠未出现明显的异常反应，14天连续观察，未见小鼠出现任何中毒反应，活动自如，进食饮水和大小便均正常，体重正常增长，一般情况良好。20只小鼠无一死亡，处死尸检，各脏器未见肉眼可见的病理改变，测得3，5，2',4'-四羟基查尔酮小鼠灌胃给药的最大耐受量大于5.Og/kg，毒性远远小于别嘌醇(LD5tl=700mg/kg)。权利要求化合物3，5，2′，4′-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是以化合物3，5，2′，4′-四羟基查尔酮3，5，2′，4′-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的药物和保健品。FSA00000080594100011.tif2.根据权利要求1所述的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的3，5，2',4'-四羟基查尔酮明显竞争性抑制黄嘌呤氧化酶活性，其IC5tl为22.5μmol/L,抑制常数为17.4μmol/L。3.根据权利要求1、2所述的化合物3，5，2',4'_四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮以14.6μmol/kg(3.98mg/kg)剂量即能显著降低氧嗪酸钾或次黄嘌呤诱导的高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平。4.根据权利要求1、2所述的化合物3，5，2',4'_四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮以灌胃给药1个剂量后即显著降低氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05,0.01)。5.根据权利要求3所述的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮以灌胃给药1个剂量后即显著降低氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05,0.01)。6.根据权利要求1、2所述的化合物3，5，2',4'_四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的3，5，2',4'_四羟基查尔酮小鼠灌胃给药的最大耐受量大于5.Og/kg。7.根据权利要求3所述的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的3，5，2',4'-四羟基查尔酮小鼠灌胃给药的最大耐受量大于5.Og/kg。8.根据权利要求4所述的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的3，5，2',4'-四羟基查尔酮小鼠灌胃给药的最大耐受量大于5.Og/kg。9.根据权利要求5所述的化合物3，5，2',4'-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，其特征是所制备的3，5，2',4'-四羟基查尔酮小鼠灌胃给药的最大耐受量大于5.Og/kg。全文摘要化合物3，5，2′，4′-四羟基查尔酮作为制备防治高尿酸血症和痛风的应用，涉及含有机有效成分的药品用途。本发明化合物体外显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性，IC50为22.5μmol/L，系竞争性抑制剂。体内研究表明该化合物具有较强的抗痛风作用，14.6μmol/kg(3.98mg/kg)剂量即能明显降低氧嗪酸钾或次黄嘌呤诱导的高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，毒副作用小，小鼠灌胃给药的最大耐受量为5.0g/kg，毒性明显低于目前临床上使用的抗痛风药物别嘌醇、秋水仙碱和苯溴马隆等，可制备防治高尿酸血症和痛风的药物和保健品。文档编号A61K31/122GK101810602SQ20101014440公开日2010年8月25日申请日期2010年4月12日优先权日2010年4月12日发明者任洁,刘佳,朱华结,李玲,牛艳芬,范华芳申请人:昆明医学院;中国科学院昆明植物研究所