专利名称：麦冬多糖在制备促血管生成药物方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及麦冬多糖的医药用途，尤其是在制备促血管 生成药物方面的应用。
背景技术：
麦冬是常用滋阴中药，具有养阴生津，润肺清心的功能。临床用于冠心病、心绞痛 取得一定疗效。多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，广泛分布于动物、植物及微 生物中，目前已发现的活性多糖有几百种。多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，几乎 存在于所有的生物中，具有能量储存、结构支持防御功能和抗原决定性等多方面的生物功 能，有些多糖还有多种药理活性。由于多糖是自然界中含量最丰富的多聚物及其特有的性 质，它们很早就应用于食品和医药领域。现在多糖已成为食品添加剂、天然药物及保健品研 发中的重要组成部分。冠心病是冠状动脉狭窄或闭塞导致心肌缺血，从而影响心功能的临床常见心血管 疾病。在缺血心肌区域促进新生血管的形成是治疗缺血性疾病的另一个重要过程，近年来 通过治疗性血管增生以减轻心肌缺血逐渐成为目前研究的热点。血管新生疗法即是通过加 强新生侧枝血管的自然过程以维持冠状动脉渐进性闭塞时的血流量。血管生成在冠心病、 缺血性脑栓塞、骨折创伤及肿瘤等的治疗、恢复和预后中，具有重要意义。血管新生过程需要多种因子参与。生理情况下血管生长处于相对平衡状态，当发 生缺血缺氧及肿瘤等应激情况时平衡失控，血管新生的过程被激活，导致侧枝血管形成。以 往对冠心病发展过程中冠状动脉侧枝循环的研究主要集中在压力梯度及血流量等物理因 素，而目前研究发现在心肌缺血缺氧时，冠脉侧枝的形成可以减少或抵御心肌缺血或坏死， 保证血液的正常供给，而其中bFGF、VEGF的信使核糖核酸表达明显增多，说明侧枝循环的 建立可能与具有生物活性物质的作用有关。如果通过适当的途径给予促进血管生成的药物，可能会促使形成丰富的冠脉侧支 循环，以及冠脉侧支血管的生成与开放，满足心脏血供需要，即为“自身冠脉搭桥术”，就可 以减轻或防止心肌缺血坏死，预防和延缓缺血性心脏病和室壁瘤形成、改善临床症状和预 后，对于改善心功能有明显作用。
发明内容
本发明旨在提供麦冬多糖的医药用途。麦冬多糖可应用于制备促血管生成药物。同时，麦冬多糖可应用于制备治疗缺血 性疾病药物，如冠心病或心绞痛。由于微血管内皮直接参与血管新生，且在心脏器官广泛分布，因此可以利用人微 血管内皮细胞对中药多糖进行筛选和活性研究。血管生成的过程是毛细血管从已存在的血 管(原血管床)中以出芽方式形成新血管床的过程，包括内皮细胞的增殖和迁移、基底膜降解、腔道形成等环节，其中内皮细胞的管腔形成在血管生成过程中尤为重要。选择HMEC-I细胞为研究对象，利用Tube formation实验检测中药多糖对内皮细 胞管腔形成的影响，可筛选中药多糖，寻找具有促血管生成作用的中药多糖，并通过鸡胚绒 毛尿囊膜(CAM)模型进一步验证中药多糖对体内血管生成作用的影响。通过上述实验证明，麦冬多糖具有较明显的促血管生成活性，在体外能促进微血 管内皮细胞形成管腔结构；在体内能促进CAM的血管生成。这一结果是对其以往药理研究 成果的重要补充，为它用于冠心病的治疗提供了有利依据。血管生成治疗在冠心病等缺血性疾病患者中具有潜在的广泛的应用价值，寻求更 多促血管生成药物和方法尤其是适合于外周给药的有效药物，无疑具有重要的意义。中医 中药治疗冠心病等缺血性疾病有着悠久的历史和明确的疗效，其机理是否和血管生成有 关，至今国内外尚缺乏研究报告，应用管腔形成、CAM等模型加强这方面的研究，不仅可使我 们做到在治疗中有的放矢，且有利于药物资源的充分开发，做到物尽其用。具有促血管生成作用的中药多糖研究报道较少，通过筛选中药多糖，寻找具有促 血管生成作用的中药多糖不仅对多糖的药物学理论作出了新的贡献，更是多糖临床应用范 围强有力的扩充，为开拓中药多糖在心血管疾病临床应用提供强有力的实验依据。
图1为实施例1中，各组中药多糖影响体外微血管内皮细胞管腔结形成的显微镜 2为实施例1中，lug/ml lOOug/ml麦冬多糖影响体外微血管内皮细胞管腔结 形成的显微镜3为实施例2中，麦冬多糖促进CAM血管生成的显微镜图
具体实施例方式药品与试剂五种中药多糖(自制)，麦冬、川芎、红景天、丹参、三七药材分别经水回流提取， 浓缩，80%乙醇沉淀，制得棕褐色粉末；MCDB131培养基(美国Gibco)、高灭活胎牛血清、 非必须氨基酸、青、链霉素、0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液均购自美国Gibco公司； 磷酸盐缓冲溶液(PBS)自配；EGF(上海信谊制药总厂)；bFGF(成纤维细胞生长因子，美国 Biosource)；细胞培养用水为新鲜三蒸水；其它所用试剂均为分析纯。仪器与器材Hepa class 100 二氧化碳培养箱(英国 Thermo Electron) ；XDS — IB 倒置生物 显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)；5810R高速冷冻离心机(美国Beckman)。细胞培养人微血管内皮细胞株(Humanmicrovascular endothelial cells，HMEC-1)，购自 中科院上海药物所。采用MCDB131培养液(加入10%牛血清，100U双抗，20mM L-谷氨酰 胺，5mg EGF)，在37°C，5% C02条件下培养。实施例1管腔形成实验96孔扳中每孔加入60、1 Matrigel胶，轻轻摇晃培养板，使其铺平。侍Matrigel
4胶凝固后.每孔加人100、1对数生长期的HMEC-I细胞悬液，细胞数为3X IO4,再分别加 人各组中药多糖(每组10ug/ml)和bFGF。37°C、5% CO2条件下培养16h后，相差显微镜 (XlOO)观察各试验组血管腔形成情况。以形成的管腔数量表示不同各组HMEC-I细胞的血 管腔形成能力。 结果表明，麦冬多糖能促进人微血管内皮细胞形成管腔结构。与空白对照组相比， 麦冬多糖处理组与bFGF阳性对照组在显微镜下均可见内皮细胞排列成管腔结构明显增 多，如图1和表1所示。其他四种中药多糖未见有明显的促血管生成活性，可能不是其所在 的中药在促血管生成活性作用方面的活性组分。表1各组中药多糖对管腔血管生成的影响^切) 注与空白对照组相比，#P< 0.01。经筛选得到具有促血管生成的中药多糖，即麦冬多糖，再进行相应的浓度梯度考 察，分别考察lug/ml，10ug/ml, 100ug/ml浓度的该中药多糖对血管腔形成的影响。利用体外管腔形成实验进一步考察麦冬多糖对血管内皮细胞管腔形成的影响，结 果表明麦冬多糖能促进人微血管内皮细胞形成管腔结构，在lug/ml至lOOug/ml范围内，表 现出一定的浓度依赖性趋势，如图2和表2所示。表2麦冬多糖对管腔血管生成的影响(iis) 注与空白对照组相比，#P< 0.01。实施例2鸡胚绒毛尿囊膜实验(I)CAM 的制备
将种蛋用含0. 01 %的新洁尔灭水溶液擦洗后晾干，放入37°C恒温孵箱中孵育(孵 箱中放人装有饱和NaCl溶液的托盘以保持湿度)。每天转蛋两次。孵育7d时，将鸡蛋在超 净台中用体积分数为0. 75的乙醇擦拭消毒。用无菌砂轮在鸡胚的气室极打磨出一个边长 约2cm的三角形窗口，用无菌镊子揭去蛋壳及其附着的部分卵壳膜，暴露卵壳膜的下半部 分。使卵壳膜与尿囊膜分离，用镊子从分离处轻轻揭去卵壳膜。分别以生理盐水和bFGF为 阴性和阳性对照，每组10胚，中药多糖加样量为每蛋5 μ g/ml。然后用无菌的透明胶带将窗 口覆盖。再将鸡胚放入恒温箱中继续孵育。(2) CAM的记录分析CAM模型制备完成后，放入恒温箱中继续孵育48h，揭去封窗的透明膜，直接照相 记录结果。解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管，以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边 缘)Imm范围内为一级血管，以实验部位边缘5mm处为二级血管，凡属趋向性生长的血管，即 为载体从中心发出，与滤膜半径的夹角小于45度者均予计数，而穿行、绕行的血管则不算 在内，分别观察计数，比较各组之间的差异。所有数据均以表示，采用SPSS 13. 0统计软件进行统计分析，组间均数比较 用t检验，多个样本均数比较用单因素方差分析。结果表明，麦冬多糖可以促进CAM的血管生成，见图3，表3。麦冬多糖给药处理可 以使CAM血管数比生理盐水组明显增加，血管分支增多，但较bFGF组要少，说明麦冬多糖能 促进新生血管形成。表3麦冬多糖对CAM血管生成的影响(^s)
组别胚数一级It管二级血管
MDG-I1026.13 ± 4.33 #53.46 ±12.31*
bFGF1030.31 士 5.11 #65.63 ± 12.88 #
生理盐水1012.38 ±2.5130.38 ±7.99 注与生理盐水组相比，*P < 0. 05，#P < 0. 01。
权利要求
麦冬多糖在制备促血管生成药物方面的应用。
2.麦冬多糖在制备治疗缺血性疾病药物方面的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的缺血性疾病为冠心病或心绞痛。
全文摘要
本发明涉及了麦冬多糖的用途。通过管腔形成实验和鸡胚绒毛尿囊膜实验显示，可将麦冬多糖用于制备促血管生成药物和缺血性疾病药物，如制备治疗冠心病和心绞痛的药物。
文档编号A61P9/10GK101919874SQ20101016822
公开日2010年12月22日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者裴明, 许世巍 申请人:上海市七宝中学