β-咔啉钌配合物及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：β-咔啉钌配合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域，尤其涉及β-咔啉钌配合物及其制备自噬诱导剂作为 抗肿瘤药物的用途。
背景技术：
1. β -咔啉钌配合物简介近年来，以具有生物活性的分子作为配体的金属配合物的发展，为追求高效，针对 靶向活性的新药设计提供了更为广阔的空间。这类配合物的研究表明，金属的固有属性和 生物活性配体分子的结合为克服当前的耐药性途径的可能性提供了线索。β -咔啉生物碱是一类人工合成和天然化合物，具有包括镇静，抗焦虑，催眠，抗惊 厥，抗肿瘤，抗病毒，抗寄生虫和抗菌等广谱生物药理学活性。(曹，彭等。2007年)据报 道，β-咔啉生物碱可以通过多种机制发挥抗肿瘤作用的活性，如插入DNA(肖，林等。2001 年)，抑制拓扑异构酶I和II (Funayama,Nishio等。1996年)，抑制⑶K(细胞周期蛋白依 赖激酶)(李，梁等。2007年)和IkB激酶(Castro，Dang等。2003年)。合成出了一类 以-1，-3和-9位不同亚基取代的β -咔啉为基本骨架的衍生物以阐释这种化合物的构效 关系(曹，彭等。2007)。由于其与苯二氮，咪唑啉，中枢神经系统(CNS)羟色胺受体的亲和 力，β-咔啉显示了相当的急性毒性，阻碍了其作为抗癌药物的临床应用。(陈，赵等。2005 年)一定数量的钌化合物已被证明可以显示出显著的抗癌活性，两个钌(III)配 合物已成功地进入临床试验阶段，即NAMI-A(Alessio, Mestroni等。2004) ([ImH] Ltrans-RuCl4 (DMSO) (Im)]，其中 Im =咪唑，DMSO = 二甲基亚砜和 KP1019 (Hartinger， Jakupec 等。2008) ([IndH] [trans_RuCl4(Ind)2]，其中 Ind =吲唑)· Ru(II)。钌(II)也已 作为抗癌药物研究物。含不稳定集团如Ru(II) “半三明治”芳烃复合物的化合物显示出在 体内和体外双重活性(Bugarcic，Habtemariam 等。2009 年)。一些 α -[Ru(II) (azpy)2Cl2] (azpy = 2-(苯)吡啶)型复合物相对于顺钼显示出类似甚至更好的细胞毒性潜力(Hotze， Bacac等。2003年)。另据报道，饱和配位的钌(II)多吡啶配合物[Ru (bpy)2 (dppn) ]Cl2 带扩展芳香配体在低浓度下针对两株抗肿瘤细胞展现出较强的细胞毒活性(IC50值)。 (Schatzschneider, Niesel ο 2008)。2.自噬诱导剂用于治疗癌症简介自噬作用(autophagy)是细胞在饥饿、能量缺乏等代谢压力下的一种生理过程， 细胞内的蛋白、细胞器和胞质通过自噬作用被包裹、消化，降解成核苷、氨基酸和脂肪酸循 环利用，合成新的大分子和ATP，从而维持细胞的正常代谢和生存。同时，在某些情况下它可 以选择性地清除某些细胞成分，如受损或多余的过氧化物酶体、内质网、线粒体、DNA，减少 异常蛋白、细胞器的堆积，维持细胞自我稳态。自噬作用不仅具有维持细胞自我稳态、促进 细胞生存的作用，过度上调的自噬作用也可以引起细胞死亡，即“自噬性细胞死亡”，也称为 II型程序化细胞死亡。
自噬作用在机体的生理和病理过程中都能见到，与人类的多种疾病，尤其是恶性 肿瘤存在密切关系。在代谢压力下，肿瘤细胞可以依靠自噬作用维持生存和活性。但在进 一步研究中，却发现了自噬抑制与肿瘤的发生存在相关性。通过对自噬作用的研究，进一步 揭示了肿瘤发生、发展的潜在机制，为肿瘤的预防和治疗提供了新的思路。 自噬诱导剂(Autophagy inducer):由于自噬作用的缺失可以造成细胞突变的累 积，形成肿瘤甚至转移灶，药物作用可通过促进自噬作用，预防肿瘤的发生发展，或使肿瘤 在过度的自噬作用下发生自噬性死亡。这一设想在治疗与异常蛋白积聚有关的退行性疾病 中取得了一定的效果。目前的许多化疗药物及放疗都可以增加肿瘤细胞中的自噬小体数 量。它莫西芬(Tamoxifen)可以提高MCF7乳腺癌细胞的自噬水平，并且促进肿瘤细胞的死 亡。同时，自噬也可抑制肿瘤的发生。首先，自噬可清除受损细胞器以避免有害自由基及突 变的发生，从而避免更大的损伤。然而，在人类多种肿瘤中，自噬诱导基因Beclinl存在缺 失或突变，从而失去对肿瘤的抑制作用。在体外实验中，将BECNl重新导人人乳腺癌细胞株 MCF-7中，自噬可被诱发，从而抑制细胞增殖及肿瘤形成。其次，自噬可限制DNA损伤，维持 基因组完整性。在永生化鼠肾上皮细胞中，自噬活性降低可导致细胞DNA损伤，基因扩增， 染色体非整倍性等。这种基因组的不稳定增加了致癌性突变率，促进了肿瘤的发生。再次， 自噬可抑制细胞生长，诱发凋亡性细胞死亡。透射电镜检测常被认为是检测自噬体的金标准，在透射电镜下可见损伤的细胞 器，如肿胀变性的线粒体，其周围出现空泡状双层膜样结构，继而双层膜环绕成自噬体，并 与溶酶体融合、消化，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。肿瘤复发是临床上的一个极其常见而又棘手的问题。原发肿瘤被根除后，经过长 时间的“休眠期”，肿瘤出现复发。而且，其恢复增殖能力的过程是迅速而高效的。真正致命 的，往往并不是那些新生的原发肿瘤细胞，而是那些经历长时间的代谢压力后“重获新生” 的残余细胞。这些残余的肿瘤细胞是如何恢复活性的，是亟需解决的问题，也是肿瘤治疗的 关键。而自噬作用很可能是问题的答案。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的β "咔啉钌配合物。本发明的目的之二是提供上述β "咔啉钌配合物的制备方法。本发明的目的之三是提供上述β-咔啉钌配合作为制备抗肿瘤药物的应用。本发明的技术方案是一种β-咔啉钌配合物，其分子式为[Ru(N~N)2(Nh)xClY] (A"A)Z，其中 N~N 选自 bpy 或 phen ；A~A 选自 PF6 或 SO3CF3 ；X = 1 或 2，Y = 2-Χ,Ζ = 1 或 2。一种β-咔啉钌配合物，其分子式为[Ru (Nl)2 (I-Py-β C)] (PF6)2其中Ν~Ν选自 bpy, phen 或 DIP。上述配合物作为制备抗肿瘤药物的应用。上述抗肿瘤药物组合物，含有上述β -咔啉钌配合物作为有效成分以及药学上可 接受的辅助剂。本发明在分子机理上证明了 β-咔啉钌配合物可以用于治疗癌症，且效果优于广 泛应用的顺钼和在临床试验中的ΝΑΜΙ-Α，β -咔啉钌配合物作为细胞自噬诱导剂用于治疗 癌症填补了现有技术的空白，为开发新一代高效的治疗恶性肿瘤的药物开拓了新思路。


图 1 为[Ru (bpy) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 晶体结构图；
图 2 为[Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的晶体结构图；图3为I-Py- β C晶体结构图；图4 为[Ru (bpy) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 晶体结构图；图5Α-5Ε分别为β -咔啉钌配合物(Β1-Β3)诱导肿瘤细胞自噬系列实验附图。
具体实施例方式本发明的β-咔啉钌配合物，其分子式为[Ru(N~N)2(Nh)xClY](A~A)z，其中Ν~Ν选 自bpy或phen ；A~A选自PF6或SO3CF3 ；X = 1或2，Y = 2-Χ,Ζ = 1或2 ；上述配合物对应的 阳离子部分的分子结构式如Α1、Α2、Α4、Α5所示 上述配合物的制备方法，将 cis-[Ru (bpy) 2C12] · 2H2O 或 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 与9H-吡啶[3，4-b] B引哚(Norharman)溶于乙醇水溶液，回流，减压蒸发，过滤去除没有反应 的9H-吡啶[3，4-b] Π引哚配体，加入NH4PF6，析出产物后清洗然后真空干燥，纯化，重结晶，得 到[Ru (bpy)2 (Nh) Cl] (PF6)或[Ru (phen)2 (Nh) Cl] (PF6)；或者，将 cis-[Ru (bpy)2Cl2] · 2H20 或 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 与与 AgSO3CF3 反应后滤去 AgCl，加入 9H-吡啶[3，4_b]吲哚， 回流，反应混合物冷却至室温后再次过滤，缓慢蒸发母液得到[Ru (bpy) 2 (Nh)2] (SO3CF3)2或 [Ru(Phen)2(Nh)2] (SO3CF3) 2，反应式如下
一种β-咔啉钌配合物，其分子式为[Ru (Ν~Ν)2 (I-Py-β C)] (PF6)2其中Ν~Ν选自 2,2'-联吡啶(bpy)，l，10-邻菲罗啉(phen)或4，7-二苯基-1，10-邻菲罗啉(DIP)；上 述配合物对应的阳离子部分的分子结构式如Bi、B2、B3所示 上述配合物的制备方法，首先将吡啶-2-甲醛(pyridine-2-carboxaldehyde)和色胺投入苯甲醚加热，力口 入钯/碳(Pd/C)后回流，反应混合物趁热过滤，旋蒸至滤液呈暗绿色，用甲醇溶解，蒸发得 到 1-(2_ 吡啶)-β -咔啉(l-(2-pyridyl)-0-carboline)；然后将1-(2-批啶)-β-咔啉与 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20、 cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20 或 cis-[Ru (DIP)2Cl2] · 2H20 中的一种溶于乙醇的混合液通氩气 回流，直至呈现明显的红色液体，趁热过滤后真空浓缩，加入NH4PF6后混合液放入冰箱过夜 冷却，过滤得到产物，用乙醇/水混合物重结晶，真空干燥，即得；反应式如下
上述配合物作为制备抗肿瘤药物的应用。上述抗肿瘤药物组合物，含有上述β -咔啉钌配合物作为有效成分以及药学上可 接受的辅助剂。以下通过具体的例子对本发明作进一步说明。试齐[J:9Η- 口比唆[3, 4-b] 口引哚(Snyder, Walker et al. 1949), cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20(B. P. Sullivan 1978)，cis_[Ru(phen)2Cl2] · 2H20(B. P. Sullivan 1978), cis-[Ru(DIP)2Cl2] ·2Η20(Β. P.Sullivan 1978 ；Puckett andBarton 2008), [(Imidazole)H] [trans-RuCl4(DMSO) (Imidazole)] (NAMI-A) (Mestroni 1998)由文献方法合成。1.钌(II)配合物[Ru (N~N)2(Nh)XC1Y](A~A)Z 的合成，其中 N~N 选自 bpy 或 phen ； A"A 选自 PF6 或 SO3CF3 ；X = 1 或 2，Y = 2_X，Z = 1 或 2。1. 1 [Ru (bpy) 2 (Nh) Cl] (PF6)的合成(Al)cis-[Ru (bpy)2C12] · 2H20(0. 520g, 1. Ommo 1)和 9H_ 吡啶[3,4-b]吲哚(0. 252g, 1. 5mmol)溶于50mL 1 1乙醇水溶液(ν/ν)，混合液用氩气清洗15分钟然后用力搅拌回 流8小时。将深红色溶液减压蒸发至IOmL再加入30mL水。剩余没有反应的9H-吡啶[3， 4-b]吲哚配体用过滤法去除。红色溶液中加入过量的NH4PF6保证了足量的红色析出物。产 物用水(20mLX2)洗后用(20mL)乙醚清洗，然后真空干燥。原产物用利用甲苯-乙腈(ν/ ν = 1 2)做洗脱液的氧化铝柱层析法纯化，再在丙酮-乙醚中重结晶。产量0.607g， 81%。C31H24ClF6N6PRu ·H2O 理论值C 47. 73%,H 3. 36%,N 10. 77%;实验值C 47. 62%,H 3. 35%;N 10.81%。ESI-MS(CH3OH) :C31H24ClN6Ru+[M-PF6]+m/z 理论值 617. 1，实验值 616. 8。1.2 [Ru (bpy) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的合成(A2)在(250mL)水甲醇中加入(0.550g，2. 2mmol) AgSO3CF3 与(0. 520g, 1. Ommol) cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 反应获取，过滤 AgCl 后，加入(0. 403mg，2. 4mmol) 9H-吡啶[3， 4-b]吲哚，溶液回流3天。反应混合物冷却至室温后再次过滤。缓慢蒸发母液得到红色晶体用于X射线衍射，晶体结构如图1所示。产量0. 881mg, 84%。C44H32F6N8O6RuS2理论值C 50. 43%, H 3. 08%, N 10. 69% ；实验值C50. 37%，H 3. 09%, N 10.65%。ESI-MS(CH3OH) 理论值 C43H32F3N8O3RuS+[M-SO3CF3]+m/z 899. 1，实验值 898. 8，C42H32N8Ru2+[M_2S03CF3]2+m/z 理 论值 399. 1，实验值 399. 0。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 11. 48 (s，2H)，9. 20 (d，J = 5. 0Hz，2H)， 8. 65-8. 59(m，6H)，8. 25 (d, J = 8. 0Ηζ，2Η)，8· 19 (t, J = 7. 5Ηζ，2Η)，8· 11 (q, J = 6. OHz, 6Η)，8· 05 (t，J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 91 (t，J = 7. 0Ηζ，2Η)，7· 61 (d，J = 3. 5Ηζ，4Η)，7· 57 (t, J = 7. 0Ηζ，2Η)，7· 31-7. 28 (m，2Η) ·1· 3 [Ru (phen) 2 (Nh) Cl] (PF6)的合成(Α4) 与1. 1 例子的方法相同，使用(0. 570g，l_ol) cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20 替代 cis-[Ru(bpy)2Cl2] ·2Η20 进行合成。产量0. 632g，78 %。C35H24ClF6N6PRu · H2O 理论值C 50. 76%,H 3. 16%,N 10. 15%;实验值C 50. 61%,H 3. 15%,N 10. 19%。ESI-MS(CH3OH) C35H24ClN6Ru+[M-PF6]+m/z 理论值 665. 1，实验值 664. 8。1.4 [Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的合成(A5)与1. 2 例子的方法相同，使用 cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20(0. 570g，Immo 1)， AgSO3CF3(0. 550g，2. 2mmol)禾Π 9Η-吡啶[3，4_b]吲哚(0. 403mg，2. 4mmol)来合成。产 量0· 872g，80 %。C48H32F6N8O6RuS2 理论值C 52.60 %，H 2. 94%, N 10.22%;实验值 C 52. 75%, H 2. 95%, N 10.15%。ESI-MS(CH3OH) =C47H32F3N8O3RuS+[M-SO3CF3]+m/ζ 理论值 947. 1，实验值 946. 8，C46H32N8Ru2+[M_2S03CF3]2+m/z 理论值 375. 1，实验值 375. 0。其晶体结 构图如图 2 所示。1H NMR (ppm, (CD3)2SO) 11. 42(s，2H)，9· 67 (d, J = 5. OHz, 2H) ,8. 90 (d, J =8. 5Hz，2H)，8. 78(s，2H)，8. 61(d，J = 8. 5Hz，2H)，8. 34-8. 29(m，6H)，8. 26 (d, J = 6. 5Hz, 2H)，8. 21 (t，J = 9. 0Hz，4H)，8. 07 (d, J = 6. 5Hz，2H)，7. 74 (q, J = 5. 0Hz，2H)，7. 58 (t, J = 3. 5Hz，4H)，7. 28-7. 24(m，2H).2.钌(II)配合物[Ru(N"N)2(l-Py-^ C)] (PF6)2 的合成，其中 N~N 选自 bpy, phen 或DIP2. 11-(2-批啶)-β _ 咔啉(l-Py—β C)的合成将吡啶-2-carboxaldehyde(535mg, 5. OOmmo 1)和色胺(8IOmg, 5. OOmmol)投入 200mL干燥苯甲醚的混合物在105°C加热2小时，加入10%钯/碳(1. 20g)后回流22h。反 应混合物趁热过滤，旋蒸至滤液呈暗绿色，用甲醇(20mL)溶解，溶液缓慢蒸发可得到可用 于测X射线衍射的黄色晶体，晶体结构图如图3所示。过滤后可得纯配合物(1. 05g,86% )。 (Hassani, Cai et al. 2005) 2. 2 [Ru (bpy) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(Bi) 1-(2-吡啶)-β -咔啉(0. 245g, 1. Ommol)和 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20(0. 520g， 1. Ommol)溶于75%乙醇(IOOmL)的混合液通氩气回流8小时。呈现明显的红色液体，趁热 过滤后真空浓缩。加入NH4PF6 (0. 244g, 1. 5mmol)后混合液放入冰箱过夜冷却。过滤得到产 物，用乙醇/水混合物重结晶，真空干燥。产量0. 797g (84% )0室温下用甲醇溶液缓慢蒸发 得到可用于X射线衍射的晶体，结构图如图4所示。元素分析=C36H27F12N7P2Ru ·Η20理论值C 44. 73%,H 3. 02%,N 10. 14%;实验值C 44. 65%,H 3. 03%,N 10.17%。ESI-MS(CH3CN) C36H27F6N7PRu+[M-PF6]+m/z 理论值 804. 1，实验值 803. 9 ;C36H27N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理论值 329.6，实验值 329.8。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 12. 36 (s, 1H) ,9. 06 (d, J = 8. OHz, 1H),8.85 (q, J = 8· 5Ηζ，4Η)，8· 31(m，3H)，8. 19 (q, J = 10. 0Hz,2H) ,8. 14 (q, J = 6.5Hz，2H)， 7. 88 (d, J = 5. OHz, 1H), 7. 86 (d, J = 8. OHz, 1H), 7. 78-7. 71 (m，4H)，7. 64 (d，J = 5. 5Hz, 1H)，7. 57-7. 52 (m, 3H)，7. 48 (t，J = 6. OHz，2H)，7. 44-7. 40 (m, 2H).
2. 3 [Ru (phen) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(B2)与2. 2 合成方法相同，用 cis-[Ru(Phen)2Cl2] · 2H20(0. 570g, 1. Ommo 1)替代 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20。C40H27F12N7P2Ru · H2O 理论值:C 47. 35%, H 2. 88%, N 9. 66% ； 实验值C 47. 47%,H 2. 87%,N 9. 64% ESI-MS(CH3CN) C36H27F6N7PRu+[M-PFj+m/z 理论值 852. 1，实验值 851. 9 ；C36H27N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理论值 353. 6，实验值 353. 8。1H NMR (ppm, (CD3)2SO) 12. 34 (s，1H)，9. 07 (d，J = 8. 0Hz，1H)，8. 81 (q，J = 4. 0Hz,2H) ,8. 74 (t, J =
9.5Ηζ，2Η)，8· 41-8. 36(m，4H)，8· 27 (t, J = 8. 0Hz，2H)，8· 24 (d, J = 4. OHz, 1Η)，8· 18 (d, J =5. 5Hz, 1Η)，8· 13 (d, J = 4. OHz, 1Η)，7. 98 (t, J = 6. 5Ηζ，2Η)，7· 90 (q, J = 5. OHz, 1Η)， 7· 86-7. 83(m，3H)，7· 75-7. 70(m，3H)，7· 44(t，J = 6. OHz, 1Η) ,7. 48 (t, J = 6·5Ηζ，1Η)，
7.40 (d, J = 8. OHz，1Η).2. 4 [Ru (DIP) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(Β3)与2. 2 合成方法相同，用 cis-[Ru(DIP)2Cl2] · 2Η20(0. 872g, 1. Ommo 1)替代 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20。C64H43F12N7P2Ru · H2O 理论值:C 58. 27%, H 3. 44%, N 7. 43% ； 实验值C 58.38 %，H 3. 39 %, N 7. 37 ESI-MS(CH3CN) C64H43F6N7PRu+[M-PF6]+m/z 理 论值 1156. 2，实验值 1155. 9 ；C64H43N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理论值 505. 6，实验值 505. 8。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 12. 42 (s, 1H) ,9. 14(d,J = 8. 5Hz, 1H)，8· 36(t, J = 5. OHz, 1H)，8· 32 (d, J = 6. OHz, 1Η)，8· 30 (d, J = 6. OHz, 1Η)，8· 27 (q, J = 3. 5Ηζ，6Η)，8· 22 (d, J = 5. 5Hz, 1Η)，
8.01 (d, J = 5. OHz, 1Η)，7. 91 (d, J = 5. 5Hz, 1Η)，7. 88 (d, J = 8. 5Hz, 1Η)，7. 85 (d, J = 6. OHz, 1Η)，7· 78 (q, J = 5. 5Ηζ，2Η)，7· 74 (t, J = 8. OHz, 1Η)，7· 69-7. 60 (m，22Η)，7· 56 (t, J =6. OHz, 1Η)，7. 42 (t, J = 8. OHz, 1Η) ·3.实验及分析3. 1 β _咔啉钌配合物肿瘤细胞抑制活性IC5tl测试使用!fepG2和HeLa两种细胞进行肿瘤细胞抑制活性IC5tl的测试将细胞以约105个/mL的密度接种于96孔板，每孔接种100 μ L，置CO2培养箱中 培养至对数生长期。然后按预设的浓度梯度加入待测样品，每一梯度至少3个重复。对照 组加入等体积的溶解样品用的溶剂。继续培养48小时后，每孔加入20 μ 1的MTT(5mg/mL)， 然后置于37°C温育4小时。小心除去上清后，每孔加入100 μ 1的DMS0，振荡约IOmin溶解 沉淀，随后用酶标仪检测OD值，波长630nm。用下式求出每一样品浓度下的细胞存活率存活率％=样品组平均OD值/对照组平均OD值χ100%以细胞存活率对药物浓度作图，按作图法求出每个样品细胞存活50%的值，即 IC50值(见表1)。表 1.
表1.使用肌1~方法检测配合物41^2^4^5和81，82，83对两种癌细胞株0fepG2 和HeLa)的IC5tl值，并用临床广泛应用的顺钼(cisplatin)作为对照。从表格数据中可以 看到在进行配合物合成后使得合成产物的IC5tl值明显下降，使其具有更高的抗癌活性，其 中A2，A4，A5和B3更是优于现在临床广泛应用的顺钼，极具开发潜力。3. 2 β -咔啉钌配合物(Β1-Β3)诱导肿瘤细胞自噬系列实验3. 2. 1透射电子显微镜(TEM)HeLa细胞(5 X IO5) 37°C时处理24h。细胞洗两次后用2% 4°C的戊二醛固定1小时， 再用2%的四氧化锇固定。细胞用50%，70%，80%，90%和100%乙醇连续清洗脱水，然后 嵌入Spurrs树脂。获得超薄切片，安装进铜网，用醋酸铀和柠檬酸铅复染，使用JEM-100CX 透射电子显微镜进行观察。使用Eversmart Jazz程序(Scitex)进行图像扫描和拍摄。如图5A所示，TEM图像显示配合物处理24小时后HeLa细胞的超微结构。a :100μΜ 配合物1处理后的HeLa细胞。b :50 μ M配合物2处理的HeLa细胞。c :2. 5 μ M配合物3处 理的HeLa细胞。在a，b，c中可以观察到大量的自噬空泡。Insert 高倍率的典型的自噬 空泡。比例尺(a-c) 5 μ m，(放大图)1 μ m。3. 2. 2质粒转染按照jetPEI 转染试剂制造商的说明(Q-biogen，法国)将绿色荧光蛋白标记的 LC3 (GFP-LC3)质粒转染进HeLa细胞(GFP-LC3，由中华人民共和国广州中山大学陈忠平教 授提供)。每24孔板转染1 μ gGFP-LC3表达质粒。经过20小时，用配合物1_3处理细胞， 使用荧光显微镜(Axio Observer ZLCarl Zeiss，德国)检测GFP-LC3的荧光以及计算空 泡(自噬体)中GFP-LC3的蛋白率。如图5B所示，GFP-LC3的细胞定位检测Ru(II)配合物1_3诱导细胞自噬的能力。将HeLa细胞铺在盖玻片上生长至70%，然后转染GFP-LC3质粒，细胞用相应浓度的配合物 1-3处理，使用多聚甲醛固定，然后用显微镜观察。Ru(II)处理后，细胞中GFP-LC3出现点 状结构，说明了自噬体相关的自噬标志分子LC3-II出现。3. 2. 3自噬泡(AVO)的丫啶橙(AO)定量染色HeLa细胞加入或不加入配合物1_3培养24小时。为了用于显微镜研究，用PBS 洗两次贴壁生长的细胞，用含培养基的1 μ g/mL丫啶橙(AO)染色，使用荧光显微镜(Axio Observer Zl, Carl Zeiss，德国)立即使用490nm带蓝色滤光器激发波长和515nm长通障 碍滤光器检测。为用于流式细胞仪研究，将细胞从60mm毫米皿(Corning)上刮下，用胰蛋白 酶-EDTA和用PBS洗两次。用丫啶橙(AO)染色15分钟后，收集细胞至苯酚无红色生长培 养基。使用488nm蓝色光波长激发10000个细胞的绿色(510-530nm)和红色(650nm)的荧 光发射由FACSCalibur (Becton Dickinson)的CellQuest软件进行检测和计算。如图5C所示，在12小时计数自噬体的形成，数据为GFP-LC3-转染的含点状荧光细胞的比率。计数至少300个GFP-LC3-转染细胞，0. 1 % DMSO作为对照也包含在内。如图5D所示，丫啶橙(AO)染色的HeLa细胞12小时处理后用荧光显微镜进行 检测。大型橙色染色为AVOs (自噬体的标记)。在没有转染的细胞中没有发现AVOs。a， control ；b, 100 μ M配合物1_处理细胞；c，50 μ M配合物2-处理细胞；d，2. 5 μ M配合物 3-处理细胞。比例尺1μπι。如图5Ε所示，使用FACS扫描定量AO染色的AVOs。细胞用配合物处理后12小时 进行AO体外活体染色。a，control ；b, 100 μ M配合物1_处理细胞；c，50 μ M配合物2-处 理细胞；d，2. 5μ M配合物3-处理细胞。显示经过Ru(II)配合物1_3处理，处理后的细胞 的AVO数量大幅增加。结论在分子机理上证明了 β-咔啉钌配合物可以用于治疗癌症，且效果优于广 泛应用的传统金属配合物顺钼和在临床试验中的钌系配合物ΝΑΜΙ-Α，其中系列B可以作为 细胞自噬诱导剂用于治疗癌症，填补了化合物作为自噬诱导剂治疗癌症的空白。
权利要求
β-咔啉钌配合物，其分子式为[Ru(N^N)2(Nh)XClY](A^A)Z，其中N^N选自bpy或phen；A^A选自PF6或SO3CF3；X＝1或2，Y＝2-X，Z＝1或2；上述配合物对应的阳离子部分的分子结构式如A1、A2、A4、A5所示FSA00000129175200011.tif
2.权利要求1所述配合物的制备方法，其特征在于将 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20 或 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20 与 9H-吡啶[3，4_b]吲哚 溶于乙醇水溶液，回流，减压蒸发，过滤去除没有反应的9H-吡啶[3，4-b]吲哚配体，力口 入NH4PF6，析出产物后清洗然后真空干燥，纯化，重结晶，得到[Ru(bpy)2(Nh)Cl] (PF6)或 [Ru(phen)2(Nh)Cl] (PF6)；或者，将 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 或 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 与与 AgSO3CF3 反应后 滤去AgCl，加入9H-吡啶[3，4-b]吲哚，回流，反应混合物冷却至室温后再次过滤，缓慢蒸发 母液得到[Ru (bpy)2 (Nh)2] (SO3CF3)2 或[Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3)2 ； 反应式如下
3.权利要求1所述配合物作为制备抗肿瘤药物的应用。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，含有权利要求1所述β-咔啉钌配合物作为有 效成分以及药学上可接受的辅助剂。
5.β-咔啉钌配合物，其分子式为[Ru(N~N)2(l-Py-i3C)] (PF6)2其中Ν~Ν选自bpy，phen 或DIP ；上述配合物对应的阳离子部分的分子结构式如Bi、B2、B3所示
6.权利要求5所述配合物的制备方法，其特征在于首先将吡啶-2-甲醛和色胺投入苯甲醚加热，加入钯/碳后回流，反应混合物趁热过 滤，旋蒸至滤液呈暗绿色，用甲醇溶解，蒸发得到1- (2-吡啶)-β -咔啉；然后将 1-(2-批啶)-β _ 咔啉与 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20、cis-[Ru(phen)2C12] · 2H20 或cis-[Ru (DIP)2Cl2] · 2H20中的一种溶于乙醇的混合液通氩气回流，直至呈现明显的红色 液体，趁热过滤后真空浓缩，加入NH4PF6后混合液放入冰箱过夜冷却，过滤得到产物，用乙 醇/水混合物重结晶，真空干燥，即得；反应式如下
7.权利要求5所述配合物作为制备细胞自噬诱导剂的应用。
8.权利要求5所述配合物作为制备抗肿瘤药物的应用。
9.根据权利要求8所述的抗肿瘤药物，含有权利要求5所述β-咔啉钌配合物作为有 效成分以及药学上可接受的辅助剂。
全文摘要
本发明公开了一种β-咔啉钌配合物，其分子式为[Ru(N^N)2(Nh)XClY](A^A)z，其中N^N选自bpy或phen；A^A选自PF6或SO3CF3；X＝1或2，Y＝2-X，Z＝1或2；或者，其分子式为[Ru(N^N)2(1-Py-βC)](PF6)2其中N^N选自bpy，phen或DIP。本发明在分子机理上证明了上述β-咔啉钌配合物可以用于治疗癌症，且效果优于广泛应用的传统金属配合物顺铂和在临床试验中的钌系配合物NAMI-A，β-咔啉钌配合物作为细胞自噬诱导剂用于治疗癌症填补了现有技术的空白，为开发新一代高效的治疗恶性肿瘤的药物开拓了新思路。
文档编号A61K31/4745GK101845060SQ201010173100
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者吴寿海, 彭文烈, 徐安龙, 朱一平, 王旻谞, 谭彩萍, 赖森森, 连武 申请人:中山大学