诱导dna构象转换的钌配合物及其制备方法

专利名称：诱导dna构象转换的钌配合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导DNA构象转换的钌配合物及其制备方法和应用，尤其是一种对poly(dA-dT).poly(dA-dT)具有特异性识别作用的诱导B-DNA和Z-DNA构象之间转换的钌配合物及其制备方法。
背景技术：
自20世纪70年代末被首次报道以来，Z-DNA逐渐受到人们关注，并成为研究的热点[1]。 Z-DNA在人类基因表达中发挥着重要作用，参与DNA的处理事件和基因的不稳定性；Z-DNA的形成序列会增加细胞系统的重组频率、基因的缺失、易位。虽然Z-DNA生物功能及其相关的蛋白还没有被充分理解，但各种实验及临床证据表明许多生物过程都需要Z-DNA的参与，Z-DNA的形成与癌症等疾病发生有关，为相关疾病的预防及治疗提供了新的靶点[2]。因此，研究Z-DNA的形成及其功能具有十分重要的理论意义及应用价值。
许多化合物已经被研究证明可以使DNA由B型转换为Z型并与Z-DNA特异性结合。如 一价的碱金属离子在高盐浓度下(Na+ 2.3 M ， Cs+~4.7 M)可以4吏DNA由B型转换为Z型，Mg2+, Ca2+,和 Ba2+可以使poly(dG-dC).poly(dG-dC)形成Z-DNA。而二价的过渡金属Zn2+, Cu2+, Mn2+, Co2+，和N产由于容易和鸟。票呤上的N7配位，在较低的浓度就可以导致DNA由B型转换为Z型[3-6]。抗癌药物(+)-daunorubicin可以选择性的结合右手螺旋B-DNA,并将Z-DNA转换为B-DNA,而(-)-daunorubicin (WP900)可以选择性结合Z-DNA,也可将B-DNA转换为Z-DNA[7]。然而迄今为止，多数化合物都是可以导致poly(dG-dC).poly(dG画dC)形成Z-DNA,因为poly(dG-dC).poly(dG-dC)由B一Z的构象转换能垒较低，而能使poly(dA-dT).poly(dA-dT)形成Z-DNA的化合物还鲜有报道。

发明内容
poly(dA-dT).poly(dA-dT)具有特异性识别作用的诱导DNA构象转换的钌配合物，可以选才奪性控制使poly(dA-dT).poly(dA-dT)可逆地由B-DNA转换为 Z-DNA。
本发明的另一个目的是提供工艺简单、产率高的上述钌配合物的制备方法。
本发明通过如下技术方案实现上述目的
本发明提供的诱导DNA构象转换的钌(II) [Ru(n)]配合物，是一种含吡啶 和1,2,4-三,并吲哚基团的多吡啶类衍生物配体的单核钌(11)配合物，所述配合 物的阳离子部分由配体和钌(II)配合构成，阴离子部分为高氯酸根(C1CV);所 述配体为主配体和辅助配体，所述主配体为8-曱氧基-3-(2-吡啶基)-5-氢 -[1,2,4]-三溱并[5,6七]吲哚(用英文表示为mphti)或8-硝基-3-(2-吡啶基)-5-氢 -[1,2,4]-三,并[5,6-b]吲哚(用英文表示为nphti);所述辅助配体为2,2-联吡啶 (用英文表示为bpy)或者l,10-邻菲罗啉(用英文表示为phen)。
所述配体mphti的结构如式I
(I )
所述配体nphti的结构如式II:
所述配体bpy的结构如式III:
(、
(II )
V乂
(III)
所述配体phen的结构如式IV:
(IV)
本发明钌配合物的阳离子部分的配体与钌(II )的配合结构有四种:
5阳离子A记为[Ru(phen)2mphti产，结构如式V:
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(V)
阳离子B记为[Ru(phen)2nphti]2+，结构如式VI
<formula>formula see original document page 6</formula>(VI)
阳离子C记为[Ru(bpy)2mphti]2+，结构如式VE:
<formula>formula see original document page 6</formula>(vn)
阳离子D记为[Ru(bpy)2叩hti产，结构如式VDI(VDI)
本发明还提供了上述钌配合物的制备方法，是先制备主配体；再将二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)或二(l,lO-邻菲罗啉)-二氯-二水合钌(II)和主配体在 乙醇与水的混合溶液中反应，然后加入NaCK)4水溶液，析出固体即得。
所述制备主配体，其中制备主配体8-甲氧基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[1,2,4]-三 溱并[5，6-b]吲哚的方法是将吡啶曱酰腙和5-曱氧基锭红在冰醋酸中加热反应， 然后冷却到室温，再用氨水中和，即得；制备主配体8-硝基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[l，2，4]-三溱并[5,6-b]吲哚的方法是将吡啶甲酰腙和5-硝基靛红在冰醋酸中 加热反应，然后冷却到室温，再用氨水中和，即得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明提供了新型的DNA构象探针，提供的含吡啶和1，2,4-三n秦并吲咪基 团的多吡啶类衍生物配体的单核钌(II)配合物，结构稳定，可以特异性地调控 和稳定具有poly(dA-dT).poly(dA-dT)序列的DNA构象。
本发明提供的钌(II)配合物不仅可以引起DNA构象转换，而且对 poly(dA-dT).poly(dA-dT)具有特异性识别作用，可以使poly(dA-dT).poly(dA-dT) 由B-DNA转换为Z-DNA。更为重要的是由B—-Z的这一 DNA构象转换过程 是可逆的，在加热的条件下又可以使Z—B-DNA,冷至室温仍可恢复Z构象， 因此可以将这类配合物称为DNA的构象转换开关，这种选4奪性调控 poly(dA-dT).poly(dA-dT)构象的化合物目前在国内外还未见相关文献报道，在 本专业技术领域中是极前沿的，有着广阔的应用前景。


图1至图13为本发明实施例7中钌配合物引起DNA构象转换的CD光i普
图
7图 1 为向 50|uM 的 poly(dA-dT).poly(dA-dT)中滴力。化合物 Ru(phen)2(mphti)](C104)2的CD光谱图；图中显示，随着配合物的加入， poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号逐渐发生变化，由B型转换为Z型；
图 2 为向 50|uM 的 poly(dA-dT).poly(dA-dT)中滴力。化合物 Ru(phen)2(nphti)](C104)2的CD光镨图；图中显示，随着配合物的加入， poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号逐渐发生变化，由B型转换为Z型；
图 3 为向 50jiM 的 poly(dA-dT).poly(dA-dT)中滴力口化合物 Ru(bpy)2(mphti)](C104)2的CD光语图；图中显示，随着配合物的加入， poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号逐渐发生变化，由B型转换为Z型；
图 4 为向 50jiM 的 poly(dA-dT).poly(dA-dT)中滴力口化合物 Ru(bpy)2(nphti)](C104)2的CD光谱图；图中显示，随着配合物的加入， poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号逐渐发生变化，由B型转换为Z型；
图 5 为向 50jiM 的 poly(dG-dC).poly(dG-dC)中滴力。化合物 Ru(phen)2(mphti)](C104)2的CD光谱；图中显示，随着化合物的加入， poly(dG-dC).poly(dG-dC)的CD信号有稍稍降低，但没有出现明显的构象变化；
图 6 为向 50|aM 的 poly(dG-dC).poly(dG-dC)中滴力。化合物 Ru(phen)2(nphti)](C104)2的CD光i普图；图中显示，随着化合物的加入， poly(dG-dC).poly(dG-dC)的CD信号有稍稍降低，但没有出现明显的构象变化；
图 7 为向 50|LiM 的 poly(dG-dC).poly(dG-dC)中滴力。化合物 Ru(bpy)2(mphti)](C104)2的CD光谱图；图中显示，随着化合物的加入， poly(dG-dC).poly(dG-dC)的CD信号有稍稍降低，但没有出现明显的构象变化；
图 8 为向 50|iM 的 poly(dG-dC).poly(dG-dC)中滴力口化合物 Ru(bpy)2(nphti)](C104)2的CD光镨图；图中显示，随着化合物的加入， poly(dG-dC).poly(dG-dC)的CD信号有稍稍降低，但没有出现明显的构象变化；
图9为滴加了 Ru(phen)2(mphti)](C104)2的poly(dA-dT).poly(dA-dT)的变温 CD光谱图；图中显示，随着温度的升高poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号发 生明显变化，由Z型变为B型；
图IO为滴加了 Ru(phen)2(nphti)](C104)2的poly(dA-dT).poly(dA-dT)的变温 CD光谱图；图中显示，随着温度的升高poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号发 生明显变化，由Z型变为B型；
8图11为滴加了 Ru(bpy)2(mphti)](C104)2的poly(dA-dT).poly(dA-dT)的变温CD光谱图；图中显示，随着温度的升高poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号发生明显变化，由Z型变为B型；
图12为滴加了 Ru(bpy)2(nphti)](C104)2的poly(dA-dT).poly(dA-dT)的变温CD光谱图；图中显示，随着温度的升高poly(dA-dT).poly(dA-dT)的CD信号发生明显变化，由Z型变为B型；
图13为滴加了 Ru(phen)2(mphti)](C104)2的poly(dA-dT).poly(dA-dT)在24。 、 94° 、冷却至24°的CD光谱图；图中显示，4皮化合物饱和的poly(dA-dT).poly(dA-dT)在常温下(24° )呈现Z型，升温至94°时完全转变为B型，而冷却到室温(24°)又可以恢复Z型。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例1
主配体8-曱氧基-3-(2-吡咬基)-5-氢-[1,2,4]-三嗪并[5，6-b]吲哚(mphti)的制备将计量摩尔比的吡啶甲酰腙和5-甲氧基靛红在水醋酸中加热(130 °C )回流5小时。冷却到室温，用25%氨水中和，得橘黄色沉淀，收集沉淀，真空干燥得黄色固体，产率77%。反应过程如下
元素分析C15H N50，实验值C, 64.78; H, 4.15; N, 25.44.理论值C, 64.72;H, 4.11; N, 25.49). !H NMR (500 MHz, d6-DMSO): 3 8.75 (d, 1H), 7.89 (t， IH)，7.54 (d, 1H), 7.53 (t， 1H), 7.34 (d, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.81 (d, IH)， 3.85 (s， 3H),FAB-MS: m/z = 278[M+1] (C15HuN50 277).实施例2
主配体S-硝基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[l,2,4]-三嗪并[5,6-b]吲哚(nphti)的制
备
方法同实施例l,用适量吡啶甲酰腙与5-硝基靛红反应，得红色固体，产率67%。反应过程如下元素分析C14H8N602,实验值C, 57.51; H, 2.72; N， 28.30.理论值C, 57.54;H, 2.76; N, 28.25.). 1H画R (500丽z, d6-画SO): 5 10.03 (s, 1H), 8.78 (s, IH),8.50 (d, IH), 8.35(d， IH), 8.00 (t， IH), 7.65 (d, 2H), 7.14 (t, IH), FAB-MS: m/z =293 [M+l] (C14H8N602 292).实施例3
配合物[Ru(bpy)2(mphti)](C104)2的制备
将计量摩尔比的二(2,2'-联吡咬)-二氯-二水合钌(II)和主配体8-曱氧基-3-(2-吡咬基)-5-氢-[1，2，4]-三嗪并[5,6-b]吲哚在乙醇-水(3: 1 )中回流反应6小时后，加入NaC104水溶液，析出红色固体。抽滤干燥的粗产品经过氧化铝柱色谱分离提纯后，得目标产物。(C104)2,产率82%。元素分析C35H27Cl2N909Ru,实验值C, 47.20; H, 3.02; N, 14.22，计算值C, 47.25; H, 3.06; N, 14.17, NMR (400固z, d6-DMSO): (5 8.84(m, 4H), 8.20 (m, 5H), 8.12 (d， 1H), 8.05 (t, 1H), 7.88 (m,4H), 7.78 (m, 4H), 7.56 (m，2H), 7.50 (t, 1H), 7.22 (d, 1H), 7.04 (s, 1H), ES-MS(CH3CN): m/z 689 ([M-2C104-H] +), 345 ([M-2C104]2+)实施例4
配合物[Ru(phen)2(mphti)KC104)2制备
将计量摩尔比的二(l, 10-邻菲罗啉)-二氯-二水合钌(II)和主配体8-曱氧基-3-(2-吡咬基)-5-氢-[1,2,4]-三嗪并[5,6-b]吲哚在乙醇-水(体积比=3:1 )中回流反应6小时后，加入NaC104水溶液，析出红色固体。抽滤干燥的粗产品经过氧化铝柱色谱分离提纯后，得目标产物。(C104)2, 产率80%。元素分析C39H27Cl2N909Ru,实验值C, 49.89; H, 2.96; N, 13.39，计算值C, 49.96; H, 2.90; N， 13.44, 画R (400MHz, d6-DMSO): 3 8.78 (m, 4H), 8.40 (d, 2H), 8.36 (s, 1H), 8.32 (d, 2H), 8.24 (d,1H), 8.14 (t， 1H), 8.04 (d, 1H)， 7.88 (m, 4H), 7.76 (m, 4H), 7.52 (d,lH), 7.46 (t,1H), 7.20 (d, 1H), 6.83 (s， 1H), ES隱MS (CH3CN): m/z 738 ([M-2C104—H]+), 370实施例5
配合物[Ru(bpy)2(nphti)](C104)2的制备
将计量摩尔比的二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体8-硝基-3-(2-吡咬基)-5-氬-[l,2，4]-三嗪并[5,6-b]吲哚在乙醇-水(体积比3:1)中回流反应6小时后，加入NaCK)4水溶液，析出红色固体。抽滤干燥的粗产品经过氧化铝柱色谱分离提纯后，得目标产物。(C104)2,产率79%。。元素分析C^H^C^NwChoRu,实验值C, 45.20; H, 2.62; N, 15.42,计算值C, 45.14; H, 2.67; N, 15.48， & NMR (400MHz, d6-DMSO): 3 8.82 (m,4H), 8.74 (d， 1H), 8.38 (s， 1H), 8.34 (d, 1H), 8.24(d,1H), 8.19(m, 2H), 8.12 (t, 1H), 8.06 (t, 1H)， 7.96(t,2H)， 7.90 (t,lH), 7.79 (t， 2H),7.69 (d， 1H), 7.57(m, 3H)， 7.50(t, 1H), 7.42(t, 1H), ES-MS (CH3CN): m/z 704([M-2C104-H]+)， 353 ([M-2C104]2+)实施例6
配合物[Ru(phen)2(nphti)](C104)2的制备
将计量摩尔比的二(i,io-邻菲罗啉)-二氯-二水合钌(n)和主配体8-硝基-3-(2-他咬基)-5-氢-[1,2,4]-三溱并[5,6七]吲哚在乙醇-水(3: 1)中回流反应6小时后，加入NaC104水溶液，析出红色固体。抽滤干燥的粗产品经过氧化铝柱色谱分离提纯后，得目标产物。(C104)2， 产率74%。元素分析C38H24Cl2N10O10Ru,实验值C, 47.87; H， 2.50; N, 14.75，计算值C, 47.91; H, 2.54; N, 14.70, ^NMR(400固z， d6-DMSO): <5 8.80 (m,4H), 8.48 (d, 1H), 8.41 (m， 2H), 8.35 (s, 1H)，8.31 (m， 2H), 8.19 (m, 4H), 8.04 (d, 1H), 7.91 (t,lH), 7.84 (t，2H), 7.78 (t, 2H), 7.65(d, 2H)， 7.50 (t， 1H)， ES-MS (CH3CN): m/z 753 ([M—2C104—H]十)，377([M-2C104]2+)
实施例5和实施例6制备钌配合物的反应过程如下
Ru(II)配合物调控DNA构象转换实验
1.配制50 的poly(dA-dT).poly(dA-dT)溶液10毫升，移取3毫升至1厘米比色亚中，测定DNA的CD光镨，然后向样品池中滴加配制好的2 mM的Ru(II)配合物溶液，每次2孩i升，混匀静止几分钟，测定样品的CD光谱，依次反复滴加钌化合物，直到样品的CD信号不变为止，结果见图1至图4;
如上述，将poly(dA-dT).poly(dA-dT)换为poly(dG-dC).poly(dG-dC)，重复上述实验，实验结果见图5至图8;
实施例6
Ru(bpy)2CI22H20
实施例7
12实验结果表明配合物可以将poly(dA-dT).poly(dA-dT)由B型转换为Z型， 在[poly(dA-dT).poly(dA-dT)] : [Ru] = 3 :1 时达到饱和，而对 poly(dG-dC).poly(dG-dC)却没有表现出此效果。
2.配制浓度比为3: 1的poly(dA-dT).poly(dA-dT): Ru的混合溶液 ([poly(dA-dT).poly(dA-dT)] = 60 jiM, [Ru] = 20 juM )，耳又3毫升至1厘米比色 皿中，改变温度测定混合溶液的CD光谦。从24度到94度，升温速率为每分 钟l度，每两度扫一次，观察样品CD信号的变化，见图9至图12;再将温度 降至室温再次测量样品的CD信号，见图13。实验结果表明升温至50度后样 品的CD信号发生明显变化，由Z型变为B型，至94度后完全转换为B型。 而冷却至室温，仍可恢复Z构象。
权利要求
1. 诱导DNA构象转换的钌配合物，由阴离子和阳离子构成，其特征在于所述配合物的阳离子部分由主配体、辅助配体和钌(II)构成；所述主配体为8-甲氧基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[1，2，4]-三嗪并[5，6-b]吲哚或8-硝基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[1，2，4]-三嗪并[5，6-b]吲哚；所述辅助配体为2，2-联吡啶或1，10-邻菲罗啉；所述阴离子为高氯酸根；所述阳离子的结构如式V或式VI或式VII或式VIII
2. 权利要求l所述钌配合物的制备方法，其特征是先制备主配体；再将二(2,2'-联吡啶)-二氯-二水合钌(n)或二(i,io-邻菲罗啉)-二氯-二水合钌(n)和主配体在乙醇与水的混合溶液中反应，然后加入NaC104水溶液，析出固体即得。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述制备主配体8-曱氧基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[1,2，4]-三嗪并[5,6-b]吲哚的方法是将吡啶曱酰腙和5-曱氧 基靛红在冰醋酸中加热反应，然后冷却到室温，再用氨水中和，即得。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述制备主配体8-硝基-3-(2_吡咬基)-5-氢-[1，2,4]-三嗪并[5,6七]吲哚的方法是将吡啶曱酰腙和5-硝基 散红在冰醋酸中加热反应，然后冷却到室温，再用氨水中和，即得。
全文摘要
本发明公开了诱导DNA构象转换的钌配合物，由阳离子和阴离子构成，所述配合物的阳离子部分由主配体、辅助配体和钌(II)构成；所述主配体为8-甲氧基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[1，2，4]-三嗪并[5，6-b]吲哚或8-硝基-3-(2-吡啶基)-5-氢-[1，2，4]-三嗪并[5，6-b]吲哚；所述辅助配体为2，2-联吡啶或1，10-邻菲罗啉；所述阴离子为高氯酸根。本发明还提供了上述钌配合物的制备方法，是先制备主配体；再将二(2，2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)或二(1，10-邻菲罗啉)-二氯-二水合钌(II)和主配体在乙醇与水的混合溶液中反应，然后加入NaClO₄水溶液，析出固体即得。本发明提供了新型的DNA构象探针，结构稳定，可以特异性地调控和稳定序列为poly(dA-dT).poly(dA-dT)的DNA构象，具有广阔的应用前景。
文档编号C07F15/00GK101463048SQ20091003641
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月4日 优先权日2009年1月4日
发明者于会娟, 晖 巢, 李吕莹, 计亮年, 黄淑枚 申请人:中山大学