结合人il-12的人抗体及其生产方法

专利名称：结合人il-12的人抗体及其生产方法
结合人IL-12的人抗体及其生产方法本申请是申请日为2000年3月24日，申请号为00807783. 5，发明名称为“结合人 IL-12的人抗体及其生产方法”的发明专利申请的分案申请。相关申请本申请是要求1999年3月25日提交的美国临时申请序号60/126，603的优先权 的非临时申请，所述临时申请的内容通过引用结合到本文中。
背景技术：
人白细胞介素12(IL_12)最近鉴定为一种细胞因子，它具有独特的结构和多效 作用(Kobayashi 等(1989) J.Exp Med. 170 :827_845 ;Seder 等(1993) Pro. Natl. Acad. Sci. 90 10188-10192 ；Ling 等(1995)J. Exp Med. 154 :116_127 ；Podlaski 等(1992)Arch. Biochem. Biophys. 294 230-237)。IL-12在与若干涉及免疫和炎症反应的疾病有关的病理 学中起着重要的作用。一篇关于IL-12、其生物活性和在疾病中的作用的综述可见Gately 等(1998)Ann Rev. Immunol. 16 :495_521。在结构上IL-12是一种异源二聚体蛋白(称为“p70亚单位”)，它包含通过二硫桥 将二者连接在一起的35kDa亚单位(p35)和40kDa亚单位(p40)。所述异源二聚体蛋白主 要由诸如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的抗原提呈细胞产生。这些细胞类型还分泌相对 于p70亚单位过量的p40亚单位。p40和p35亚单位在遗传学上是不相关的，而且也没有关 于它们具有生物活性的报道，尽管P40同源二聚体可能具有IL-12拮抗剂的作用。在功能上，IL-12在调节抗原特异性1型T辅助(Thl)淋巴细胞和2型T辅助(Th2) 淋巴细胞之间的平衡中起重要作用。Thl和Th2细胞控制自身免疫性疾病的发生和发展， IL-12在调节Thl淋巴细胞的分化和成熟中起重要的作用。Thl细胞释放的细胞因子是炎症 性细胞因子，包括Y干扰素(IFNy)、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2细胞分泌IL_4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL-13促进体液免疫、过敏反应和免疫抑制。与Thl反应在自身免疫性疾病中占优势以及IFN γ的促炎活性一致的是，IL-12可 能在与许多诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)和节段性回肠炎的自身免疫性疾 病和炎症疾病有关的病理学中起主要作用。已经证实MS病人的IL-12的表达增加，因为文献证实急性MS斑中存在不同水平 的 p40 mRNAo (Windhagen 等，(1995) J. Exp. Med. 182 1985-1996)。另外，用 MS 患者表达 ⑶40L的T细胞体外刺激抗原提呈细胞使IL-12产生增加(与对照T细胞相比)，这与⑶40/ ⑶40L相互作用是IL-12的有效诱导剂的观测结果一致.与健康对照相比，在RA患者滑液中观测到IL-12 p70水平升高(Morita等 (1998) Arthritis and Rheumatism. 41 :306_314)。在 RA 滑液中细胞因子信使核酸 (mRNA)表达类型鉴定主要为 Thl 细胞因子。(Bucht 等，(1996)Clin. Exp. Immunol. 103 347-367)。IL-12似乎还在与节段性回肠炎(⑶)有关的病理学中起重要作用。在节段性 回肠炎患者的肠粘膜中观测到IFNy和IL-12表达增加(Fais等(1994) J. Interferon Res. 14 235-238 ；Parronchi 等，(1997) Am. J. Path. 150 :823_832 ；Monteleone 等，(1997) Gastroenterology. 112 1169-1178 和 Berrebi 等，(1998) Am. J. Path. 152 :667_672)。CD 患者的粘膜固有层的T细胞的细胞因子分泌类型的特征是主要为Thl反应，包括IFNy水平 明显升高(Fuss等，(1996) J. Immunol. 157 1261-1270)。而且，CD患者的结肠组织切片显示 丰富的表达IL-12的巨噬细胞和表达IFN γ的T细胞(Parronchi等(1997) Am. J. Path. 150 823-832)。因为人IL-12在各种人类疾病中的作用，因此设计了各种治疗策略来抑制或中 和IL-12活性。尤其是寻找结合并中和IL-12的抗体用作抑制IL-12活性的手段。某些 最早期的抗体为小鼠单克隆抗体(mAb)，它由IL-12免疫小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分 泌(参见例如Strober等的世界专利申请公布号WO 97/15327 ；Neurath ^ (1995) J.Exp. Med. 182 1281-1290 ；Duchmann 等(1996) J. Immunol. 26 :934_938)。这些小鼠 IL-12 抗体 的体内应用受到限制，因为存在将小鼠抗体给予人类的有关问题，例如血清半衰期短、不 能激发某些人类效应物功能以及在人体内诱发抗小鼠抗体的不需要的免疫反应(“human anti-mouseantibody，，(HAMA)反应)。一般来说，试图解决在人类使用完全小鼠抗体有关问题的措施包括通过遗传工 程改进所述抗体使其成为更接近人类的抗体。例如制备了嵌合抗体，嵌合抗体中所述 抗体链的可变区是鼠源性的，而所述抗体链的恒定区是人源性的(Junghans等(1990) Cancer Res. 50 1495-1502 ；Brown 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :2663_2667 ； Kettleborough 等(1991) Protein Engineering. 4 :773_783)。但是因为这些嵌合抗体和人 源化抗体仍然保留部分鼠序列，所以它们仍然可能激发不需要的免疫反应、人抗嵌合抗体 (HACA)反应，当长时间给予所述抗体时尤其如此。鼠抗体或其衍生物(例如嵌合抗体或人源化抗体)的优选IL-12抑制剂应该为完 全人抗IL-12抗体，因为这样的抑制剂不会激发HAMA反应，即使长期使用也不会激发HAMA。 然而，本领域没有关于这类抗体的介绍，因此仍然需要这样的抗体。发明概述本发明提供结合人IL-12的人抗体。本发明还涉及应用本发明的人抗IL-12抗体 治疗或预防其病理学涉及IL-12的急性或慢性疾病或病症。一方面，本发明提供结合人IL-12的分离人抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，本发明提供选择性突变的人IL-12抗体，包括在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点选 择性突变人抗体或其抗原结合部分，使得它结合人IL-12。在一个优选实施方案中，本发明提供选择性突变的人IL-12抗体，包括在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点选择性突变人抗体或其抗 原结合部分，使得它结合人IL-12。在另一个优选实施方案中，在一个以上具有增强活性氨基酸残基的优选选择性诱 变位点、接触或超突变位点选择性突变所述选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部 分。在另一个优选实施方案中，在3个以下优选选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性 突变选择性突变的人IL-12抗体或其抗原结合部分。在另一个优选实施方案中，在2个以 下的优选选择性诱变位点、接触或超突变位点选择性突变所述选择性诱变的人IL-12抗体 或其抗原结合部分。在再一优选实施方案中，选择性突变所述选择性突变的人IL-12抗体 或其抗原结合部分，以便获得目标特异性亲和水平，相对于当用噬菌体展示技术对相同抗原选择抗体时获得的水平，所述目标水平提高。在另一个优选实施方案中，所述选择性突变 的人IL-12抗体还保留了至少一个需要特性，例如保留与其他蛋白或人组织的非交叉反应 性、保留表位识别、产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分它结合 人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0. Is—1或0. Is"1以下的K。ff速率常数(rate constant)与人IL-12解离，或者它以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制体外植物凝集 素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖.更优选所述分离的人抗体或 其抗原结合部分以IX ΙΟ、—1或IX ΙΟ、—1以下的K。ff速率常数与人IL-12解离，或者以 1X10_7M或1X10_7M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖.更优选 所述分离的人抗体或其抗原结合部分以IXlO-3S-1或IXlO-3S-1以下的K。ff速率常数与人 IL-12解离，或者以IX 10、或IXlO-8M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母 细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以IXlO-4S-1或IXlO-4S-1以下的 Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC50抑制体外PHA测定 中的植物凝集素母细胞增殖。更优选所述分离的人抗体或其抗原结合部分以IXlO-5S-1或 1 X IO-5S-1以下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1 X KT10M或1 X KT10M以下的IC50 抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。甚至更优选所述分离的人抗体或其抗原结 合部分以IXicr5iT1或IXicr5iT1以下的K。ff速率常数与人il-12解离，或者以ixio_"m或 1 X IO-11M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞增殖。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有 以下特性a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 1氨基酸序列的重链⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的轻链⑶R3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 3氨基酸序列的重链⑶R2 ；以及具有包含SEQ IDNO 4氨基酸序列的轻链⑶R2.在一个 优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO :5氨基酸序列 的重链⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO :6氨基酸序列的轻链⑶Rl。在一个优选实施方案 中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO :7氨基酸序列的重链可变区； 以及具有包含SEQ ID NO 8氨基酸序列的轻链可变区.在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有 以下特性a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重链⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 10氨基酸序列的轻链⑶R3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 11氨基酸序列的重链⑶R2 ；以及具有包含SEQID NO 12氨基酸序列的轻链⑶R2。在一 个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID N0:13氨基酸序列的重链⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO 14氨基酸序列的轻链⑶Rl。在一个优选实施方 案中，所述分离的人抗体具有包含SEQ ID NO: 15氨基酸序列的重链可变区；以及具有包含 SEQ ID NO: 16氨基酸序列的轻链可变区。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重链⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 18氨基酸序列的轻链⑶R3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重链⑶R2 ；以及具有包含SEQID NO 20氨基酸序列的轻链⑶R2。在一 个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID N0:21氨基酸 序列的重链⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO 22氨基酸序列的轻链⑶R1。在一个优选实施 方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO :23氨基酸序列的重链 可变区；以及具有包含SEQ ID NO :24氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方案中， 所述分离的人抗体包含选自Kabat等论述的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定 区或者它们的任何等位基因变异体的重链恒定区(Kabat，E.A.，等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部(U. S. D印artment of Heath and HumanServices)，NIH公告第91-3242号)，通过引用包括在本文中。在一个更 优选的实施方案中，所述抗体重链恒定区是IgGl。在另一个优选实施方案中，所述分离的人 抗体是Fab片段或F(ab，)2片段或单链Fv片段。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含选自SEQ ID NO :404_SEQ ID NO :469的氨基酸序列的重链CDR3 ；以 及c)具有包含选自SEQ ID NO :534_SEQ ID NO 579的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO :335-SEQ ID NO :403的氨基酸序列的重链CDR2 ；以及具有包含选自SEQ ID N0: 506-SEQ ID N0:533的氨基酸序列的轻链⑶R2。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗 体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO :288-SEQ ID NO :334的氨基酸序列的重链 CDRl ；以及具有包含选自SEQ ID NO :470_SEQ ID NO 505的氨基酸序列的轻链CDRl。在一 个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分包括含SEQ ID N0:23氨基酸序列 的重链可变区；以及包括含SEQ ID NO :24氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方 案中，所述分离的人抗体包含如上所述的重链恒定区或Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv 片段.在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X 10_9M或1 X 10_9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 25的氨基酸序列的重链⑶R3 ；以及
c)具有包含SEQ ID NO 26的氨基酸序列的轻链⑶R3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重链⑶R2 ；以及具有包含SEQID NO 28的氨基酸序列的轻链⑶R2。 在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID N0:29的氨 基酸序列的重链⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列的轻链⑶Rl。在一个优 选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID N0:31氨基酸序列的 重链可变区；以及具有包含SEQ ID NO :32氨基酸序列的轻链可变区。在一个优选实施方 案中，所述分离的人抗体包含如上所述的重链恒定区或Fab片段或F(ab’)2片段或单链Fv 片段。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO :1氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO 3氨基酸序列的重 链⑶R2和含SEQ ID NO 5氨基酸序列的重链⑶Rl，或者为其在接触位点或超突变位点存 在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO 1氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO: 3氨基酸序列的重链⑶R2和含SEQ ID N0:5氨基 酸序列的重链CDRl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 2氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的轻 链CDR2和含SEQ ID NO :6氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在接触位点或超突变位点存 在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO 2氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的轻链⑶R2和含SEQ ID NO :6氨 基酸序列的轻链CDRl的抗体高10倍以下。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的 重链CDR2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重链CDRl，或者为其在接触位点或超突变位 点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的重链⑶R2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重链CDRl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ IDNO 12氨基酸序列的轻 链CDR2和含SEQ ID NO 14氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在接触位点或超突变位点存 在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO 12氨基酸序列的轻链⑶R2和含SEQ ID NO 14 氨基酸序列的轻链CDRl的抗体高10倍以下。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO 19氨基酸序列的重链⑶R2和含SEQ ID NO 21氨基酸序列的重链⑶Rl，或者为其在优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率 较所述包括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重 链⑶R2和含SEQ ID NO 21氨基酸序列的重链⑶Rl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 18氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ IDNO 20氨基酸序列的 轻链CDR2和含SEQ ID NO 22氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率 较所述包括含SEQ ID NO 18氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO :20氨基酸序列的轻链 ⑶R2和含SEQ ID NO 22氨基酸序列的轻链⑶Rl的抗体高10倍以下。本发明还提供编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。一种优选的分离 核酸编码包含SEQ ID N0:17氨基酸序列的重链CDR3。所述分离的核酸编码抗体重链可变 区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO: 19氨基酸序列的抗体重 链可变区的⑶R2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ IDN0:21氨基酸序 列的抗体重链可变区的⑶R1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO 23氨基酸序列的抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID N0:18氨基酸序列的轻链CDR3。所述分离的核酸编码抗体轻链可变区。在另一个实施方案 中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO :20氨基酸序列的抗体轻链可变区的⑶R2。在另 一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO :22氨基酸序列的抗体轻链可变区的 CDR1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO :24氨基酸序列的抗体轻 链可变区。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X 10_9M或1 X 10_9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO 27氨基酸序列的 重链⑶R2和含SEQ ID NO 29氨基酸序列的重链⑶Rl，或者为其在优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率 较所述包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO :27氨基酸序列的重链 ⑶R2和含SEQ ID NO 29氨基酸序列的重链⑶Rl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 26氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ IDNO 28氨基酸序列的 轻链CDR2和含SEQ ID NO 30氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率 较所述包括含SEQ ID NO 26氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO :28氨基酸序列的轻链 ⑶R2和含SEQ ID NO 30氨基酸序列的轻链⑶Rl的抗体高10倍以下。一种优选的分离核酸编码包含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重链⑶R3。所述分离 的核酸编码抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO 27氨基酸序列的抗体重链可变区的CDR2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含 SEQ IDNO :29氨基酸序列的抗体重链可变区的⑶R1。在另一个实施方案中，所述分离的核 酸编码包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的抗体重链可变区。在另一个实施方案中，所述分离 的核酸编码包含SEQ ID N0:26氨基酸序列的轻链⑶R3。所述分离的核酸编码抗体轻链可变区。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO :28氨基酸序列的抗体轻 链可变区的⑶R2。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID N0:30氨基酸序 列的抗体轻链可变区的⑶R1。在另一个实施方案中，所述分离的核酸编码包含SEQ ID NO 32氨基酸序列的抗体轻链可变区。另一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制体外植物凝 集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。b)具有包含选自Vh3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可 变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突 变。c)具有包含选自νλ 1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链 可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在 突变。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有 以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制体外植物凝 集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。b)具有包含选自SEQ ID NO :595_667的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链 可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在 突变。c)具有包含选自SEQ ID NO :669_675的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链 可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在 突变。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有 以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 k。ff速率常数与人IL-12解离，或者它以IXlCT6M或1X10_6M以下的IC5tl抑制体外植物凝 集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。b)具有包含C0S-3种系氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区在具有增 强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。c)具有包含DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区在具有增 强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有 以下特性a)它结合人IL-12，并且根据表面胞质团共振测定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 koff速率常数与人IL-12解离，或者它以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制体外植物凝 集素母细胞增殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。
b)具有包含选自Vh3种系家族成员的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可 变区包含结构类似于其他VH3种系家族成员CDR2的CDR2和结构类似于其他VH3种系家族 成员CDRl的CDR1，而且其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性 诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。c)具有包含选自νλ 1种系家族成员的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链 可变区包含结构类似于其他ν λ 1种系家族成员⑶R2的⑶R2和结构类似于其他V λ 1种系 家族成员CDRl的CDR1，而且其中所述轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选 择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR3存在 突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR3存在突 变.在另一个实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDR2存在突变。在 另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDR2存在突变。在 另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的重链CDRl存在突变。在另 一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分的轻链CDRl存在突变。另一方面，本发明提供带有本发明抗体编码核酸的重组表达载体以及这种载体导 入其中的宿主细胞，本发明还包括通过培养本发明的宿主细胞制备本发明的抗体的方法。再一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它中和人IL-12的 活性和至少一种选自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、弥猴(cynomolgus) IL-12和恒河 猴IL-12的其他灵长类IL-12的活性，但是它不中和小鼠IL-12的活性。再一方面，本发明提供包含本发明抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体 的药用组合物。再一方面，本发明提供包含所述抗体或其抗原结合部分和其他药物如治疗药物的 组合物。再一方面，本发明提供抑制人IL-12活性的方法，包括使人IL-12与本发明的抗体 如J695接触，从而抑制人IL-12活性。再一方面，本发明提供抑制罹患其中IL-12活性有害的疾病的病人的人IL-12活 性的方法，包括给予所述病人本发明的抗体如J695，从而抑制所述病人的人IL-12活性。所 述疾病可为例如节段性回肠炎、多发性硬化或类风湿性关节炎。再一方面，本发明的特征为改善抗体或其抗原结合部分的活性以获得预定目标活 性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)从 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、
L94选择优选选择性诱变位点。c)分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获 得第一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价第一组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选择性诱变位点的 突变是否产生具有预定目标活性或部分目标活性的抗体或其抗原结合部分；e)逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各个突变，形 成组合抗体或其抗原结合部分。
f)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部 分是否具有预定目标活性或部分目标活性。g)如果步骤d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者 获得只具有部分活性的抗体，则使选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96
的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二组突变抗体或其抗原结 合部分；h)评价第二组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H35、H50、H53、 H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性 或部分活性的抗体或其抗原结合部分；i)逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的步骤g)的各 个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；j)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部 分是否具有预定目标活性或部分目标活性；k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者 获得只具有部分活性的抗体，则使选自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得第三组突变抗体或其抗原结合部分；1)评价第三组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H33B、H52B和L31A 的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部 分；m)逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的步骤k)的各 个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；η)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部 分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分。另一方面，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；e)对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各个突变，形成组 合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结 合部分。在一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括
a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超 突变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表 达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；e)对至少一个其他接触位点或超突变位点重复步骤b)至d)；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各个突变，形成组 合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结 合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94*L96。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、 H3IB、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。在一个更优选的实施方案中，选择性诱 变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、 L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和 L94。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少 2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，而且以合适表达系统表达 所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲 代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优 选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位 识别，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合 干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择 性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组 织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位，防止游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在 一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与 其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二 聚体情况下的P40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球 蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表 达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至 e)；g)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性和至少 一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特 性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位 识别，即优选识别P70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合 干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择 性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组 织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位，防止游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体.在 一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其 他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚 体情况下的P40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋 白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的接触位点或超突变位点，由此鉴定选定 的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的接触位点或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由 此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲 代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。
0144]在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优 选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位 识别，即优选识别P70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合 干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择 性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织 的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位，防止游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在 一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚 体情况下的P40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋 白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表 达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f)对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤a)至 e)；g)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性和至少 一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特 性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优 选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位 识别，即优选识别P70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合 干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择 性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组 织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表 位，防止游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在 一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自1)保留与其 他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的P40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋 白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性 的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位点；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性的增强 活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部 分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 以外的位点选择 用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得 一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性 的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是 其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 位点；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性的增 强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其 抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；
b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化；f)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位点；g)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性但不影 响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况；直到获得相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结 合部分。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的亲和力的方法， 包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是 其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性 的抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性的变化；f)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位点；g)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性但是不 影响至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成具有至少一种保留特性的组合抗体 或其抗原结合部分；以及h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种特性的保留情况；直到获得相对于所 述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部 分·所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性而不影响其 他特性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、HlOl、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性 并保留其他特性的抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是 其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位点；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示改进活性而且不影响 至少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，直到获得相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗 原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。附图简述

图1A-1B显示一系列结合人IL-12的人抗体的重链可变区的氨基酸序列与种系序 列Cos-3/JH3和Dpll8 Lvl042的排列对比。Kabat编码用来指示氨基酸位置。显示了 Joe 9野生型的全长序列。而其他抗体，只显示了与Joe 9野生型不同的氨基酸位点。图1C-1D显示一系列结合人IL-12的人抗体的轻链可变区的氨基酸序列的对比。 Kabat编码用来指示氨基酸位置。显示了 Joe 9野生型的全长序列。而其他抗体，只显示 了与Joe 9野生型不同的氨基酸位点。图2A-2E显示通过定点诱变突变的Y61抗体的重链⑶R位点和各位点的相应氨基 酸取代。图2A-2E分别为Y61重链⑶R Hl诱变、Y61重链⑶R H2诱变、Y61重链⑶R H2诱 变、Y61重链⑶R H3诱变，和Y61重链⑶R H3诱变。图右侧的条形图显示取代抗体解离速 率(实心条)与非突变Y61解离速率(空心条)的比较。图2F-2H显示通过定点诱变突变的Y61抗体的轻链⑶R位点和各位点的相应氨基 酸取代。图2F-2H分别为Y61轻链⑶R Ll诱变、Y61轻链⑶R L2诱变，和Y61轻链⑶R L3 诱变。图右侧的条形图显示取代抗体解离速率(实心条)与非突变Y61解离速率(空心 条)的比较。图3证实人抗IL-12抗体J695对弥猴血浆新蝶呤水平的体内效力。图4显示用胶原免疫小鼠后不同天数的关节炎平均评分的曲线图，证实与用大鼠 IgG治疗相比，用C17. 15治疗显著减轻关节炎相关症状。发明详述为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。术语“增强活性的氨基酸残基”包括增强所述抗体活性的氨基酸残基。当然增强 活性的氨基酸残基可取代接触位点、超突变位点或优选选择性诱变位点的氨基酸残基，进 而在一个或多个CDR中可能存在一个以上的增强活性的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残 基包括增强抗体的结合特异性/亲和性例如增强抗人IL-12抗体与人IL-12的结合的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基还包括增强抗体例如抑制人IL-12的人IL-12抗体的中和 效价的氨基酸残基。术语“抗体”包括4个多肽链组成的免疫球蛋白分子，4个多肽链是通过二硫键内 部连接的2个重链(H)和2个轻链(H).重链由1个重链可变区(本文简称为HCVR或VH) 和1个重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。轻链由1个轻链 可变区(本文简称为LCVR或VL)和1个轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL 组成。VH和VL区可进一步分为超变区(称为互补决定区(CDR))和更保守区(称为构架区 (FR))，超变区位于构架区之间。各VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端至羧基 末端的排列顺序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包括保持特异性结合抗原(例如 hIL-12)能力的抗体片段。曾经证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体片段完成。属于术 语抗体的“抗原结合部分”的结合片段实例包括(i)Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH 1结构 域组成的一价片段；(ii)F(ab’)2片段，它是包括通过铰链区的二硫键连接的2个Fab片段 的二价片段；(iii) VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)抗体单臂VL和VH结构城组成的 Fv 片段；(v)VH 结构域构成的 dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature 341 :544_546)；以及(vi) 分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构城VL和VH由独立的基因编码， 但是它们可利用重组方法以合成接头连接在一起，合成接头使它们能够制成其中VL和VH 区成对形成一价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(ScFv)；参见例如Bird等(1988) Science 242 :423-426 和 Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。这种单链 抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。也包括其他形式的单链抗体例如双体分子 (diabodies)。双体分子是双价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单一多肽链上， 但是采用短到允许同一链上的这2个结构域成对的接头，由此驱使所述结构域与另一条 链的互补结构域成对，而产生2个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 ；Poljak,R. J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。进 而抗体或其抗原结合部分可以成为所述抗体或其抗原结合部分与一个或多个其他蛋白或 肽通过共价或非共价结合形成的更大免疫粘附分子的组成部分.这样的免疫粘附分子的 实例包括利用链霉抗生物素蛋白核心区制成四聚scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及利用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端 多组氨酸标记制成双价生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。可采用常规技术例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体，由完整抗 体制备诸如Fab和F(ab，)2片段的抗体部分。而且如本文所述，可采用标准重组DNA技术 获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。优选的抗原结合部分是完整结构域或成对的完整结 构城。术语“回复突变”是指人抗体的部分或全部体细胞突变的氨基酸被同源种系抗体 序列的相应种系残基取代的过程。本发明的人抗体的重链序列和轻链序列分别与VBASE数 据库中的种系序列对比，鉴定具有最高同源性的序列。使本发明的人抗体的差异通过突变 编码该不同氨基酸的确定核苷酸位置而恢复为种系序列。研究由此鉴定为回复突变的候选 对象的各氨基酸的作用是直接还是间接影响抗原结合，而突变后发现影响所述人抗体任何 需要特性的任何氨基酸不纳入最终的人抗体；例如选择性诱变方法鉴定的增强活性的氨基酸不进行回复突变。为了使回复突变的氨基酸数目最少，可保留与最接近种系序列不同、 但是与第二种种系序列相应氨基酸相同的氨基酸位置，前提是对于所述氨基酸两侧至少10 个、优选12个氨基酸，第二种种系序列与本发明人抗体的序列相同而且共线性。可在优化 抗体的任何阶段进行回复突变；但是优选正好在选择性诱变方法之前或之后进行回复突 变。更优选正好在选择性诱变方法之前进行回复突变。本文使用的术语“人白细胞介素IL-12” (本文简称为hIL-12或IL-12)包括主 要由巨噬细胞和树突细胞分泌的人细胞因子。该术语包括一种异源二聚体蛋白，该蛋白包 含通过二硫键将二者结合在一起的35kD亚单位(p35)和40kD亚单位(p40)。所述异源二 聚体蛋白称为“P70亚单位”.例如以下文献进一步介绍了人IL-12的结构=Kobayashi等 (1989)J. Exp Med. 170 :827_845 ；Seder 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. 90 10188-10192 ； Ling 等(1995) J.Exp Med. 154 116-127 ；Podlaski 等(1992) Arch. Biochem. Biophys. 294 230-237。术语人IL-12包括重组人IL_12(rh IL-12)，它可利用标准重组表达方法制得。术语“Kabat编码”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中交互使用。本领域公 知的这些术语是指编码比抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区的其他氨基 酸残基更易变(即超变)的氨基酸残基的系统(Kabat等(1971)Arm.NY Acad. Sci. 190 382-391 禾口 Kabat,Ε· Α·等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,第 五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。对于重链可变区而言，超变区为⑶Rl 的第31-35位氨基酸、⑶R2的第50-65位氨基酸和⑶R3的第95-102位氨基酸。对于轻链 可变区而言，超变区为⑶Rl的第24-34位氨基酸、⑶R2的第50-56位氨基酸和⑶R3的第 89-97位氨基酸。Kabat编码在本文中用来指示对本发明抗体进行修饰的氨基酸位置。例如可使 Y61抗IL-12抗体重链CDRl位置31的丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E) (H31S — E)，或者可使 轻链CDR3位置94的甘氨酸(G)突变为酪氨酸(Y) (L94G — Y)。术语“人抗体”包括具有相当于Kabat等介绍的人种系免疫球蛋白序列的可变 区禾口'恒定区的抗体(参见 Kabat 等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。本发明的人抗体可包 含例如不是由CDR(尤其是CDR3)的人种系免疫球蛋白序列(例如体外随机诱变或定点诱 变或体内体细胞突变导入的突变)编码的氨基酸残基。优选用本文介绍的“选择性诱变方 法”导入所述突变。所述人抗体可具有至少一个被氨基酸残基例如由非人种系免疫球蛋白 序列编码的增强活性的氨基酸残基取代的位点。所述人抗体可具有高达20个被不是人种 系免疫球蛋白序列组成部分的氨基酸残基取代的位点。在其他实施方案中，取代最高达10 个、最高达5个、最高达3个或最多2个位点。在一个优选实施方案中，这些取代位于以下 更详细介绍的CDR区。然而，本文使用的术语“人抗体”不包括其中另一种哺乳动物(例如 小鼠)种系来源的CDR序列移植到人构架序列上的抗体。术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如利 用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在以下部分II中进一步介绍)、从重组组 合人抗体文库分离的抗体(在以下部分III中进一步介绍)、从人免疫球蛋白基因转基因 动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如(Taylor, L. D.等(1992)Nucl. Acids Res. 20 6287-6295)或者涉及人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有人种系免疫球蛋白序列来源的可变区和恒 定区(参见 Kabat，E. A.等(1991) Sequence of Protein of Immunological Interest，第 五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。然而，在某些实施方案中，使这样的 重组人抗体进行体外诱变(或者当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)， 因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列可能不是体内人抗体种系所有组成成分中天然 存在的序列，尽管所述序列得自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列有关。但是， 在某些实施方案中，这样的重组抗体得自选择性诱变方法或回复突变或这两种方法。“分离抗体”包括基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如基本不含 特异性结合非hIL-12抗原的抗体、特异性结合hIL-12的分离抗体)。特异性结合hIL-12 的分离抗体可结合其他物种的IL-12分子(下文更详细讨论)。此外，分离抗体可基本不含 其他细胞物质和/或化学物质。“中和抗体”(或“中和hIL-12活性的抗体”)包括其与hIL-12的结合抑制hIL_12 的生物活性的抗体。这种对hIL-12生物活性的抑制作用可通过检测hIL-12生物活性的一 个或多个指标评价，所述指标例如为对植物凝集素母细胞增殖测定(PHA)中的人植物凝集 素母细胞增殖的抑制作用，或对人IL-12受体结合测定中的受体结合的抑制作用(参见实 施例3-γ干扰素诱导测定).这些hIL-12生物活性指标可通过本领城已知的若干标准体 外或体内测定中的一个或多个测定评价(参见实施例3)。术语“活性”包括各种活性，例如抗体对抗原的结合特异性/亲和性如结合IL-12 抗原的抗hIL-12抗体；和/或抗体的中和效价如其与hIL-12的结合抑制hIL_12的生物活 性的抗hIL-12抗体，例如对PHA母细胞增殖的抑制作用或对人IL-12受体结合测定中的受 体结合的抑制作用(参见实施例3)。术语“表面胞质团共振”包括例如采用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway，NJ)通过检测生物传感器基体(matrix)中的蛋白浓 度改变而可分析实时生物特异性作用的光学现象。关于其进一步的介绍参见实施例5和 Jonsson, U.等(1993)Ann. Biol. Clin. 51 :19_26 Jonsson，U.等(1991)Biotechniques 11 620-627 ;Johnsson，B.等(1995) J. Mol. Recognit. 8 125-131 和 Johnnson，B.等(1991) Anal. Biochem. 198 :268_277。本文使用的术语“K。ff”是用以指抗体与抗体/抗原复合物解离的解离速率常数 (off rate constant)0本文使用的术语“Kd”是指一种具体抗体抗原相互作用的解离常数(dissociation constant)0术语“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链核酸或双链核 酸，但是优选为双链DNA。关于编码结合IL-12的抗体(包括“分离抗体”)或抗体部分(例如VH、VL、⑶R3) 的核酸，本文使用的术语“分离核酸分子”包括其中编码所述抗体或抗体部分的核苷酸序列 不含其他编码结合非hIL-12抗原的抗体或抗体部分的核苷酸序列的核酸分子，所述其他 序列可能天然邻接人类基因组DNA中的所述核酸。因此，例如编码抗IL-12抗体的VH区的 本发明分离核酸不含其他编码结合非IL-12抗原的其他VH区的序列.术语“分离核酸分 子”还包括编码双价、双特异性抗体的序列，所述双价双特异性抗体例如为双体分子，其中VH和VL区不含其他非所述双体分子序列。术语“载体”包括能够转运与其连接的另一个核酸分子的核酸分子。一种类型的 载体是“质粒”，质粒是额外DNA节段可连接入其中的环形双链DNA环。另一类载体是病毒 载体，在病毒载体中额外DNA节段可连接入病毒基因组中。某些载体能够在其导入的宿主 细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体 (例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中，因此与 宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够控制与其有效连接的基因的表达。这样的载体 在本文中称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。一般来说，重组DNA技术中应 用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可交互使用，因为质粒是 最常用的载体形式。然而，本发明包括同类的其他形式表达载体，例如具有同等功能的病毒 载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)包括重组表达载体已经导入其中 的细胞。当然这类术语不仅指具体对象的细胞，而且也指这种细胞的子代细胞。因为突变 或环境的影响连续传代时可能发生某些改变，所以这样的子代细胞可能事实上与亲代细胞 不完全相同，但是仍然包括在本文使用的术语“宿主细胞”范畴内。本文使用的术语“改变”是指抗体或其抗原结合部分中的一个或多个氨基酸的改 变。可通过在一个或多个位点添加、取代或缺失氨基酸而产生这样的改变。应用已知技术 如PCR诱变可引起所述变化。术语“接触位点”包括抗体重链可变区或轻链可变区的⑶R1、⑶R2或⑶R3中的氨 基酸位点，这些位点被以26种已知抗体抗原结构之一接触抗原的氨基酸占据。如果CDR氨 基酸以26种已知抗体抗原复合物结构中的任一种接触所述抗原，则可认为该氨基酸占据 了接触位点.与非接触位点相比，接触位点被接触抗原的氨基酸占据的可能性更高。接触 位点最好为含有以26种结构中的3种以上结构(>11.5%)接触抗原的氨基酸的CDR位 点。接触位点最优选为含有以25种结构中的8种以上结构(> 32% )接触抗原的氨基酸 的CDR位点。术语“超突变位点”包含占据抗体重链可变区或轻链可变区的⑶R1、⑶R2或⑶R3 区中的位点的氨基酸残基，这些残基被认为在所述抗体的体内亲和力成熟过程中体细胞超 突变的频率或概率高。“体细胞超突变的高频率或高概率”包括所述残基在所述抗体的体内 亲和力成熟过程中发生体细胞超突变的5-约40%机会的频率或概率。当然在该规定范围 的所有范围值也是本发明的一部分，例如5-约30%、5_约15%、15-30约％。术语“优选选择性诱变位点”包括占据重链可变区或轻链可变区的⑶R1、⑶R2或 CDR3区的位点的氨基酸残基，可认为优选选择性诱变位点既可是接触位点又可是超突变位 点ο术语“选择性诱变方法”包括通过选择和单独突变在至少一个优选选择性诱变位 点、超突变位点和/或接触位点的CDR氨基酸而改进抗体活性的方法。“选择性诱变的”人抗 体为含有应用选择性诱变方法在所选定位点产生的突变的抗体。在另一个实施方案中，所 述选择性诱变方法用来提供优选突变抗体重链可变区的CDR1、CDR2或CDR3 (此后分别称为 H1、H2和H3)或轻链可变区的⑶R1、⑶R2或⑶R3(此后分别称为L1、L2和L3)的各选定氨 基酸残基的方法。氨基酸残基可选自优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点。根据各个氨基酸在轻链可变区或重链可变区的位置选择各个氨基酸。当然超突变位点也可以是接 触位点。在一个实施方案中，选择性诱变方法是“靶向方法”。表述“靶向方法”包括以靶向 方式优选突变抗体重链可变区的⑶R1、⑶R2或⑶R3或者轻链可变区的⑶R1、⑶R2或⑶R3 的各个选定氨基酸残基的方法，例如“逐组靶向方法(Group-wise targeted approach) ”或 “逐个CDR靶向方法(CDRii setargeted approach) ”。在“逐组靶向方法，，中，针对具体各 组的各氨基酸残基进行选择性突变，包括组I (包括L3和H3)、组II (包括H2和Li)和组 III (包括L2和Hl)，所列各组的顺序为优选靶向顺序。在“逐个⑶R靶向方法”中，以以下 优选靶向顺序针对各⑶R的各个氨基酸残基进行选择性突变H3、L3、H2、Li、Hl和L2。使 选定的氨基酸残基突变为例如至少2个其他氨基酸残基，并测定突变对抗体活性的影响。 以抗体的结合特异性/亲和性和/或抗体的中和效价的变化检测活性。当然，选择性诱变 方法可用来优化任何来源的任何抗体，包括噬菌体展示、人IgG种系基因的转基因动物、从 人B细胞分离的人抗体。选择性诱变方法优选用于不能用噬菌体展示技术进一步优化的抗 体。应该指出的是，任何来源包括噬菌体展示、人IgG种系基因的转基因动物、从人B细胞 分离的人抗体的各种抗体可在选择性诱变方法之前或之后进行回复突变。术语“增强活性的氨基酸残基”包括增强抗体活性的氨基酸残基。当然增强活性 的氨基酸残基可取代优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点的氨基酸残基，进而在 一个或多个CDR中可能存在1个以上的增强活性的氨基酸残基。增强活性的氨基酸残基包 括增强抗体(例如结合人IL-12的抗人IL-12抗体)的结合特异性/亲和性的氨基酸残 基。增强活性的氨基酸残基还包括增强抗体中和效价的氨基酸残基，所述抗体例如为抑制 人IL-12的人IL-12抗体。本发明各方面在以下各小节中更详细地介绍。I.结合人IL-12的人抗体本发明提供结合人IL-12的分离人抗体或其抗原结合部分.本发明的人抗体优选 为重组中和性人抗hIL-12抗体。例如通过用实施例1所述的噬菌体展示技术筛选hIL-12 的一个或多个人\和VhcDNA文库，从而可选择结合人IL-12的本发明抗体。最初筛选人 Vl*VhcDNA文库鉴定了一系列的抗IL-12抗体，其中一种本文称为“Joe 9”(或“Joe 9野 生型”)，选定其用于进一步研制。Joe 9是一种亲和力较低的人IL-12抗体(例如1(。 约 0. lsec—1)，但它仍可用于特异性结合和检测hIL-12。可如下提高Joe 9抗体的亲和力对 重链⑶R和轻链⑶R进行诱变，产生一组“混合及匹配”而且可进一步突变的轻链可变区和 重链可变区序列，最终获得对hIL-12的亲和力增强的无数其他抗hIL-12抗体(参见实施 例1、表2 (见附件A)和图IA-D的序列对比)。在这些抗体中，在本文中称为Y61的人抗hIL-12抗体证实，结合亲和力显著改善 (例如Koff约2 X Kr4sec-1)。选择Y61抗hIL-12抗体通过分别突变重链CDR和轻链CDR中 的具体氨基酸残基进一步成熟亲和力。根据占据优选选择性诱变位点、接触位点和/或超 突变位点的氨基酸残基选择用于位点特异性突变(选择性诱变方法)的Y61的氨基酸残 基。关于重链CDR和轻链CDR选定位点的取代的总结见图2A-2H。本文称为J695的本发明 优选重组中和抗体产生于Y61轻链⑶R2位置50的Gly取代为Tyr以及Y61轻链⑶R3位 置94的Gly取代为Tyr。关于Joe 9野生型至J695谱系(lineage)的一组本发明抗IL-12抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列对比示于图1A-1D。关于Joe 9至J695谱系，这些序列的对比 可鉴定结合hIL-12的本发明抗体的优选重链可变区和轻链可变区的共有序列以及CDR3、 ⑶R2和⑶Rl的共有序列。此外，总结于图2A-2H的Y61诱变分析对于包含修饰Y61但仍然 保持良好hIL-12结合特性的序列的Y61至J695谱系，可鉴定结合hIL_12的重链可变区和 轻链可变区的共有序列以及结合hIL-12的⑶R3、⑶R2和⑶Rl共有序列。在后附的序列表 中以鉴定序列鉴定的本发明优选CDR、VH和VL序列(包括共有序列)总结如下。
以测定Kd速率和K。ff速率的表面胞质团共振分析功能性表征Joe9野生型亲和力 成熟产生的抗体。获得了一系列K。ff速率在以下范围内的抗体约0. Is-1至约IX ΙΟ、、 更优选K。ff约1 X IO-4S"1至约1 X IO-5S-1或1 X IO-5S-1以下。如实施例3所述，还体外表征 了抗体抑制植物凝集素(PHA)母细胞增殖的能力。获得了一系列IC5tl值在以下范围内的抗 体约1 X ICT6M至约1 X 10_"M、更优选约1 X IiT10M至1 X IiT11M或更低。因此，在一个方面，本发明提供这样的分离人抗体或其抗原结合部分结合人 IL-12并以0. Is"1或以0. Is"1以下的表面胞质团共振测定的K。ff速率常数与人IL-12解 离，或者它以ixio_6m或ixio_6m以下的ic5(l抑制体外植物凝集素母细胞增殖测定(pha 测定)的植物凝集素母细胞增殖。在优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结 合部分以IXicr2iT1或IXicr2iT1以下的K。ff速率常数与人il-12解离，或者以ixio_7m或 IXlO-7M以下的IC5tl抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在更优选的实施方案 中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以IXicr3iT1或IXicr3iT1以下的1(。 速率常数 与人IL-12解离，或者以1 X IO-8M或1 X 10、以下的IC5tl抑制体外PHA测定的植物凝集素 母细胞增殖。在更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以1Χ10ΛΓ1 或1 X IO-4S-1以下的K。ff速率常数与人IL-12解离，或者以1 X 10_9M或1 X 10_9M以下的IC5tl 抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗 体或其抗原结合部分以1 X IO-5S-1或1 X IO-5S-1以下的K。ff速率常数与人IL-12解离，或者 以1 X IO-10M或1 X IO-10M以下的IC5tl抑制体外PHA测定的植物凝集素母细胞增殖。在甚至 更优选的实施方案中，分离的人IL-12抗体或其抗原结合部分以IXicr5iT1或IXicr5iT1以 下的Koff速率常数与人IL-12解离，或者以1 X IO-11M或1 X IiT11M以下的IC50抑制体外PHA 测定的植物凝集素母细胞增殖。可用表面胞质团共振测定IL-12抗体的解离速率常数(K。ff)(参见实施例5)。一 般来说，表面胞质团共振分析应用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor，Piscataway，NJ)通 过表面胞质团共振(SPR)检测配体(固定在生物传感器基体上的重组人IL-12)和分析物 (抗体溶液)之间的实时结合作用。也可以通过固定分析物(生物传感器基体上的抗体) 而提供配体(重组IL-12溶液)进行表面胞质团共振。可用若干合适体外测定中的一种或 多种测定评价IL-12抗体或其抗原结合部分的中和活性(参见实施例3)。 本领域众所周知，抗体重链CDR和抗体轻链CDR在抗体与抗原的结合特异性/亲 和性中起重要作用。因此本发明包括具有Joe 9的轻链⑶R和重链⑶R的人抗体以及具 有经修饰增强抗体的结合特异性/亲和性的CDR的其他抗体。如实施例1所证实，对所述 轻链⑶R和重链⑶R的一系列修饰可使人抗hIL-12抗体的亲和力成熟。结合人IL-12的 Joe 9野生型至J695的人抗体系列的重链和轻链可变区的氨基酸序列对比见图1A-1D。根 据序列对比(见上表的总结)确定抗体CDR的共有序列基序。例如Joe 9至J695谱系的 VH CDR3的共有基序包含氨基酸序列(H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID N0:1)，该氨基 酸序列包含SEQ ID NO 7所示共有HCVR的位置95-102的氨基酸。VIXDR3的共有基序包 含氨基酸序列Q- (S/T) -Y- (D/E) - (S/R/K) - (S/G/Y) - (L/F/T/S) - (R/S/T/ff/H) - (G/P) - (S/ T/A/L) - (R/S/M/T/L-V/I/T/M/L) (SEQ ID NO :2)，该氨基酸序列包含 SEQ ID NO :8 所示共有 LCVR的位置89-97的氨基酸。 因此，另一方面，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以下特性a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 1氨基酸序列的重链CDR3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的轻链⑶R3.在一个优选实施方案中，所述抗体还包括含氨基酸序列F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y -A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO :3)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO 7的共有HCVR的位置50-65 的氨基酸)的VHCDR2以及还包括含氨基酸序列(G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S(SEQ ID NO: 4)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO 8的共有LCVR的位置50-56的氨基酸)的VL⑶R2。在另一个优选实施方案中，所述抗体还包括含氨基酸序列F-T-F-S_(S/ Ε) -Y-G-M-H (SEQ ID NO 5)(它包括含氨基酸序列SEQ IDNO 7的共有HCVR的位置27-35的 氨基酸)的VH CDRl以及还包括含氨基酸序列(S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/ A)-(N/G/Y)-(T/D) -V-(K/H) (SEQ ID NO 6)(它包括含氨基酸序列 SEQ ID NO 8 的共有 LCVR的位置24-34的氨基酸)的VL CDRl。在再一优选实施方案中，所述本发明抗体包括含SEQ ID NO 7氨基酸序列的HCVR 和含SEQ ID NO 8氨基酸序列的LCVR0根据对产生J695抗体的Y61进行的突变分析可确定其他共有基序(总结于图 2A-2H)。如图2A-2H所示的条形图所证实，Y61的重链和轻链⑶R的某些残基可取代而不 会显著减弱所述抗体的hIL-12结合特性。例如以12个不同氨基酸残基对CDR Hl的位置 30的各个取代不会显著降低所述抗体的K。ff速率，说明该位置可用各种不同氨基酸残基取 代。因此根据突变分析(即可用其他氨基酸残基取代的Y61中的位置)，确定共有基序。重 链和轻链⑶R3的共有基序分别示于SEQ ID NO 9和10，重链和轻链⑶R2的共有基序分别 示于SEQ IDNO 11和12，而重链和轻链⑶Rl的共有基序分别示于SEQ ID N0:13禾口 14。VH 和VL区的共有基序分别示于SEQ ID NO 15和16。因此，在一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具 有以下特性a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重链CDR3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 10氨基酸序列的轻链CDR3。在一个优选实施方案中，所述抗体还包括含SEQ ID NO 11氨基酸序列的VH⑶R2 以及还包括含SEQ ID NO 12氨基酸序列的VIXDR2。在另一个优选实施方案中，所述抗体还包括含SEQ ID NO 13氨基酸序列的VH CDRl以及还包括含SEQ ID NO 14氨基酸序列的VLCDRl。在再一优选实施方案中，所述本发明抗体包括含SEQ ID NO 15氨基酸序列的 HCVR和含SEQ ID NO 16氨基酸序列的LCVR。本发明的一种优选抗体是人抗hIL-12抗体Y61，它是通过PCR诱变⑶R3使Joe 9 野生型的亲和力成熟而制得(如实施例1所述)。根据表面胞质团共振和体外中和测定， Y61的特异性/结合亲和性改善。Y61的重链和轻链⑶R3分别示于SEQ ID NO 17和18，Y61的重链和轻链⑶R2分别示于SEQ ID NO 19和20，而Y61的重链和轻链⑶Rl分别示于 SEQ ID NO :21和22。Y61的VH具有SEQ IDNO 23的氨基酸序列，而Y61的VL具有SEQ ID NO 24的氨基酸序列(这些序列也示于图1A-1D，与Joe9对比)。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞 增殖；b)具有包含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重链CDR3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 18氨基酸序列的轻链⑶R3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重链⑶R2，以及具有包含SEQID NO 20氨基酸序列的轻链⑶R2。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO :21氨基酸序列的重链⑶R1，以及具有包含SEQID NO 22氨基酸序列的轻链⑶R1。在再一优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 23氨基酸序列的重链可变区，以及具有包含SEQID NO 24氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同种异型变异体，正如Katbat所论述(Kabat， Ε· Α·,等(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，美国人类健 康服务部，NIH公告第91-3242号)。所述抗体重链恒定区最好是IgGl重链恒定区。或者， 所述抗体部分可是Fab片段或F(ab’ 2)片段或单链Fv片段。对Y61各个残基的修饰产生一批图2A-2H所示的抗体.以表面胞质团共振和/或 体外中和测定测定各抗体的特异性/结合亲和性。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含选自SEQ ID NO :404_SEQ ID NO 469的氨基酸序列的重链CDR3 ；以 及c)具有包含选自SBQ ID NO :534_SEQ ID NO 579的氨基酸序列的轻链CDR3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自SEQ ID NO :335-SEQ ID NO :403的氨基酸序列的重链CDR2 ；以及具有包含选自SEQ ID N0: 506-SEQ ID NO :533的氨基酸序列的轻链CDR2。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含选自 SEQ ID NO :288-SEQ ID NO :334的氨基酸序列的重链CDRl ；以及具有包含选自SEQ ID N0: 470-SEQ ID NO 505的氨基酸序列的轻链CDRl。在再一优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分包括含SEQ ID NO 23氨基酸序列的重链可变区以及含SEQ ID NO :24氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同种异型变异体，正如Katbat所论述(Kabat， Ε· Α·,等(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，美国人类健 康服务部，NIH公告第91-3242号)。所述抗体重链恒定区最好是IgGl重链恒定区。或者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab’ 2)片段或单链Fv片段。本发明的一种特别优选的重组中和抗体J695是通过对抗体Y61的接触和超突变 氨基酸残基进行定点诱变而制得(参见实施例2和以下部分III)。J695与Y61的不同之 处在于Y61轻链⑶R2位置50的Gly取代为Tyr以及Υ61轻链⑶R3位置94的Gly取代 为Tyr。J695的重链和轻链CDR3分别示于SEQ ID NO 25和26，J695的重链和轻链CDR2 分别示于SEQ ID NO 27和28，而J695的重链和轻链CDRl分别示于SEQ ID NO 29和30。 J695的VH具有SEQ ID NO 31的氨基酸序列，而J695的VL具有SEQ ID NO 32的氨基酸 序列(这些序列也示于图1A-1D，与Joe9对比)。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 25的氨基酸序列的重链⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 26的氨基酸序列的轻链⑶R3。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重链⑶R2，以及具有包含SEQID NO 28的氨基酸序列的轻链⑶R2。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列的重链CDRl，以及具有包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列的轻链⑶R1。在再一优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分具有包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的重链可变区，以及具有包含SEQID NO 32氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述全长抗体包含重链恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgA和IgE恒定区，以及它们的任何同种异型变异体，正如Katbat所论述(Kabat， Ε· Α·,等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，美国人类 健康服务部，NIH公告第91-3242号)。所述抗体重链恒定区最好是IgGl重链恒定区。或 者，所述抗体部分可是Fab片段或F(ab’ 2)片段或单链Fv片段。可使Joe 9至J695的谱系抗体或Y61至J695的谱系抗体的CDR3、CDR2和CDRl 的优选共有序列产生其他突变，以获得本发明的其他抗IL-12抗体。可应用标准分子生物 学技术，例如PCR诱变，针对轻链和/或重链CDR的各个接触氨基酸残基或超突变氨基酸残 基进行这样的修饰方法，然后如本文所述对修饰抗体进行动力学和功能分析(例如实施例 3所述的中和测定和实施例5所述的BIAcore分析)。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO :1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO :3氨基酸序列的重 链⑶R2和含SEQ ID NO :5氨基酸序列的重链⑶R1，或者为其在优选选择性诱变位点或超 突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含 SEQID NO :1氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ ID NO 3氨基酸序列的重链CDR2和含SEQ ID NO 5氨基酸序列的重链⑶Rl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 2氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的轻 链CDR2和含SEQ ID NO :6氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在优选选择性诱变位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含 SEQID NO 2氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的轻链CDR2和含SEQ ID NO 6氨基酸序列的轻链⑶Rl的抗体高10倍以下。另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的 重链⑶R2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重链⑶Rl，或者为其在优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率 较所述包括含SEQ ID NO :9氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的重链 ⑶R2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重链⑶Rl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO 12氨基酸序列的 轻链CDR2和含SEQ ID NO 14氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在优选选择性诱变位点、 接触位点或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率 较所述包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO :12氨基酸序列的轻链 ⑶R2和含SEQ ID NO 14氨基酸序列的轻链⑶Rl的抗体高10倍以下。一般技术人员还知道，可对本发明抗体例如Y61或J695的⑶R区进行其他突变， 以获得本发明的其他抗IL-12抗体。如上所述，可用标准分子生物学技术进行这样的修饰 方法。分别如实施例3和5所述，可对修饰抗体进行功能和动力学分析。对Y61各个残基 进行达到与J695相同的修饰示于图2A-2H，见实施例2介绍。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO 19氨基酸序列的 重链⑶R2和含SEQ ID NO :21氨基酸序列的重链⑶Rl，或者为其在优选选择性诱变位点 或超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包 括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重链⑶R3、含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重链⑶R2和 含SEQ ID NO 21氨基酸序列的重链⑶Rl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 18氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO 20氨基酸序列的 轻链CDR2和含SEQ ID NO 22氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在优选选择性诱变位点或 超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的< 速率较所述包括 含SEQ ID NO 18氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO 20氨基酸序列的轻链⑶R2和含 SEQ ID NO 22氨基酸序列的轻链⑶Rl的抗体高10倍以下。另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制体外PHA测定中的植物凝集素母细胞 增殖；b)包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重链CDR3、含SEQ IDNO 27氨基酸序列的 重链⑶R2和含SEQ ID NO :29氨基酸序列的重链⑶Rl，或者为其在优选选择性诱变位点或 超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的k。ff速率较所述包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重链⑶R3、含SFQ ID NO ,21氨基酸序列的重链⑶R2和含 SEQ ID NO 29氨基酸序列的重链⑶Rl的抗体高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 26氨基酸序列的轻链CDR3、含SEQ IDNO 28氨基酸序列的 轻链CDR2和含SEQ ID NO 30氨基酸序列的轻链CDRl，或者为其在优选选择性诱变位点或 超突变位点存在一个或多个氨基酸取代的突变体，其中所述突变体的< 速率较所述包括 含SEQ ID NO 26氨基酸序列的轻链⑶R3、含SEQ ID NO :28氨基酸序列的轻链⑶R2和含 SEQ ID NO 30氨基酸序列的轻链⑶Rl的抗体高10倍以下。在再一实施方案中，本发明提供分离的人抗体或其抗原结合部分，它中和人IL-12 活性以及中和至少一种选自以下的其他灵长类IL-12活性狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩 IL-12、弥猴IL-12和恒河猴IL-12，但其不中和小鼠IL-12活性。II.诜择重组人抗体可通过筛选重组组合抗体文库、优选scFv噬菌体展示文库分离获得本发明的 重组人抗体，所述文库用从得自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VHcDNA制得。制备 和筛选这样的文库的方法学是本领域已知的。除了市售用于制备噬菌体展示文库的试 剂盒(倒如 PharmaciaRecombinat Phage Antibody System，目录号 27-9400—01 ；以及 StratageneSurfZAP 噬菌体展示试剂盒，目录号240612)之外，具体适用于制备和筛选抗 体展示文库的方法和试剂实例可参见例如Kang等的PCT公布号WO 92/18619 ；Winter等的 PCT 公布号 WO 92/20791 ；Breitling 等的 PCT 公布号 WO 93/01288 ；McCafferty 等的 PCT 公 布号 W092/01047 ；Garrard 等的 PCT 公布号 WO 92/09690 ；Fuchs 等(1991) Bio/Technology 2:1370-1372 ；Hay 等(1992)Hum Antibody Hybridomas 2:81_85 ;Huse 等(1989)Science 246:1275-1281 ；McCafferty 等，Nature(1990)348 552~554 Griffiths 等(1993)EMB0 J U :725-734 ;Hawkins 等(1992) J Mol Biol 226 889~896 :Clackson 等(1991)Nature 352 624-628 ；Gram 等(I992)PNAS 89 3576-3580 ；Garrad 等(1"1)Bio/Technology 9 1373-1377 ;Hoogenboom 等(1991) Nuc Acid Res 边4133_4137 和 Barbas 等(1991) PNAS 88 :7978-7982o用于该方法的抗体文库优选为用人VL和VH cDNA制备的scFv文库。优选用重组 人IL-12作为抗原筛选scFv抗体文库，以选择具有对IL-12的结合活性的人重链和轻链序 列.为了选择对IL-12的p35亚单位或p70异源二聚体特异性的抗体，在存在过量游离 P40亚单位情况下进行筛选测定。例如应用实施例1所述的micro-Friguet滴定法可确定 亚单位优选抗体。在选定初始的人VL和VH节段后，进行其中筛选不同成对的选定VL和VH节段的 IL-12结合的“混合和匹配”实验以选择优选VL/VH对组合(参见实施例1)。另外，为了进 一步提高hIL-12结合的亲和力和/或降低解离速率常数，可用类似于天然免疫反应过程中 与抗体亲和力成熟有关的体内体细胞突变过程的方法，优选在VH和/或VL的CDR3区中 随机突变所述优选VL/VH对的VL和VH节段。这种体外亲和力成熟可通过应用分别与VH ⑶R3或VL⑶R3互补的PCR引物扩增VH和VL区而完成，所述引物在某些位置已经“掺入 了”( “spiked”)4种核苷酸碱基的随机混合物，使得获得的PCR产物编码随机突变已经导 入VH和/或VL⑶R3区的VH和VL节段。可再选择和再筛选这些随机突变VH和VL节段 对hIL-12的结合，可选定对IL-12结合具有高亲和力和低解离速率的序列。表2(参见附件A)显示了因为体外亲和力成熟而产生的结合特异性/亲和力改变的抗体。在从重组免疫球蛋白展示文库选择、分离和筛选了本发明的抗hIL-12抗体后，可 从噬菌体颗粒(例如噬菌体基因组)回收编码选定抗体的核酸，并将其用标准重组DNA技 术亚克隆入其他表达载体。必要时，可进一步操作所述核酸以产生本发明的其他抗体形式 (例如与编码额外免疫球蛋白结构域(例如额外恒定区)的核酸连接).为了表达通过筛选 组合文库分离的重组人抗体，使编码所述抗体的DNA克隆入重组表达载体中，并将其导入 哺乳动物宿主细胞中，见以下部分IV的更详细介绍。在实施例1更详细地介绍了应用噬菌体展示技术选择人IL-12结合抗体的方法以 及通过随机诱变或定点诱变CDR区使选定抗体亲和力成熟。如实施例1所述，筛选人VL和VH cDNA文库鉴定一系列抗IL- 12抗体，其中选定 Joe 9抗体用于进一步研制。比较Joe 9的重链可变区与从VBASE数据库选择的重链种系 序列，显示Joe 9与C0S-3种系序列相似。C0S-3属于种系序列的VH3家族。Vh3家族是人VH种系所有组成成分的一部分，VH种系所有组成成分可根据核苷酸 序列同源性分为 7 个家族，即 VH1-VH7 (Tomlinson 等(1992) J. Mol. Biol.，227，776-798 和 Cook等(1995) Immunology Today，16，237-242)。VH3家族的成员最多，在种系所有组成成 分中占的比例最大。对于任何给定的人VH3种系抗体序列，在整家族中的氨基酸序 列同一性是最高的(参见例如 Tomlinson 等(1992) J. Mol. Biol.，227，776-798 和 Cook 等
(1995)Immunology Today, 16，237-242)。任何2个VH3家族种系VH序列之间的氨基酸序 列同一性变化范围为约100个VH残基中的69-98个残基(即任何2个种系VH序列之间的 氨基酸序列同源性为69-98% )。对于大多数种系序列对，具有至少80个或80个以上的相 同氨基酸残基(即至少80%氨基酸序列同源性)。VH3家族成员间的高度氨基酸序列同源 性使某些氨基酸残基位于VH链CDR和构架区的关键位点。这些氨基酸残基赋予CDR以结 构特征。 抗体结构研究表明，根据占据CDR和构架区某些位置的关键氨基酸残基，可将CDR 构象分为各种家族的正则CDR结构。因此，在具有正则结构和相同关键氨基酸残基的不同 抗体中存在相似的局部 CDR 构象(Chothia 等(1987) J. Mol. Biol.，196，901-917 和 Chothia 等(1989) Nature，342，877-883)。在VH3家族中，在CDRl和CDR2正则结构的关键位点存在 保守的氨基酸残基同一性(Chothia 等(1992) J. Mol. Biol.，227，799-817)。C0S-3种系VH基因是VH3家族成员之一，而且是3-30(DP_49)种系VH等位基因 的一种变异体。C0S-3只在位置5与Joe 9 VH氨基酸序列不同。Joe9 VH和C0S-3之间 以及Joe 9 VH和其他VH3家族成员之间的高度氨基酸序列同源性赋予高度CDR结构同源 性(Chothia 等(1992)J. Mol. Biol.，227，799-817 ；Chothia 等(1987)J. Mol. Biol.，196， 901-917 和 Chothia 等(1989)Nature,342,877-883)。技术人员知道，鉴于与Joe 9的高度氨基酸序列相似性和正则结构相似性，其他 VH3家族成员也可用来获得结合人IL-12的抗体。例如可如下达到此目的通过链改组技术 选择合适的VL(Winter等(1994) Annual Rev. Immunol.，12，433-55)或者将啮齿动物抗体 或其他人抗体的CDR(包括本发明抗体的CDR)移植到VH3家族构架上。根据核苷酸序列同源性，人Va种系所有组成成分可分为10个家族(Williams等
(1996)J. Mol. Biol.，264，220-232)。比较Joe 9的轻链可变区与从VBASE数据库选择的轻链种系序列，显示Joe 9与DPL8 λ种系相似。Joe 9VL与DPL8序列仅在4个构架位置上不 同，而且与其他VaI家族成员的构架序列高度同源。鉴于与Joe 9的高度氨基酸序列同源 性和正则结构相似性，其他VaI家族成员也可用来获得结合人IL-12的抗体。例如可如下 达到此目的通过链改组技术选择合适的VL (Winter等同上)或者将啮齿动物抗体或其他 人抗体的CDR(包括本发明抗体的CDR)移植到Va 1家族构架上。本发明方法包括结合hIL-12的重组抗体，它包含得自种系序列的VH3家族成员之 一的重链可变区和得自种系序列的Va 1家族成员之一的轻链可变区。此外，技术人员知道， 任何Vh3家族重链序列成员可与任何Va 1家族轻链序列成员组合。本领域技术人员还知道，在一个群体(例如人类群体)中存在导致种系氨基酸序 列变化的DNA序列多态性。这样的种系序列遗传多态性可因为天然等位基因变异而存在于 群体中的个体之间。这样的天然等位基因变异通常可导致1-5%的基因核苷酸序列变异。 天然等位基因变异所致的任何以及全部这样的核苷酸变异以及由此产生的种系序列氨基 酸多态性均属于本发明范畴。因此，一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有 以下特性a)结合人IL-12，并根据表面胞质团共振测定，以0. Is—1或0. Is—1以下k。ff速率常 数与人IL-12解离，或者以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制体外植物凝集素母细胞增 殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。b)具有包含选自Vh3种系家族成员之一的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重 链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的接触位点或超突变位点存在突变。c)具有包含选自νλ 1种系家族成员之一的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述 轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点 存在突变。在一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在重链CDR3中存
在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在轻链CDR3中
存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在重链CDR2中
存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在轻链CDR2中
存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在重链CDRl中
存在突变。在另一个优选实施方案中，所述分离的人抗体或其抗原结合部分在轻链CDRl中
存在突变。—般技术人员知道，鉴于Vh3种系家族成员之间或轻链V λ 1种系家族成员之间的 高度氨基酸序列相似性，所以种系序列突变可获得结合人IL-12的其他抗体.表1 (参见附 件Α)显示了 VH3家族成员的种系序列，而且证实了家族成员中的显著序列同源性。表1还 显示了 νλ 家族成员的种系序列。提供Joe 9的重链序列和轻链序列作为比较.例如可在本发明抗体发生突变的相同氨基酸位置(例如Joe 9中的突变)，或νλ 家族成 员的种系序列发生突变。可用标准分子生物学技术，例如PCR诱变，针对种系序列中的各个 氨基酸残基进行修饰，然后如本文所述对修饰抗体进行动力学和功能分析(例如实施例3 所述的中和测定和实施例5所述的BIAcore分析)。因此，一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有以 下特性a)具有包含选自SEQ ID NO :595_667的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链 可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在 突变。b)具有包含选自SEQ ID NO :669_675的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链 可变区在具有增强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在 突变。一般技术人员知道，鉴于Joe 9和C0S-3重链种系序列之间以及Joe 9和DPL8 λ 种系序列之间的高度氨基酸序列相似性，所以这些种系序列CDR区的其他突变可获得结合 人IL-12的其他抗体。可用如上所述的标准分子生物学技术进行这样的修饰方法。因此，在一个方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具 有以下特性a)结合人IL-12，并根据表面胞质团共振测定，以0. Is—1或0. Is—1以下k。ff速率常 数与人IL-12解离，或者以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制体外植物凝集素母细胞增 殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。b)具有包含C0S-3种系氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区在具有增 强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。c)具有包含DPL8种系氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区在具有增 强活性的氨基酸残基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变.由于某些氨基酸残基占据轻链可变区和重链可变区的CDR和构架区的关键位点， 所以结构特征存在于这些区中。具体来说，⑶R2和⑶Rl区是正则结构分类的依据。因为 家族成员之间存在高度氨基酸序列同源性，所以这些正则特性存在于家族成员之间。技术 人员知道，在赋予这些正则结构的氨基酸残基的修饰可产生结合IL-12的其他抗体。可采 用如上所述的标准分子生物学技术进行所述修饰。因此，另一方面，本发明的特征在于一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它具有 以下特性a)结合人IL-12，并根据表面胞质团共振测定，以0. Is—1或0. Is—1以下k。ff速率常 数与人IL-12解离，或者以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制体外植物凝集素母细胞增 殖测定(PHA测定)中的植物凝集素母细胞增殖。b)具有包含选自Vh3种系家族成员之一的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重 链可变区包括与其他VH3种系家族成员的CDR2结构相似的CDR2以及与其他VH3种系家族 成员的CDRl结构相似的CDR1，而且其中所述重链可变区在具有增强活性的氨基酸残基的 优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变；c)具有包含选自νλ 1种系家族成员之一的氨基酸序列的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括与其他V λ 1种系家族成员的⑶R2结构相似的⑶R2以及与其他V λ 1种系 家族成员的CDRl结构相似的CDR1，而且其中所述轻链可变区在具有增强活性的氨基酸残 基的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点存在突变。本发明重组人抗体具有与选自VBASE数据库的人种系免疫球蛋白序列同源的可 变区和恒定区。重组人抗体的突变(例如随机诱变或PCR诱变)产生不是由人种系免疫球 蛋白序列编码的氨基酸。此外，得自人类提供者的重组抗体文库将包括由于发生于B细胞 发育期间的正常体细胞突变过程而不同于其相应种系序列的抗体序列。值得注意的是，如 果PCR扩增获得的“种系”序列编码不同于真正种系构型的构架区的氨基酸(即与真正种 系序列相比扩增序列发生改变)，则最好使这些氨基酸不同变回真正种系序列(即构架残 基“回复突变”为种系构型)。因此本发明可任选包括回复突变步骤。为此，首先比较所述 种系编码的重链和轻链氨基酸序列与突变免疫球蛋白重链和轻链构架氨基酸序列，鉴定与 最接近种系序列不同的突变免疫球蛋白构架序列的氨基酸残基。然后，利用遗传密码确定 应该使哪个核苷酸改变，从而使突变免疫球蛋白序列的合适核苷酸回复突变为相应的种系 序列。应用标准方法如PCR介导的诱变(其中突变核苷酸掺入PCR引物，使得PCR产物存 在所述突变)或定点诱变对突变免疫球蛋白构架序列进行诱变。研究鉴定为回复突变侯选 对象的各氨基酸的作用，以了解在抗原结合中的作用是直接作用还是间接作用，而最终的 人抗体不应有突变后发现影响人抗体任何需要特性的任何氨基酸；举例来说，使用选择性 诱变方法鉴定的增强活性的氨基酸不易发生回复突变。测定诱变获得的抗体特性的测定可 包括ELISA、竞争性ELISA、体外和体内中和测定和/或(参见例如实施例3)各种来源(包 括人、灵长类和/或其他物种)的组织切片的组织化学。为了使回复突变的氨基酸数目最少，可保留与最接近种系序列不同、但是与第二 种种系序列相应氨基酸相同的氨基酸位置，前提是第二种种系序列的所述氨基酸两侧至少 10个、优选12个氨基酸与本发明人抗体的序列相同而且共线性。这保证用本发明的人抗体 治疗个体的专化抗原提呈细胞提呈给免疫系统的任何肽表位都不是外源性的，而是与自身 抗原相同，即所述第二种种系序列编码的免疫球蛋白。可在优化抗体的任何阶段进行回复 突变；但是优选正好在选择性诱变方法之前或之后进行由复突变。更优选正好在选择性诱 变方法之前进行回复突变。III.对优选选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的修饰通常可用以上部分II所述的噬菌体展示方法选择亲和力提高的抗体。可以通过 CDR残基的随机突变组合以及产生包含不同序列抗体的大文库达到此目的。然而，对于有 效选择方法，抗体抗原反应必须处于平衡，以便高亲和力抗体在不同时间优选结合所述抗 原。在达到某一水平的亲和力(即抗体Υ61的亲和力)后，当噬菌体展示方法用来提高选 定抗IL-12抗体的亲和力时，不能确定建立平衡的选择条件(推测由于抗原和噬菌体颗粒 之间的额外非特异性作用所致)。因此，不能用噬菌体展示方法选择更高亲和力的抗体。因 此，对于至少部分抗体或抗原，噬菌体展示方法受限于其选择具有高度改善的结合特异性 /亲和性的抗体的能力。所以，建立了克服了这些限制的称为选择性诱变方法(Selective Mutagenesis Approach)的方法，它不需要抗体的噬菌体展示的亲和力成熟，该方法由本发 明提供。尽管研制了该选择性诱变方法，用以克服使用噬菌体展示系统的缺陷，但是应该指 出的是，该方法也可用于噬菌体展示系统。而且，选择性诱变方法可用来增强任何抗体的活性。为了增强抗体的活性(例如亲和力活性或中和活性)，人们最好使重链和轻链的 各CDR位点突变为相应的其他可能氨基酸残基。但是，因为抗体内平均存在70个CDR位点， 所以这种方法是非常费时的而且操作繁复.因此，本发明方法使人们可通过只突变重链和 /或轻链CDR中的某些选定残基而增强抗体的活性。此外，本发明方法可增强抗体活性，而 不影响其他需要抗体特性.根据一级序列或其在可变区中的位置，不能精确预测确定抗体可变区的什么氨 基酸残基接触抗原。尽管如此，Kabat等通过对不同特异性抗体进行序列对比，已经鉴定 了为抗体之间显著不同的可变区局部区域的CDR(Kabat等(1971)Ann. NY Acad. Sci. 190 382-393, Kabat, Ε. Α.等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,第 五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)。结构研究表明，抗原结合表面由CDR 中存在的氨基酸残基形成。还知道CDR外面的其他氨基酸残基在抗原结合中起结构性作用 或直接参与抗原结合。所以，对于各抗原抗体对，CDR内以及CDR外面的氨基酸残基可能 是重要的。Tomlison等进行了序列对比研究，在重链和轻链⑶Rl和⑶R2中以及在为体细胞 突变高频位点的部分κ链CDR3中鉴定了许多位点。(Tomlison等(1996) J. Mol. Biol. 256 813-817)。具体来说，位置 H31、H31B、H33、H33B、H52B、H56、H58、L30、L31、L31A、L50、L53、 L91、L92、L93和L94鉴定为体细胞突变高频位点。然而，该分析不包括重要重链⑶R3区 以及已知位于抗体结合位点中心而且潜在与抗原产生重要作用的轻链⑶R3部分。此外， Tomlison等提出单独的体细胞多样性不一定能预测特定氨基酸在抗原结合中的作用，而 且他们认为保守氨基酸残基接触抗原，而非保守氨基酸残基不接触抗原。该结论进一步 得到关于体细胞突变对抗体亲和力的影响的突变研究的支持(Sharon，(1990), PNAS,84 4814-7)。高亲和力抗对苯偶氮基胂酸盐(Ars)抗体的19个体细胞突变同时被其相应的种 系残基取代，产生种系形式的活性丧失200倍的抗Ars抗体。只恢复19个体细胞突变中的 3个突变就可恢复抗Ars抗体的全部亲和力，证实允许发生许多体细胞突变而不影响抗原 结合活性。该结果的部分原因在于抗体多样性特性本身。未成熟B细胞最初可产生识别许多 自我抗原或非自我抗原的低亲和力抗体。而且，抗体可能发生引起自身反应的亲和力成熟 序列变化过程。所述低亲和力抗体的超突变可用来消除自身反应性(“负性选择”)并增加 对外源抗原的亲和力。所以，分析无数抗体的一级和结构数据不能提供以下目的的预测方 法(1)体细胞超突变位点在亲和力成熟过程与降低对不需要抗原的亲和力的过程中的作 用；或者(2)特定氨基酸如何影响特定抗原抗体对的特性。通过分析许多抗原抗体复合物的晶体结构进行了阐明特定氨基酸残基在抗原识 别中的作用的其他努力(MacCallum等(1996) J. Mol. Biol. 262 :732_745)。指出位于CDR中 和CDR外的位点的潜在作用。在26个分析的结构中的10个以上结构中参与抗原结合的 CDR 位点包括重链 H31、H33、H50、H52、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98 和 HlOO 以及 轻链L30A、L32、L91、L92、L93、L94、L96。但是，所述作者指出，应用这些数据和其他结构数 据预测抗原接触可或多或少预测接触位点，因此推测不同策略可能适用于不同抗原。Pini等介绍了在大噬菌体展示文库的抗体CDR序列中随机化多个残基，以快速增加抗体亲和力(Pini 等(1998) J. Biol. Chem. 273 :21769_21776)。然而，Pini 等所论述的 高亲和力抗体在总共8个位置具有突变，而对增强抗体亲和力必须哪些变化进行简化分析 (reductionaryanalysis)不可行，因为需要测试无数可能组合所需要的最小数目的氨基酸。此外，随机化多个残基不一定能够保留抗体的其他需要特性。需要的抗体特性是 本领域已知的，包括例如保留非交叉反应性，例如与其他蛋白或人组织的非交叉反应性，以 及保留与改善中和效价的人种系免疫球蛋白序列密切相关的抗体序列.其他需要特性包 括保留物种交叉反应性的能力、保留表位特异性的能力和保留在哺乳动物细胞中高水平表 达蛋白的能力。可用本领域已知的技术观测或测量所述需要特性，所述技术包括但不限于 ELISA、竞争性ELISA、体外和体内中和测定(参见例如实施例3)、根据需要对包括人、灵长 类或其他来源的不同来源的组织切片的免疫组织化学分析以及利用瞬时表达或稳定表达 研究在哺乳动物细胞中的表达。另外，Pini等的方法可导入比增强亲和力实际需要的最小数目更多的变化，而且 可产生在人体内引发抗人抗体(HAMA)形成的抗体。此外，如其他地方所论述，本文证实的 噬菌体展示或其他相关方法，包括核糖体展示，在抗体和抗原之间亲和力达到一定水平后， 这些方法不适用，而且因为其他作用，包括与其他噬菌体或核糖体组分以及抗原的其他作 用，不能在合理的时间范围内建立达到平衡所需的条件。一般技术人员可以从上述参考文献内容收集关于抗体多样性原因的有趣科学信 息。然而，本发明提供增强特定抗原抗体对的抗体亲和力的方法，同时保留抗体的其他相关 特性或需要特性。这在考虑需要赋予特定抗体各种不同特性包括抗原结合时特别重要。如果起始抗体具有需要保留的需要特性时，选择性诱变方法是保留这些需要特性 而同时增强抗体活性的最佳策略。例如诱变Y61时，目的是增强抗体对hIL-Ι的亲和力而 且提高抗体的中和效价，同时保留所需要的特性。需要的Y61特性包括(1)保留与其他蛋 白或人组织的非交叉反应性，(2)保留精确的表位特异性，即优选识别p70(p40/p35)异源 二聚体中的P40表位，因此防止游离可溶性p40的结合干扰；以及(3)产生具有尽可能接近 其相应种系免疫球蛋白序列的重链和轻链氨基酸序列的抗体。在一个实施方案中，本发明方法提供选择性诱变方法作为保留抗体需要特性同时 增强亲和力和/或中和效价的策略。术语“选择性诱变方法”定义同上，包括分别使选定氨 基酸残基突变的方法。可首先从优选选择性诱变位点选择需要突变的氨基酸残基，然后从 接触位点、再后从超突变位点选择需要突变的氨基酸残基。可使各个选定的位置突变为至 少2个其他氨基酸残基，确定所述突变对抗体需要特性以及抗体活性改善的影响。选择性诱变方法包括以下步骤按照顺序1)优选选择性诱变位点；2)接触位点；3)超突变位点，选择候选位置， 然后根据在抗体重链可变区和轻链可变区中的位置对位置排序(优选顺序为⑶R3>OTR2 > CDR1)；按照排列的顺序分别使候选的优选选择性诱变位点、超突变位点和/或接触位点 突变为所有可能的其他氨基酸残基，分析各个突变对抗体活性的影响，以确定增强活性的
氨基酸残基；必要时，逐步组合各个增强活性的氨基酸残基，分析各种组合对抗体活性的影响；选择具有增强活性的氨基酸残基的突变抗体，就其免疫原性潜能根据氨基酸取代的部 位和同一性对所述突变抗体进行排序。最高位次为包含几乎与种系数据库描述的可变区序 列相同的氨基酸序列的突变抗体，或者具有与其他人抗体相似的氨基酸序列的突变抗体。 第二位次为包含种系序列或其他人抗体序列罕见的氨基酸取代的突变抗体。最低位次为种 系序列或另一种人抗体序列未曾有的氨基酸取代的突变抗体。如上所述，突变抗体包含的 至少一个增强活性的氨基酸残基位于⑶R3优于位于⑶R2，位于⑶R2优于位于⑶R1。重链 可变区CDR优于轻链可变区CDR。还可以研究突变抗体例如与其相应的亲代抗体相比的活性增强情况.例如应用 中和测定或利用表面胞质团共振分析的结合特异性/亲和性(参见实施例3)可测定突变 抗体的活性改善。优选活性改善较亲代抗体增高至少2-20倍。活性改善较亲代抗体增高 可至少为“xl”至“x2”倍，其中“xl”和“x2”为2-20之间而且包括2和20的整数，包括所 述范围中的范围，例如2-15 (例如5-10)。还可以研究具有增强活性的氨基酸残基的突变抗体，以确定突变后是否保留至少 一种其他需要特性。例如以抗hIL-12抗体测试(1)保留与其他蛋白或人组织的非交叉反 应性，⑵保留表位识别，即优选识别p70(p40/p35)异源二聚体中的p40表位，因此防止游 离可溶性P40的结合干扰，以及(3)产生具有尽可能接近其相应种系免疫球蛋白序列的重 链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体；以及根据不同于种系序列的数目确定哪些抗体至 少可能引发人免疫反应.对具有1个以上(例如至少2个或至少3个)增强活性的氨基酸 残基的抗体进行相同的观测，以确定是否保留了需要特性。在诱变Y61中应用“选择性诱变方法”的一个实例如下所述。各突变H31S — E、 L50 — Y或L94G —Y分别增强抗体的中和活性。然而当测试组合克隆时，组合克隆 H31S — E+L50 — Y+L94G — Y 的活性不比 L50 — Y+L94G — Y(J695)更好。所以，CDRl 的位 置31由种系氨基酸残基Ser变为Glu对于J695的活性比Y61有提高是非必须的。因此， 选择性诱变方法鉴定与最终活性有关的最小数目的变化，由此降低最终抗体的免疫原性潜 力而且保留抗体的其他需要特性。选择性诱变方法制备的编码VH和VL的分离DNA可转化为全长抗体链基因、Fab片 段基因或scFV基因，如IV部分所述。为了表达选择性诱变方法制备的VH和VL区，可将编 码重链和轻链的表达载体转染入各种宿主细胞，见IV部分的详细介绍。优选宿主细胞包括 原核生物宿主细胞，例如大肠杆菌，或者真核生物宿主细胞，例如酵母细胞，如酿酒酵母。最 优选的真核生物宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，见IV部分的详细介绍。选择性诱变方法提供了制备活性增强的抗体的方法而不需要用其他方法预先进 行抗体亲和力成熟。选择性诱变方法提供制备经过回复突变、亲和力增强的抗体的方法。选 择性诱变方法还提供增强亲和力成熟抗体的活性的方法。技术人员知道，选择性诱变方法可用于本领域已知的标准抗体操作技术.实例包 括但不限于CDR移植抗体、嵌合抗体、scFV片段、全长抗体的Fab片段和其他来源例如转基 因小鼠的人抗体。对抗体进行快速大规模的突变分析包括利用核糖体展示技术的体外转录和翻译 (参见例如 Hanes 等，(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. 94 :4937_4942 ；Dall Acqua 等，(1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8 :443_450 ；He 等，(1997) Nucleic Acid Res. 25 :5132_5134)和授予Kawasaki的美国专利第5，643，768和5，658，754号。选择性诱变方法还提供制备可用 核糖体展示技术选择的活性增强抗体的方法。在本发明方法中，通过改变HCVR和/或LCVR的各个⑶R位点而进一步修饰抗体或 其抗原结合部分。尽管可以用噬菌体展示抗体制备这些修饰，但是优选所述方法，因为可用 在其他类型宿主系统如细菌、酵母或哺乳动物细胞表达系统中表达的抗体实施该方法。选 择用于修饰的CDR中的各个位点基于为接触位点和/或超突变位点的位点。本文定义的优选接触位点和超突变位点示于表3 (参见附件A)，其按照本发明方 法的修饰详细介绍于实施例2。优选接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、 H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、 L91、L92、L93、L94 和 L96。优选超突变位点选自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、 L31、L32、L53和L93。更优选的氨基酸残基(称为“优选选择性诱变位点”)既是接触位点 又是超突变位点，它们选自 H30、H31、H3IB、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、 L92、L93、L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。优选增强活性的氨基酸残基取代位于 选自以下位点的氨基酸残基H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。更优选增强活性的氨基酸残基取代位于以下位点的氨基酸残基H30、H31、H31B、H32、 H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。特别优选增强活性的氨基酸残 基取代位于选自L50和L94的位点的氨基酸残基。一般来说，本发明方法包括选择目的亲代抗体或其抗原结合部分的重链或轻链 CDR中特别优选的选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点，随机突变所述各位点(例 如利用突变寡核苷酸的遗传方法制备修饰抗体的“微小文库(mini-library)”)或者使一 个位点突变为特定需要氨基酸，以鉴定显示增强活性的氨基酸残基，纯化修饰抗体(例如 用非噬菌体展示宿主系统)，检测修饰抗体对抗原的活性(例如利用BIAcore分析测定k。ff 速率)，必要时，对其他CDR位点重复所述步骤，组合证实活性增强的各个突变，以及测试各 种组合是否产生较亲代抗体更高活性(例如亲和性或中和效价)的抗体或其抗原结合部 分。因此，在一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法， 包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)依次选择用于突变的互补决定区(CDR)中的1)优选选择性诱变位点，2)接触 位点或3)超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤 a)-d)；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各个突变，形成组 合抗体或其抗原结合部分；以及
g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结 合部分。最好所述选定抗体的活性提高而如上所述不丧失或保留亲代抗体的至少一种需要 特性。一般技术人员应用本领域已知的技术可检测或观测所述需要特性。优选的接触位点选自H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。优选超突变位点选自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和 L93。 更优选的优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、 L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤 a)-d)；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、2个单独显示具有改进活性的增强活性 的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有两个增强活性氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于 所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。优选的接触位点选自H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96.优选超突变位点选自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和 L93。 更优选的优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、 L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤 a)-d)；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、3个单独显示具有改进活性的增强活性 的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有两个增强活性氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对于 所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。优选增强活性的氨基酸残基取代位于选自以下位点的氨基酸残基H30、H31、 H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、 L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。在诱变各个选定位点后，可对突变克隆测序，以鉴定在各克隆的选定位点中导入 了什么氨基酸残基。可选择少数克隆(例如约24个)进行测序，在统计学上来说应获得 10-15种独特抗体，但可对大多数克隆(例如60个以上)进行测序，保证鉴定在选定位点具 有每种可能取代的抗体。在一个实施方案中，首先选择用于诱变的重链和/或轻链CDR3区的接触位点和/ 或超突变位点。然而，对于已经通过噬菌体展示选择随机诱变⑶R3区而体外使亲和力成熟 的抗体，最好首先选择重链和/或轻链CDRl或CDR2中的接触位点和/或超突变位点。在一个更优选的实施方案中，首先选择用于诱变的重链和/或轻链CDR3区的优选 选择性诱变位点。然而，对于已经通过噬菌体展示选择随机诱变⑶R3区而体外使亲和力成 熟的抗体，最好首先选择重链和/或轻链CDRl或CDR2中的优选选择性诱变位点。在另一个优选实施方案中，如下依次通过选择性诱变方法优化选定抗体首先使 选自 H30、H31、H3IB、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94 的优选 选择性诱变位点各自突变为至少2个其他氨基酸残基(优选为5-14个其他氨基酸)，所获 得抗体的特征为亲和力、中和效价提高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方论述 的其他特性)。如果一个优选选择性诱变位点的突变根本不能或不能足够增强亲和力或中 和效价，甚至如果组合多个增强活性的氨基酸取代优选选择性诱变位点的氨基酸残基也不 能获得具有目标活性(包括亲和力和/或中和效价)的组合抗体，则从H35、H50、H53、H54、 H95、H96、H97、H98、L30A和L96选择其他氨基酸残基用于选择性诱变，并使其各自突变为至 少2个其他氨基酸残基(优选为5-14个其他氨基酸残基)，获得抗体的特征为亲和力、中和 效价提高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方论述的其他特性)。如果选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A 和 L96 的氨基酸残基的单 一突变根本不能或不能足够增强活性(包括亲和力和/或中和效价)，甚至如果组合多个增 强活性的氨基酸取代这些位点的氨基酸也不能获得具有目标活性(包括亲和力和/或目标 中和效价)的组合抗体，则从H33B、H52B、L31A选择其他氨基酸残基用于选择性诱变，并 使其各自突变为至少2个其他氨基酸残基(优选为5-14个其他氨基酸残基)，获得抗体的 特征为亲和力、中和效价提高(而另外可能的特征为保留至少一种其他地方论述的其他特 性)。当然，连续选择性诱变方法可在以上概述的任何步骤终止，只要鉴定出具有需要 活性(包括亲和力和中和效价)的抗体。如果预先选定位点的诱变鉴定出了增强活性的氨基酸残基，但是组合抗体仍然未达到活性的目标组合(包括亲和力和中和效价)，和/或如 果所鉴定的增强活性的氨基酸还影响其他需要特性而因此不可接受时，则可对其他CDR残 基进行诱变(参见IV部分)。本发明方法可用来改善抗体或其抗原结合部分的活性，以获得预定的目标活性 (例如预定的亲和力和/或中和效价，和/或需要特性)。因此，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分活性以获得预定目标活性的方法， 包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)从 H30、H31、H3IB、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、
L94选择优选选择性诱变位点。c)分别使选定的优选选择性诱变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得 第一组突变抗体或其抗原结合部分；d)评价第一组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定单一选择性诱变位点的 突变是否产生具有预定目标活性或部分目标活性的抗体或其抗原结合部分；e)逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各个突变，形 成组合抗体或其抗原结合部分。f)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部 分是否具有预定目标活性或部分目标活性。g)如果步骤d)或f)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者 获得只具有部分活性的抗体，则使选自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96
的其他氨基酸残基突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得第二组突变抗体或其抗原结 合部分；h)评价第二组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H35、H50、H53、 H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的单个氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性 或部分活性的抗体或其抗原结合部分；i)逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的步骤g)的各 个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；j)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部 分是否具有预定目标活性或部分目标活性；k)如果步骤h)或j)没有获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分，或者 获得只具有部分活性的抗体，则使选自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸残基突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得第三组突变抗体或其抗原结合部分；1)评价第三组突变抗体或其抗原结合部分的活性，以确定选自H33B、H52B和L31A 的单一氨基酸残基的突变是否产生具有预定目标活性或部分活性的抗体或其抗原结合部 分；m)逐步组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的步骤k)的各 个突变，形成组合抗体或其抗原结合部分；η)评价所述组合抗体或其抗原结合部分的活性，以确定组合抗体或其抗原结合部 分是否具有预定目标活性，由此获得具有预定目标活性的抗体或其抗原结合部分。
可应用许多诱变方法，包括PCR装配、Kunkel (dut-ung-)和硫代磷酸(Amersham Sculptor试剂盒)寡核苷酸定向诱变。各种各样的宿主表达系统可用来表速突变抗体，包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳 动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适细菌表达载体的实例为pUCl 19 (Sfi)。其 他抗体表达系统是本领域已知的和/或在以下IV部分中介绍。可鉴定用本发明方法生产的修饰抗体或其抗原结合部分，而不依赖于噬菌体展示 方法进行选择。因此，对于改善通过噬菌体展示系统选择获得但是其活性不能进一步通过 噬菌体展示系统诱变增强的重组亲代抗体或其抗原结合部分的活性，特别优选本发明方 法。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方 法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表 达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；e)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤 b)至 d)；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、显示具有改进活性的各个突变，形成组 合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结 合部分。优选接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、HlO 1、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。优选超突变位点选自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和 L93。 更优选的优选选择性诱变位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、 L50、L91、L92、L93和L94。特别优选的接触位点选自L50和L94。利用现有的方法制备结合亲和力和中和效价提高同时保留如上所述的其他抗体 特性是不可能的或者极其费时。但是，本发明方法可非常容易地鉴定这类抗体。本发明方 法处理的抗体可以是任何来源的抗体。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方 法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，而且以合适表达系统表达 所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲 代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们 选自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选 识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或 3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自 1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/ p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种 系免疫球蛋白序列的抗体。如果抗体针对特定抗原的亲和力会因此增强，而此时噬菌体展示方法(或相关系 统，包括核糖体展示)不再适用，且要保留其他需要特性，则可应用本发明方法。因此，在另 一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表 达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为需要保留的特性；直到获得相对于所述亲代抗体或 其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分；f)任选对至少一个其他优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点重复步骤 a)至 e)；g)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性和至少 一种保留特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价所述组合抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性；直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特 性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游 离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体.在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们 选自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选 识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或 3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自 1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/ p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种 系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表 达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；
e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲 代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们 选自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选 识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或 3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选 自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/ p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种 系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包 括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中的优选选择性诱变位点、接触位点或超突 变位点，由此鉴定选定的接触位点或超突变位点；c)分别使所述选定的优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点突变为至少2 个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表 达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性，其中所述特性为所述抗体需要保留的特性；直到获得相对于所述亲 代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留特性的抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述接触位点选自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在另一个优选实施方案中，所述超突变位点选自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交 叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止 游离可溶性P40的结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，选择性诱变的残基选自优选选择性诱变位点，它们 选自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选 识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或 3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。在一个更优选的实施方案中，所述接触位点选自L50和L94，而所述其他特性选自 1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/ p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的结合干扰，和/或3)产生接近种 系免疫球蛋白序列的抗体。IV.修饰其他⑶R残基最后，可用增强活性的氨基酸残基需要、和/或结合抗原和/或保留所述抗体其他 需要特性直接或间接需要的任何方法鉴定特定抗体抗原对中的所有CDR残基。这类CDR残 基称为“优选选择性诱变位点”。应该注意的是，在特定的条件下也可以用其他方法鉴定所 述优选选择性诱变残基，包括抗体和抗原的共结晶以及分子建模。如果完成了优选鉴定集中于上述优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点的 增强活性的氨基酸的所有努力，或者如果需要其他改进，可如下所述修饰其余CDR残基。应 该知道，按照上述实施方案已经可以在任何一个或多个接触位点或超突变位点修饰所述 抗体，但是可能需要进一步改进。所以，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗 原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价所述突变抗体或所述突变抗体系列或其抗原结合部分相对于所述亲代抗 体或其抗原结合部分的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价所述突变抗体或所述突变抗体系列或其抗原结合部分相对于所述亲代抗 体或其抗原结合部分的至少一种其他特性的变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原 结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。如果一个残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；B)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的
位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位点；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性的增强 活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部 分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。如果完成了优选鉴定集中于上述接触位点或超突变位点的增强活性的氨基酸的 所有努力，或者如果需要其他改进，而且所述抗体不能通过诱变和噬菌体展示(或相关的 核糖体展示)方法进一步优化，则可如下所述修饰其余CDR残基。应该知道，按照上述实施 方案已经可以在任何一个或多个优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点修饰所述抗 体，但是可能需要进一步改进。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方 法，包括a)提供重组亲代抗体或其抗原结合部分；所述重组抗体以噬菌体展示系统选择 获得，但是其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)选择用于突变的互补决定区(CDR)中 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、 H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、 L91、L92、L93、L94以外的氨基酸残基和；c)分别使所述选定接触或超突变位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得 一组突变抗体或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性 的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。
如果单一诱变不足以提高所述抗体的亲和力，则可诱变其他残基。因此，在另一个 实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是 其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分，并以非噬菌体展示系统表达所述抗体系列；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他位点重复步骤b)至d)，所述位点既不是b)项选定的位点，也 不是 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、 H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 位点；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个单独显示具有改进活性的增强 活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和其他特性；直到获得相对于所述亲代抗体或其 抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。可能完成了优选鉴定集中于所述优选选择性诱变位点、接触位点或超突变位点的 增强活性的氨基酸的所有努力，或者可能需要其他改进，而且重要的是保留所述抗体的其 他特性。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性而不 影响其他特性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性 并保留其他特性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。如果单一残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；所以，在另一个实施方案 中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性变化；f)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至e)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位点；g)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个分别显示改进活性而不影响至 少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及h)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况；直到获得相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种保留的其他特性的抗体或其 抗原结合部分。对优选选择性诱变位点、接触和超突变残基的诱变可能并没有足够增强所述抗体 的亲和力，而诱变和噬菌体展示方法(或相关核糖体展示方法)可能不再有用，而且应该保 留至少一种其他特性。因此，在另一个实施方案中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的亲和力的 方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是 其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、HlOU L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的
位点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组突变抗体 或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的至少一种其他特性的变化，直到获得相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性的抗体或其抗原结合部分。所述其他特性优选选自1)保留与其他蛋白或人体组织的非交叉反应性，2)保留 表位识别，即优选识别p70 p40/p35异源二聚体情况下的p40表位，防止游离可溶性p40的 结合干扰，和/或3)产生接近种系免疫球蛋白序列的抗体。如果单一残基的诱变不能满足要求，则可诱变其他残基；所以，在另一个实施方案 中，本发明提供改善抗体或其抗原结合部分的活性的方法，包括a)提供亲代抗体或其抗原结合部分，所述抗体以噬菌体展示系统选择获得，但是 其活性不能通过所述噬菌体展示系统诱变进一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
点选择用于突变的互补决定区(CDR)中的氨基酸残基；c)分别使所述选定位点突变为至少2个其他氨基酸残基，由此获得一组交变抗体 或其抗原结合部分并以非噬菌体展示系统表达；d)评价该组突变抗体或其抗原结合部分相对于所述亲代抗体或其抗原结合部分 的活性和至少一种其他特性的保留情况，由此鉴定增强活性的氨基酸残基；e)对至少一个其他⑶R位点重复步骤b)至d)，所述CDR位点既不是b)项选定的 位点，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位点；f)组合所述亲代抗体或其抗原结合部分、至少2个分别显示改进活性而不影响至 少一种其他特性的增强活性的氨基酸残基，形成组合抗体或其抗原结合部分；以及g)评价具有2个增强活性的氨基酸残基的所述组合抗体或其抗原结合部分相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分的活性和至少一种其他特性的保留情况，直到获得相对 于所述亲代抗体或其抗原结合部分具有改进活性和至少一种其他保留特性的抗体或其抗 原结合部分。V.表达抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链基因和重链基因，制备本发明的抗 体或抗体部分。为了重组表达抗体，用一个或多个携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和 重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达， 而且优选分泌入培养所述宿主细胞的培养基中，从该培养基中可回收所述抗体。标准重 组DNA方法学用来获得抗体重链基因和抗体轻链基因，使这些基因导入重组表达载体中， 然后使所述载体导入宿主细胞中，所述标准方法例如为以下文献介绍的方法=Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis (编辑)，Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Ausubel, F. Μ.等(编辑)CurrentProtocols in Molecuar Biology,Greene Publishing Associates, (1989)和 Boss 等的美国专利第 4，816，397 号。为了获得编码Joe 9wt或Joe 9wt-相关抗体的重链可变区的DNA片段，如II部 分所述，从人文库筛选人IL-12特异性抗体并使其突变。获得编码Joe 9wt或Joe 9wt_相 关VH和VL节段的DNA片段后，应用标准方法例如PCR定点诱变(PCR介导的诱变，其中突 变核苷酸掺入PCR引物中，使得PCR产物存在所述突变)或其他定点诱变方法，对这些序列 进行诱变。应用标准重组DNA技术进一步操作具有需要水平的活性和结合特异性/亲和性的人IL-12抗体如J695，例如使可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv 基因。在这些操作中，VL或VH编码DNA片段与编码另一种蛋白的另一 DNA片段如抗体恒 定区或柔性接头有效连接。本文使用的术语“有效连接”是指两种DNA片段连接在一起，使 得两种DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框中。编码VH区的分离DNA可通过使VH编码DNA与另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和 CH3)的DNA分子有效连接而转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知 的(参见例如 Kabat，E· A·等(1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest， 第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)，通过标准PCR扩增可获得包含这些 区段的DNA片段。所述重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒 定区及Kabat介绍的其任何同种异型变异体(Kabat，E. Α.等(1991) Sequence of Proteins oflmmunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)，但是 最优选为IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，VH编码DNA可以与另一种只编码 重链CHl恒定区的DNA分子有效连接。编码VL区的分离DNA可通过使VL编码DNA与另一种编码轻链恒定区CL的DNA 分子有效连接而转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是 本领域己知的(参见例如 Kabat，E. A.等(1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国人类健康服务部，NIH公告第91-3242号)，通过标准PCR扩增可获 得包含这些区段的DNA片段。所述轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选λ恒定 区。为了获得scFv基因，使VH和VL编码DNA片段与另一种编码柔性接头的片段 如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3W片段有效连接，使得VH和VL序列可表达为邻接的单 链蛋白，VL和VH区通过柔性接头连接在一起(参见例如Bird等(1988) Science M2 423-426 ；Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-5883 ；McCafferty 等， Nature(1990)348 :552_554)。为了表达本发明抗体或抗体部分，使如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链 的DNA插入表达载体中，使得所述基因与转录控制序列和翻译控制序列有效连接。在这种 情况下，术语“有效连接”是指抗体基因连接入载体，使得所述载体中的转录控制序列和翻 译控制序列发挥其预定的调节所述抗体基因的转录和翻译的作用。选择与所用的表达宿主 细胞匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入独立的载体， 而更常见的是，将这两种基因插入同一表达载体。应用标准方法(例如连接在抗体基因片 段和载体中的互补限制性位点，或者如果没有限制性位点则平端连接)使抗体基因插入表 达载体中。在插入J695或J695相关的轻链序列或重链序列之前，所述表达载体已经带有 抗体恒定区序列。例如一种使J695或J695相关的VH和VL序列转化为全长抗体基因的方 法是将其分别插入编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH节段与所述载体 中的CH节段有效连接，而VL节段与所述载体中的CL节段有效连接。另外或者二者择一， 重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可克隆入载体， 以便信号肽按读框与抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源 信号肽(即非免疫球蛋白信号肽)。除了抗体链基因之外，本发明重组表达载体携带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列.术语“调节序列”是指包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增 强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。例如以下文献介绍了这类调节序列 Goeddel ；GeneExpression Technology :Methods in Enzymology 185，Academic Press， SanDiego,CA(1990)。本领域技术人员知道，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可能取 决于诸如用于转化的宿主细胞的选择、需要蛋白的表达水平等的因素。用于哺乳动物宿主 细胞表达的优选调节序列包括控制蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如得 自以下病毒的启动子和/或增强子巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病 毒40 (SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)) 和多瘤病毒。关于病毒调节元件及其序列的进一步介绍，参见例如Stinski的美国专利第 5，168，062号、Bell等的美国专利第4，510，245号和Schaffner等的美国专利第4，968，615 号，Bujard等的美国专利第5，464，758号和Bujard等的美国专利第5，654，168号。除了抗体链基因和调节序列之外，本发明重组表达载体可携带其他序列，例如调 节所述载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基 因有助于选择所述载体已经导入其中的宿主细胞(参见例如均为Axel等的美国专利第 4，399，216,4, 634，665和5，179，017号)。例如，选择标记基因通常赋予载体导入其中的 宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还 原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤选择/扩增dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选 择)。为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染入宿主细胞 中。各种形式的术语“转染”包括通常用于将外源DNA导入原核生物宿主细胞或真核生物 宿主细胞的各种各样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管理论上可 在原核生物宿主细胞或真核生物宿主细胞中表达本发明抗体，但是优选在真核生物宿主细 胞中表达抗体，而最优选哺乳动物宿主细胞，因为真核生物细胞、尤其是哺乳动物细胞较 原核生物细胞更可能装配和分泌适当折叠的免疫活性抗体。用于表达本发明重组抗体的优 选哺乳动物宿主细胞包括中国苍鼠卵巢细胞(CH0细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216-4220 介绍的 dhfrTHO 细胞，和 DHFR 选择标记一起使 用，如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601_621 中所介绍)、NSO 骨髓瘤细 胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，如下 制备抗体培养宿主细胞足够长时间，使抗体在宿主细胞中表达，更优选所述抗体分泌入宿 主细胞在其中生长的培养基中。应用标准蛋白纯化方法可从培养基中回收抗体。宿主细胞也可以用来产生完整抗体的一部分，例如Fab片段或scFv分子。应该知 道，关于上述方法的各种改变也属于本发明范畴。例如最好用编码本发明抗体的轻链或重 链(而不是同时的二者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用来去除结合hIL-12 非必需的编码轻链或重链或二者的DNA的一部分或全部。本发明的抗体也包括这样的截短 DNA分子表达的分子。另外，可以应用标准化学交联方法交联本发明抗体与第二种抗体制备 双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，而另一条重链和轻链是非hIL-12 抗原特异性的。在一个用于重组表达本发明抗体或其抗原结合部分的优选系统中，编码抗体重链 和抗体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链基因和抗体轻链基因独立与增强子/启动子调节元件(例如得自SV40、CMV、腺 病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)有 效连接，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带有DHFR基因，它使得可应用甲氨 蝶呤选择/扩增选择以载体转染的CHO细胞。培养选定的转化体宿主细胞，以便表达抗体 重链和抗体轻链，从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用来制备重组表达载体、 转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。可用人免疫球蛋白 基因的转基因动物(例如小鼠)表达本发明的抗体或其抗原结合部分(参见例如Taylor， L.D.等(1992) Nucl. Acids Res.迎6287_6295)。也可以修饰植物细胞，以产生表达本发明 抗体或其抗原结合部分的转基因植物。鉴于以上所述，本发明的另一个方面涉及可用于重组表达本发明抗体和各种抗体 部分的核酸、载体和宿主细胞组分。本发明的特征优选在于编码J695的CDR或J695的完 整重链可变区和/或轻链可变区的分离核酸。因此，在一个实施方案中，本发明的特征在于 一种编码抗体重链可变区的分离核酸，所述分离核酸编码包含SEQ ID N0:25氨基酸序列的 J695重链⑶R3。优选编码抗体重链可变区的核酸还编码包含SEQ ID N0:27氨基酸序列的 J695重链⑶R2。更优选编码抗体重链可变区的核酸还编码包含SEQ ID N0:29氨基酸序列 的J695重链⑶R1。甚至更优选所述分离核酸编码包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的抗体 重链可变区(J695的全长VH区)。在其他实施方案中，本发明的特征在于一种编码抗体轻链可变区的分离核酸，所 述分离核酸编码包含SEQ ID N0:26氨基酸序列的J695轻链⑶R3。优选编码抗体轻链可 变区的核酸还编码包含SEQ ID N0:28氨基酸序列的J695轻链⑶R2。更优选编码抗体轻 链可变区的核酸还编码包含SEQ ID N0:30氨基酸序列的J695轻链⑶R1。甚至更优选所 述分离核酸编码包含SEQ ID NO :32氨基酸序列的抗体轻链可变区(J695的全长VL区)。本发明还提供编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体。例如在一个实施方案 中，本发明提供编码以下抗体链的重组表达载体a)具有包含SEQ ID NO 31氨基酸序列的可变区的抗体重链；以及b)具有包含SEQ ID NO 32氨基酸序列的可变区的抗体轻链。本发明还提供一种或多种本发明重组表达载体导入其中的宿主细胞。优选所述宿 主细胞为哺乳动物宿主细胞，更优选宿主细胞为CHO细胞、NSO细胞或COS细胞。本发明甚 至还提供如下合成本发明重组人抗体的方法在合适培养基中培养本发明的宿主细胞，直 到合成本发明的重组人抗体。所述方法还可包括从培养基中分离所述重组人抗体。VI.药用组合物和药物的给药本发明抗体和各种抗体部分可掺入适合给予患者的药用组合物中。通常所述药用 组合物包括本发明抗体或抗体部分以及药学上可接受的载体。本文使用的“药学上可接受 的载体”包括生理学上匹配的任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟 吸收剂等。药学上可接受的载体的实例包括一种或多种水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘 油、乙醇等，以及它们的组合物。在大多数情况下，最好所述组合物包含等渗剂，例如糖类、 多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例 如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们延长抗体或抗体部分的保藏期或有效性。本发明的抗体和各种抗体部分可掺入适用于胃肠外给药的药用组合物中。优选抗体或抗体部分制备为含0. l-250mg/ml抗体的注射溶液。注射溶液可由装于燧石小瓶或琥 珀小瓶、安瓿或预填充的注射器的液体剂型或冻干剂型构成。缓冲剂可为PH 5.0_7.0(最 好PH 6.0)的L-组氨酸(l-50mM)，最好5-10mM。其他合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸 钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可用来以0-300mM浓度(液体剂型最好为150mM) 改善溶液的等渗性(toxicity)。冻干剂型可包含低温防护剂，主要为0-10%蔗糖(最好 0.5-1.0%)。其他合适低温防护剂包括海藻糖和乳糖。冻干剂型可包含增量剂，主要为 1-10%甘露醇(最好2-4% )。液体和冻干剂型可应用稳定剂，主要为l_50mM L-蛋氨酸 (最好5-10mM)。其他合适的增量剂包括甘氨酸、精氨酸，也可包含0-0. 05%吐温80 (最好 0. 005-0. 01% )0其他表面活性剂包括但不限于吐温20和BRIJ表面活性剂。在一个优选实施方案中，药用组合物包含约0.01mg/kg-10mg/kg剂量的所述抗 体。更优选所述抗体剂量包括每隔1周给予lmg/kg，或每周给予0. 3mg/kg。本发明的组合物可以为各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，例 如液体溶液(例如注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓 剂。优选形式取决于预定的给药模式和治疗用途。常见的优选组合物为注射溶液或输注溶 液形式，例如类似于用于其他抗体被动免疫接种人类的组合物。优选的给药模式为胃肠外 给药(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉给药)。在一个优选实施方案中，所述抗体通过静脉 输注或注射给药。在另一个优选实施方案中，所述抗体通过肌肉或皮下注射给药。通常治疗组合物在生产及储藏条件下必须是无菌稳定的。所述组合物可配制为溶 液、微乳剂、分散剂、脂质体或其他适合高浓度药物的有序结构。可如下制备无菌注射溶液 将需要量的所述活性化合物(即抗体或抗体部分)以合适溶剂根据需要与以上列举的一种 成分或组合物混合，然后过滤除菌。一般如下制备分散剂将所述活性化合物掺入含有基本 分散介质和以上列举的需要的其他成分的无菌溶媒中。在用于制备无菌注射溶液的无菌冻 干粉的情况下，制备的优选方法是真空干燥和喷雾干燥，由所述活性成分和任何其他需要 成分的预先过滤除菌溶液制得冻干粉。例如利用如卵磷脂包衣、在分散剂的情况下维持需 要的颗粒大小，以及利用表面活性剂可维持溶液的合适流体性。通过使组合物中含有延迟 吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶可延长注射组合物的吸收。尽管对于许多治疗应用来说，优选的给药途径/给药模式为皮下注射、静脉内注 射或输注，但是可用本领域已知的各种方法给予本发明的抗体和各种抗体部分。技术人员 知道，给药途径和/或给药模式取决于需要的效果.在某些实施方案中，可应用避免所述化 合物快速释放的载体制备所述活性化合物，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微包 囊传递系统。可应用可生物降解、生物匹配的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙 醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的大多数方法是专利方法或本领域技术人 员公知的方法。参见例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 编著，Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可利用例如惰性稀释剂或可食同化 载体口服给药。所述化合物(和其他成分，如果需要的话)可装入硬壳或软壳明胶胶囊、压 制成片或直接掺入患者的食物中。对于口服治疗性给药，所述化合物可掺混于赋形剂，而且 以摄食片剂、口颊片、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。为了通 过非胃肠外给药给予本发明化合物，可能必须用防止其失活的物质对本发明化合物进行包衣或者本发明化合物与所述物质同时给予。其他活性化合物也可以掺入所述组合物中。在某些实施方案中，本发明抗体或抗 体部分可与一种或多种其他治疗药物配制在一起和/或共同给予，所述药物可用于治疗 IL-12活性起有害作用的疾病。例如本发明的抗hIL-12抗体或抗体部分可与一种或多种结 合其他靶的其他抗体(例如结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)配制在一起和 /或共同给予。而且，本发明的一种或多种抗体可与两种或两种以上的前述药物联合使用。 这样的联合治疗可有利地使用较低剂量的所给予的治疗药物，因此避免与各种单一治疗相 关的可能毒性或并发症。熟练医师知道，当本发明抗体用作联合治疗的一部分时，最好比只 给予患者所述抗体的剂量更低的剂量的抗体(例如通过应用联合治疗可达到协同治疗效 果，它又使得可应用较低剂量的所述抗体而达到需要的治疗效果)。白细胞介素12在与涉及免疫和炎症因素的各种疾病有关的病理学中起重要作 用。这些疾病包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、少年慢性关节炎、Lyme关节炎、 牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、节段性回肠炎、溃疡性结肠 炎、炎症性肠病、胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎性硬皮 病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应、与器官移植有关的急性或慢性免疫 病、肉样瘤病、动脉硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki病、Grave病、肾病综合征、慢性疲劳 综合征、Wegener肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾脏显微镜下血管炎、慢性活动性肝 炎、眼色素层炎、脓毒性休克、毒素性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、感染性疾病、寄生 虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、慢性舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏 病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison病、I 型散发性多腺体缺陷和II型多腺体缺陷、Schmidt综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、 脱发、斑形脱发、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎 关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊柱关节病、动脉硬 化性疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类 天疱疮、线性IgA病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、少 年恶性贫血、肌痛性脑炎/Royal Free Disease、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性关节炎、 原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相 关性疾病、丙型肝炎、普通可变性免疫缺陷(普通可变性低丙种球蛋白血症)、扩张性心肌 病、女性不育、卵巢功能衰竭、成熟前卵巢功能衰竭、纤维性肺病、隐原性纤维性肺泡炎、炎 症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺 病、全身性硬化相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、系统性红斑狼疮相 关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjogren病相关性肺病、关节僵硬性脊椎炎相关性 肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物引起的间质性肺病、辐射 性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、淋巴细胞侵润性肺病、感染后间 质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性肝炎或 狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗-LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑色 棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺功能低下、与器官移植有关的急性免疫病、与器官移植 有关的慢性免疫病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中 性白细胞减少、肾病N0S、肾小球肾炎、显微镜下的肾脏脉管炎、莱姆病、盘状狼疮红斑、特发性男性不育或N0S、精子的自身免疫、多发性硬化(全部亚型)、胰岛素依赖型糖尿病、交感 性眼炎、继发于结缔组织病的肺动脉高压、Goodpasture综合征、结节性多动脉炎在肺部的 表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still病、全身性硬化、Takayasu病/动脉炎、自身免疫 性血小板减少、特发性血小板减少、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿自身 免疫性甲状腺机能低下(Hashimoto病)、萎缩性自身免疫性甲状腺机能低下、原发性粘液 性水肿、晶状体性眼色素层炎、原发性脉管炎和白癜风。本发明的人抗体和各种抗体部分可 用来治疗自身免疫性疾病、尤其是与炎症有关的疾病，包括类风湿性脊椎炎、变态反应、自 身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素层炎。优选本发明抗体或其抗原结合部分用来治疗类风湿性关节炎、节段性回肠炎、多 发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病和牛皮癣，见VII部分更详细的介绍。本发明的人抗体或抗体部分也可以与用于治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病的 一种或多种其他治疗药物一起使用。本发明抗体或其抗原结合部分可单独或联合使用以治疗所述疾病。应该知道，本 发明抗体或其抗原结合部分可单独使用或与其他物质例如治疗药物联合使用，所述其他药 物由技术人员选定以达到预定目的。例如所述其他物质可以是本领域已知的用于治疗本发 明抗体所治疗疾病或病症的治疗药物。所述其他物质也可以是赋予所述治疗组合物有益 特性的物质，例如影响所述组合物粘度的物质。还应该知道，本发明范围内的组合是用于其预定目的的组合。以下列举的物质是 为了说明本发明而不是为了限制本发明。为本发明组成部分的组合可以是本发明抗体和至 少一种选自以下所列的其他物质。所述组合也可以包括一种以上其他物质，例如两种或三 种其他物质，只要这样的组合形成的组合物能够实现其预定作用。优选的组合为非类固醇抗炎药物(也称为NSAIDS)，非类固醇抗炎药物包括诸如 布洛芬的药物。其他优选组合有包括强的松龙的皮质类固醇；当联合本发明抗IL-12抗 体治疗患者时，通过逐渐减少所需要的类固醇剂量可减少甚至消除应用类固醇的周知副作 用。可与本发明抗体或抗体部分联合用于治疗类风湿性关节炎的治疗药物的非限制性实 例包括以下药物抑制细胞因子的抗炎药物(CSAID)；其他的人细胞因子或生长因子(例如 TNF.LT,IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18,EMAP-II,GM-CSF,FGF 和 PDGF) 的抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子(例如CD2、CD3、 CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80 (B7. 1)、CD86 (B7. 2)、CD90)或其配体 (包括⑶154 (gp39或⑶40L))的抗体联合使用。优选的治疗药物组合可在不同位点干扰自身免疫和随后的炎症级联反应；优选的 实例包括TNF拮抗剂，例如嵌合人源化或人TNF抗体、D2E7(1996年2月9日申请的美国申请 序号 08/599，226)、cA2 (Remicade )、CDP 571、抗 TNF抗体片段(例如 CDP870)和可溶性 p55 或p75 TNF受体以及它们的衍生物、(p75TNFRIgG(Enbrel )或p55TNFRIgG(Lenerc^pt)、可 溶性IL-13受体(sIL-13)，此外还有TNF α转化酶(TACE)抑制剂；同样IL-1抑制剂(例如 白细胞介素1转化酶抑制剂，例如Vx740或IL-IRA等)因为同样的原因可能也是有效的。 其他优选的组合包括白细胞介素11、抗P7s和ρ-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)。再一优选组 合为自身免疫反应中的其他重要作用物，它们可与IL-12作用平行发挥作用、依赖于IL-12 作用或与IL-12作用协同作用；特别优选IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体或IL-18结合蛋白。已经证实，IL-12和IL-18相互重叠但是具有不同的作用，二者的拮 抗剂组合可能是最有效的。又一优选组合是非消耗性抗-CD4抑制剂。另外的其他优选组 合包括协同刺激途径CD80(B7. 1)或CD86(B7. 2)的拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性 配体。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与药物联合使用，所述药物例如甲氨蝶呤、 6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪氯喹啉/羟氯喹啉、青霉胺、金硫苹果酸 盐(肌肉注射和口服)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇类(口服、吸入和局部注射)、β _2 肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤类(茶碱、氨茶碱)、色甘酸 盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和氧托铵、环孢菌素、冊506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来 氟米特、NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血 栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子如TNF α或IL-I信号转导的药 物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL_1 β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗 P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFa转化酶(TACE)抑制剂、T细胞信号转导抑制剂 如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶 抑制剂、可溶性细胞因子受体以及它们的衍生物(例如可溶性P55或p75 TNF受体和衍生 物 p75TNFRIgG(Enbrel )和 p55TNFRIgG(Lenerc^pt)、sIL-lRI、sIL-lRII、sIL_6R、可溶性 IL-13 受体(sIL-13))和抗炎细胞因子 H^i^niL-4、IL-lO、IL-ll、IL-13*TGF0)。优选 组合包括甲氨蝶呤或来氟米特，在中度或重度类风湿性关节炎的情况下优选环孢菌素。与本发明抗体或其抗体部分联合用于炎症性肠病的治疗药物的非限制性实例包 括以下药物布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇类；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨 酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗 氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-I受体拮抗剂；抗IL-I β单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生 长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基咪唑化合物；其他人细胞因子或生长因子(例如TNF、 LT、IL-U IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、ΕΜΑΡ-ΙΙ、GM-CSF、FGF 和 PDFG)的 抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可与针对细胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、 ⑶8、⑶25、⑶28、⑶30、⑶40、⑶45、⑶69、⑶90)或其配体的抗体联合使用。本发明抗体或 其抗原结合部分也可以与各种药物联合使用，所述药物例如为甲氨蝶呤、环孢菌素、Π(506、 雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来氟米特、NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二 酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子 如TNF α或IL-I信号转导的药物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1 β 转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TNFa转化酶抑制剂、 T细胞信号转导抑制剂如激酶抑制齐U、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡唳、硫唑嘌呤、6-巯基 嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体以及它们的衍生物(例如可溶性p55 或 P75TNF 受体、sIL-lRI、sIL-lRII、sIL_6R、可溶性 IL-13 受体(sIL-13))和抗炎细胞因 子(例如 IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 和 TGF β ) 可联合抗体或抗原结合部分治疗节段性回肠炎的治疗药物的优选实例包括 以下药物TNF拮抗剂，例如抗TNF抗体、D2E7(1996年2月9日申请的美国申请序号 08/599，226)、cA2 (Remicade )、CDP571、抗 TNF 抗体片段(例如 CDP870)、TNFR-Ig 构建 物(p75TNFRIgG(Enbrel )和 p55TNFRIgG(Lenerc^pt)、抗 P7s、ρ-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、可溶性IL-13受体(sIL-13)和PDE4抑制剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可与 诸如布地奈德和地塞米松的皮质类固醇类联合使用。本发明抗体或其抗原结合部分也可 以与以下药物联合使用例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉秦，而且也可以与干扰 促炎因子(例如IL-1)的合成或作用的药物联用，例如IL-I β转化酶抑制剂(例如Vx740) 和IL-lra。本发明抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞信号转导抑制剂联用，例如酪氨 酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明抗体或其抗原结合部分可与IL-Il组合使用。可与本发明抗体或抗体部分联合治疗多发性硬化的治疗药物的非限制性 实例包括以下药物皮质类固醇类；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰 胺；环孢菌素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β la(Av0nex ；Biogen)； 干扰素 lb(Betaseron ；Chiron/Berlex) ；Copolymer 1(Cop-1 ；Copaxone ；Teva Pharmaceutical Industries, Inc.)；高压氧；静脉免疫球蛋白；克拉立平(clabribine)； 其他人细胞因子或生长因子(例如 TNF、LT、IL-U IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、 IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDR；)的抗体或拮抗剂。本发明抗体或其抗原结合部分可 与针对细胞表面分子(例如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、 CD86、CD90)或其配体的抗体联合使用。本发明抗体或其抗原结合部分也可以与各种药物 联合使用，所述药物例如为甲氨蝶呤、环孢菌素、Π(506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、来氟米 特、NSAID如布洛芬、皮质类固醇类如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓形 成剂、补体抑制剂、肾上腺素能药物、干扰促炎细胞因子如TNFa或IL-I信号转导的药物 (例如1肌1(力11(、11(1(、？38或嫩？激酶抑制剂)、11^1 β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、 P-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、TACE抑制剂、T细胞信号转导抑制剂如激酶抑制剂、金属蛋 白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因 子受体以及它们的衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体、sIL-lRI、sIL-lRII、sIL_6R、 可溶性IL-13受体(sIL-13))和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF3 )。可与本发明抗体或其抗原结合部分联合治疗多发性硬化的治疗药物的优选实例 包括干扰素- β如干扰素β Ia和干扰素β Ib ；Copaxone，皮质类固醇类、IL-I抑制剂、TNF 抑制剂和抗⑶40配体和⑶80的抗体。本发明的药用组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗体 部分。“治疗有效量”是指以必要的给药剂量和时间周期达到需要的治疗效果的有效量。抗 体或抗体部分的治疗有效量可随各种因素(例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重)以及 抗体或抗体部分在个体激发需要反应的能力而变化。抗体或抗体部分的治疗有效量也可以 为抗体或抗体部分的治疗有益作用超过其任何毒性或有害作用的剂量。“预防有效量”是指 以必要的给药剂量和时间周期达到需要的预防效果的有效量。一般来说，因为预防有效量 是在患者患病前或疾病早期阶段使用，所以预防有效量低于治疗有效量。可调整给药方案以获得最佳需要反应(例如治疗反应或预防反应)。例如单次大 剂量给药，可随时间给予数个分剂量，或者可根据治疗情况的要求相应减少或增加剂量。特 别优选配制为剂量单位形式的胃肠外组合物，以便于给药而且剂量均勻。本文使用的剂量 单位形式是指根据待治疗的哺乳动物对象的单位剂量调制的物理独立单位；每个单位含有 预计产生需要治疗效果的预定量活性化合物和需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的 规格取决于或直接取决于(a)活性化合物的独特特性和需要达到的具体治疗效果或预防效果，以及(b)配制技术固有的限制，例如活性化合物在各个个体的治疗敏感性。本发明抗体或抗体部分治疗或预防有效量的典型非限制性范围为0. 01-20mg/kg, 更优选l-10mg/kg，甚至更优选0. 3-lmg/kg。需要注意的是，剂量值可随需要缓解的病症类 型和程度而变化。进一步需要指出的是，对于任何具体对象，具体给药方案应该在不同时间 根据个体需要和管理或监控所述组合物使用的人员的专业判断而进行调整，本文给出的 剂量范围仅仅是举例说明，而不是限制要求保护的组合物的范围或实施。VII.本发明抗体的使用因为本发明抗hIL-12抗体或其部分能够结合hIL-12，所以可应用常规免疫测定， 例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织的免疫组织化学，将其用来检 测hIL-12(例如生物样品，例如血清或血浆)。本发明提供检测生物样品中的hIL-12的方 法，包括使生物样品与本发明抗体或抗体部分接触，以及检测与hIL-12结合的抗体(或抗 体部分)或非结合的抗体(或抗体部分)，由此检测生物样品中的hIL-12。应用有助于检测 结合抗体或非结合抗体的可检测物质直接标记或间接标记抗体。合适的可检测物质包括各 种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶实例包括辣根过氧物酶、碱性磷酸 酶、β _半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物 素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、 罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；合适放射 性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。作为标记抗体的替代方法，可应用以可检测物质标记的rhIL-12标准品和非标记 抗hIL-12抗体通过竞争性免疫测定检测生物体液中的hIL-12。在该测定中，混合生物样 品、标记的rhIL-12标准品和抗hIL-12抗体，测定标记的rhIL_12标准品结合非标记抗体 的量。生物样品中的hIL-12量与结合抗hIL-12抗体的标记rhIL-12标准品量成反比。本发明的Y61和J695抗体也可以用来检测非人类物种来源的IL-12、尤其是灵长 类来源的IL-12。例如Y61可用来检测弥猴和恒河猴的IL-12。J695可用来检测弥猴、恒河 猴和狒狒的IL-12。然而，抗体既不与小鼠IL-12交叉反应也不与大鼠IL-12交叉反应(参 见实施例3，F小节).本发明的抗体和抗体部分能够在体外(参见实施例3)和体内(参见实施例4) 中和hIL-12活性。因此，本发明的抗体和抗体部分可用来抑制IL-12活性，例如抑制含有 hIL-12的细胞培养物、人类对象或其他具有本发明抗体与之交叉反应的IL-12的哺乳动物 对象(例如灵长类，诸如狒狒、弥猴和恒河猴)的IL-12活性。在一个优选实施方案中，本发 明提供中和人IL-12活性和至少一种其他灵长类IL-12、但是不中和小鼠IL-12活性的分离 的人抗体或其抗原结合部分，所述灵长类IL-12选自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、弥 猴IL-12和恒河猴IL-12。所述IL-12优选为人IL-12。例如对于含有或怀疑含有hIL_12 的细胞培养物，可在所述培养基中加入本发明抗体或抗体部分，抑制培养物中的hIL-12活 性。在另一个实施方案中，本发明提供在患有其中IL-12活性有害的疾病的患者 抑制IL-12活性的方法。IL-12参与了各种各样的疾病的病理生理学(Windhagen等， (1995)J. Exp. Med. 182 1985-1996 ；Morita φ (1998)Arthritis and Rheumatism. 41 306-314 ；Bucht 等，(1996) Cl in. Exp. Immunol. 103 :347_367 ；Fais 等(1994) J. InterferonRes. 14 235-238 ；Parronchi 等，(1997) Am. J. Path. 150 :823_832 ；Monteleone 等，(1997) Gastroenterology. 112 1169-1178 和 Berrebi 等，(1998)Am. J. Path. 152 667-672 ； Parronchi等(1997)Am. J. Path. 150 :823_832)。本发明提供在患有这种疾病的患者抑制 IL-12活性的方法，该方法包括给予所述患者本发明抗体或抗体部分，使得所述患者体内的 IL-12活性受到抑制。最好是所述IL-12为人IL-12，所述患者为人类患者。或者，所述患 者可以是表达本发明抗体与之交叉反应的IL-12的哺乳动物。甚至所述患者可以是导入了 hIL-12的哺乳动物(例如通过给予hIL-12或表达hIL-12转基因)。本发明抗体可以因为 治疗目的而给予人类患者(下文进一步讨论)。此外，本发明抗体可给予表达所述抗体与之 交叉反应的IL-12的非人类哺乳动物，其目的是兽医学目的或作为人类疾病动物模型。关 于后者，这样的动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效能(例如试验给药剂量和给药 疗程)。本文使用的术语“其中IL-12活性有害的疾病”包括其中已经证实所述病症患者 体内存在的IL-12是或怀疑是与所述病症的病理生理学有关或者为引起所述病症恶化的 因素的疾病和其他病症。因此，其中IL-12活性有害的病症是预期抑制IL-12活性可缓解 所述病症的症状和/或发展的病症。这类病症的证据是例如所述病症患者的生物体液中的 IL-12浓度升高(例如所述患者的血清、血浆、滑液等中的IL-12浓度升高)，所述IL-12浓 度可用例如如上所述的抗IL-12抗体检测。关于其中IL-12活性有害的病症有许多实例。 在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分可用于治疗本文所述疾病或病症的疗法。 在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分可用于生产治疗本文所述疾病或病症的 药物。下面进一步讨论本发明抗体和抗体部分在治疗几个非限制性的具体病症中的应用；A.类风湿性关节炎白细胞介素12在诸如类风湿性关节炎的炎症性疾病中具有作用。在类风湿性关 节炎患者的滑液中已经检测到诱导型IL-12p40信使，而且证实IL-12存在于类风湿性关节 炎患者的滑液中(参见例如 Morita 等，(1998) Arthritis and Rheumatism 41 306-314) 发现IL-12阳性细胞存在于类风湿性关节炎滑膜的内层下。本发明人抗体和抗体部分可用 来治疗例如类风湿性关节炎、少年类风湿性关节炎、Lyme关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节 炎和痛风性关节炎。一般来说，所述抗体或抗体部分系统性给药，尽管对于某些病症来说， 局部给予所述抗体或抗体部分可能是有益的。本发明抗体或抗体部分也可以与一种或多种 其他用于治疗自身免疫性疾病的治疗药物一起给予.在用于类风湿性关节炎的胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠模型中，在关节炎之前用 抗IL-12 mAb(大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体，C17. 15)处理小鼠非常明显地抑制疾病的发 生以及降低疾病的发生率和严重程度。发生关节炎后早期给予抗IL-12 mAb治疗降低关节 炎严重程度，但是发生疾病后晚期用抗IL-12 mAb治疗小鼠对疾病严重程度的影响最小。B.节段性回肠炎白细胞介素-12也在炎症性肠病节段性回肠炎具有作用。节段性回肠炎患者的 肠粘膜的IFN-Y和IL-12表达增高(参见例如Fais等，(1994) J. Interferon Res. 14 235-238 ；Parronchi 等，(1997) Amer. J. Pathol. 150 823~832 ;Monteleone 等，(1997) Gastroenterology 112 1169~1178 ；Berrebi等，(1998)Amer. J. Pathol. 152 :667_672)。已 经证实抗IL-12抗体抑制小鼠结肠炎模型疾病，所述模型例如为TNBS诱导的结肠炎IL-12失效小鼠，以及抑制最近的IL-10失效小鼠疾病。因此，本发明抗体和抗体部分可用于治疗 炎症性肠病。C.多发性硬化白细胞介素-12在多发性硬化的病理生理学中为关键介导物。在多发性硬化患 者的病变部位证实了诱导型IL-12p40信使或IL-12本身的表达(Windhagen等，(1995) J. Exp. Med. 182 1985-1996, Drulovic 等，(1997) J. Neurol. Sci. 147 145-150)。慢性进行 性多发性硬化患者的IL-12循环水平升高。研究多发性硬化患者的T细胞和抗原提呈细胞 (APC)揭示，自我保持的各个系列的免疫性相互作用为进行性多发性硬化发生Thl型免疫 反应的基础。T细胞分泌的IFN-Y增加导致APC产生的IL-12增加，这可长时间维持产生 慢性状态的Thl型免疫活化和疾病的循环(Balashov等，(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. M 599-603)。采用多发性硬化的小鼠和大鼠实验性变应性脑脊髓炎(EAE)模型研究了 IL-12 在多发性硬化患者中的作用。在多发性硬化的小鼠复发缓解型EAE模型中，用抗IL-12 mAb 预先处理延迟麻痹以及降低临床评分。在麻痹高峰或随后的复发期用抗IL-12 mAb治疗降 低临床评分。因此，本发明抗体或其抗原结合部分可用来缓解人类患者多发性硬化的相关 症状。D.胰岛素依赖型糖尿病白细胞介素-12为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的重要介导物。通过给予IL-12在 NOD小鼠诱导IDDM，而抗IL-12抗体对IDDM过继转移模型具有保护作用。发病早的IDDM 患者常常出现所谓的“蜜月期”，在“蜜月期”中保有部分残留胰岛细胞功能。这些残留胰岛 细胞产生胰岛素，而且调节血糖水平比给予胰岛素更好。用抗IL-12抗体治疗这些早期发 病的患者可进一步防止破坏胰岛细胞，由此维持内源性来源的胰岛素。E.牛皮癣白细胞介素-12为牛皮癣的关键介导物。牛皮癣包括与THl型细胞因子表达类 型有关的急性和慢性皮肤病变。(Hamid 等(1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1 225-231 ； Turka等(1995)Mol. Med. 1 :690_699)。在患病的人体皮肤样品中检测到IL-12 p35和p40 mRNA。由此，本发明的抗体或其抗原结合部分可用来缓解诸如牛皮癣的慢性皮肤病。通过以下实施例进一步阐明本发明，而不能将其解释为以任何方式限制本发明。 在整个本说明书中引用的所有引用文献，包括参考文献、授予的专利和公开的专利申请，其 内容均通过引用特别结合到本文中。进而应该知道，在此所附的所有表格(参见附件A)内 容均引用性纳入本发明。
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实施例实施例1 分离抗IL-12抗体A.筛选IL-12结合抗体通过筛选3个不同的scFv噬菌体展示文库分离抗hIL-12的抗体，所述噬菌体展 示文库利用从人扁桃体(称为scFv 1)、扁桃体和外周血淋巴细胞(PBL)(称为svFv 2)、 以及骨髓来源的淋巴细胞(称为BMDL)获得的mRNA的人VL和Wi cDNA制得.Vaughan等 (1996)NatureBiotech. 14 309-314中介绍了文库的构建以及筛选方法。应用所述各种抗原即人IL-12 p70亚单位、人IL-12 p40亚单位、嵌合IL-12 (小 鼠P40/人p35)、小鼠IL-12、生物素化人IL-12和生物素化嵌合IL-12筛选所述文库。应 用标准方法使所述抗原包被在免疫试管中，从而选择IL-12特异性抗体(Marks等，(1991) J. Mol. Biol. 222 581-597)。用 IL-12 或生物素化 IL-12 筛选 scFv 文库 2，产生大量 IL-12 特异性结合物。根据BstNl酶性消化类型确定而且经DNA测序证实，选择5个不同的克隆 类型。主要克隆类型有 VHDP58/VLDPL11、VHDP77/VLDPK31、VHDP47/VL 和 VHDP77/VLDPK31， 它们均能够识别IL-12的p40亚单位。以IL_12p70筛选BMDL文库获得3个不同克隆类型.发现其中2个克隆为交叉反 应克隆。对主要克隆测序，而且该克隆由VHDP35/VLDP组成。该克隆识别IL-12的p40亚 单位。用IL-12 p70筛选svFv文库1没有获得特异性IL-12抗体。为了鉴定优选结合p70异源二聚体或IL-12的p53亚单位而不是p40亚单位的 IL-12抗体，使用联合的scFv 1+2文库以及BMDL文库。为了选择识别p70异源二聚体或
78P35亚单位的IL-12抗体，使噬菌体文库预温育，并在游离p40存在下进行选择。对分离克 隆的测序显示9个不同抗体谱系。通过“micro-Friguet”滴定法进一步分析亚单位优选 性。以ELISA中捕获生物素的IL-12滴定含有scFv的上清液并测定ED5Q。产生50% ED的 scFv浓度与浓度逐渐增加的游离p70或p40 (抑制剂)预温育。检测生物素IL-12包被板 的ELISA信号的减少，并对游离p70或p40浓度作图。这为p70和p40的各克隆提供IC5(1。 如果两种亚单位的滴定过程一致，则svFv既结合p40又结合p70。滴定过程的任何变化说 明P70优选于p40的程度。B.对IL-12的杭体i普系特异件的亲和力成孰(Toe 9)测试各克隆抑制IL-12在IL-12受体结合测定(称为RBA)中结合其受体的能力， 以及测试其抑制IL-12诱导的PHA刺激的人体母细胞增殖(PHA测定)的能力，如实施例3 所述。克隆Joe 9在RBA和PHA测定中的IC50值均最低，两种测定的IC50值均为1 X 10_6M. 另外，Joe9重链可变区(VH)的变化数与从VBASE数据库鉴定的最接近的种系序列C0S-3相 比最小。表1(见附件A)显示VH3家族种系序列，其中C0S-3为成员之一，以及VaI家族种 系序列各成员。所以，选择亲和力成熟的Joe 9。Joe9野生型(Joe9wt)抗体的VH和VL的 氨基酸序列示于图1A-1D。为了提高Joe 9的亲和力，制备各种突变的重链和轻链二者的互补决定区 3(^1 3)。应用重链^1 3(称为“!13”)或轻链⑶R3(称为“L3”)特异性简并寡核苷酸通过定 点PCR诱变产生⑶R3变异体，在各⑶R3中平均存在3种碱基取代(称为“掺入(spike)”)。 应用含有全部4种核苷酸的随机混合物的简并重链寡核苷酸5’ TGTCCCTTGGCCCCA(G) (T) (A) (G) (T) (C) (A) (T) (A) (G) (C) (T) (C) (C) (C) (A) (C) (T) GGTCGTACAGTAATA3，(SEQ ID NO 580)和寡核苷酸 pUC 反向 Tag :GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCACACA GG (SEQ ID NO 581)对重链⑶R3进行PCR诱变，产生所有组成成分的重链⑶R3突变体。应用Joe 9 反向寡核苷酸(5，TGG GGCCAA GGG ACA3，(SEQ ID NO 582)和 fdteteseq 24+21 寡核苷酸 (5' -ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GACGTT AGT-3' (SEQ ID NO
583)扩增亲代轻链。两种PCR产物之间的互补性用来驱使两种片段在PCR装配反应退火，用pUC 反向 Tag(SEQ ID NO 581)禾口 fdTag 5，-ATT CGT CCTATA CCG TTC—3，(SEQ ID NO:
584)扩增全长重组svFv文库。用含有全部4种核苷酸的混合物的轻链寡核苷酸 5，GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC (C) (C) (T) (C) (A) (G) (G) (C) (T) (G) (T) (T) (G) (T) (C) ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3，(SEQ IDNO :585)禾口 Joe 9 反向寡核苷酸5，TGG GGC CAA GGG ACA3，(SEQID NO 586)对轻链进行PCR诱变，产生所有组成成分的轻链⑶R3突变体。 应用 pUC 反向 Tag (SEQ ID NO 581)和 HuJH3F0R寡核苷酸 5，TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3， (SEQ ID NO 587)扩增亲代重链。两种PCR产物之间的互补性用来驱使两种片段在PCR装 配反应退火，用反向 Tag GAC ACC TCG ATC AGC G(SEQ ID NO 588)禾口 HuJ λ 2-3F0R NOT寡 核苷酸 5，GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGCCGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC3’ (SEQ ID NO 589)扩增全长重组svFv文库。用InM生物素化IL-12选择重链⑶R3突变体，用含7nM浓度的游离IL-12或p40 的PBS于室温下洗涤1小时。利用噬菌体ELISA分析克隆，并应用低密度IL-12芯片以 BIAcore动力学结合研究测试结合IL-12的克隆(参见实施例5中的BIAcore分析方法)。一般来说，BIAcore 分析禾[I用 BIAcore 系统(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)通过 表面胞质团共振(SPR)测量配体(固定在生物传感器基体上的重组人IL-12)和分析物(抗 体溶液)之间的实时结合作用。该系统利用SI^R的光学特性检测葡聚糖生物传感器基体中 蛋白浓度变化。蛋白质与已知浓度的葡聚糖基体共价结合。通过葡聚糖基体注射抗体，注 射抗体和固定配体之间的特异性结合使基体蛋白浓度增加，结果是sra信号改变。sra信号 变化记录为共振单位(RU)，而且沿传感图的y轴随着时间而显示。为了测定解离速率(off rate, koff)、结合速率(on rate, kon)、结合速率常数(Ka) (association rate constant)禾口 解离速率常数(Kd) (dissociation rate contstant)，应用BIAcore动力学评价软件(2. 1 版本)。以中和测定分析证实k。ff速率改善的克隆，中和测定包括抗体对IL-12结合其受体 的抑制作用(RBA测定)、对IL-12诱导的PHA刺激的人母细胞增殖的抑制作用(PHA测定) 和对IL-12诱导的人母细胞产生γ干扰素的抑制作用(IFNy测定)。关于重链⑶R3掺入 克隆70-1至70-13的中和测定的解离速率和/或IC5tl值的总结见表2 (参见附件A)。克 隆70-1的k。ff速率比亲代Joe 9克隆更佳，而且具有2.0X 10_7M的最低IC5tl值。因此，选 择克隆70-1转化为完整IgGl。应用InM生物素IL-12选择轻链CDR3突变体，用含7nM浓度的游离ρ40的PBS洗 涤。利用噬菌体ELISA分析克隆，并应用低密度IL-12芯片以BIAcore结合分析测试结合 IL-12的克隆.以中和测定测试解离速率优于亲代Joe 9克隆的克隆，所述中和测定测定 对IL-12受体结合的抑制作用或对PHA母细胞增殖的抑制作用。关于轻链CDR3突变克隆 78-34至79-1中和测定的解离速率和/或IC5tl值的总结见表2 (参见附件Α)。根据k。ff速率，与亲代Joe 9相比，克隆78_34和78_35的k。ff速率提高。选择其 中2个克隆对重链突变体进行组合分析。C.组合克隆具有最佳结合特性的突变轻链和重链克隆用于组装scFv。通过PCR重叠延伸并连 接(pull-throug)如上所述的突变VH和VL区段而组合效价特性改善的突变克隆组合。组 合重链突变体(70-2、70-13和70-1)和轻链突变体(78_34、78_35和79_1)产生克隆101-14 至26-1，如表2所示(参见附件A)。这些克隆中和测定的k。ff速率和/或IC5tl值见表2。BIAcore结合分析鉴定了克隆101_11，它由重链CDR3突变克隆70_1和轻链CDR3 突变克隆78-34组合产生，其解离速率为0. 0045^。此k。ff速率分别与重链⑶R3突变体 克隆70-1 (0.0134s—1)或轻链CDR3突变克隆78-34 (0.0164s—1)相比显著改善。此外，克隆 101-11的中和测定显示显著改善。因此，选择克隆101-11进行如下所述的亲和力成熟。P.克隆101-11的亲和力成熟克隆101-11的进一步亲和力成熟包括应用掺入寡核苷酸引物对101-11的重链和 轻链⑶R3 二者进行重复循环的PCR诱变。以降低浓度的生物素化IL-12(bio-IL-12)选择 克隆。应用BIAcore结合分析和RBA、PHA中和测定评价所述突变克隆的结合特性。克隆 136-9至170-25的k。ff速率和/或IC5tl值见表2 (参见附件A)。克隆103-14证实受体结 合测定和PHA母细胞测定二者的IC5tl值均提高。克隆103-14还证实k。ff速率低，因此选择 它进行进一步的亲和力成熟。E.制备和选择克隆103-14轻链⑶R3的随机文库应用如下概述的3个不同文库于3个节段系统性随机化克隆103-14的轻链CDR3(QSYDRGFTGSMV(SEQ ID NO :590))，其中X由序列NNS的随机密码子编码，N为任何核 苷酸，而S为脱氧胞嘧啶或脱氧胍。L3. 1 = XXXXXXFTGSMV(SEQ ID NO 591)L3.2 = QSYXXXXXXSMV(SEQ ID NO 592)L3. 3 = QSYDRGXXXXXX(SEQ ID NO 593)对克隆103-14的全部3个轻链CDR(称为L3. 1、L3. 2和L3. 3)进行随机诱变。不 突变克隆103-14的重链⑶R3(称为H3)。构建基于克隆103-14的4个随机文库(H3和 L3. 1、L3. 2 & L3. 3)，使其接受各种各样的选择条件，包括应用有限的抗原浓度和存在或缺 乏过量游离抗原(P40和p70)。主要用BIAcore从选择物(克隆73-B1至99-G11)筛选产 品，间或应用RBA进行筛选，结果示于表2 (参见附件A)。对克隆103-14的轻链⑶R进行随机诱变获得克隆Y61，与亲代克隆103-14相比， 其IC5tl值明显改善。选择Y61转化为完整IgGl。按照PHA测定，完整Yei-IgGl的IC5tl值 约130pM。IC50值不受游离p40过量50倍摩尔的影响，证实游离p40不与Y61抗IL-12抗 体交叉反应，因而未减少抗体结合异源二聚体。Y61重链可变区和轻链可变区的全长序列如 下所示。Y61重链可变区肽序列CDRHlQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEffVACDR H2FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTCDR H3HGSHDN WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 23)Y61轻链可变区肽序列CDRLlQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIYCDR L2GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCCDR L3QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG(SEQ ID NO 24)按照Kabat定义指示CDR残基。实施例2 :Y61超突变位点和接触位点的突变通常采用噬菌体展示方法对亲和力改善的重组抗体进行选择。可如下达到此目 的通过随机突变组合的CDR残基，获得包含不同序列的单链抗体的大文库。一般根据其抗 体抗原反应达到平衡的能力选择亲和力改善的抗体。但是，当Υ61 scFV在噬菌体表面表达 并与IL-12温育时，未能找到允许系统达到正常抗体抗原平衡的选择条件。scFV-噬菌体保 持与IL-12结合，推测是由于非特异性作用所致，因为纯化Y61 scFv显示正常解离动力学。 因为Y61不能应用噬菌体展示亲和力成熟的常规方法(即制备文库以及通过诱变多⑶R残 基进行选择)，所以开发了新的策略，其中使各个CDR位点突变。该策略涉及选择用于突变的合适CDR位点，而且基于鉴定和选择为优选选择性诱变位点、接触位点和/或超突变位点的氨基酸。接触位点定义为当抗原与抗体反应时与抗 原接触的概率高的残基，而超突变位点定义为认为在抗体体内亲和力成熟过程中发生体细 胞超突变的概率高的残基。优选选择性诱变位点为既是接触位点又是超突变位点的CDR位 点。应用实施例1所述的方法已经优化Y61抗体的CDR3区，因此，难以应用噬菌体展示选 择方法进一步改进位于抗体结合位点中心的区城。通过去除不利的抗原抗体接触或工程构 建新的接触使CDR3区外面的潜在接触位点突变，可进一步改善活性。认为是抗原接触点的Y61的氨基酸残基和体内亲和力成熟过程中的体细胞超突 变部位的CDR位点示于表3 (参见附件A)。对于Y61的亲和力成熟，选择CDR3外面的15个 残基、L3环中的3个残基和H3环中的5个残基进行PCR诱变。使Y61 scFv基因克隆入pUC119 (Sfi)质粒载体中，以用于诱变。以随机密码子设 计合成寡核苷酸，以使各个选定位点突变。经PCR诱变后，对少数克隆(约24个)测序，并 用宿主细胞例如细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞表达。纯化表达抗体，用BIAcore系统测定 k。ff。然后用中和测定测试解离速率改善的克隆(与Y61相比)。对其他CDR位点重复该过 程。将证实中和活性改善的各个突变组合，以获得中和效价更高的抗体。为了提高中和效价突变的Y61 CDR位点和各位点的相应氨基酸取代示于图 2A-2H。给出了 BIAcore分析测得的解离速率。这些解离速率示于每个表右侧的直方图中。位点H30、H32、H33、H50、H53、H54、H58、H95、H97、H101、L50、L92、L93 的取代结果 证实，所检测的所有氨基酸取代均产生解离速率比Y61低的抗体。发现位点H52、L32和L50 中只有一个氨基酸取代改善了 Y61的解离速率，所有其他改变均对活性产生不利影响。对 于L50，Gly —Tyr这个单一的改变明显提高(5_10倍)Y61的中和效价。结果证实，这些位 点对Y61的活性是重要的，说明大多数情况下噬菌体展示能够选择最佳残基。但是，在位点 H31、H56、L30和L94发现数个取代改善Y61的解离速率，说明这些位点对抗原结合也是重 要的，尽管噬菌体展示方法不能选择这几个最佳残基。对Y61的接触位点和超突变位点进行选择性突变鉴定了轻链CDR2中的氨基酸残 基L50和轻链⑶R3中的残基L94，它们均提高Y61的中和能力。这些突变的组合产生累加 效应，获得抗体J695，其中和能力明显增强。J695重链可变区序列和轻链可变区序列的全 长序列如下所示。J695重链可变区肽序列CDRHlQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEffVACDR H2FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTCDR H3HGSHDN WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 31)J695轻链可变区肽序列CDRLlQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIYCDR L2YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
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CDR L3QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG(SEQ ID NO 32)按照Kabat定义指示CDR残基。关于重链和轻链可变区序列对比的总体情况示于图1A-1D，说明从Joe9至J695的 克隆的谱系发展。CDR和残基按照Kabat编号。实施例3 抗hIL-12抗体的功能活性为了检测本发明的人抗人IL-12抗体的功能活性，所述抗体用于数个检测抗体抑 制IL-12活性的能力的检测法中。A.制备PHA活化的人淋巴母细胞按照 Current Protocols in Immunology,Unit 7. 1 所述，通过 Ficoll- Hypaque 梯度离心(1500rpm，45分钟)从健康供者收集白细胞(leukopac)，从白细胞再分离人外周 血单核细胞(PBMC)。收集位于血液水溶液和淋巴细胞分离液交界面的PBMC，用磷酸缓冲盐 水(PBS)以1500rpm离心15分钟洗涤3次，以去除Ficoll-Paque颗粒。然后按照 Current Protocols in Immunology, Unit 6. 16 所述， 舌化 PBMC 形 成淋巴母细胞。将洗涤后的PBMC以0.5-1Χ IO6细胞/ml重悬浮于添加0.2% (ν/ν) PHA-P (Difco, Detroit, MI)的 RPMI 完全培养基(RMPI 1640 培养基，10%胎牛血清(FBS)、 100U/ml青霉素、lOOyg/ml链霉素)中，在5%二氧化碳大气中于37°C培养4天。4天后， 用加有0. 2% (v/v)PHA-P和50U/ml重组人IL-12的RPMI完全培养基以1 1体积将细胞 培养物一分为二。通过使携带人IL-12 cDNA的表达载体转染入COS细胞(参见Kaufman 等，(1991) Nucleic Acids Res. 19,4484-4490)产生重组人 IL-12，按照 PCT/US96/01382 所 述纯化重组人IL-12。然后使细胞培养物再培养1-3天。收获PHA母细胞，用RPMI完全培 养基洗涤2次，用95% FBS,5% DMSO以10X IO6细胞/ml冻存细胞。在存在IL-2下培养1天后收集用于IL-12受体结合测定(参见B部分)的PHA母 细胞，而在存在IL-2下培养3天后收集用于PHA母细胞增殖测定(参见C部分)和γ干 扰素诱导测定(参见D部分)的PHA母细胞。B. IL-12受体结合测定如下分析抗IL-12抗体抑制放射性标记的IL-12结合PHA母细胞上的IL-12受体 的能力。使各种浓度的抗IL-12抗体与50-100pM125I-hIL-12 (应用Bolton-Hunter标记方 法制备碘化 hIL-12，比活 20-40mCi/mg，ΝΕΝ-Dupont)在结合缓冲液(RPMI 1640,5% FBS, 25mMHepes pH 7.4)中于37°C预温育1小时。如上所述分离PHA母细胞，洗涤一次，再用结 合缓冲液重悬浮为2 X IO7细胞/ml细胞密度。在抗体125I-hIL-12混合物中加入PHA母细 胞(IX IO6细胞)，室温下温育2小时。如下分离细胞结合放射性与游离125I-hIL-12 室温 下离心检测混合物30秒，吸出液体，用0. Iml结合缓冲液洗涤，然后于4°C以10，OOOXg离 心4分钟。利用γ计数器检测细胞沉淀物的细胞结合放射性。在缺乏抗体的情况下测定 总结合，而通过在所述测定中含有25nM非标记IL-12测定非特异性结合。一式二份进行温 育。在采用Y61和J695人抗IL-12抗体的IL-12受体结合测定中，两种抗体对IL-12 受体结合具有相似的抑制作用。Y61抑制IL-12受体结合的IC5tl值约1. 6X 10_"M，而J695 的 IC50 值约 1. 1 ΧΙΟ、。
C.人PHA母细胞增殖测定评价抗IL-12抗体抑制PHA母细胞增殖的能力(IL-12刺激PHA母细胞增殖)。在 微量滴定板(U形底，96孔，Costar, Cambridge, ΜΑ)的IOOml RPMI完全培养基中使连续稀 释的抗IL-12抗体与230pg/ml hIL-12于37°C、5%二氧化碳预温育1小时。洗涤如上所述 分离的PHA母细胞一次，将其用RPMI完全培养基重悬浮为3 X IO5细胞/ml细胞密度。在 抗体/hIL-12混合物中加入PHA母细胞(100ml，3X IO4细胞)，于37°C、5%二氧化碳温育3 天，用 0. 5mCi/ 孔(3H)-胸苷(Amersham，Arlington Heights, IL)标记 4-6 小时。将培养 内容物通过细胞收集器(Tomtec，Orange, CT)收获在玻璃纤维滤膜上，利用液闪计数检测 掺入细胞DNA中的(3H)-胸苷。一式二份检测所有试样。存在各种浓度p70 p40(即IL-12异源二聚体与游离p40亚单位的比率)的中 和结果示于表4 (参见附件A)。分析在PHA母细胞增殖测定中的Y61人抗IL-12抗体证实，在只有IL_12 p70而 没有任何过量的p40(p70 p40比率为1 0)的情况下，所述抗体抑制PHA母细胞增殖的 IC5tl值约1.8X10-1QM。在存在50倍过量游离p40(p70 p40比率为1 50)的情况下，Y61 抗体抑制PHA母细胞增殖的IC5tl值约1.8 X ΙΟ,Μ。该结果证实，Υ61抑制母细胞增殖的能 力不受存在的过量Ρ40的影响。在ρ70 ρ40比率1 0的情况下，人抗IL-12抗体J695抑制PHA母细胞增殖的 IC5tl值约LOXlO-11Mt5在ρ70 ρ40比率1 50的情况下，该抗体抑制PHA母细胞增殖的 IC5。值约5. 8士2. 8 X ICT12M(η = 2)，说明过量ρ40对J695抗体只有轻微的抑制作用。总体 结果证实，因为在L50和94的突变，J695比Υ61的中和活性有改善。P. γ干扰素诱导测定如下分析抗IL-12抗体抑制PHA母细胞产生IFN y (IL-12刺激产生IFN γ )的能 力。在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的100ml RPMI完全培养基中使各种浓度的抗 IL-12抗体与200-400pg/ml hIL-12于37°C、5%二氧化碳预温育1小时。洗涤如上所述分 离的PHA母细胞一次，将其用RPMI完全培养基重悬浮为1 X IO7细胞/ml细胞密度。在抗体 /hIL-12混合物中加入PHA母细胞(100μ 1，1X106细胞)，于37°C和5%二氧化碳温育18 小时。温育后从各孔取出150 μ 1无细胞上清液，应用ELISA(Endogen Interferon gamma ELISA, Endogen, Cambridge, ΜΑ)检测所产生的人IFNy水平。一式二份检测各上清液。人抗IL-12抗体Υ61在该测定中的分析证实，Υ61抑制人IFNy产生的IC5tl值约 1.6父10,] ，而人抗1卜12抗体邛95抑制人IFNy产生的IC5。值约5. 0士2. 3 X ICT12M(η = 3)。结果证实，因为L50和L94的修饰而显著改善J695的亲和力。Ε.用分离的PBMC诱导产生非人IL-12为了检测人抗hIL-12抗体与其他物种IL-12的交叉反应性，如下制备非人 IL-12。对弥猴、狒狒和犬 PBMC 使用 Iymphopr印(Nycomed，Oslo, Norway)，对犬 PBMC 使 M Accu-paque (Accurate Chemical & Sci. Corp. ， Westbury， NY)，寸力鼠 PBMC Lympholyte-rat (AccurateChemical & Sci. Corp. , Westbury, NY),如上所述通过密度梯度 离心从新鲜的肝素化血液分离PBMC。然后按照文献所述(D，Andrea等，(1992) J. Exp. Med. 176,1387-1398, Villinger 等，(1995) J. Immunol. 155,3946-3954，Buettner 等，(1998) Cytokine 10，241-248)，诱导PBMC产生IL-12.洗涤后的PBMC以IXlO6细胞/ml重悬浮于加有0.0075% (重 量 / 体 禾只)SAC (Pansorbin ；Calbiochem-Behring Co. , La Jolla, CA)或 l_5mg/ml ConA(SigmaChemical Co.，St. Louis,MO)和 0. 0075% SAC 的 RPMI 完全培养基中，在 5%二 氧化碳大气下于37°C培养18小时。离心收集无细胞和无SAC培养基并通过0. 2mm滤膜过
滤ο从Emory University School of Medicine，Atlanta，GA 获得的恒河猴 IL-12 为 重组恒河猴IL-12。F.小鼠2D6细胞增殖测定小鼠T细胞克隆2D6在小鼠IL-2、IL-4、IL-7和IL-12作用下增殖(Maruo等， (1997) J. Leukocyte Biol. 61，346-352)。还检测到其在含有大鼠IL-12的大鼠PBMC上清液 作用下的明显增殖。犬、弥猴、狒狒或人IL-12对2D6细胞没有作用。以加有50mM β-巯基 乙醇(β ME)和30ng/ml小鼠IL-12的RPMI完全培养基培养小鼠2D6细胞。检测前1天， 洗除小鼠IL-12，用加有β ME的RPMI完全培养基温育所述细胞过夜。在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的IOOml RPMI完全培养基中使连续稀释的 抗IL-12抗体与40pg/ml小鼠IL-12于37°C、5%二氧化碳下预温育1小时。洗涤2D6细 胞一次，将其用含β ME的RPMI完全培养基重悬浮为IX IO5细胞/ml细胞密度。在抗体/ hIL-12混合物中加入2D6细胞(100 μ 1，1 X IO4细胞)，于37°C、5%二氧化碳温育3天，以 0. 5mCi/孔(3H)-胸苷标记4-6小时。收获培养内容物，利用液闪计数进行计数。一式二份 检测所有样品。G. .1695与非人IL-12的种间交叉反应性应用从数个非人类物种分离的PBMC分析J695与非人IL-12的种间交叉反应性。 应用如上所述的几个生物测定证实大鼠、犬、弥猴和狒狒PBMC上清液中存在非人IL-12活 性，所述测定例如小鼠2D6细胞增殖测定、人PHA母细胞增殖测定和通过用针对小鼠IL-12 和/或人IL-12的兔和/或羊多克隆抗体阻断非人PBMC诱导的反应的、干扰素诱导测定。 然后通过测定观测到50%抑制反应的J695抗体浓度，以相同生物测定评价人抗hIL-12抗 体Y61和J695与PBMC上清液中的非人IL-12或纯化的小鼠IL-12和恒河猴IL-12的交叉 反应性。种间交叉反应性结果总结于表5。结果证实，Y61和J695分别能够识别各种猴的 IL-12(例如Y61能够识别弥猴IL-12和恒河猴IL-12，J695能够识别弥猴IL-12、恒河猴 IL-12和狒狒IL-12)，而且J695对犬IL-12的活性约低35倍；Y61和J695均与小鼠或大 鼠IL-12没有交叉反应性。H. .1695的人细胞因子特异性以竞争性ELISA测试J695的特异性，其中测试一组人细胞因子干扰可溶性J695 结合固定的人IL-12的能力。该组人细胞因子包括IL-Ia和IL-1 β (Genzyme, Boston, MA)、IL-2 (Endogen)、IL-4, IL-10、IL-17、IFNy 和 TGF-β 1 (R & D，Minneapolis, MN)、 IL-8 (Calbiochem)、PDGF> IGF-I 禾口 IGF-II(Boehringer Mannheim Corp. , Indianapolis, IN) ,TNFa 和淋巴毒素、IL-6、可溶性 IL-6 受体、IL-ll、IL-12p70、IL-12p40、M_CSF 禾口 LIF。 EBI-3为非洲淋巴瘤病毒感染B淋巴细胞诱导产生的IL-12p40相关蛋白(Devergne等， (1996) J.Virol. 70 1143-1153)，它表达为人 IgG-Fc 嵌合体(EBI-3/Fc)。还测试了 单链鲑 精 DNA(Sigma)。
表5种间交叉反应性数据 用0. Iml人IL-12 (2 μ g/ml的0. IM碳酸盐包被缓冲液(4体积0. IM碳酸氢钠和 8.5体积0. IM碳酸氢钠))于4°C包被平底ELISA免疫测定微量滴定板(96孔，高度结合， Costar)过夜。用含0. 05%吐温20的PBS (PBS-T)洗涤板2次，用200 μ 1的lmg/ml牛血清白 蛋白(BSA, Sigma)的PBS-T于室温下封闭1小时，再用PBS-T洗涤2次。加入含IL-12抗体 J695(100ng/ml)的样品(100 μ 1)和各细胞因子(2ηΜ)的含 50 μ g/mlBSA 的 PBS-T (PBS-T/ BSA)并于室温下温育2小时。洗涤板4次，然后与100μ 1小鼠抗人λ-HRP(1 500的 PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. Inc.，Birmingham, AL)于室温下温育 1 小时。洗涤板 4 次，然后用 ABTS (Kirkegaard & Perry Lab.，Gaithersburg, MD)在黑暗中显色 20-30 分 钟。用微量板读数器(Molecular Devices, Menlo Park, CA)读取0D45(1nm。确定相对于缺 乏任何可溶性细胞因子时J695结合IL-12包被板的百分结合率。结果证实，J695结合固定的人IL-12只被人IL_12 p70阻断，在较低程度上被人 IL-12 p40阻断，不被所测试的任何其他细胞因子阻断。I.对新型IL-12分子的结合已经介绍了一种替代IL-12异源二聚体，其中p35亚单位被新型pl9分子代替。应 用3D同源性检索IL-6/IL-12家族成员鉴定了 pl9，而且以活化树突细胞合成pl9。pl9结 合p40形成pl9/p40 二聚体，它具有IL-12样活性，但是其IFN γ诱导作用不如ρ35/ρ40异 源二聚体有效。预测识别单独的Ρ40、但是优选识别ρ70分子中的ρ40(例如J695和Υ61， 参见实施例3Η)的抗体也会既中和ρ35/ρ40分子又中和ρ19/ρ40分子。实施例4 抗hIL-12抗体的体内活性用改进的Bree等使用的模型检测IL-12抗体对IL-12诱导反应的体内作用，以研 究人 IL-12 对弥猴外周血液学的影响(Bree 等，(1994)Biochem Biophys Res. Comm. 204 1150-1157)。在以前的研究中，以1 μ g/kg/天连续5天给予人IL-12，在24小时后使白细 胞(WBC)数降低、尤其是淋巴细胞和单核细胞亚组降低。在72小时时观察到血小板数降低。 在IFN- γ作用下单核细胞活化标志血浆新蝶呤水平在24小时时开始升高，在72小时时达到最高。在人抗hIL-12抗体的第一个研究中，使平均体重5kg的15只健康弥猴镇静，并分 为5组(η = 3)。第1组接受静脉内(IV)给予10mg/kg人静脉免疫球蛋白(IVIG，Miles, Eckhart，IN，用A蛋白琼脂糖凝胶纯化)。第2组接受静脉内给予lmg/kg C8.6.2(中和小 鼠抗人IL-12单克隆抗体)。第3组接受静脉内给予10mg/kg C8. 6. 2。第4组接受静脉内 给予lmg/kg Y61 (人抗人IL-12抗体，从CHO细胞条件培养基纯化)。第5组接受静脉内给 予 10mg/kg Y61。给予所述抗体后1小时，所有弥猴接受单次皮下(SC)注射人IL-12(lyg/kg)。在 以下时间点取血试样基线、8、24、48、96和216小时，分析全血细胞分类计数和血清化学。 还检测血清人IL-12、C8. 6. 2抗体、Y61抗体、猴IFN- γ、猴IL-10、猴IL-6和血浆新蝶呤水平。用IL-12和IVIG对照抗体(第1组)处理的弥猴呈现大多数预期的血液学变 化，包括WBC、血小板、淋巴细胞计数和单核细胞计数降低。这样的降低在用1或10mg/kg C8. 6. 2或Y61抗体处理的弥猴(第2-5组)没有观测到或不明显。通过猴IFN-Y 禾Π 猴 IL-IO (Biosource International, Camarillo, CA)、猴 IL-6 (Endogen)和血浆新蝶呤(ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY)特异性的 ELISA 分 析血清或血浆样品。在任何IL-12治疗的动物，包括用IL-12和IVIG治疗的对照动物，均 没有检测到IFN- y、IL-IO或IL-6。这可能是因为IL-12剂量低(仅1剂的1 μ g/kg)。尽 管如此，IL-12和IVIG处理动物的血浆新蝶呤水平增加约3倍，但是所有C8. 6. 2或Y61处 理动物均没有变化，包括较低剂量(lmg/kg) Y61处理的动物，说明Y61在体内有效阻断这种 对IL-12的敏感反应。 在第二个研究中，通过给予外源性rhIL-12和检测J695是否能够阻断或降低通常 与给予rhIL-12有关的反应，从而研究J695在弥猴体内的活性和药效学(PD)。对雄性弥猴 (每组η = 3)如下给药经隐静脉以单剂快速静脉浓注(IV)注射或背部皮肤皮下(SC)注 射0. 05,0. 2或1. Omg/kg J695或lmg/kg静脉免疫球蛋白(IVIG)。给予J695或IVIG后1 小时，所有动物接受单剂背侧皮肤皮下注射1 μ g/kg rhIL-12。给予J695后直到28天通 过股静脉收集血样。从每个血样获得血清，并用ELISA检测IL-12、J695、IFN- γ和抗J695 抗体。应用反相高效液相层析检测新蝶呤。相对于给予J695或rhIL-12之前检测的新蝶呤水平归一化的新蝶呤水平示于图 3。为了比较各组间的新蝶呤抑制作用，计算各动物新蝶呤水平归一化的曲线下面积(AUC) (表6)。新蝶呤暴露(AUC)受到剂量依赖性的抑制，相对于IVIG对照组各IV组抑制约 71-93%, SC组抑制约71-100%。这些结果说明，当通过IV或SC途径给药时，抑制新蝶呤 作用50%需要的J695剂量(ED50)低于0. 05mg/kg。表6 J695在弥猴体内对IL-12诱导的新蝶呤的剂量依赖性抑制 用J695处理还防止或减少通常与给予rhIL-12有关的血液学变化(白细胞减少 和血小板减少)。给予rhIL-12后24小时，淋巴细胞计数相对于对照IV和SC IVIG处理组 的基线值下降约50%。所有3个剂量水平的SC或IV给予J695均防止这种降低，使得24 小时时的淋巴细胞计数与基线值大致相同。给予IL-12后48小时，用IV和SC IVIG处理 组的血小板计数相对于基线值下降约25%。目标为维持高于90%效应水平的血清水平的典型剂量方案为大致每隔一周IV和 SC给予lmg/kg或大致每周给予0. 3mg/kg,假设重复给药有轻微累积作用。该研究证实，能 够对各种猴安全给予这样剂量的抗体。在独立的毒性研究中，还发现能够安全给予各种猴 高至100mg/kg的所述抗体。J695还有效防止用嵌合IL-12处理的小鼠产生IFN- γ，所述嵌合IL-12是组合小 鼠Ρ35亚单位和人IL-12 ρ40亚单位的分子。与在小鼠无生物活性的人IL-12相反，这种 嵌合IL-12在小鼠保持生物功能，包括诱导IFN-γ。此外，人ρ40亚单位允许所述嵌合分 子被J695结合并中和。腹膜内注射给予雌性C3H/HeJ小鼠(10只/实验组)嵌合IL-12， 每次剂量为0. 05mg/kg，在第0、1、2、3和4天每天给药5次。在注射IL-12之前30秒，在 第 0、2 和 4 天腹膜内注射给予剂量为 0. 05,0. 01,0. 002,0. 0004,0. 00008 和 0. 000016mg/kg 的J695。在第0、2和4天腹膜内注射给予剂量为0. 05mg/kg的对照hulgGl γ。在第5天 从小鼠取血，并用ELISA测定血清IFN- γ水平。结果证实，J695对IFN- γ产生量产生剂 量依赖性抑制，ED5tl约0. 001mg/kg。总而言之，这些结果证实，J695是体内IL-12活性的有 效抑制剂。实施例5 人抗体与重组人IL-12 (rhIL-12)结合的动力学分析应用BIAcore 系统(Biacore AB, Uppsala, Sweden)通过表面胞质团共振(SPR)检 测捕获配体(人抗rhIL-12抗体J695，捕获在生物传感器基体上)和分析物(rhIL-12溶 液)之间的实时结合作用。所述系统利用SH 的光学特性检测葡聚糖生物传感器基体中的 蛋白浓度变化。蛋白质共价结合到已知浓度的葡聚糖基体上.通过葡聚糖基体注射抗体， 注射抗体和固定配体之间的特异性结合使基体蛋白浓度增加，结果SH 信号发生改变。SPR 信号变化记录为共振单位(RU)，而且随时间沿传感器图的y轴显示。为了有助于山羊抗人 IgG(Southern Biotechnology Associates, Cat.
88No. 2040-01 ,Birmingham，AL)固定在生物传感器基体上，首先用IOOmM N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)和400mM盐酸N-乙基-N，_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)活化基体上的羧 基，使山羊抗人IgG通过游离胺基共价连接到葡聚糖基体上。接着，经活化的基体注射山羊 抗人IgG通过活化的生物传感器注射用醋酸钠，pH 4.5稀释的35μl山羊抗人IgG(25μg/ ml)，蛋白上的游离胺直接结合到活化的羧基上。注射IM乙醇胺失活未反应的基体EDC-酯。 标准胺偶联试剂盒可市售获得(Biacore AB, Cat. No. BR-1000-50, Uppsala, Sweden)。用 HBS、流动缓冲液(running buffer) (Biacore AB, Cat. No. BR-1001-88,Uppsala, Sweden)稀释J695，以便J695通过山羊抗人IgG捕获在基体上。为了测定rhIL_12特异性 抗体结合固定的山羊抗人IgG的能力，如下进行生物测定。以流速5μ1/π η通过山羊抗 人IgG多克隆抗体偶联的葡聚糖基体注射等份J695 (25 μ g/ml ；25 μ 1等份)。在注射所述 蛋白之前和在注射后立即使HBS缓冲液单独流经各流动池(flowcell)。基线和相当于J695 注射结束后约30秒时间点之间的信号净差用来代表IgGl J695结合量(约1200RU)。检 测直接结合可溶性rhIL-12的rhIL-12特异性抗体。用HBS流动缓冲液稀释细胞因子，以 5 μ Ι/min流速通过固定蛋白基体注射50 μ 1等份。所用rhIL_12的浓度为10、20、25、40、 50、80、100、150和200nM。注射rhIL_12之前和注射后立即使单独的HBS缓冲液流经各流 动池。基线信号和细胞因子注射结束后的信号的净差用来表示具体样品的结合值。在注射 下一个样品之前用IOOmM盐酸再生生物传感器基体。为了测定解离常数(off-rate)、结合 常数(on-rate)，应用BIAcore动力学评价软件(2. 1版)。与COS产生的J695相比，CHO产生的J695结合rhIL_12的典型结果示于表7。表7 =CHO或COS产生的J695与rhIL-12的结合 应用BIAcore技术定量分析捕获J695和可溶性rhIL_12之间的分子动力学作用。进行数个独立的实验，并用商业性BIAcore数学分析软件分析结果，获得动力学速率常数， 如表8所示。表8 J695对rhIL_12的表观动力学速率常数和亲和力常数 CHO产生的 J695(Kd= 1. 34X IOD 抗体和 COS产生的 J695 (Kd = 9. 74X IOD 抗体作用的计算表观常数(Kd)存在微小不同。用以下公式由观测到的速率常数计算J695 和rhIL-12之间的表观解离常数(Kd) Kd =解离速率/结合速率。为了测定J695和rhIL-12作用的表现解离速率常数和表观结合速率常数，应用 固定量J695(2yg/ml)和不同浓度的rhIL-12进行数个结合反应。捕获J695和可溶性 rhIL-12之间的实时结合作用传感器图表明，两种形式的抗体的结合相和解离相非常相似。为了进一步评价捕获IgGl J695mAb结合可溶性重组细胞因子的能力，应用直接 BIAcore方法。在该方法中，用IgGl J695 (2 μ g/ml)包被山羊抗人IgG(25 μ g/ml)偶联的 羧甲基葡聚糖传感器表面，然后加入重组细胞因子。当可溶性rhIL-12注射通过捕获CHO或 COS产生的IgGl J695的生物传感器表面时，信号量随细胞因子溶液浓度增加而增加。所测 试的任何浓度(高至 IOOOnM)的 rmIL-12(R & D Systems, Cat. No. 419-ML, Minneapolis, MN)或rhIL-12均没有观测到结合。这些结果支持以下结论IgGl J695抗体识别rhIL-12 上的不同决定簇。表9显示了应用BIAcore的实验结果，证实人IgGl J695mAb只结合可溶性 rhIL-12，而不结合任何一种其他重组细胞因子。表9 利用BIAcore技术的J695表位作图 实施例6 J695与IL-12的亲和力的进一步研究利用BIAcore胞质团共振技术定量分析J695抗体和人IL-12之间的分子动力学 作用，获得表观动力学速率常数。BIAcore技术用来检测可溶性rhIL_12对固相捕获J695的结合。使山羊抗人IgG 抗体固定在生物传感器芯片上，然后注射固定量的J695并捕获在所述表面上。加样不同浓 度的rhIL-12，随时间检测不同浓度IL-12对J695的结合。假定为零级解离动力学和一级 结合动力学以及J695和IL-12为简单的一对一分子作用，计算表观解离速率常数和表观结 合速率常数。进行了 3个独立实验，所示值为3个实验的平均值。根据这些测量结果获得表 观解离速率常数(kd)和表观结合速率常数GO，并用其计算所述作用的Kd值(见表10)。 结果表明J695对rhIL-12具有高度亲和力。表10 J695和人IL-12作用的动力学参数 实施例7 大鼠抗小鼠白细胞介素-12的单克隆抗体C17. 15的特性和中和活性为了评价应用小鼠IL-12特异性的单克隆抗体在炎症和自身免疫小鼠模型的 IL-12治疗研究与类似的人类疾病方法的相关性，研究了大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体 C17. 15与小鼠IL-12的作用。评价C17. 15中和PHA母细胞增殖测定中的小鼠IL-12活性 以及阻断小鼠IL-12结合细胞表面受体的能力，也评价C17. 15-小鼠IL-12结合作用的动 力学。在人PHA母细胞增殖测定(参见实施例3)中，连续稀释的C17. 15或大鼠 IgG2a (对照抗体)与230pg/mL小鼠IL-12于37°C预温育1小时。使PHA刺激的母细胞加 入到所述抗体IL-12混合物中，于37°C温育3天。然后用1 μ Ci/孔[3H]-胸苷标记细胞6 小时。收获培养物，检测掺入的[3H]-胸苷。在没有加入小鼠IL-12情况下检测背景非特异 性增殖。一式二份检测所有样品。发现在该测定中C17. 15对重组小鼠IL-12的IC5tl(M)为 1. 4X 10-11，相比之下，观测到在相同条件下J695对重组人IL-12的IC50值为5. 8 X 10_12 (见 表 11)。表11 比较抗人IL-12单克隆抗体J695和大鼠抗小鼠IL-12单克隆抗体C17. 15
的特性 还测定了 C17. 15抑制小鼠IL-12结合细胞受体的能力。连续稀释的C17. 15与 100ρΜ[125Ι]_小鼠IL-12在结合缓冲液中于37°C预温育1小时。2D6细胞(2X IO6)加入 到抗体/[125I]-小鼠IL-12混合物中，于室温下温育2小时。分离细胞结合放射性与游离 [125I]-IL-12，测定保留的细胞结合放射性。缺乏抗体时测定标记小鼠IL-12与2D6细胞上 的受体的总结合，通过在测定中包含25nM未标记的小鼠IL-12而测定非特异性结合。总结 合减去非特异性结合计算得特异性结合。一式二份进行温育。结果表明，C17. 15抑制小鼠 IL-12结合细胞受体的IC5tl(M)为1. 5X10,。通过生物分子作用分析评价C17. 15对重组小鼠IL-12的亲和力.使山羊抗大鼠 IgG抗体固定在生物传感器芯片上，然后注射固定量的C17. 15抗体，使C17. 15捕获在芯片 表面上。将不同浓度的重组小鼠IL-12加样在C17. 15表面上，随时间检测小鼠IL-12对 固定C17. 15的结合。假定为零级解离动力学和一级结合动力学以及固定C17. 15和小鼠 IL-12为简单的一对一分子作用，计算表观解离速率常数和表观结合速率常数。根据这些测 量结果计算表观解离速率常数(kd，解离速率常数)和表观结合速率常数(ka，结合速率常 数)。这些结果用来计算所述作用的Kd值。观测到重组小鼠IL-12-C17. 15作用的结合速
91率为3. 8Χ105Μ 解离速率为1.84 X 10 而Kd为4. 8X10·。在中和小鼠IL-12活性和结合细胞表面受体中观测到的C17. 15活性以及C17. 15 结合小鼠IL-12的动力学与相似的J695-rhIL-12作用测量结果有关。说明根据结合速率、 解离速率、Kd、IC50和PHA母细胞测定，大鼠抗小鼠IL-12抗体C17. 15和抗人IL-12抗体 J695的作用模式几乎相同。因此，C17. 15在炎症和自身免疫疾病的小鼠模型中用作J695 的同源抗体，研究IL-12阻断对这些模型动物疾病的发生或发展的影响(参见实施例8)。实施例8 给予α -小鼠IL_12抗体对小鼠自身免疫性疾病或基于炎症的疾病的 治疗Α. α-11-12^^017. 15对胶原$秀导型小鼠关节炎的抑制作用已经证实了 IL-12水平和类风湿性关节炎(RA)有关。例如，与健康对照相 比，在RA患者的滑液中检测到IL-12 ρ70水平升高(Morita等(1998)Arthritis and Rheumatism. 41 =306-314)。因此，评价大鼠抗小鼠IL-12抗体C17. 15抑制胶原诱导型小鼠 关节炎的能力。第O天用II型胶原免疫雄性DAB/1小鼠(10/组)，从第_1天(胶原免疫前1天) 至第12天隔天用C17. 15或对照大鼠IgG以10mg/kg腹膜内注射处理所述小鼠。临床监测 所述小鼠足爪发生关节炎的情况直到第90天为止。关节炎分级为0_正常；1-炎症局限 于一个关节；2-涉及一个以上的关节、但是不是整个足爪；3-涉及整个足爪；4-足爪变形； 5_所涉及关节僵硬.一个小鼠的关节炎评分为该小鼠各单独足爪的关节炎级别的总和(最 大=20)。结果表示为每组的均数士SEM。如图4所示，结果表明C17. 15处理小鼠仅在处理后第50天以后才有可检测到的 关节炎评分，C17. 15处理小鼠获得的最大关节炎平均评分低于IgG处理小鼠检测到的最大 评分至少5倍。证实大鼠抗小鼠IL-12抗体C17. 15可防止小鼠发生胶原诱导型关节炎。B.大鼠α -小鼠IL_12抗体C17. 15对小鼠结肠炎的抑制作用还证实IL-12在结肠炎的发生/病理学中具有作用。例如已经证实抗IL-12抗 体抑制小鼠结肠炎模型(例如TNBS诱导型结肠炎IL-12失效小鼠(Simpson等(1998) J. Exp. Med. 187(8) 1225-34)的疾病。同样证实了抗IL-12抗体抑制IL-IO失效小鼠的结 肠炎发生。以2个研究评价了大鼠抗小鼠IL-12抗体C17. 15抑制小鼠TNBS结肠炎的能力 (Davidson 等(1998)J. Immunol. 161(6) :3143_9)。在第一个研究中，通过插入直肠的儿科脐动脉插管给予含2. OmgTNBS的150 μ L 50%乙醇溶液，在无病原体的SJL小鼠诱导结肠炎。对照小鼠只用150yL50%乙醇溶液处 理。在第11天通过尾静脉静脉内给予单剂0. 75,0. 5,0. 25或0. Img C17. 15或0. 75mg对 照大鼠IgG2a，在第11和17天对小鼠称重，并在第17天进行组织学评分，从而评价所述治 疗的治疗作用。用C17. 15治疗小鼠的体重在抗体治疗的48小时内增加，而在治疗后第6 天正常.组织学征实了 C17. 15的治疗作用。进一步还评价了所述治疗小鼠脾脏和结肠的 〔04+1~细胞的0^-^分泌以及所述治疗小鼠脾脏或结肠来源的巨噬细胞的IL-12水平(见 表 12)。在第二个研究中，优化给药方案，在第12至14天分别用总剂量为0. Img或0. 5mg C17. 15或0. Img对照IgG2a的一半剂量治疗小鼠。发现与未治疗的对照相比，以0. Img/ 小鼠或0. 25mg/小鼠的剂量单剂给予C17. 15仅部分改善TNBS诱导型结肠炎，而且不会显著降低CD4+T细胞体外产生IFN- γ，但是显著降低IL-12分泌。在0. 5mg/小鼠或0. 5mg/ 小鼠以上的单剂给药时观测到反应。采用所测试的最低抗体剂量并以2次分剂量注射给予 (第12和14天)改进给药方案，表明多次低剂量比一次性大剂量更有效。所获得数据示于 表12。表12 抗小鼠IL_12mAb C17. 15抑制在小鼠建立的结肠炎 按照结肠的排泄和肉眼外观评价，相隔1天以2个分剂量给予总剂量为0. Img/小 鼠或0. 05mg/小鼠的C17. 15单克隆抗IL-12完全逆转结肠炎。此外，该剂量方案显著下 调固有层(lamina propria) T细胞产生IFN-γ和巨噬细胞产生IL-12，使得后一水平与没 有TNBS结肠炎的对照乙醇处理小鼠观测到的水平相似。因此，给予TNBS结肠炎小鼠模型 C17. 15以剂量依赖方式逆转结肠炎的发展。C. a-IL-12杭体对小鼠牛自身免,疮t牛脑脊髓炎(EAE)的抑制作用人们普遍认为IL-12在多发性硬化(MS)的发病机理中起作用。已经证实诱导 的IL-12p40信使在MS患者的急性斑中表达而在炎症性脑梗塞病变没有表达(Windhange， Α.等(1995) J. Exp. Med. 182 1985-1996)。得自MS患者的T细胞(而非对照T细胞)通过 上调CD40L表达刺激抗原提呈细胞产生IL-12(Balashov，K. Ε.等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 599-603)。MS患者的IFN- y分泌增加，体外用α -IL-12抗体可阻断IFN- γ 分泌(Balashov，K. Ε.等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :599_603)。在 MS 患者检测 到血清IL-12水平升高，但是其他神经疾病血清IL-12水平没有升高(Nicoletti，F.等 (1996) J. Neuroimmunol. 70 :87_90)。已经证实IL-12产生增加与MS患者疾病活动有关 (Cormabella, Μ.等(1998) J. Clin. Invest. 102 :671_678)。研究了 IL-12 在小鼠多发性硬 化模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发病机理中的作用(LeonardJ.P.等(1995) J.Exp. Med. 181 :281_386 ；Banerjee, S.等(1998) Arthritis Rheum. (1998)41 :S33 ；以及 Segal, B. Μ.等(1998) J. Exp. Med. 187 =537-546)。已知该模型疾病由THl亚群T细胞诱导产生。所以，评价a-IL-12抗体预防急性EAE发生的能力。发现α -IL-12抗体能够抑制急性EAE发生、抑制发生后的疾病，并减轻用自身抗 原髓鞘碱性蛋白免疫小鼠的复发的严重程度(Banerjee, S.等(1998) Arthritis Rheum. (1998)41 :S33)。α-IL-12抗体在小鼠的治疗的有益作用在停止治疗后持续2个月以上。还 证实抗IL-12抗体抑制过继转移致脑炎T细胞接受小鼠的疾病(LeonardJ.P.等(19950J. Exp. Med. 181 :281_386)。实施例9 J695的临床药理学在双盲交叉研究中，对64名健康男性对象给予剂量逐渐递增的J695或安慰剂。在 给药前和给药后0. 25h检测补体片段C3a证实补体系统没有活化。只有观测到伴随感染症 状的对象的CRP和纤维蛋白原水平升高。所有对象均存活，而且J695的总体耐受性非常好。没有1例因为副作用事件(AE) 而停止治疗。观测到的最常见AE是头痛和普通感冒/气管炎，这两种副作用均不是严重病症。1名研究对象为33岁单身男性，在研究开始就患有滴状牛皮癣。按照随机研究设 计，该患者随机接受经SC给予的5mg/kg J695。给予所述抗体之前10天，所述患者仅在 手臂和腿上有散在小丘疹病变。给予所述抗体时，该患者出现红斑变红、增厚而且角化过 度。给予J695后1周，所述患者述说皮肤症状改善，包括病变变平和脱皮减轻。第二次给 予J695(5mg/kg IV)不久，在没有任何局部治疗的情况下患者的皮肤完全没有牛皮癣病变。 在第二次给予抗体后随着预期的J695清除再次出现覆盖有白色鳞屑的红斑。实施例10 比较2个CHO细胞系产生的J695为了重组表达J695，通过磷酸钙介导的转染将编码所述抗体重链和所述抗体轻链 的重组表达载体导入 dhfr-CHO 细胞中(Urlaub，G.和 Chasin，L. Α. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 =4216-4220) 在所述重组表达载体中的抗体重链基因和轻链基因各自与增强 子/启动子调节元件(例如产生自SV40、CMV、腺病毒等的调节元件，例如CMV增强子/AdMLP 启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)有效连接，以驱动高水平转录所 述基因。所述重组表达载体还携带有D用FR基因，DHFR基因允许用甲氨蝶呤选择/扩增 选择所述载体转染的CHO细胞。使150个编码人抗体J695肽序列的表达载体的微生物溶解于50ml圆锥形管 的2. 7ml水中。加入300 μ L 2. 5Μ氯化钙，将该DNA混合物滴加到50ml圆锥形管的3ml 2XHEPES缓冲盐水中。涡旋5秒并室温下温育20分钟后，使ImL溶液均勻分散在各板中 (仍然为F12培养基)，使该板于37°C温育4小时。吸去液体，在每个板中加入2ml 10 % DMSO 的F12。DMSO震荡持续1分钟，然后在各板中加入5mlPBS稀释DMS0。用PBS洗板2次，然 后加入IOml加有H/T和5% FBS (选择表述DHFR的细胞)的α MEM，37°C温育过夜。以每 孔100个细胞密度将细胞接种入96孔板，各板于37°C、5%二氧化碳温育2周，每周更换培 养基1次。最后一次更换培养基后5天，1 50稀释培养上清液，并用人IgGY链特异性 ELISA进行测试。使产生最高ELISA信号的克隆从96孔板转移到1. 5ml/孔αΜΕΜ+5%透 析血清的12孔板中。3天后进行另一个人IgGY链特异性ELISA，12个具有最高活性的克 隆分入αΜΕΜ+5%透析血清和20nM MTX中。细胞系031898218在存在20nM MTX下生长，而
94没有任何明显细胞死亡或生长率降低，在3日测定中产生1. 8μ g/ml hlgG。031898218在 含MTX的培养基中生长的T-25培养物平均产生J695为11. 9 μ g/ml。称为ALP903的细胞 系适应在无血清条件下悬浮生长，产生7. 5pg J695/细胞/24h。ALP903细胞最初用α MEM/5 % FBS/20nM MTX培养基选择后，再用20nM MTX传代。 所述细胞在IOOnM MTX选择下培养，然后在随后的30天中用500nM MTX传代2次。此时所 述培养物产生32 μ gJ695/mL/24h。通过有限稀释亚克隆培养物。亚克隆218-22在96孔板 中2天产生16. 5μ g/mL J695，在12孔板中2天产生50. 3 μ g/mL J695。用α MEM/5%透析 FBS/500nM MTX培养克隆218-22 38天，然后使其如上所述进行无血清旋转培养。称为ALP 905的无血清悬浮培养的平均细胞特异性产量为58pg/细胞/24h。第一种用来产生J695的细胞系(ALP 903)由培养物产生J695抗体的产量低于 第二种细胞系ALP 905。为了保证ALP 905产生的J695在功能上与ALP 903产生的J695 相同，评价了两批抗体的IL-12亲和力、阻断IL-12结合细胞受体的能力、抑制IL-12诱导 IFN- γ的能力以及抑制IL-12介导的PHA母细胞增殖的能力。通过表面胞质团共振研究(BIAcore分析)检测结合IL-12的动力学速率常数，从 而确定ALP 903和ALP 905批J695对IL-12的亲和力。以3个实验(如实施例3所述) 测定ALP 903和ALP 905批J695抗体结合rhIL_12的解离速率常数(kd)和结合速率常 数(ka)。通过解离速率常数除以结合速率常数计算获得结合IL-12的亲和力Kd。计算各 个实验的Kd，然后平均。结果表明ALP 903和ALP 905批J695测得的动力学参数和结合 rhIL-12的亲和力非常类似=ALP 903批的计算Kd为1. 19士0. 22 X ICTiqM,而ALP 905批的 Kd 为 1.49 士0.47 X ICTiqM (见表 13)。评价ALP 903和ALP 905产生的J695阻断rhIL_12结合PHA活化的人T淋巴母 细胞上的IL-12受体的能力(参见实施例3)。测试以10倍连续稀释的起始浓度为IX 10_8 的各J695样品。使所述抗体与50pM[125I]_人IL-12在结合缓冲液中于37°C预温育1小 时。PHA母细胞加入抗体/[125I]-人IL-12混合物中，室温下温育2小时。通过离心和洗涤 步骤分离细胞结合放射性和游离[125I]-IL_12，计算抑制百分率。利用4参数曲线拟合由抑 制曲线确定J695的IC5tl值，并通过2个独立实验证实。一式二份进行温育。两批J695的 结果非常相似(见表13)。评价ALP 903和ALP 905细胞产生的J695抑制rhIL_12诱导体外PHA活化的人 淋巴母细胞产生IFN-Y的能力。连续稀释的J695与200pg/mL rhIL_12于37°C预温育1 小时。加入PHA淋巴母细胞，37°C温育18小时。温育后取出无细胞上清液，用ELISA测定 人IFN-Y水平。利用4参数曲线拟合用抑制曲线的IC5tl值对抗体浓度作图。结果证实两 批J695抑制IFN- γ产生的能力非常相似。体外PHA母细胞增殖测定用于测定ALP 903和ALP 905 J695对rhIL_12的中和 能力。连续稀释的每种类型的J695与230pg/mL人IL-12于37°C预温育1小时。然后加入 PHA母细胞，37°C温育3天。然后用IYCi/孔[3H]-胸苷标记细胞6小时。收获培养物，测 量掺入的[3H]-胸苷。在缺乏rhIL-12的情况下测定非特异性增殖(背景)。发现ALP 903 和ALP 905 J695的IC5tl值非常相似，见表13。ALP 903批和ALP 905批J695抗体的中和rhIL-12活性、阻断IL-12结合细胞表 面受体和结合rhIL-12中的活性没有明显不同，所以这两种不同细胞类型产生的抗体是等同物。表13 比较ALP 903和ALP 905批的J695的特性 等同实施方案本领域技术人员知道或者最多用常规实验就能够确定本文所述本发明具体实施 方案的许多等同实施方案。这样的等同实施方案包括在以下权利要求书内。
权利要求
一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO1氨基酸序列的重链CDR3。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，它编码抗体重链可变区。
3.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶R2包含SEQID NO 3的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶Rl包含SEQID NO 5的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQID NO :7氨基酸序列的抗体重链可变区。
6.一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的轻链⑶R3。
7.如权利要求6所述的分离的核酸分子，它编码抗体轻链可变区。
8.如权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDR2包含SEQID NO 4的氨基酸序列。
9.如权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDRl包含SEQID NO 6的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQID NO :8氨基酸序列的抗 体轻链可变区。
11.一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO :9氨基酸序列的重链⑶R3。
12.如权利要求11所述的分离的核酸分子，它编码抗体重链可变区。
13.如权利要求12所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶R2包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
14.如权利要求12所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶Rl包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQID N0:15氨基酸序列的 抗体重链可变区。
16.一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO 10氨基酸序列的轻链⑶R3。
17.如权利要求16所述的分离的核酸分子，它编码抗体轻链可变区。
18.如权利要求17所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列。
19.如权利要求17所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDRl包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列。
20.如权利要求19所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQIDNO 16氨基酸序列的抗 体轻链可变区。
21.一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重链⑶R3。
22.如权利要求21所述的分离的核酸分子，它编码抗体重链可变区。
23.如权利要求22所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶R2包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列。
24.如权利要求22所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶Rl包含SEQ ID NO 21的氨基酸序列。
25.如权利要求24所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQID N0:23氨基酸序列的抗体重链可变区。
26.一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO 18氨基酸序列的轻链⑶R3。
27.如权利要求26所述的分离的核酸分子，它编码抗体轻链可变区。
28.如权利要求27所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。
29.如权利要求27所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDRl包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列。
30.如权利要求29所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQID N0:24氨基酸序列的 抗体轻链可变区。
31.一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO :25氨基酸序列的重链⑶R3。
32.如权利要求31所述的分离的核酸分子，它编码抗体重链可变区。
33.如权利要求32所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶R2包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列。
34.如权利要求32所述的分离的核酸分子，其中所述抗体重链可变区的⑶Rl包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列。
35.如权利要求34所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQID NO :31氨基酸序列的 抗体重链可变区。
36.一种分离的核酸分子，它编码包含SEQ ID NO :26氨基酸序列的轻链⑶R3。
37.如权利要求36所述的分离的核酸分子，它编码抗体轻链可变区。
38.如权利要求37所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
39.如权利要求37所述的分离的核酸分子，其中所述抗体轻链可变区的CDRl包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列。
40.如权利要求39所述的分离的核酸分子，它编码包含SEQID N0:32氨基酸序列的 抗体轻链可变区。
41.一种包含权利要求1-40中任一项所述的核酸分子的重组表达载体。
42.—种已经导入权利要求41所述的重组表达载体的宿主细胞。
43.一种合成结合人IL-12的人抗体的方法，包括在培养基中培养权利要求42所述的 宿主细胞，直到结合人IL-12的人抗体被所述细胞合成为止。
全文摘要
本发明公开了特异性结合人白细胞介素-12(hIL-12)的人抗体，优选重组人抗体。优选抗体对hIL-12具有高度亲和力，而且在体外和体内中和hIL-12活性。本发明的抗体可以是全长抗体或其抗原结合部分。本发明的抗体或抗体部分可用于检测hIL-12以及抑制例如患有其中hIL-12活性有害的疾病的病人体内的hIL-12活性。本发明还包括用于表达本发明重组人抗体的核酸、载体和宿主细胞以及合成所述重组人抗体的方法。
文档编号A61P19/02GK101921772SQ20101019528
公开日2010年12月22日 申请日期2000年3月24日 优先权日1999年3月25日
发明者A·R·敦坎, A·文图里尼, A·维多姆, A·迈勒斯, B·拉布科夫斯基, D·E·特拉西, E·J·德比施雷, G·M·韦德曼, J·G·埃尔文, J·G·萨菲尔德, M·帕斯金德, M·怀特, M·罗古斯卡, N·W·瓦尼, P·萨科拉法斯, S·L·杜富, S·卡门, S·史密斯, S·巴纳吉, S·弗里德里希, T·L·霍尔特特, Z·凯马克卡兰 申请人:艾博特股份有限两合公司