专利名称：St-246的立体异构体的制备方法
技术领域：
本发明涉及ST-246的立体异构体的制备方法。
背景技术：
ST-246是美国Siga公司研发的一种抗痘病毒药物，ST-246的化学名为4_三 氟甲基-N-(3，3a，4，4a，5，5a，6，6a-八氢-1，3_ 二氧_4，6-亚乙烯基环丙基[f]异氮 杂-2 (IH)茚基)-苯甲酰胺{4-trifluoromethyl-N- (3，3a, 4，4a, 5，5a, 6,6a-octahydro-l， 3-dioxo_4，6-ethenoeyeloprop[f]isoindol-2(IH)-yl)-benzamide monohydrate}， ST-246存在立体异构体，Robert等人的国际专利申请W02004112718A2、W02008130348A1 已公开了该化合物、化合物的合成及其治疗痘病毒及其相关感染疾病的应用，并对ST-246 的结构用1H-NMR进行了结构解析，并对性质进行了研究，如，所述的合成方法为，将环庚三 烯、马来酸酐与二甲苯的混合物在氮气保护下加热回流反应得到固状物后，用叔丁基甲醚 结晶，所得结晶产物和4-三氟甲基苯甲酰胼于乙醇中加热回流反应后用乙酸乙酯正己 烷(1 1)重结晶得目的产物。但是对存在的立体化学未提及，包括立体异构体的表征及 其归属，按W02004112718A2所述方法制备的ST-246是否为纯式I化合物还是式I化合物 和式II化合物的混合物及其相应的含量无法确定。
式I式II为控制ST-246中式II化合物的含量以确保ST-246的纯度，需要式II化合物作 为标准对照，上述文献均未提及式II化合物的制备方法，不能有效控制ST-246的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种含ST-246的药物组合物及其制备方法与应用。本发明所提供的药物组合物，其组成包括式I所示的化合物和式II所示的化合 物，所述药物组合物中式I所示化合物的质量含量大于等于98. 5%，式II所示化合物的质 量含量小于等于0.5% ；
3(式 I)(式 II)。所述药物组合物中式I所示化合物的质量含量可进一步为大于等于99. 0%，式II 所示化合物的质量含量可进一步为小于0. 2%。本发明所述药物组合物的制备方法(即高纯度ST-246的制备方法)，包括下述步 骤氮气保护下，将式III所示化合物与4-三氟甲基苯甲酰胼在有机溶剂中进行加热反应， 得到所述药物组合物的粗品；
(式 III)。所述方法还包括对药物组合物粗品进行纯化的步骤将所述药物组合物溶于乙酸 乙酯中，然后依次用0. 2 0. 5mol/L盐酸和水萃取，收集有机层，过滤，得到初步纯化的药 物组合物；再用体积比为1 1 1 1.5的乙酸乙酯-正己烷的混合溶剂进行重结晶，得 到纯化的药物组合物。其中，所述有机溶剂选自下述溶剂中的至少一种乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氢呋 喃、乙二醇独甲醚和二氧六环；所述反应的反应温度为65-85°C，反应时间为12-15小时。为了得到高纯度的ST-246，上述方法中所用的式III所示化合物的原料中，式III 所示化合物的质量含量大于等于98. 5%，杂质式IV所示化合物的质量含量应小于1. 5%。式III、式IV所示化合物的含量测定方法可采用HPLC法进行检测，色谱条件如下 色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为体积比1 1的乙腈-质量浓度0.4% 磷酸二氢铵的混合溶液；流速为0. 5-lml/min ；检测波长230nm，柱温30°C。在该色谱条件 下，式III、式IV所示化合物可实现完全分离。上述高纯的式III所示化合物可按照下述方法制备得到将环庚三烯、马来酸酐 与二甲苯的混合物在氮气保护下加热回流反应12 18小时，然后将反应混合物冷却至室 温，过滤，收集固体，将固体干燥，得到类白色结晶性产物；将所得产物用叔丁基甲醚重结晶 得到式III所示化合物；所述反应的反应体系中环庚三烯与马来酸酐的摩尔比为1 1 1 1.5。本发明所制备的药物组合物中式I、式II所示化合物的含量可采用HPLC法进行
4检测，色谱条件如下色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为体积比1 1的乙 腈_质量浓度0. 4%磷酸二氢铵的混合溶液；流速为0. 5-lml/min ；检测波长230nm，柱温 30°C，定量限为0. 02%。在该色谱条件下，式I、式II所示化合物可实现完全分离。为了更准确的测定药物组合物中立体异构体ST-246’ (式II化合物)的含量，以 确保组合物中ST-246的高含量，本发明还制备了高纯度的立体异构体ST-246’作为标准对 照。式II所示化合物的制备方法，包括下述步骤氮气保护下，将式IV所示化合物与 4_三氟甲基苯甲酰胼在有机溶剂中进行加热反应，得到式II所示化合物； 所述有机溶剂选自下述溶剂中的至少一种乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氢呋喃、乙 二醇独甲醚和二氧六环；所述反应的反应温度为65-85°C，反应时间为12-15小时其中，式IV所示化合物可按照下述方法制备得到将环庚三烯、马来酸酐与二甲 苯的混合物在氮气保护下加热回流反应12 18小时，然后将反应混合物冷却至室温，过 滤，收集滤液，将滤液减压浓缩，浓缩物加入叔丁基甲醚中加热溶解，放至室温，待析出固 体后，过滤，得固体产物；将所得固体产物溶于乙酸乙酯进行硅胶柱层析，采用体积比为 1/13-1/9的乙醚/正己烷混合溶剂进行梯度洗脱，HPLC检测结果，收集目标洗脱液，浓缩， 用二甲苯重结晶，得到式IV所示化合物；所述反应的反应体系中环庚三烯与马来酸酐的摩 尔比为1 1 1 1. 5。式II所示化合物的制备方法还包括下述纯化步骤将式II所示化合物溶于乙酸 乙酯中，然后依次用0. 2 0. 5mol/L盐酸和水萃取，收集有机层，过滤，得到初步纯化的式 II所示化合物；再用体积比为1 1 1 1.5的乙酸乙酯-正己烷的混合溶剂进行重结 晶，得到纯化的式II所示化合物。式II所示化合物的纯度检测方法采用HPLC法进行检测，色谱条件如下色谱柱填 充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为体积比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氢铵的混合溶 液；流速为0. 5-lml/min ；检测波长230nm，柱温30°C。按照上述方法制备的式II所示化合物的纯度最高可达98. 0%以上，该产品可作 为ST-246，标准品使用。此外，在该色谱条件下色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙 腈-0.4%磷酸二氢铵(50 50, ν/ν)；流速为0. 5-lml/min;检测波长230nm，柱温30°C;对 所制备的药物组合物中含有的主要成分(式I、式II所示化合物)以及可能含有的杂质如 式III、式IV、式V、式VI和式VII化合物可以实现完全分离。
本发明的再一个目的是提供所述药物组合物的应用。本发明所提供的药物组合物的应用是其在制备抗痘病毒药物中的应用。以所述药物组合物为活性成分制备的抗痘病毒药物也属于本发明的保护范围。所述药物组合物的治疗有效剂量为250_800mg，优选为400mg。所述抗痘病毒药物可由活性组分和药用载体制成口服制剂。所述口服制剂的剂型 优选为片剂、胶囊剂、粉剂或颗粒剂。本发明的抗痘病毒药物可以是按常规制剂方法制备成的片剂，其中所述药学上可 接受载体包括药用片剂的稀释剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂；其中稀释剂可选择微晶纤维 素、淀粉、预胶化淀粉、乳糖、糊精、甘露醇、聚乙烯醇中的一种或多种。粘合剂可选择淀粉 浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和明胶浆中的一种。崩解剂可选择 淀粉、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮中的一种。润滑剂可选择滑石粉、硬脂酸镁、微粉 硅胶中的一种或两种。本发明片剂的制备方法是式I、式II组合物和稀释剂、崩解剂分别 研细过筛，混合均勻，用黏合剂制成软材，筛滤制粒，置50-60°C条件下干燥，再筛滤整粒后 加入润滑剂，混合均勻，压片。本发明的的抗痘病毒药物可以是按常规制剂方法制备成的胶囊剂，其中所述药学 上可接受载体包括微晶纤维素、淀粉、乳糖、糊精、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉 钠、微粉硅胶或40CP-100CP乙基纤维素、硬醋酸钠中的一种或几种，本发明胶囊剂的制备 方法是式I组合物和所述药学上可接受载体分别研细过筛，混合均勻，装胶囊，或用黏合剂 制成软材，筛滤制粒，置50-60°C条件下干燥，再筛滤整拉后加入润滑剂，混合均勻，装胶囊。本发明的的抗痘病毒药物可以是按常规制剂方法制备成的颗粒剂，其中所述药学 上可接受载体包括成型剂，可选用如β-环糊精、乳糖和糊精中的至少一种，矫味剂可选 用，如蔗糖、碳酸钠、椰子香精中的至少一种，崩解剂可选用，如可溶性淀粉、羧甲基淀粉钠 中的一种；粘合剂可选用，如羟丙基甲基纤维素或其它临床上可接受的结构类似物。本发明 颗粒剂的制备方法为按处方量取式I组合物与上述辅料混合后，喷雾干燥，干式制粒，整粒 即得产品；或将原辅料混合按处方量加入粘合剂，制成软材，将上述软材经12目筛制粒，再 于30-75°C干燥，12目筛整粒，将整粒好的颗粒加入已过80目筛的椰子香精混合均勻，分装 即得颗粒剂。本发明的的抗痘病毒药物可以是按常规制剂方法制备成粉剂，其中所述药学上可 接受载体包括药用的稀释剂，其中稀释剂可选择微晶纤维素、淀粉、乳糖、预胶化淀粉、糊 精中的一种或多种。本发明制备粉剂方法是含式I化合物的组合物和稀释剂分别研细过 筛，混合均勻，分装。本发明意义在于本发明提供了式I化合物含量高的药物组合物及其制备方法， 通式还提供了该药物组合物的质量控制方法。体外抗痘病毒活性试验表明，S-246含量高 的药物组合物对痘苗病毒天坛株感染的Vero E6细胞具有保护作用。
图1为式III化合物的1H-NMR(CDCl3)图谱。图2为式III化合物的N. 0. E(DMSO)图谱。图3为式I化合物的1H-NMR(CDCl3)图谱。
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图4为式I化合物的N. 0. E (DMSO)图谱。图5为式I化合物的13C-WR(DMSO)图谱。图6为式I化合物的红外光谱。图7为式I化合物的1H-1H COSY(DMSO)图谱。图 8 式 I 化合物的 13C-1H COSY(DMSO)图谱。图9式I化合物的13O1H HMBC (DMSO)图谱。图10为式I化合物的DEPT (DMSO)图谱。图11为式I化合物的X-晶体衍射图谱。图12为式IV化合物的1H-NMR(CDCl3)图谱。图13为式IV化合物的N. 0. E (DMSO)图谱。图14为式II化合物的1H-NMR(CDCl3)图谱。图15为式II化合物的N. 0. E(DMSO)图谱。图16为式II化合物的X-晶体衍射图谱。图17为含式I化合物的组合物的HPLC图谱。图18为式II化合物的HPLC图谱。图19为式III化合物的HPLC图谱。图20为式IV化合物的HPLC图谱。图21为式V化合物的HPLC图谱。图22为式VI化合物的HPLC图谱。图23为式VII化合物的HPLC图谱。图24式I、式II、式III、式IV、式V、式VI和VII化合物的混合物的HPLC图谱。
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用的4-三氟甲基苯甲酰胼(式V化合物)可按照下述方法制备
得到
式V式VI1、中间体4-三氟甲基苯甲酸乙酯(式VI化合物)的合成在搅拌和冷却下，30min内将178. 5g(l. 5mol)氯化亚砜滴加到190g(Imol) 4_三氟 甲基苯甲酸(式VII化合物)和1.5L无水乙醇的混合物中。滴加完后，缓缓升温至78°C， 并在此温度下回流6h，TLC跟踪反应至结束，蒸出过量的乙醇和氯化亚砜后，加入2L水，静 置分层，分出有机相，水层用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并用IL饱和碳酸钠溶液洗涤， 无水硫酸钠干燥，蒸出乙酸乙酯，得无透明液体产物202. 7g(93. 0% )0 b. p. 81°C /5mmHg。
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2、4_三氟甲基苯甲酰胼(式V化合物)的合成将4-三氟甲基苯甲酸乙酯218g (l.Omol)，85 %水合胼114g(1.5mol)于 500mL乙醇溶液中搅拌回流240min，TLC跟踪反应至结束。冷却结晶，过滤，干燥得到 182. 5g(88.8%)无色晶体。m ρ 116 118°C。薄层检测展开剂甲醇-石油醚_乙酸乙 酯(10 10 1)，Rf = 0.8。1H-WR(CDCl3) δ 7. 883(d，2H) ； δ 7. 729(d，2H) ； δ 7. 722(s， 1H, ΗΝ) ； δ 4. 182 (s，2Η，NH2)。实施例1、制备反式-四环[3. 2. 2. O24]壬烷_6_烯-面内_8_面内_9_ 二羧酸酐 (式III化合物)将环庚三烯(50g，0.543mol)、马来酸酐(61. 3g，0. 624mol)与二甲苯(300ml)的混 合物在氮气保护下加热至120°C反应15小时，然后将反应混合物冷却至室温，形成固状物 后，过滤，粗品干燥，得到80g(83.7%)的类白色结晶性产物。将粗品80g加入叔丁基甲醚 400ml中，加热回流，趁热过滤，滤液置5°C条件下过夜，滤出固体，加入到叔丁基甲醚400ml 中，加热回流，趁热过滤，滤液置5°C条件下过夜，滤出固体，再加入到叔丁基甲醚350ml中， 加热回流，趁热过滤，滤液置5°C条件下过夜，滤出固体干燥，得白色结晶目的物68g(叔丁 基甲醚重结晶三次)。m.p. 100 101 °C。1H-WR(CDCl3) [ δ 5. 888(q，2H，J = 3· 6)，δ 3. 254(t，2H，J = 1. 8), δ 3. 464 (2Η, J =1. 8)，δ . 114(m，2H，J = 1. 8)，δ 0· 259 (m，1Η, J = 3. 6)，δ 0· 374 (m，1Η, J = 7. 2)。Ms 191. 1。1H-NMR 图谱(图 1)及 Ν· 0· E 图谱(图 2)显示，当照射 2、4 氢[δ 1. 114(m,2H)] 时，其8、9氢和3’氢信号增强，而3氢信号不变，说明该结构符合面内式构型。采用HPLC法对制备的式III所示化合物的含量进行测定，色谱条件如下色谱柱 填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为体积比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氢铵的混合 溶液；流速为0. 5-lml/min ；检测波长230nm，柱温30°C。式III所示化合物的HPLC图谱如 图19所示。采用面积归一化法计算得到式III化合物的纯度> 98. 5%实施例2、制备含式I化合物的药物组合物(即高纯度的ST-246)在氮气保护下，将实施例式III化合物(30g，0. 16mol)和4_三氟甲基苯甲酰胼 (37g，0. 18mol)于1000ml乙醇的溶液中加热回流(79°C )反应13小时，减压蒸去乙醇，析 出白色结晶固体，将固体溶于乙酸乙酯1500ml中，溶液依次用0. 5mol/L的盐酸(2X500ml) 和水(500ml)萃取，收集有机层，过滤，得目的产物固体36g，滤液用无水硫酸钠干燥，浓缩， 过滤得目的产物6g，共得产物43. 8g(收率70. 0&)，乙酸乙酯-正己烷(1 1)重结晶，得白 色结晶性粉末40. 8g(总收率64. 7% ) ；m. p. 194 196°C。薄层检测展开剂正己烷_乙 醚-醋酸(3 4 1)，Rf = 0.8。1H-WR(CDCl3) δ 8. 428 (s, 1H) ； δ 7. 888 (d, 2H, J = 7. 8) ； δ 7. 659 (d, 2H, J = 7. 8) ； δ 5. 836 (s,2H) ； δ 3. 145 (2Η) ； δ 3. 456 (2Η) ； δ 1. 153 (m, 2H) ； δ 0. 259 (m, 1H, J = 3. 0) ；0. 323 (m，1H，J = 7. 8) ；1H-NMR 图谱(图 3)及 N. 0. E 图谱显示(图 4)，当照射 10、11 氢[δ 1. 153(m，2H)]时，其3、4氢和12’氢信号增强，而12氢信号不变，说明该结构符合反 式构型。Ms 376. 1元素分析仪器型号EA1108型元素分析仪测定。
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测定结果59.96，4. 08，7. 34，符合分子式 C19H15F3N2O3. H2O采用HPLC法对所制备的高纯度ST-246的质量进行检测，色谱条件如下色谱柱填 充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为体积比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氢铵的混合溶 液；流速为0. 5-lml/min ；检测波长230nm,柱温30°C。高纯度ST-246的HPLC图谱如图17 所示。以实施例4制备的式II化合物作为检测高纯度ST-246中ST-246’的标准品。测得 式I质量含量为99. 85%，式II质量含量为0. 08%。实施例3、制备反式-四环[3. 2. 2. O24]壬烷_6_烯-面外_8_面外_9_ 二羧酸酐 (式IV化合物)将环庚三烯(50g，0.543mol)、马来酸酐(61. 3g，0. 624mol)与二甲苯(300mL)的混 合物在氮气保护下加热回流反应20小时，然后将反应混合物冷却至室温，过滤，将滤出的 母液真空浓缩成固体后，取固体加入叔丁基甲醚IOOml中，加热溶解，放至室温，待析出固 体后，过滤，固体溶于乙酸乙酯IOOml中，拌入IOg硅胶，蒸去溶剂，晾干，上80g硅胶柱，用 体积比为1/13-1/9的乙醚/正己烷的混合溶液(即1/13、1/12、1/11、1/10、1/9)作洗脱剂 进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3 5个柱体积，根据HPLC检测结果收集目标洗脱液，浓缩， 用二甲苯重结晶得目标化合物。1H-NMR (CDCl3) δ 5. 950 (q, 2H) , δ 3· 080 (s，2Η)，δ 3. 415 (2Η), δ 1· 136 (m，2Η)， δ 0. 147 (m, 1Η)，δ 0. 233 (m, 1Η) ；1H-NMR 及 N. 0. E 图谱显示(图 19，20)，当照射 2、4 氢 [δ 1. 136(m，2H)]时，其8、9氢和3’信号不变，说明该结构符合面外式构型。Ms 191. 1 ;m. ρ· 112 113°C。采用HPLC法对制备的式IV所示化合物的含量进行测定，色谱条件如下色谱柱填 充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为体积比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氢铵的混合溶 液；流速为0. 5-lml/min ；检测波长230nm，柱温30°C。式IV所示化合物的HPLC图谱如图 20所示。采用面积归一化法计算得到式IV化合物的纯度> 98. 5%。实施例4、制备式II化合物(即ST-246’标准品)在氮气保护下，将式IV化合物(3g，0.016mol)和4_三氟甲基苯甲酰胼(3. 7g， 0. OlSmol)于IOOml乙醇的溶液加热回流(79°C )反应13小时，减压蒸去乙醇，析出白色 结晶固体，将固体溶于乙酸乙酯150ml中，溶液用0. 5mol/L的盐酸(2X50ml)和水(50ml) 萃取，有机层，过滤，得目的产物固体3. 4g，滤液用无水硫酸钠干燥，浓缩，过滤得目的产 物0.6g，共得产物4.0g(收率67.8%)，乙酸乙酯-正己烷(1 1)重结晶，得白色结晶 性粉末3. 2g(总收率54. 2% ) ；m. p. 174_176°C。薄层检测展开剂正己烷-乙醚-醋酸 (3 4 1)，Rf = 0. 8。1H-NMR(CDCl3) δ 9. 101 (s, 1H) ； δ 7. 846(d，2H，J = 7. 8) ； δ 7. 582 (d，2H， J = 7. 8) ； δ 5. 939 (q, 2H, J = 3. 6) ； δ 3. 392 (s,2H) ； δ 2. 836 (s,2H) ； δ 3. 456 (2Η)； δ 1. 117(m，2H) ； δ 0. 218 (d，1H, J = 5. 4) ； δ 0. 114(m, 1Η) (m, IH, J = 3. 0) ；1H-NMR 图谱及 N. 0. E图谱显示(图14，15)，当照射10、11氢[δ 1. 117(m,2H)]时，其3、4氢和12’氢信号 不变，说明该结构符合顺式构型。Ms 376.1元素分析仪器型号EA1108型元素分析仪测定。测定结果:C%为60. 64，3. 98，7. 45，符合分子式 C19H15F3N2O3. H2O
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采用HPLC法对制备的式II化合物的含量进行测定，色谱条件如下色谱柱填充剂 为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为体积比1 1的乙腈-0. 4%磷酸二氢铵的混合溶液； 流速为0. 5-lml/min ；检测波长230nm，柱温30°C。式II化合物的HPLC图谱如图18所示。 采用面积归一化法计算计算得到式II化合物的纯度> 98. 0%，该化合物可作为检测实施 例2制备的高纯度ST-246中ST-246，含量的标准品。实施例5、含有式I组合物制成的片剂处方实施例2制备的式I组合物 200g乳糖IOOg微晶纤维素60g预胶化淀粉40g羧甲基淀粉钠40g微粉硅胶4g硬脂酸镁4g0. 3% HPMC适量_1000 片制备方法取式I组合物与乳糖、微晶纤维素200 100 40配比微粉化，得微粉 混合物，将处方量微粉化物与微晶纤维素、预胶化淀粉、微粉硅胶及羧甲基淀粉钠充分研磨 混勻后，加入适量0.3% HPMC水溶液制软材，20目筛制粒，40°C恒温干燥后，加入硬脂酸镁 混合均勻后，20目筛整粒，压片即得。实施例6、含式I组合物制成的颗粒剂处方实施例2制备的式I组合物 200g乳糖400g蔗糖IOOg椰子香精30g交联聚维酮30g_1000 袋制备方法取式I组合物、乳糖、蔗糖、椰子香精、交联聚维酮，分别研细过60目筛， 按处方量取主药与上述辅料混合后，喷雾干燥，干式制粒，整粒即得产品；或将原辅料混合 按处方量加入粘合剂，制成软材，将上述软材经12目筛制粒，再于60°C干燥，12目筛整粒， 将整粒好的颗粒加入已过80目筛的椰子香精混合均勻，分装即得颗粒剂。实施例7、含有式I组合物制成的胶囊剂处方实施例2制备的式I组合物 200g微晶纤维素150g乳糖150g羧甲基淀粉钠30g硬脂酸镁6g2%羟丙基纤维素适量
_1000 粒制备方法取式I组合物、微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠，别研细过60目筛，按 处方量取主药与上述辅料，混合均勻，用黏合剂2%羟丙基纤维素制成软材，18目筛筛滤制 粒，置60°C条件下干燥，整粒后加入硬脂酸镁，混合均勻，装胶囊。实施例8、式I组合物体外抗痘病毒活性1、实验材料病毒痘苗病毒天坛株，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所保 证可在符合国家和军队有关规定且经相关部门批准后向公众提供；参考文献金奇，陈南 海，姚二梅等.痘苗病毒天坛株基因组旁侧区结构及开放读码框架的分析.病毒学报.1997 年3月，第13卷，第1期。细胞=Vero E6，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所保证可 在符合国家和军队有关规定且经相关部门批准后向公众提供；参考文献:WANG Lin, LI Rong-song, GUO Hai-yan, and etal. Developmen t of a screen ing method for poten tial an ti-SARS compounds based on Vero-E6cells.中草药.第 35 卷第 9 期· 2004 年 9 月· 1019-1023。供试品式I组合物，其中式I质量含量为99. 85%，式II质量含量为0. 08%。2、实验方法(1)细胞病变法(CPE)法将病毒从-70°C冰箱中取出，放冰浴中融化。用细胞维 持液将病毒稀释成IO-IOOTCID5(i，放冰浴中。弃去已长成单层细胞的96孔板中的培养液。 向正常细胞对照孔中加入细胞维持液，每孔100 μ 1，共3个复孔。用稀释的病毒悬液感染病 毒对照孔、西多福韦阳性药物对照孔和试验孔中的细胞，每孔 οομ 1，37°C吸附1. 5h。弃病 毒液，向病毒对照孔中加入细胞维持液，每孔100 μ 1，共3个复孔；向西多福韦阳性药物对 照孔中加入西多福韦溶液(浓度为100 μ g/ml)，每孔100 μ 1，共3个复孔；向试验孔中加入 含有不同浓度待测化合物的维持液，每孔100 μ 1，每个浓度3个复孔。将96孔板置于37°C、 5%0)2培养箱中培养。每日在倒置显微镜下观察并记录细胞病变情况。直到病毒对照孔出 现4个“ + ”细胞病变时为实验终点。用软件计算抑制50%细胞病变的组合物浓度(IC5tl)。(2)中性红染色法同细胞病变法。每日在倒置显微镜下观察并记录细胞病变情 况。直到病毒对照孔出现4个“ + ”的细胞病变时为实验终点。每孔加入0. 中性红25μ 1， 于37°C放置1.5h，然后将每孔中的液体吸出。用PBS洗2次。加醋酸乙醇，每孔100 μ 1。 设空白对照。用酶标仪在492nm处测定OD值。计算细胞存活率和死亡率，然后用软件计算 组合物的IC5Q。(3)空斑减数实验准备长成单层细胞的24孔板，弃培养液，每孔加入100 200PFU的病毒悬液 150 μ 1，再加入350 μ 1细胞维持液，37°C吸附1. 5h。弃病毒液，加入不同浓度的药物溶液， 每孔1ml，每个浓度各设3个复孔。设正常细胞对照、病毒对照、利巴韦林阳性药物对照，每 个对照设3个复孔。37°C,5% CO2培养72h。弃孔中液体，用0. 1 %结晶紫溶液染色，350 μ 1/ 孔。室温放置lh。弃染色液，蚀斑可见易数。计数蚀斑，用软件计算组合物的IC5Q。3、实验结果
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本实验室采用CPE法、中性红染色法和蚀斑降低实验测定含ST-246的组合物对痘 苗病毒天坛株感染的Vero E6细胞的保护作用(见表1、2、3)。表1. ST-246对痘苗病毒的IC5tl (CPE法) 表2. ST-246对痘苗病毒的IC5tl (中性红染色法)
供试品IC50 (μιηοΙ/L)
实验一 实验二 实验三χ 土S
含 ST-246 的组合物 0.017 0.041 0.0180.025±0.014表3. ST-246对痘苗病毒的IC5tl (蚀斑降低实验)
供试品IC5O (μπιοΙ/L)实验一实验二 实验三x±S含ST-246的组合物0.0011460.001 0.0011770.0011 士0.00009
1权利要求
式II所示化合物的制备方法，包括下述步骤氮气保护下，将式IV所示化合物与4 三氟甲基苯甲酰肼在有机溶剂中进行加热反应，得到式II所示化合物；FSA00000222154000011.tif
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机溶剂选自下述溶剂中的至少一 种乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氢呋喃、乙二醇独甲醚和二氧六环，优选溶剂为乙醇；所述 反应的反应温度为65-85°C，反应时间为12-15小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于式IV所示化合物按照下述方法制备 得到将环庚三烯、马来酸酐与二甲苯的混合物在氮气保护下加热回流反应12-18小时，然 后将反应混合物冷却至室温，过滤，收集滤液，将滤液减压浓缩，浓缩物加入叔丁基甲醚中 加热溶解，放至室温，待析出固体后，过滤，得固体产物；将所得固体产物溶于乙酸乙酯进行 硅胶柱层析，采用体积比为1/13-1/9的乙醚和正己烷组成的混合溶剂进行梯度洗脱，收集 目标洗脱液，浓缩，用二甲苯重结晶，得到式IV所示化合物；所述反应的反应体系中环庚三 烯与马来酸酐的摩尔比为1 1-1 1.5。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述梯度洗脱依次采用下述体积比的乙 醚/正己烷混合溶剂进行洗脱1/13、1/12、1/11、1/10、1/9，每个梯度洗脱3 5个柱体积。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于式II所示化合物的制备方法还 包括下述纯化步骤将式II所示化合物溶于乙酸乙酯中，然后依次用0. 2-0. 5mol/L盐酸和 水萃取，收集有机层，过滤，得到初步纯化的式II所示化合物；再用体积比为1 1-1 1.5 的乙酸乙酯_正己烷的混合溶剂进行重结晶，得到纯化的式II所示化合物。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于式II所示化合物的纯度检测方 法采用HPLC法进行检测，色谱条件如下色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相 为体积比1 1的乙腈_质量浓度0. 4%磷酸二氢铵的混合溶液；流速为0. 5-lml/min ；检 测波长230nm，柱温30°C。(式 II)(式 IV)。
全文摘要
本发明公开了一种ST-246立体异构体的制备方法。该化合物的结构式如式II所示。其制备方法包括下述步骤氮气保护下，将式IV所示化合物与4-三氟甲基苯甲酰肼在有机溶剂中进行加热反应，得到式II所示化合物。对得到化合物按照下述方法进行纯化可得到纯化的产品将式II所示化合物溶于乙酸乙酯中，然后依次用0.2-0.5mol/L盐酸和水萃取，收集有机层，过滤，得到初步纯化的式II所示化合物；再用体积比为1∶1-1∶1.5的乙酸乙酯-正己烷的混合溶剂进行重结晶，得到纯化的式II所示化合物。该方法制备的化合物可作为检测ST-246中式II化合物的含量的标准品。
文档编号A61K31/403GK101906064SQ20101024853
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者孙雅洁, 张东娜, 徐力昆, 李理宇, 杨亮, 杨扬, 王洪权, 窦媛媛, 董鹏, 贝祝春, 郭永建 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所