专利名称：聚苹果酸前药衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚合物药物，特别是载带多种活性基团的多功能聚合物药物，具 体涉及聚苹果酸类前药衍生物及应用。
背景技术：
目前临床应用的药物主要为低分子化合物，低分子药物，其具有疗效高、使用方便 等优点，但同时也存在很大的副作用。如在给药后的短时间内，血液中药物的浓度往往高于 治疗所需浓度，有时甚至高于最低中毒浓度，从而导致人体发生中毒、过敏等；有些低分子 药物在人体内代谢速度快，半衰期短，易排泄，随着时间的推延，血药浓度会很快降低到最 低有效浓度以下从而影响疗效；重复给药后，会增加对人的毒副作用，并且许多药物因为水 溶性差而影响人体吸收，而高分子载体是降低小分子药物副作用的有效手段之一。高分子化合物由于具有较大的相对分子量和丰富的链结构等特点，可把小分子药 物引入高分子链，可降解的聚合物作为药物载体可以使得药物释放具有较好的靶向性、药 物释放更加平缓，特别是可以使一些不稳定、半衰期短的药物在人体内达到可控制释放的 效果。因此将可降解聚合物应用于药物释放体系中作为药物载体得到了较深入的研究。具 有生物相容性和生物可降解性的高分子材料作为小分子药物的载体可在病灶部位选择性 地释放药物，能极大地提高药物的生物利用率，有效地降低药物的毒副作用和用药剂量，并 且将某些聚合物前药引入靶向分子，实现主动寻靶的效果。利用生物可降解高分子作为载 体，一般有两种方法化学结合小分子药物和物理包埋小分子药物。将不同种类的药物封 入高分子小球或微粒中，以聚合体为基础的抗肿瘤药物会在较长时间内直接进入病灶部位 释放药物，使药物的毒副作用降低到最小。目前制备聚合物前药中应用较多的有聚乳酸 (PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚谷氨酸等。聚乳酸、聚乙醇酸不溶于水，交联的药物分子在体内释 放较慢，影响药效；聚谷氨酸等吸水性又太强，容易崩解，对于其药效也有影响。聚苹果酸是一种特殊的脂肪族聚酯，具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容 性和生物可吸收性；另外聚苹果酸还具有两个显著的优点(1)易代谢性。由于L-苹果酸 是生物体内克雷伯氏三羧酸循环(Kerbs TCA)的中间体，A -聚苹果酸容易在生物体内通 过正常的三羧酸循环代谢途径除去；(2)易修饰性。聚苹果酸重复单元具有悬挂羧基，易溶 于水，而且容易与其它官能团反应而制得聚苹果酸衍生物，或引入靶向分子或小分子药物， 从而制得许多具有特殊功能的产物。通过共聚或悬挂羧基的修饰来调节聚苹果酸及其衍生 物大分子链的结构和组成，从而实现可控释放。迄今为止，以VertCammas和Kajiyaina等 为代表的国外学者已对聚苹果酸的合成、性能和应用做了较深入的研究；用其做载体制备 的脑靶向聚合物前药，不但具有良好的生物相容性及降解性，且改善了药物性质。在国内目 前对聚苹果酸的研究主要集中在其合成方法的改进和优化，复旦大学印春华等(中国专利 申请号200710040494. 6)发明了一种两亲性的0-长链烷基-N-聚苹果酸壳聚糖接枝共聚 物，其它未见用其做药物、抗体、配体、增敏剂等聚苹果酸类相关前药及其衍生物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一类聚苹果酸前药衍生物，该类前药衍生物不但能调节原有 药物的两亲性，增强其生物相容性，而且制备的前药在人体环境下，可断键释放药物，达到 缓释的目的。改性后的两亲性衍生物，通过调节亲水部分和疏水部分比例，可制备成纳米 给药体系(如胶束、纳米乳)，继而也可采用物理包封方式将其他难溶性药物(尤其抗肿瘤药 物)、增敏剂载入纳米药物体系。本发明实现过程如下
结构通式(I)所示的聚苹果酸前药衍生物，
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自带有或修饰后带有活性氨基(-NH2)、羟基(-0H)、 巯基(-SH)、-S-S-或腙键(-NH-N=CH-),并利用上述活性基团的反应性能够与聚苹果酸中 的羧基进行反应的药物、抗体、配体、增敏剂、穿膜肽、RGD肽、生物大分子药物或聚乙二醇 (PEG)0聚苹果酸的分子量为1500 200，000 ；聚苹果酸和队、R2、R3、R4, R5, R6取代基的单元 摩尔比为0.广99。R1^R2, R3, R4, R5 和 R6 独立地选自带有或修饰后带有—d—、_0_、_0_ (CH2) 3-C0_NH-
>-R10-CH=N-NH-, -R11-S-S-基团，其中 R10 为-NH-NH-CO- (CH2)n-C0-、-NH_ (CH2)n_S_S- (CH2)n_ C0-,-Gly-,-Gly-Phe-Lau-Gly-或-Gly-Gly- ；R11 选自-NH- (CH2) n -，上述 η 为 1 12，最好 为1 6。上述带有活性氨基(-NH2)的药物为抗肿瘤药物阿霉素、阿扎胞苷、克拉曲滨，来那 度胺及其衍生物。上述的带有羟基(-0Η)或巯基(-SH)的药物为抗肿瘤药物紫杉醇、多烯紫杉醇、喜 树碱、羟基喜树碱、达沙替尼、雌莫司汀、氟脲苷、盐酸米托蒽醌、奈拉宾、链佐星，长春亲碱 药物及其衍生物。在结构通式(I)所示的聚苹果酸前药衍生物结构中，聚苹果酸与药物、抗体、配体， 增敏剂相互作用的同时还可用PEG修饰，用以延长药物半衰期及体内循环时间。本发明以可生物降解的聚苹果酸为支载体，利用聚苹果酸结构中的羧基，在碳化 二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)的催化作用下，与带有活性氨基(-NH2)、羟基 (-0H)、巯基(-SH)、-S-S-或腙键(-NH-N=CH-)的药物、抗体、配体、穿膜肽、增敏剂等键合， 制备出聚苹果酸前药衍生物。本发明的聚苹果酸前药衍生物，其制备方法包括如下步骤 (1)制备聚苹果酸载体。(2)药物分子的引入。其主要过程是将上述聚苹果酸载体与带有或修饰后带有活 性氨基(-NH2)、羟基(-0H)、巯基(-SH)、-S-S-或腙键(-NH-N=CH-)的药物、抗体、配体，增敏 剂等一种或多种相互作用或同时作用，在干燥的二甲基亚砜(DMSO)或N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，在EDC/ HOSU作用下，冰浴反应3飞h后，在室温反应l(T48h制得带有酰胺键、酯 键的前药或相关衍生物，这些基团可单一存在也可多种同时存在。
本发明的优点与积极效果
(1) 由本发明制备的聚苹果酸类的相关前药可直接用于药物转运体系。(2) 药物支载体聚苹果酸是一种可生物降解的材料，其降解产物为人体本身 具有的物质，不会产生蓄积毒性和毒副作用，具有无毒性、无免疫原性和抗原性、生物相容 性良好的特点。(3) 本发明中聚苹果酸前药及其衍生物，通过PEG或其他相似大分子的修 饰，能显著延长药物的半衰期，延长在体内的循环时间。(4) 本发明中聚苹果酸前药及其衍生物，通过调节亲水部分和疏水部分配比， 在一定PH的缓冲溶液中可自组装成疏水核亲水壳的纳米粒(胶束)，其表面仍带有易修饰 的羧基，可进一步与特异性配体结合，从而提供主动靶向给药系统。(5) 本发明中聚苹果酸前药及其衍生物的降解速度可以通过改变聚苹果酸分 子量和侧链羧基脱保护的程度来调节，从而实现支载或包封药物、抗体、配体，增敏剂等材 料的缓释、控释。说明书附图
图1为聚苹果酸-阿霉素前药的核磁氢谱；
图2为聚苹果酸-阿霉素前药释药曲线；
图3 LHRH-聚苹果酸-阿霉素纳米胶束透射电镜图4纳米胶束入胞图A 聚苹果酸-阿霉素(lh) B =LHRH-聚苹果酸-阿霉素(Ih)； 图5为聚苹果酸-紫杉醇前药的核磁氢谱； 图6为聚苹果酸-喜树碱前药的核磁氢谱。
具体实施例方式带有活性氨基(-NH2)、羟基(-0H)或巯基(-SH)的材料还包括抗体(如抗HER2 抗体等或可根据需要将抗体进行修饰后带有上述基团)、配体(如叶酸、促黄体激素释放激 素 LHRH 等)，增敏剂(如 PDTC，ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)，穿膜肽(TAT， transcriptional activator protein)，RGD jj^dLI^·。本发明经过大量的实验研究，以阿霉素、紫杉醇和喜树碱为药物模型，聚苹果酸自 制，分别以酯键和酰胺键与聚苹果酸键合制备前药。本发明制备的聚苹果酸前药及其衍生 物作为一种新型的药物控释载体可用于多种药物的控制释放，通过键合不同的受体和抗 体，可达到主动靶向的效果；通过键合不同抗肿瘤药物的增敏剂可减小药物产生的多药耐 药性；通过键合PEG，可延长药物半衰期及其在体内循环时间。以下是发明人给出的实施例，但本发明不限于这些实施例。实施例1 酰胺键键合阿霉素_聚苹果酸前药的制备
称取IOOmg聚苹果酸(MW:5，000)溶到适量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)备用。分别称取 125mg盐酸阿霉素(ADR · HCl)和39mL三乙胺(TEA)溶解在DMF中，室温下搅拌过夜后，与 上述聚苹果酸溶液混合，加入62mg EDC/HC1，0°C时反应2小时，然后室温下反应10小时， 结束后在去离子水中透析48h，以除去未反应的单体及溶剂，冷冻干燥即得产物。利用红外分光光度计和核磁共振氢谱表征产物结构(图1)
IR (KBr) 3424 (0H), 2943 (CH), 1743 (C00)，1647 (CONH), 1617 cm-1 (aromaticC=O)。实施例2 酯键键合阿霉素_聚苹果酸前药的制备
称取等量的聚苹果酸(MW :5，000)和DOX溶解到适量的DMF中，磁力搅拌，室温下反应 10小时，透析48小时，冷冻干燥即得红色产物。IR (KBr) 3437 (0H), 2943 (C-H), 1736 (COO)，1618 cnT1 (aromatic C=O). 如图2所示，在pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中，酯键水解速率相对较酰胺键快，但都能起
到缓释作用。实施例3 =LHRH键合阿霉素-聚苹果酸纳米胶束的制备
称取等量的聚苹果酸(MW :5，000)和DOX溶解到适量的DMF中，磁力搅拌条件下缓慢加 入促黄体激素释放激素(LHRH)，DCC的DMSO溶液，磁力搅拌，室温下反应16小时，透析48 小时，冷冻干燥即得红色产物。透析法自组装成纳米胶束取0.025g产物，溶于20ml DMSO 中，将反应液倒入200ml pH8 PBS中，然后倒入透析袋中，在5L相同pH的PBS中透析1天。 将透析袋中液体取出加入5ml分散剂，冷冻干燥，得到200nm左右的纳米胶束(图3)。亦可 在成胶束过程中加入增敏剂(PDTC)，进行物理包封。以乳腺癌细胞A2780为模型，研究其内吞机制。结果表明，通过LHRH介导作用，相 同时间内(1小时)，胶束LHRH-聚苹果酸-阿霉素(B)荧光强度明显高于聚苹果酸-阿霉素 体系(A)，表明前者通过受体-配体介导途径进入肿瘤细胞的更多(图4)。实施例4酯键键合紫杉醇_聚苹果酸前药的制备
称取50mg聚苹果酸(MW :5，000)溶到适量N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)备用。分别称取 63mg盐酸阿霉素(D0X ·Ηα)和2ImL三乙胺(TEA)溶解在DMF中，室温下搅拌过夜后，与上 述聚苹果酸溶液混合，加入3Img EDC/HC1，0°C时反应2小时，然后室温下反应10小时，结束 后在去离子水中透析48h，以除去未反应的单体及溶剂，冷冻干燥即得产物。IR (KBr) 3430 (0H), 2942 (C-H), 1736 (COO)，1620 cnT1 (aromatic C=O). 核磁氢谱表征其结构图5。实施例5酯键键合喜树碱_聚苹果酸前药的制备
称取50mg聚苹果酸(MW :5，000)溶到适量N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)备用。分别称取 63mg喜树碱溶解在DMF中，室温下搅拌过夜后，与上述聚苹果酸溶液混合，加入3Img EDC/ HC1,0°C时反应2小时，然后室温下反应10小时，结束后在去离子水中透析48h，以除去未反 应的单体及溶剂，冷冻干燥即得产物。核磁氢谱表征其结构图6
实施例6腙键键合阿霉素-聚苹果酸前药的制备
称取8. 7mgD0X -HCl, 1. 5mg己二酸二酰胼和3mgLiCl溶于5ml 二甲基乙酰胺(DMA)，然 后再加入3uL乙酸，室温，避光反应18h。以甲醇作为展开剂，柱层析法分离提纯并干燥，得 酰胼化阿霉素。称取6mg酰胼化阿霉素，2mgNHS，50mg聚苹果酸，溶于适量N，N- 二甲基甲酰胺 (DMF)，加入15mg EDC/HC1，避光，室温下反应24h。反应后的溶液在去离子水中透析48h，以 除去未反应的单体及溶剂，冷冻干燥即得产物。实施例7 二硫键键合阿霉素
称取IOOmg聚苹果酸，8mg巯基乙胺，IOmgNHS和15mgEDC/HCl溶于适量DMF中，室温下反应20h，反应后的溶液在去离子水中透析48h，以除去未反应的单体及溶剂，冷冻干燥即 得巯基化PMLA。称取8mg阿霉素，IOmg 3-(2-二硫代吡啶)丙酰胼(PDPH)和IOmgNHS溶于适量 DMF中，加入20mg EDC/HC1，避光，室温反应20h。反应后的溶液用柱层析法纯化。将纯化干 燥后的固体5g，溶于IOmlDMSO,加入20mg巯基化PMLA，室温下反应48h，反应后的溶液在去 离子水中透析48h，以除去未反应的单体及溶剂，冷冻干燥即得产物。上述实施例详细给出了本发明的较佳的实施例，对本发明做出了详细的描述，并 非用上述实施例限定本发明。本领域的技术人员应当意识到在不脱离本发明技术方案所给 出的技术特征和范围的情况下，对技术特征所作的增加、或以本领域一些同样内容的替换， 均应属于本发明的保护范围。
权利要求
结构通式(I)所示的聚苹果酸前药衍生物，其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自带有或修饰后带有活性氨基、羟基、巯基、-S-S-或腙键，并利用上述活性基团的反应性能够与聚苹果酸中的羧基进行反应的药物、抗体、配体、增敏剂、穿膜肽、RGD肽、生物大分子药物或聚乙二醇。289527dest_path_image001.jpg
2.根据权利要求1所述的聚苹果酸前药衍生物，其特征在于氓、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自带有或修饰后带有 —、-O-、-O- (CH2) 3-C0-NH-、-R10-CH=N-NH-，-R11-S-S-基团，其中 R10 为-NH-NH-CO-(CH2)n-C0-、-NH-(CH2)n-S-S-(CH2)n-C0-、-Gly-、-Gly-Phe-Lau-Gly-或-Gly-Gly- ；R11 为-NH-(CH2)n -，上述 η 为 1 12。
3.根据权利要求1所述的聚苹果酸前药衍生物，其特征在于所述带有活性氨基的药 物为抗肿瘤药物阿霉素、阿扎胞苷、克拉曲滨，来那度胺及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的聚苹果酸前药衍生物，其特征在于所述的带有羟基或巯基 的药物为抗肿瘤药物紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、达沙替尼、雌莫司汀、氟脲 苷、盐酸米托蒽醌、奈拉宾、链佐星，长春亲碱药物及其衍生物。
5.根据权利要求1至4任意之一所述的聚苹果酸前药衍生物，其特征在于聚苹果酸 的分子量为150(Γ200，000。
6.根据权利要求5所述的聚苹果酸前药衍生物，其特征在于聚苹果酸和IWH R5、R6取代基的单元摩尔比为0.广99。
7.根据权利要求1所述的聚苹果酸前药衍生物，其特征在于聚苹果酸与药物、抗体、 配体，增敏剂相互作用的同时用PEG修饰，可以延长药物半衰期及体内循环时间。
8.权利要求1至4任意之一所述聚苹果酸前药衍生物的制备方法，包括下述步骤(1)制备聚苹果酸载体；(2)将上述聚苹果酸载体与带有或修饰后带有活性氨基、羟基、巯基、-S-S-或腙键的 药物、抗体、配体，增敏剂等一种或多种相互作用或同时作用，在干燥的二甲基亚砜或N， N-二甲基甲酰胺中，在EDC/ HOSU作用下，冰浴反应3 6h后，在室温反应l(T48h制得带有 酰胺键、酯键的前药或相关衍生物，这些基团可单一存在也可多种同时存在。
9.权利要求1所述的聚苹果酸前药衍生物在纳米药物转运中的应用。
10.权利要求1所述的聚苹果酸前药衍生物在药物缓、控释中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有结构通式(I)所示的聚苹果酸类前药衍生物，其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自带有或修饰后带有活性氨基、羟基、巯基、-S-S-或腙键，并利用上述活性基团的反应性能够与聚苹果酸中的羧基进行反应的药物、抗体、配体、增敏剂、穿膜肽、RGD肽、生物大分子药物或聚乙二醇。本发明制备的聚苹果酸类的相关前药可直接用于药物转运体系，其降解产物为人体本身具有的物质，不会产生蓄积毒性和毒副作用，具有无毒性、无免疫原性和抗原性、生物相容性良好的特点。
文档编号A61K45/00GK101879315SQ20101025385
公开日2010年11月10日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者乔有备, 吴红, 张海涛, 李飞 申请人:中国人民解放军第四军医大学