防治单纯疱疹病毒i型或ii型感染的重组减毒活疫苗和制备方法

专利名称：防治单纯疱疹病毒i型或ii型感染的重组减毒活疫苗和制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能够防治单纯疱疹病毒I型或单纯 疱疹病毒II型感染所致疾病的基因重组减毒活疫苗和制备方法。
背景技术：
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)是一种经皮肤和粘膜密切接触传播 的病毒，包括单纯疱疹病毒I型(简称HSV-1)和单纯疱疹病毒II型(简称HSV-2)，两种 病毒具有83%以上的共同基因特征，50%以上的基因同源性。其中I型在人群的感染率可 高达80%以上，并长期潜伏于感觉神经节内，虽然大多数HSV-I感染者没有明显症状，但 少数感染者可产生终生的反复发作的面口疱疹、致盲性很高的眼内眼炎以及致命性的疱疹 性肺炎和疱疹脑炎。HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，占生殖器疱疹原发感染的90%以 上。II单纯疱疹病毒感染人类后主要引起生殖系统原发性和复发性疱疹，可以终生潜伏在 神经节内，在机体免疫力降低时复发。孕妇感染HSV-II型病毒后易发生流产，也可致胎儿 先天畸形或智力低下。新生儿在分娩时感染可导致高热、呼吸困难或中枢神经系统病变，其 中60% -70%的新生儿可能死亡。此外，有研究表明，生殖器疱疹可将艾滋病感染风险增加 2-3倍，并促进艾滋病病毒的传播。研究表明安全套并不能有效预防疱疹病毒感染，世界范 围内生殖器疱疹发病率在逐年上升，据美国最新统计数据显示，美国成人生殖器疱疹患病 率已经上升到了 16%以上，在纽约已经上升至25%以上，目前并无单纯疱疹病毒感染，尤 其是复发性感染的特效治疗方法，抗病毒药物常规用药虽能缓解一些临床症状，但不能彻 底清除体内潜伏的病毒，也不能减少复发次数，因此迫切需要开发能有效防治单纯疱疹病 毒感染的疫苗。近数十年来世界各国HSV疫苗的研究结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免 疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；新型DNA疫苗虽能同时诱导体 液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在 单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫 苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的 疫苗上市，单纯疱疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶段。病毒减毒活疫苗是最为经典的疫苗形式，这种类型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰质 炎疫苗等在人类抵抗感染性疾病的历史上发挥了不可替代的作用，为人类的健康做出了不 可磨灭的贡献。减毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一 样的感染和复制特性，但没有致病作用，此类疫苗可以有效地诱导机体产生全面的免疫应 答，相对于其它种类的疫苗而言，免疫原性强，保护效果好。传统的减毒活疫苗主要是通过连续培养筛选得到的，但这种方法耗时费力，用这 种方法很难得到致病性降低的单纯疱疹病毒毒株。近年来，研究者开始采用现代分子生物 学技术，将HSV基因组的特定基因进行敲除以获得重组株。本发明则是利用现代分子生物学技术，以Genebank中的HSV-I和HSV-2基因组参考序列(HSV-I登录号NC_001806，HSV-2 登录号NC_001798)为蓝本，通过联合敲除多个基因，筛选出了 HSV-I型和HSV-2型重组减 毒株，它们的致病能力均发生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-I和HSV-2感染所
致疾病。

发明内容
本发明的目的是提供能够预防和治疗单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II感染 所致疾病的重组减毒活疫苗及所述疫苗的制备方法。本发明涉及的单纯疱疹病毒I型重组株或单纯疱疹病毒II型重组株，均由野生型 HSV-I或野生HSV-I经过重组、筛选和纯化得来的。所采用的技术方案是取水泡较为明显的口唇疱疹和生殖器疱疹患者的水泡液，分 离鉴定出野生型HSV-I和HSV-2 ；扩大培养后提取病毒完整基因组；和含有荧光表达基因及 拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的同源侧翼序列的穿梭载体共同转染Vero 细胞；在荧光显微镜下使用一种或者联合使用多种荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病 毒，经过空斑纯化后可获得所需要的重组减毒活疫苗。可以获得一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，特征是敲除了其基因组中 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-1 重组株。可以获得一种其上所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，在于联合敲除 了其基因组中的UL43到UL4之间的基因片段和其它复制或感染非必需基因片段的HSV-I 重组株；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9、US10、US11、US12基因，UL55、UL56 到左侧RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因或三者的任意组合。可以获得一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，特征是敲除了其基因组中 的US2、US3、US4和US5基因的HSV-I重组株。可以获得一种如上所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，在于联合敲除 了其基因组中的US2、US3、US4、US5基因和其它复制或感染非必需基因片段的HSV-I重组 株；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USll、US12基因，UL55、UL56到左 侧RL2、RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意组合。可以获得一种单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，特征是敲除了其基因组 中的 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-2 重组株。可以获得一种如上所述的单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，在于联合敲 除了其基因组中的UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因和其它复制或感染非必需基因片段 的HSV-2重组株所述其它复制或感染非必需基因片段是US9、US10、US11、US12基因，UL55 UL56到左侧RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因，或者上述三者的任意组合。可以获得一种单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，特征是敲除了其基因组 中的US2、US3、US4和US5基因的HSV-2重组株。可以获得一种如上所述的单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，在于联合敲 除了其基因组中的US2、US3、US4、US5基因和其它复制或感染非必需基因片段的HSV-2重 组株；所述其它复制或感染非必需基因片段是US9、US10、USll、US12基因，UL55、UL56到左 侧RL2和RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意组合。
用类似的方法在上述重组株的基础上可进一步敲除其它如基因获得致病性进一 步减低的重组株。作用在小鼠身上可证明，上述的重组株病毒致病能力均有不同程度的减弱，可以 保护小鼠免受致死量单纯疱疹病毒I型或II型的攻击；作用在豚鼠身上证明重组株可以预 防和治疗豚鼠生殖器疱疹。上述重组株可以作为重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗以防治单纯 疱疹病毒感染所致相关疾病。本发明用以构建同源重组穿梭质粒的pShuttle-CMV质粒购自Stragene公司，序 列和物理图谱见该公司的产品目录。本发明所用荧光标记基因是绿色荧光蛋白表达盒和红色荧光蛋白表达盒。本发明的有益效果相比传统疫苗而言，本发明制备的减毒活疫苗均是经过基因 工程重组后的减毒活疫苗，不易发生毒力回复，其它生物学特性和野生型单纯疱疹病毒相 似，但进入机体后仅能刺激机体产生免疫应答而无致病作用，具有良好的安全性；本疫苗保 留了单纯疱疹病毒I型或II型的大部分抗原，具有较高的免疫原性，能很好地模拟野生型 HSV-I或HSV-2，有效地诱导机体粘膜和体液免疫应答，构建机体抵抗疱疹感染的第一道防 线，降低人群发病率；激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，有可能清除已感染病毒， 控制疱疹的复发和传播。


图1重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗的构建策略示意图；图2重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSHOlL结构示意图；图3重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSHOILS结构示意图；图4重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSH01S1结构示意图；图5重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSH01SS结构示意图；图6重组单纯疱疹病毒减毒II型活疫苗JSH02L结构示意图；图7重组单纯疱疹病毒减毒11型活疫苗JSH02LS结构示意图；图8重组单纯疱疹病毒减毒II型活疫苗JSH02S1结构示意图；图9重组单纯疱疹病毒减毒II型活疫苗JSH02SS结构示意图；图10重组单纯疱疹病毒减毒I I型活疫苗JSH02LR结构示意图；图11重组单纯疱疹病毒减毒11型活疫苗JSH02RS结构示意图。
具体实施例方式本发明技术方案中单纯疱疹病毒I型或II型重组减毒活疫苗的总体构建策略参 见附图1。提取野生型HSV-I和HSV-2完整基因组；构建含有绿色或红色荧光表达基因及 拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的侧翼序列的同源重组穿梭载体，二者共同 转染Vero细胞，在荧光显微镜下挑选表现相应颜色荧光的重组病毒，经过空斑纯化后可获 得敲除了 HSV-I或HSV-2重组减毒活疫苗。其中敲除了HSV-I UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因的 HSV-1 重组株，命名为 JSHOlL ；敲除了HSV-I UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-1 重组株，命名为JSHOlLS。
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敲除了HSV-1US2、US3、US4、US5 基因的 HSV-1 重组株，命名为 JSHOlS ；敲除了HSV-1US2、US3、US4、US5 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-I 重组株，命 名为 JSH01SS。敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因的 HSV-2 重组株，命名为 JSH02L ；敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 和 US9、US10、US11、US12 基因的 HSV-2 重组株，命名为JSH02LS。敲除了HSV-2US2、US3、US4、US5 基因的 HSV-2 重组株，命名为 JSH02S ；敲除了HSV-2US2、US3、US4、US5 和 US9、US10、US11 US12 基因的 HSV-2 重组株，命 名为 JSH02SS。用类似的方法在上述重组株的基础上可进一步敲除其它如基因获得致病性进一 步减低的重组株。实施例1重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSHOlL构建1.分离野生型HSV-I和HSV-2(1)取临床HSV感染的病人疱疹液和分泌物，加入ImlPBS缓冲液后用0. 45微米滤
器过滤ο(2)取一个六孔板，每孔传2 X IO5个Vero细胞，在5个孔内每孔加入200微升病 毒过滤液，一个孔留作对照。(3)放入37°C二氧化碳培养箱中培养48-72小时后观察孔内细胞病变效应(CPE)。(4)待六孔板孔内细胞出现完全CPE后将培养基和细胞一起收入离心管中。(5)将离心管在37°C -负80°C下冻融3次，5000转离心10分钟后将上清转入2ml EP管中，放入负80°C冰箱中备用。(6)自EP管中取200微升病毒液，利用HSV分型鉴定引物分型，分离一株HSV-I和 一株 HSV-2。2.提取HSV-I基因组(1)感染前一天，胰酶消化并计数vero细胞，每个IOcm平皿接种3 X IO6细胞，补 足IOmL含血清正常细胞生长培养液。(2)感染当天，确认细胞达到80-90%融合。加原始HSV-I病毒粗体液100微升 (如果已知滴度则按MOI = 10)到细胞中，蜗旋平皿轻轻混勻。(3)在37°C C02培养箱培养，直到80-90%的细胞出现圆缩(一般感染后2_3天)。(4)用吸管轻轻吹打平皿，将细胞和培养基一起转移至无菌15mL离心管中， 于-80°C 30分钟，然后在37°C水浴15分钟解冻。重复此步骤三次，3000转离心15min。(5)收集上清液于-80°C保存。(6)0. 45微米过滤后加保护剂保存于-80°C。若需要长期保存，则加入10%甘油， 置于-80°C。HSV-I在4°C保存时滴度下降比较快，所以HSV-I应该分装保存在一 80°C，每 次使用时取出实验所需量，一次用完，无需反复冻溶，既能保证每次使用的滴度，又能大大 降低HSV-I被污染的机率。(7)取300微升病毒液加入700微升高纯水，加入10微升蛋白酶K、10%的SDS50 微升(使终浓度分别稀释为蛋白酶K的100倍稀释、SDS的50倍稀释)混勻。37°C水浴过 夜。
(8)加入同体积的酚12000rpm离心5min。收集上层液体。一般情况下抽提2_3
次，至无蛋白析出。(9)加入同体积的酚氯仿异戊醇(即500微升氯仿异戊醇、500微升酚)12000rpm 离心5min抽提2-3次，收集上层液体。(10)加入4°C预冷的十分之一体积的乙酸钠、2. 5倍体积的-20°C预冷的无水乙 醇，-20°C沉淀30min或过夜。(11) 12000rpm 4°C离心 15min。弃上清。(12) lml4°C预冷的 70% 乙醇洗 1-2 遍，12000rpm 4°C离心 5min。(13)弃上清，自然干燥或37°C干燥。3.构建同源重组穿梭载体pShuttle-01L-GFP。(1)参考NCBI上登录号为NC_001806的HSV-1基因组UL区UL43 UL47的序列， 分别设计UL43基因的左侧侧翼序列和UL47基因的右侧侧翼序列的扩增引物。(2)UL43侧翼序列的引物设计在UL43左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在UL43 左侧翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环 后回收目的条带。(3) UL47侧翼序列的引物设计UL47右侧翼序列上游引物5，末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，UL47 右侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回 收目的条带。 (4) PCR扩增GFP表达质粒pLK0_GFP (由本公司自己构建)上的GFP表达盒，上游 引物5’末端添加AseI位点和三个保护碱基，下游引物的5’末端添加PmeI位点和三个保 护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR产物，回收备用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切UL47侧 翼序列PCR产物，回收酶切产物。(7)分两步将步骤(5)和(6)中回收的产物克隆至pShuttle-CMV载体上后即构建 成功 pShuttle-01L-GFP。4.同源重组生产HSV-I重组株JSHOlL(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-OlL-GFP质粒。(2)用脂质体2000将HSV-I基因组和pShuttle-01L_GFP质粒共转染至vero细 胞。(3)在倒置荧光显微镜下将绿色CPE处的细胞吸出，转移至含有IML培养基的EP管中。(4)将EP管在_80°C和37°C反复冻融三次。(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微 镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-I敲除株JSH01L，参见附图2。(6)用Vero细胞增殖后用TCID50法测定滴度实验操作
(6. 1)收集一瓶Vero细胞，计数。(6. 2)用 DMEM 2%准备 20ml 105/ml 细胞。(6. 3)用12道排枪在2块96孔板中每孔加入IOOul细胞悬液。(6. 4)稀释病毒液，在第1管中加入0. 9ml DMEM 2%，其余加入1. 8ml。(6. 5)在第1管中再加入0. Iml病毒保存液。(6. 6)换用新枪头，上下吸打5次混勻。(6. 7)从第1管中吸取0. 2ml加入第2管中。(6.8)反复稀释至最高稀释度。(6. 9)用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。(6. 10)最后8个稀释液加入96孔板，每孔0. 1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对 照。阴性对照孔中加入0. Iml DMEM 2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。(6. 11)37 °C 培养 10 天。(6. 12) 10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点 或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。(6. 13)计算每一排中出现阳性的孔数。如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良 好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。按照下述公式计 算滴度=T = 101+d(S-0. 5) IU/ml，其中d = LoglO稀释倍数，S =从第一次稀释起的阳性比 率之和，2次平行实验得到的滴度值应相差< 10°_7。实施例2重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSHOlL的致病能力减低1.实验材料野生型单纯疱疹病毒I型用Vero细胞扩增后测定滴度，滴度约为1 X 109IU/ml ；重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSHOlL 用Vero细胞扩增后滴度约为1 X IO9IU/ ml ；普通级别实验小白鼠30只，雌性，体重20 土 2g，每一只都在其身体的不同部位做 好标记，在将相应标记转化为1-30共30个阿拉伯数字，按随机化原则分为10只/组，分为 对照组、正常剂量组和高剂量组三组。2.实验操作经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱疹病毒I型20微升，正常剂量组给予20 微升JSH01L，高剂量组给予100微升JSH01L，观察小鼠情况。3.结果对组组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡，死 亡率为100% ；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，这说明和野生型相比，JSHOlL几乎没 有致病能力。实施例3活疫苗JSHOlL对小鼠的免疫保护实验1.实验材料野生型单纯疱疹病毒I型用Vero细胞扩增HSV-I后测定滴度，滴度约为 lX109IU/ml ；重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSHOlL 用Vero细胞扩增后滴度约为1 X IO9IU/ ml ；正常细胞裂解液培养皿中正常培养的Vero细胞刮下后在-80°C和37°C反复冻融后过滤。普通级别实验小白鼠30只，雌性，体重20 土 2g，每一只都在其身体的不同部位做 好标记，在将相应标记转化为1-30共30个阿拉伯数字，按随机化原则分为15只/组，分为 阴性组和阳性组共两组。2.免疫及攻毒方案免疫剂量=IO7TCID5tl重组病毒；途径鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-1 进行攻击试验，计算小鼠死亡率，确定保护效果。3.操作步骤(1)小鼠随机分组后阴性对照组经鼻腔滴注途径给于50微升正常细胞裂解液；阳 性组同样方法给于50微升JSH01L，观察小鼠情况。(2)第5周，攻毒实验；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-I 病毒(含 IO8IU)。2)小鼠腹腔内注射HSV-10. lml。3)观察小鼠情况结果小鼠攻毒后阴性组死亡情况。攻毒后第5d开始出现死亡情况，第13后全部 死亡，阳性组存活。阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量单纯疱疹病毒I型攻击。实施例4重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSHOILS构建JSHOILS的构建策略和方法类似实施例1，具体详述如下1.构建旧9、旧10、旧11、旧12基因联合敲除的把￥-1敲除株几!1015。(1)构建同源重组穿梭载体pShuttle-01-RED。1. 1)参考NCBI上登录号为NC_001806的HSV-1基因组的US区US9 US12的序 列，分别设计US9基因的左侧侧翼序列和US12基因的右侧侧翼序列的扩增引物。1. 2)US9侧翼序列的引物设计在US9左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在US9左 侧翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后 回收目的条带。1. 3) US12侧翼序列的引物设计US12右侧翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，US12 右侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回 收目的条带。1. 4)用 BglII 和 BamHI 双酶切 pDsredl-cl，连接，转化，得 pDsredbb 质粒。1. 5)用AseI和MluI切pDsredbb质粒，电泳回收1. 5kb片段1. 6)用NotI和PmeI酶切US9侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切US12侧 翼序列PCR产物，回收酶切产物。1. 7)将步骤1. 5)和1. 6)中回收的产物分两步克隆至pShuttIe-CMV载体后即构 建成功 pShuttle-01-RED。(2)同源重组生产HSV-I敲除株JSHOlS2. 1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-Ol-RED质粒。2. 2)用脂质体2000将HSV-I基因组和pShuttle-01-RED质粒共转染至vero细胞。2. 3)在倒置荧光显微镜下将红色CPE处的细胞吸出，转移至含有IML培养基的EP管中。2. 4)将EP管在_80°C -37°C反复冻融三次。2. 5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显 微镜下挑出红色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-I重组株JSH01S。2. 6)用Vero细胞扩增JSHOlS后提取基因组备用。2.联合应用红色和绿色荧光标记构建HSV-I重组减毒活疫苗JSH01LS—一同源重 组生产HSV-I敲除株JSHOILS(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-OlL-GFP质粒。(2)用脂质体2000将表达红色荧光JSHOlS基因组和pShuttle-OlL-GFP质粒共转 染至vero细胞。(3)在倒置荧光显微镜下将同时表现红色和绿色荧光的CPE处的细胞吸出，转移 至含有IML培养基的EP管中。(4)将EP管在_80°C -37°C反复冻融三次。(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微 镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-I重组株JSH01LS，参见附图3。实施例5重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01LS的致病能力减低1.实验材料野生型单纯疱疹病毒I型用Vero细胞扩增HSV-I后测定滴度，滴度约为 lX109IU/ml ；重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01LS 用Vero细胞扩增后滴度约为1 X IO9IU/ ml ；普通级别实验小白鼠30只，雌性，体重20 土 2g，每一只都在其身体的不同部位做 好标记，在将相应标记转化为1-30共30个阿拉伯数字，按随机化原则分为10只/组，分为 对照组、正常剂量组和高剂量组三组。2.实验操作 经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱疹病毒I型20微升，正常剂量组给予20 微升JSH01LS，高剂量组给予100微升JSH01LS，观察小鼠情况。3.结果对照组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡，死 亡率为100% ；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，死亡率是0，这说明和野生型相比， JSHOILS几乎没有致病能力。实施例6活疫苗JSH01LS对小鼠的免疫保护实验1.实验材料野生型单纯疱疹病毒I型用Vero细胞扩增HSV-I后测定滴度，滴度约为 lX109IU/ml ；重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01LS 用Vero细胞扩增后滴度约为IX IO9IU/ ml ；正常细胞裂解液培养皿中正常培养的Vero细胞刮下后在-80°C和37°C反复冻融后过滤。普通级别实验小白鼠30只，雌性，体重20 土 2g，每一只都在其身体的不同部位做 好标记，在将相应标记转化为1-30共30个阿拉伯数字，按随机化原则分为15只/组，分为 阴性组和阳性组。2.免疫及攻毒方案免疫剂量107TCID50重组病毒；途径鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-I 进行攻击试验，计算小鼠死亡率，确定保护效果。3.操作步骤(1)小鼠随机分组后，阴性对照组经鼻腔滴注途径给于50微升正常细胞裂解液； 阳性组同样方法给于50微升JSH01LS，观察小鼠情况。(2)第5周，攻毒实验；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-1 病毒(含 IO8IU)。2)小鼠腹腔内注射HSV-10. lml。3)观察小鼠情况4.结果小鼠攻毒后阴性组死亡情况。攻毒后第5天开始出现死亡情况，第13后 全部死亡，死亡率为100% ；阳性组全部存活，死亡率是0。阳性组和阴性组差别显著，疫苗 可抵抗致死量病毒攻击。实施例7重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01S1的构建1.构建同源重组穿梭载体pShuttle-01S-GFP。(1)参考NCBI上登录号为NC_001806的HSV-I基因组US区US2 US5的序列，分 别设计US2基因的左侧侧翼序列和US5基因的右侧侧翼序列的扩增引物。(2) US2侧翼序列的弓丨物设计在US2左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在US2左 侧翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后 回收目的条带。(3)US5侧翼序列的引物设计US5右侧翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，US5右 侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收 目的条带。(4) PCR扩增GFP表达质粒pLK0_GFP (由本公司自己构建)上的GFP表达盒，上游 引物5’末端添加AseI位点和三个保护碱基，下游引物的5’末端添加PmeI位点和三个保 护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR产物，回收备用。(6)用NotI和PmeI酶切US2侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切US5侧翼 序列PCR产物，回收酶切产物。(7)分两步将1. 5)和1. 6)步骤中回收的产物克隆至pShuttle_CMV载体上即构建 成功 pShuttle-01 S-GFP。2.同源重组生产HSV-I敲除株JSH01S1(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-OlS-GFP质粒。
(2)用脂质体2000将HSV-I基因组和pShuttle-OlS-GFP质粒共转染至vero细 胞。(3)在倒置荧光显微镜下将绿色CPE处的细胞吸出，转移至含有IML培养基的EP管中。(4)将EP管在_80°C -37°C反复冻融三次。(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微 镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-I敲除株JSH01S1，参见附图4。实施例8重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01S1的复制感染能力减低1.实验材料野生型HSV-I，JSHOlSi, Vero细胞，六孔板。2.实验方法六孔板内每孔传入5 X IO5个Vero细胞，培养24小时，按感染复数 (MOI) 0. 1和1分别用野生型HSV-I和JSH01S1感染六孔板其中四孔，剩余两个孔做为对照， 观察病毒感染孔细胞病变效应产生情况。3.结果预期野生型HSV-148小时至72小时左右完全产生CPE，而JSH01S1在6 到7天左右方可产生完全CPE，说明重组株JSH01S1相对于野生型HSV-I而言复制和感染能 力明显降低。实施例9重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSHOISl的致病能力减低1.实验方法和实施例2所用方法相同，经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱 疹病毒I型20微升，正常剂量组给予20微升JSH01S1，高剂量组给予100微升JSH01S1，观 察小鼠情况。2.结果预期对照组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死 亡，死亡率为100%;正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，死亡率是0，说明和野生型相比， JSHOISl几乎没有致病能力。实施例10活疫苗JSH01S1对小鼠的免疫保护实验1.实验方法和实施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，预期阴性组攻毒后第5 天开始出现死亡情况，第13后全部死亡，死亡率为100%;阳性组全部存活，死亡率是0。预 期阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量病毒攻击。实施例11联合应用红色和绿色荧光标记构建重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗 JSHOISS1.用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取实施例4中构建的pShuttle-01-RED 质粒。2.扩增实施例7所构建的表达绿色荧光的重组型病毒JSH01S1。3.用实施例1中基因组提取方法提表达绿色荧光的重组型病毒JSH01S1的基因组。4.用脂质体2000将JSH01S1基因组和pShuttle_01-RED质粒共转染至vero细 胞。5.在倒置荧光显微镜下将同时表现红色荧光和绿色荧光的CPE处的细胞吸出，转 移至含有IML培养基的EP管中。6.将EP管在_80°C -37°C反复冻融三次。7.将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微镜下挑出同时表现红色荧光和绿色荧光的空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-I敲除株 JSHOlSSo参见附图5。实施例12重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSHOISS的致病能力减低实验方法和实施例2所用方法相同，经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱疹 病毒I型20微升，正常剂量组给予20微升JSH01SS，高剂量组给予100微升JSH01S1，观察 小鼠情况。结果预期对组组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡， 死亡率为100% ；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，死亡率是0，这说明和野生型相比， JSHOISS几乎没有致病能力。实施例13活疫苗JSH01SS对小鼠的免疫保护实验实验方法和实施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，预期阴性组攻毒后第5天 开始出现死亡情况，第13后全部死亡，死亡率为100%;阳性组全部存活，死亡率是0。预期 阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量病毒攻击。实施例14重组单纯疱疹病毒II型减毒活疫苗JSH02L构建1.按照实施例1中HSV-I基因组提取方法提取HSV-2基因组。2.构建同源重组穿梭载体pShuttle-02L_GFP。(1)参考NCBI上登录号为NC_001798的HSV-2基因组的UL43-UL47的序列，分别 设计UL43基因的左侧侧翼序列和UL47基因的右侧侧翼序列的扩增引物。(2)UL43侧翼序列的引物设计在UL43左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在UL43 左侧翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环 后回收目的条带。(3)UL47侧翼序列的引物设计UL47右侧翼序列上游引物5，末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，UL47 右侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回 收目的条带。(4) PCR扩增GFP表达质粒pLK0_GFP (由本公司自己构建)上的GFP表达盒，上游 引物5’末端添加AseI位点和三个保护碱基，下游引物的5’末端添加PmeI位点和三个保 护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR产物，回收备用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切UL47侧 翼序列PCR产物，回收酶切产物。(7)分两步将步骤2. 5)和2. 6)中回收的产物克隆至pShuttle-CMV载体即构建成 功 pShuttle-02-GFP。3.同源重组生产HSV-2敲除株JSH02L(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-02L_GFP质粒。(2)用脂质体2000将HSV-2基因组和pShuttle-02L_GFP质粒共转染至vero细 胞。(3)在倒置荧光显微镜下将绿色CPE处的细胞吸出，转移至含有IML培养基的EP管中。(4)将EP管在_80°C和37°C反复冻融三次。(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微 镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-I敲除株JSH02L(图6)。(6)用Vero细胞增殖后用TCID5tl法测定滴度。实施例15应用绿色和红色荧光标记构建HSV-2重组减毒活疫苗JSH02LSJSH02LS的构建策略和方法类似先前的JSH01LS的构建方法，具体详述如下1.构建US9、US10、US11和US12基因联合敲除的HSV-2重组株JSH02S。(1)构建同源重组穿梭载体pShuttle-02-RED。1. 1)参考NCBI上登录号为NC_001798的HSV-2基因组的US区US9-US12的序列， 分别设计US9基因的左侧侧翼序列和US12基因的右侧侧翼序列的扩增引物。1. 2)US9侧翼序列的引物设计在US9左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在US9左 侧翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后 回收目的条带。1. 3) US12侧翼序列的引物设计US12右侧翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，US12 右侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回 收目的条带。1. 4)用 BglII 和 BamHI 双酶切 pDsredl-cl，连接，转化，得 pDsredbb 质粒。1. 5)用AseI和MluI切pDsredbb质粒，电泳回收1. 5kb片段1. 6)用NotI和PmeI酶切US9侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切US12侧 翼序列PCR产物，回收酶切产物。1. 7)分两步将1. 5)和1. 6)步骤中回收的产物克隆至pShuttle-CMV载体后即构 建成功 pShuttle-012-RED。(2)同源重组生产HSV-2敲除株JSH02S2. 1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-02L-RED质粒。2. 2)用脂质体2000将HSV-2基因组和pShuttle_02L-RED质粒共转染至vero细 胞。2. 3)在倒置荧光显微镜下将红色CPE处的细胞吸出，转移至含有IML培养基的EP管中。2. 4)将EP管在_80°C -37°C反复冻融三次。2. 5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显 微镜下挑出红色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-2敲除株JSH02S。2. 6)用Vero细胞扩增JSH02S后提取基因组备用。2.构建HSV-2重组减毒活疫苗JSH02LS——同源重组生产HSV-2敲除株JSH02LS(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-02L_GFP质粒。(2)用脂质体2000将JSH02S基因组和pShuttle-02L_GFP质粒共转染至vero细 胞。
(3)在倒置荧光显微镜下将绿色CPE处的细胞吸出，转移至含有IML培养基的EP管中。(4)将EP管在_80°C和37°C反复冻融三次。(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微 镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-2敲除株JSH02LS，参见附图7。实施例16重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH02S1的构建1.构建同源重组穿梭载体pShuttle-02S_GFP。(1)参考NCBI上登录号为NC_001798的HSV-2基因组的US2-US5的序列，分别设 计US2基因的左侧侧翼序列和US5基因的右侧侧翼序列的扩增引物。(2)US2侧翼序列的引物设计在US2左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在US2左 侧翼序列下游引物的5’末端添加Pmel、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后 回收目的条带。(3)US5侧翼序列的引物设计US5右侧翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，US5右 侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收 目的条带。(4) PCR扩增GFP表达质粒pLK0_GFP (由本公司自己构建)上的GFP表达盒，上游 引物5’末端添加AseI位点和三个保护碱基，下游引物的5’末端添加PmeI位点和三个保 护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR产物，回收备用。(6)用NotI和PmeI酶切US2侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切US5侧翼 序列PCR产物，回收酶切产物。(7)将上述步骤(5)和(6)中回收的产物分两步克隆至pShuttle-CMV载体后即构 建成功 pShuttle-02S-GFP。2.同源重组生产HSV-2敲除株JSH02S1(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-02S_GFP质粒。(2)用脂质体2000将HSV-2基因组和pShuttle-02S_GFP质粒共转染至vero细 胞。(3)在倒置荧光显微镜下将绿色CPE处的细胞吸出，转移至含有IML培养基的EP管中。(4)将EP管在-80°C -37°C反复冻融三次。(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微 镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-2敲除株JSH02S1，参见附图8。实施例17联合应用绿色和红色荧光标记构建重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗 JSH02SS1.用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-02-RED质粒。2.提取实施例16中构建的重组病毒JSH02S1基因组，用脂质体2000将JSH02S1 基因组和pShuttle-02-RED质粒共转染至vero细胞。
3.在倒置荧光显微镜下将同时表现红色和绿色荧光的CPE处的细胞吸出，转移至 含有IML培养基的EP管中。4.将EP管在_80°C -37°C反复冻融三次。5.将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显 微镜下挑出同时表现红色和绿色荧光的空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-2敲除株 JSH02SS，参见附图9。实施例18重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH02S1和JSH02SS的复制感染能力减 低实验材料野生型HSV-2，JSH02S1, JSH02SS, Vero细胞，六孔板。实验方法六孔板内每孔传入5X IO5个Vero细胞，培养24小时，按感染复数 (MOI)O. 1和1分别用野生型HSV-2、JSH02S1和JSH02SS感染孔内细胞，观察病毒感染孔细 胞病变效应产生情况。结果预期野生型HSV-2 48小时至72小时左右完全产生CPE，而JSH02S1和 JSH02SS在6到7天左右方可产生完全CPE，说明重组株JSH02S1和JSH02SS相对于野生型 HSV-2而言复制和感染能力明显降低。实施例19重组单纯疱疹病毒II型活疫苗的致病性减弱1、实验材料 野生型单纯疱疹病毒II型用Vero细胞扩增HSV-2后测定滴度，滴度约为 lX107IU/ml ；重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS 用Vero细 胞扩增后将滴度均调整约为IX 107IU/ml ；普通级别实验小白鼠50只，雌性，体重20 土 2g，每一只都在其身体的不同部位做 好标记，在将相应标记转化为1-50共50个阿拉伯数字，按随机化原则分为10只/组，分为 对照组、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 组。2、实验操作经腹腔注射途径给予对照组野生型单纯疱疹病毒II型200微升，其它组分别给予 200 微升 JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS，观察小鼠情况。3、结果预期对组的小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡， 其它组小鼠存活，JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS的致病性均减弱。实施例20重组单纯疱疹病毒II型活疫苗对小鼠的免疫保护实验1.实验材料野生型单纯疱疹病毒II型和重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗同上述实施例。正常细胞裂解液培养皿中正常培养的Vero细胞刮下后在-80°C和37°C反复冻融 后过滤。普通级别实验小白鼠50只，雌性，体重20 土 2g，每一只都在其身体的不同部位做 好标记，在将相应标记转化为1-50共50个阿拉伯数字，按随机化原则分为10只/组，分为 阴性组、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 组。2.免疫及攻毒方案免疫剂量106TCID50重组病毒；途径鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-2 进行攻击试验，计算小鼠死亡率，确定保护效果。
3.操作步骤(1)小鼠随机分组后，阴性对照组经鼻腔滴注途径给于50微升正常细胞裂解液， 其它组分别给于50微升JSH02L、JSHOlLS, JSHOISl和JSH01SS JSH02L，观察小鼠情况。(2)第5周，攻毒实验；1)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-2 病毒(含 IO6IU)。2)小鼠腹腔内注射HSV-20. Iml。3)观察小鼠情况4、结果阴性对照组小鼠攻毒后第5天开始出现死亡情况，第13后全部死亡，其它 组全部存活。其它组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量病毒攻击。实施例21重组单纯疱疹病毒II型活疫苗对豚鼠生殖器疱疹的免疫保护实验1、实验材料野生型单纯疱疹病毒II型用Vero细胞扩增HSV-2后测定滴度，滴 度约为1 X 107IU/ml ；重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS 用Vero细胞扩增后将滴度均调整约为IX 107IU/ml ；普通级别实验豚鼠50只，雌性，体重275 土 5g，每一只都在其身体的不同部位做 好标记，在将相应标记转化为1-50共50个阿拉伯数字，按随机化原则分为10只/组，分为 对照组、JSH02L、JSH02LS、JSH02S1 和 JSH02SS 组。2、免疫及攻毒方案免疫剂量=IO5TCID5tl重组活疫苗；途径鼻腔滴注，在0周实施初次免疫，2周(14 天)以后进行加强免疫一次，再过两周以后，即第5周(35天)用野生型HSV-2进行攻击试 验，计算豚鼠外阴皮损累计积分，确定保护效果。3、操作步骤(1)第0周，初次免疫豚鼠随机分组后阴性对照组经鼻腔滴注途径给于50微升 细胞裂解液；阳性组同样方法分别给于50微升JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS，观察 豚鼠情况。(2)第2周，加强免疫阴性对照组经鼻腔滴注途径给于100微升细胞裂解液；阳 性组同样方法给于100微升JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS，观察豚鼠情况。(3)第5周，攻毒实验；1)用棉签蘸生理盐水擦洗豚鼠外阴。2)用ImL注射器配上灌胃针头吸取0. 2mlHSV_2病毒(含IO6IU)。3)将针头伸入阴道内阴道穹隆后将病毒液注入，缓慢退出。4)用明胶海棉塞住阴道维持病毒液体24h。豚鼠出现症状红肿、起疱、溃疡、结痂。评分标准0无症状0.5，仅轻微红肿；1.0，红肿明显，无水疱；1. 5，单个小水疱(彡2mm)；2. 0，单个大水疱(> 2mm)；2. 5，多个小水疱和/或阴道溃疡(出血)；
3.0，多个大水疱；3. 5，严重外阴肿胀；4.0，多个小/大疤融合；4. 5，后肢瘫痪；5.0，外阴溃疡，后肢瘫痪4、实验结果预期攻毒后阴性对照组发病情况攻毒后3天全部出现初发感染症状，大约6 7 天，豚鼠皮损程度最严重，逐渐减轻，第10天后基本消失。中间偶有豚鼠病重死亡。初次发 病后13天后出现复发感染，整体评分较大；各阳性组预期偶有豚鼠出现轻微红肿症状，无 其它明显症状，整体评分较小。阳性组和阴性组差别显著，疫苗可预防生殖器疱疹。实施例22重组单纯疱疹病毒II型活疫苗对豚鼠生殖器疱疹的免疫治疗实验1、实验材料同上述实施例2、实验方法用HSV-2病毒攻击豚鼠后第5天，将豚鼠随机分为5组，分别经鼻腔 途径给予JSH02L、JSH02LS、JSH02S1和JSH02SS各50微升；第一次免疫治疗后的14天，同 途径和剂量进行第二次免疫治疗，两周后再免疫一次，待豚鼠初发感染症状消退后用紫外 灯照射豚鼠外阴10分钟以诱发复发感染，观察豚鼠复发情况，计算皮损指数。3、实验结果预期给药后对照组复发症状明显，评分较大，各阳性组复发症状轻 微，评分较小，本疫苗在豚鼠身上对复发型生殖器疱疹有一定的治疗作用，可以减轻复发症 状。实施例23致病性进一步减低的重组单纯疱疹病毒I型和II型活疫苗的构建用构建JSHlSS和JSH02SS类似的方法进一步敲除重组单纯疱疹病毒I型或II型 基因组上其他复制或感染非必需的US9到US12之间的基因片段(US9、US10、USll和US12 基因)，UL55到左侧RLl基因之间的基因片段(包含UL55、UL56、RL2和RLl基因)，US2到 US5之间的基因片段(包含US2、US3、US4、US5基因)，UL43到UL47基因之间的基因片段 (包含UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因)或其任意组合基因片段，以构建致病性进一 步减低的重组单纯疱疹病毒I型或II型活疫苗，设计欲敲除基因片段两侧的侧翼序列的引 物，扩增出约700bp至2000bp左右的侧翼序列，将700bp至2000bp左右的侧翼序列和空斑 筛选标记基因克隆至pShuttle-CMV载体，使空斑筛选标记基因位于两侧侧翼序列之间，和 野生型或重组型重组单纯疱疹病毒I型或II型基因组共转染至Vero细胞中，进行同源重 组，空斑纯化筛选出重组致病性进一步减低的重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗如JSH02LR，参 见附图10和JSH2RS，参见附图11等。
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权利要求
一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因组中UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因。
2.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于联合 敲除了其基因组中的UL43到UL47的基因片段和其它复制或感染非必需基因片段；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到 左侧RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因或三者的任意组合。
3.一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因组中的US2、 US3、US4 禾口 US5 基因。
4.一种如权利要求3所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于联合 敲除了其基因组中的US2、US3、US4、US5基因和其它复制或感染非必需基因片段；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到 左侧RL2、RL1基因，UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因，或者上述三者的任意组合。
5.一种单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因组中的 UL43、UL44、UL45、UL46、UL47 基因。
6.一种如权利要求5所述的单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，其特征在于联 合敲除了其基因组中的UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因和其它复制或感染非必需基因片 段所述其它复制或感染非必需基因片段是US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到左 侧RL2和RLl基因，US2、US3、US4、US5基因，或者上述三者的任意组合。
7.—种单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因组中的 US2、US3、US4 禾口 US5 基因。
8.—种如权利要求7所述的单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，其特征在于联合 敲除了其基因组中的旧2、旧3、旧4、到旧5基因和其它复制或感染非必需基因片段；所述其它复制或感染非必需基因片段是US9、US10、USl 1、US12基因，UL55、UL56到左 侧RL2和RLl基因，UL43、UL44、UL45、UL46到UL47基因，或者上述三者的任意组合。
9.一种如权利要求1、2、3、4所述的单纯疱疹病毒I型或者如权利要求5、6、7、8所述的 单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于步骤一取疱疹患者的水泡液，分离鉴定出野生型单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒 II型；步骤二 扩大培养后提取病毒完整基因组，设计引物扩增出拟定敲除的基因片段的左 右两侧700bp至2000bp的同源侧翼序列；步骤三将步骤二所述同源侧翼序列和荧光蛋白基因克隆至PShuttle-CMV载体，使荧 光蛋白基因位于同源侧翼序列之间，再和野生型或重组型单纯疱疹病毒I型或II型基因组 共转染至Vero细胞中，进行同源重组；步骤四在荧光显微镜下使用一种或者联合使用多种荧光蛋白基因作为标记挑选出重 组病毒；经过空斑纯化后可获得单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫田ο
全文摘要
本发明提供一种防治单纯疱疹病毒I型或II型感染的重组减毒活疫苗和制备方法，该重组减毒活疫苗在于敲除了其基因组中UL43、UL44、UL45、UL46、UL47基因；该方法包括分离鉴定出野生型单纯疱疹病毒；扩大培养后提取病毒完整基因组，设计引物扩增出拟定敲除的基因片段的同源侧翼序列；将同源侧翼序列和荧光蛋白基因克隆至pShuttle-CMV载体，进行同源重组；使用荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病毒；经过空斑纯化后可获得单纯疱疹病毒基因重组减毒活疫苗。本发明制备的减毒活疫苗均是经过基因工程重组后的减毒活疫苗，不易发生毒力回复，其它生物学特性和野生型单纯疱疹病毒相似。
文档编号A61P31/22GK101926992SQ20101025360
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者刘景伟 申请人:郑州金森生物科技工程有限公司