专利名称：与存在于人巨细胞病毒gB糖蛋白的AD1区域的特定的不连续表位结合的单克隆抗体及其 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人巨细胞病毒(human Cytomegalovirus)(以下有时称为“HCMV”) 结合的单克隆抗体及其抗原结合片段。特别是涉及与HCMV的gB糖蛋白的ADl区域结合的人单克隆抗体及其抗原结合片段。
背景技术：
人巨细胞病毒(HCMV)与人疱疹病毒6型(HHV-6)、人疱疹病毒7型(HHV-7)相同， 属于疱疹病毒科β疱疹病毒亚科。直径约为180nm，在野生株中编码165个基因，其是基因组大小约为2351Λρ (非专利文献1和2、的双链DNA病毒，在疱疹病毒科中是最大的。HCMV的种属特异性强，不感染人以外的动物，但普遍感染人，在人体内与广泛的组织具有亲和性。而且，一旦感染则在宿主的免疫建立后也不被排除，会终生保持。HCMV 一旦感染则终生潜状感染，在日本人成人中9成以上已经感染HCMV并带有病毒，但在健康人中病毒活化引起疾病的情况很少见。但是，在艾滋病、癌症、器官移植后、骨髓移植后、血液透析后等免疫缺陷状态下， 该潜伏感染的HCMV产生再活化，有时会引起间质性肺炎、视网膜炎、胃肠炎、脑炎等根据情况会致死的严重的HCMV感染症(非专利文献3和4)。另外，如果胎儿期孕妇受到HCMV的原发感染，HCMV感染由孕妇经由胎盘波及至胎儿，则会引发先天性CMV感染症(congenital cytomegalovirus disease ；也称为巨细胞包涵体病或先天性巨细胞包涵体病(cytomegalic inclusion disease))，引起流产、死产、新生儿死亡。或者，不死亡的情况下有时也会引起低出生体重、肝脾肿大、黄疸、血小板减少性紫癜、小头畸形、精神发育障碍、智力发育迟缓、脉络膜视网膜炎、听觉障碍等。此外，在新生儿期或婴儿期，当来自母亲的HCMV抗体的转移不充分时，有时也会由于经产道、母乳、尿液或唾液等的HCMV感染而引发肝功能异常、间质性肺炎、单核细胞增多症等(非专利文献3、 4 禾口 5)。HCMV感染症已成为世界性的问题，正在推进能够抑制上述HCMV所致的各种病态的发病或缓和该病态的预防或治疗药的开发。近年来，作为抑制HCMV的增殖的抗病毒药， 已开发出更昔洛韦(Ganciclovir)(非专利文献6和7)、磷甲酸(i^scarnet)(非专利文献 8)、缬更昔洛韦(Valganciclovir)(非专利文献9)等。更昔洛韦在细胞内变为活性型的更昔洛韦-三磷酸，是通过与作为DNA聚合酶的底物的脱氧鸟苷-三磷酸(dGTP)竞争性地拮抗来抑制DNA聚合酶、从而妨碍病毒DNA的合成的抗病毒药，主要用于艾滋病等免疫缺陷状态下的巨细胞病毒视网膜炎的治疗、CD4淋巴细胞数为100/mm3以下的晚期HIV感染症中的巨细胞病毒视网膜炎的发病抑制，作为医药品也受到了认可。但是，有报道指出更昔洛韦等抗病毒剂具有造血障碍等各种副作用，其使用方式如上所述受到限制。作为更昔洛韦的副作用，频率最高、需要注意的是骨髄抑制伴发的血液障碍。白细胞、红细胞、血小板异常减少，作为其初期症状，可以观察到发烧、喉咙疼痛、异常疲倦、皮下出血等出血倾向。根据情况，精神神经系统可见异常，产生头痛、眩晕、失眠、思考异常、焦虑感等。另外，在动物实验中报道了致畸性、致突变性、致癌性，在妊娠中无法使用。除此之外，通过在先天性HCMV感染症的重症病例中使用更昔洛韦，具有减少神经后遗症表现和改善听力衰退的发展等效果(非专利文献10)，但关于作为更昔洛韦的副作用即骨髄抑制、致畸性、致癌性的问题，仍需要进行充分且慎重的研究。缬更昔洛韦是更昔洛韦的L-缬氨酸酯，在经口给药后通过肠道和肝脏的酯酶转换成更昔洛韦。因此，作用机制和副作用与更昔洛韦相同，存在骨髄抑制、致畸性、致癌性的问题，在日本主要作为艾滋病等免疫缺陷状态下的巨细胞病毒视网膜炎的治疗药得到了认可。另一方面，磷甲酸是焦磷酸的类似物，与DNA聚合酶的焦磷酸结合位点直接作用而抑制DNA聚合酶，由此抑制HCMV的增殖。对于耐更昔洛韦的HCMV也有效。作为主要的副作用，有恶心、贫血、血清肌酐上升、呕吐、低镁血症、低钾血症、感觉异常等，特别是出现休克、肾损害的频率高，因此需要慎重给药。在日本仅允许对艾滋病患者中确诊为HCMV视网膜炎的患者或临床上强烈疑似HCMV视网膜炎的患者使用，不能以预防感染为目的使用(非专利文献8)。由上述内容可知，迫切期望开发出能够预防上述HCMV所致的各种疾病的发病或缓和其症状、并且无副作用的药物。其中，迄今为止作为抗HCMV抗体已进行了两件临床开发，一件是专利文献3中记载的抗HCMV抗体“C23 (开发时被称为TI-23) ”，其为识别gB糖蛋白的AD2区域的抗体，另一件是专利文献4中记载的抗HCMV抗体“SDZ MSL 109”，其为识别HCMV表面的gH糖蛋白的单克隆抗体。特别是C23，据报道具有高中和活性，由空斑法求得的50%阻止浓度为0. 5 μ g/mL(非专利文献11)，但中途放弃了开发。另一方面，对于HCMV的疫苗也进行了深入的开发，但现状是尚未得到可耐临床使用的疫苗。此外，近年来，开发出人源抗CMV高效价丙种球蛋白制剂，在美国在应对肾移植伴发的HCMV感染症的发病预防方面得到认可。但是，由于抗CMV高效价丙种球蛋白制剂是人源血液制剂，因此还存在各种问题。例如，由于是人来源丙种球蛋白的混合物，因此批次间的活性存在较大偏差，且活性低，另外供给量有限，此外还常伴有未知的病原性病毒、病原体的混入等风险等。因此，能够与HCMV结合且中和其感染性(使其生物学活性丧失)的单克隆抗体 (以下有时称为“抗HCMV抗体”)，作为HCMV所致的各种病态的预防或治疗药受到期待，例如，对于免疫缺陷状态的患者，在针对因HCMV而引起的各种疾病的预防或治疗战略上非常有用。S卩，认为为了使HCMV的活性丧失从而预防疾病的发病或缓和症状，将对HCMV具有强亲和性和高中和能力、且不显示过敏反应的人源抗HCMV抗体作为所谓“抗体药物”进行给药是特别有效的。
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但是，迄今为止所报道的HCMV抑制抗体(例如，专利文献1、2、3、4和幻在对于 HCMV的亲和性和中和能力等方面是不充分的，因此无法期待充分抑制HCMV的生物活性并预防HCMV所引起的各种疾病的发病或缓和其症状。因此，迫切期望开发出作为不引起异物识别应答的人单克隆抗体、对于HCMV的亲和性、特异性和中和能力优异、可期待作为预防或治疗药应用的抗HCMV抗体及其抗原结合片段。此外，最近有文献指出为了抑制HCMV在生物体内的增殖，不仅中和活性很重要， 阻止细胞间感染也很重要(非专利文献12和13)，因而迫切期望兼具细胞间感染阻止活性的抗HCMV抗体。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特表平8-50M03号公报专利文献2 日本特表平8-506325号公报专利文献3 :W087/03602专利文献4 :W093/021952专利文献5 :W02007/094423非专利文献非专利文献 1 :Davison, A. J. et al. , The human cytomegalovirus genome revisited comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J. Gen. Virol., 2003 ；84 :pl7-28非专利文献 2 :Dolan, A. et al. , Genetic content of wild-type human cytomegalovirus. J. Gen. Virol. , 2004 ；85 :pl301_1312非专利文献3 :多屋馨子，感染症O話寸^卜j力· 口々^ > ；^感染症， Infectiou Diseases Weekly Report Japan. 2003 ；第 15週10-14# 专禾Ij JC ^ 4 Griffiths, P. D. , The treatment of cytomegalovirus infection. J. Anti. Chemo. ，2002 ；49 :p243-253非专利文献 5 :Demmler, G. J. , Congential cytomegalovirus infection and disease. Seminars in Pediatric Infection Diseases. Seminors in Pediatric Infectious Diseases, 1999 ；10 :pl95_200非专禾Ij 文献 6 :Freitas， V. R. et al. , Activity of9- (1, 3-dihydroxy-2-Propoxymethel)guanine compared with that of acyclovir against human, monkey, and rodent cytomegaloviruses. Anti. Agent Chemo. , 1985 ；28 :p240_245非专利文献7 :田辺三菱製薬株式会社、抗寸^卜 > 力‘π々4 > ^化学療法剤7 )>点滴静注用500mg、if > *々α if义製剤添付文書、(2007年10月改訂)非专利文献8 7 7卜，七才、力株式会社、抗々4 > 7剤点滴注射用‘于、7力 > 匕· ^ 24mg/mL才、7力A才、7卜f卜·J々么水和物注射剤添付文書、(2007年6月改訂)非专利文献9 田辺三菱製薬株式会社、抗寸^卜 > 力‘π々4 > ^化学療法剤八 'J今寸錠4500mg、A y ^y >7 η 义塩酸塩製剤添付文書、(2007年10月改訂)
]非专利文献 10 :Kimberlin, D. W. et al. , Effect of ganciclovir therapy onhearing in symptomatic congental cytomegalovirus disease involving the central nervous system ；randomized,controlled trial. J. Pediatr. , 2003 ；143 :16-25非专 利文 献 11 :Masuho, Τ. , et al. , Human monoclonal antibodies neutralizing human cytomegalovirus. J. Gen. Virol, 1987 ；68 :pl457_1461非专利文献 12 :Navarro、D. et al. ,Glycoprotein B of human cytomegalovirus promotes virion penetration into cells, transmission of infection from cell to cell, and fusion of infected cells. Virology, 1993 ; 197 :pl43_158非专利文献 13 :0hizumi,Y. ,Neutralizing mechanism of two human monoclonal antibodies against human cytomegalovirus glycoprotein 130/55. J. Gen. Virol., 1992 ；73 :p2705-270
发明内容
由以上可知，与HCMV特异性结合且充分抑制其生物活性的抗体或抗原结合片段， 在针对因HCMV而引起的各种疾病的治疗战略上或预防战略上非常有用。另一方面，目前作为医药品得到认可的大部分抗体药物，其给药量非常大，每天数 mg 数百mg，而且价格昂贵。除抗体医药品之外的迄今为止上市的生物医药品，大多每天的给药量为数十μ g lmg。与此相比，抗体医药品每天所需的给药量是迄今为止的生物医药品的约10倍至1000倍，差距非常大。HCMV会导致各种疾病状态，对于这些疾病的治疗， 当考虑到波及新生儿、幼儿和孕妇的可能性时，重要的课题在于活性高且治疗用量少、可较低地抑制治疗费等。即，虽为抗体药物但要求高生物活性，从医疗费等方面出发，亲和性越优异且具有越高的中和能力则作为医药品的有用性越高。另外，关于抗体医药品，虽然所需生产量大幅增加，但生产设备在世界范围内处于不足状态。从这样的状况出发，如果是亲和性和中和能力优异的抗体，则能够以更少的量发挥效果，因此期望具有更高亲和性和中和能力的人抗HCMV单克隆抗体。而且，HCMV原本在体内就对广泛的组织和细胞种类具有感染性(Sinzger，C. et al.，Curr Top Microbiol Immunol.，2008 ；325 :p63_83)，因而认为，就抗HCMV抗体显示临床效果的方面而言，重要的是，无论感染宿主细胞为成纤维细胞型和上皮细胞/内皮细胞型中的任何一种类型，均具有有效的中和活性。此外，如果考虑到HCMV在生物体内的感染扩大的方式，则期望该抗HCMV抗体不仅具有单纯的中和能力，而且还兼具阻止细胞间感染的能力。进而，如果考虑到作为医药品的有效性和安全性，则期望提供含有对于导致各种疾病状态的HCMV具有高中和能力和细胞间感染阻止能力的人源单克隆抗体及其抗原结合片段的医药组合物。本发明人为了获得如上所述的抗体进行了不懈努力，结果通过创造性的研究成功地获得了一种人单克隆抗体，该抗体可特异性识别存在于HCMV gB糖蛋白上的ADl区域中的、迄今为止未报道过的不连续表位，并且兼具高中和能力和高细胞间感染阻止能力，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及以下所述的抗HCMV单克隆抗体或其结合性片段、编码该抗体或结合性片段的DNA(多核苷酸)、含有该DNA的载体、含有该载体的宿主细胞等。[1] 一种抗体或其抗原结合片段，与人巨细胞病毒(HCMV)gB糖蛋白的ADl区域结合，其识别存在于ADl区域中的序列号25的氨基酸序列、序列号沈的氨基酸序列和序列号 27的氨基酸序列构成的不连续序列作为表位。[2] 一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体为与人巨细胞病毒(HCMV)gB糖蛋白的 ADl区域特异性结合、且能够中和其生物活性的单克隆抗体，其中，(i)重链的可变区含有(a)选自由序列号13的氨基酸序列、和序列号13的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的重链CDRl的氨基酸序列、(b)选自由序列号14的氨基酸序列、和序列号14的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的重链CDR2的氨基酸序列、和(c)选自由序列号15的氨基酸序列、序列号15的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、和序列号22所示的氨基酸序列组成的组中的重链CDR3的氨基酸序列；以及(ii)轻链的可变区含有(a)选自由序列号16的氨基酸序列、和序列号16的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDRl的氨基酸序列、(b)选自由序列号17的氨基酸序列、和序列号17的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDR2的氨基酸序列、和(c)选自由序列号18的氨基酸序列、和序列号18的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDR3的氨基酸序列。[3]如上述[2]所述的抗体或其抗原结合片段，其与由HCMV-gB糖蛋白的549 580位的连续氨基酸残基构成的氨基酸序列(序列号2 和596 640位的连续氨基酸残基构成的氨基酸序列(序列号24)的区域中存在的2个以上的不连续序列构成的表位特异
性结合。[4]如上述[2]所述的抗体或其抗原结合片段，其识别存在于HCMV-gB糖蛋白的 ADl区域中的序列号25的氨基酸序列、序列号沈的氨基酸序列和序列号27的氨基酸序列构成的不连续序列作为表位。[5]如上述[3]或[4]所述的抗体或其抗原结合片段，其含有⑴(a)包含序列号13的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列号14的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、和(c)选自由序列号22的氨基酸序列组成的组中的重链CDR3的氨基酸序列；以及(ii)(a)包含序列号16的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列号17的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、和
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(c)包含序列号18的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。[6]如上述[5]所述的抗体或其抗原结合片段，其含有⑴(a)包含序列号13的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列号14的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列号15的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；以及(ii)(a)包含序列号16的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、(b)包含序列号17的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列号18的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。[7]如上述[2]所述的抗体或其抗原结合片段，其含有(a)由序列号10的氨基酸序列、序列号10的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号10的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列构成的重链可变区 (HCVR)；以及(b)由序列号12的氨基酸序列、序列号12的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号12的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列构成的轻链可变区 (LCVR)。[8]如上述[7]所述的抗体或其抗原结合片段，其含有(a)包含序列号10的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)、和(b)包含序列号12的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。[9]如上述[2]所述的抗体或其抗原结合片段，(a)序列号2或6的氨基酸序列、序列号2或6的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号2或6的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的重链(H 链)；以及(b)序列号4或8的氨基酸序列、序列号4或8的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号4或8的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的轻链(L 链)。[10]如上述[9]所述的抗体或其抗原结合片段，其含有(a)包含序列号2或6的氨基酸序列的重链(H链)、和(b)包含序列号4或8的氨基酸序列的轻链(L链)。[11]如上述[1] [10]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，上述抗体为人单克隆抗体。[12]如上述[1] [11]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，上述抗体的类(亚类)为IgGlU)。[13]如上述[1] [12]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其对于HCMV的实验室株(AD169)在人成纤维细胞存在下的50%空斑形成阻止浓度为0. 05μ g/mL(约 0. 3nM)以下。[14]如上述[1] [13]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其在预先用 HCMV的实验室株(AD169)感染人成纤维细胞(MRC-5)的体系中，在0. 2 μ g/mL(约1. 3nM) 以下具有50%以上的细胞间感染阻止能力。[15] 一种用于预防或治疗人巨细胞病毒(HCMV)相关疾病的医药组合物，其含有上述[1] [14]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。[16]如上述[15]所述的医药组合物，其中，HCMV相关疾病为(a)免疫缺陷状态下的HCMV的再活化所致的间质性肺炎、视网膜炎、胃肠炎或脑炎；(b)HCMV感染由孕妇波及到胎儿所致的先天性CMV感染症；(c)由上述先天性CMV感染症引起的流产、死产、新生儿死亡；(d)上述先天性CMV感染症未致死亡时引起的低出生体重、肝脾肿大、黄疸、血小板减少性紫癜、小头畸形、精神发育障碍、智力发育迟缓、脉络膜视网膜炎或听觉障碍；或者(e) 在新生儿期或婴儿期因HCMV感染而发病的肝功能异常、间质性肺炎或单核细胞增多症。[17] 一种分离的核酸，其编码与HCMV gB糖蛋白的ADl区域特异性结合、且能够中和其生物活性的抗HCMV单克隆抗体或其抗原结合片段，所述核酸选自以下核酸编码选自由序列号2、4、6、8、10、12、13 18和22组成的组中的氨基酸序列的核酸、以及与该核酸在高严格条件下杂交的核酸。[18] 一种载体，其中，重组有上述[17]所述的核酸。[19] 一种宿主细胞，其中，导入有上述[18]所述的载体。[20]如上述[1] [14]中任一项所述的抗体或抗原结合片段的制作方法，其中， 包括培养上述[19]所述的宿主细胞的步骤。本发明的抗HCMV抗体、特别是与HCMV-gB糖蛋白的ADl区域特异性结合的抗体或其抗原结合片段，例如在免疫缺陷状态下，能够与导致各种疾病的HCMV特异性结合，使其生物活性丧失(中和)，从而对HCMV发挥优异的中和能力。另外，在本发明的抗HCMV-gB糖蛋白ADl抗体为人单克隆抗体的实施方式中具有如下优点无免疫原性，也未观察到免疫反应。本发明的抗HCMV抗体的一个实施方式，对于HCMV还具有较高的细胞间感染阻止能力或细胞间感染阻止活性。如果考虑到HCMV在生物体内的感染扩大的方式，则该抗HCMV 抗体不仅具有单纯的中和能力还兼具阻止细胞间感染的能力是很有利的。本发明的抗HCMV抗体或其抗原结合片段，对于HCMV具有高中和能力和阻止感染扩大的活性，而且在人单克隆抗体的实施方式中不具有免疫原性，因此认为其作为因HCMV 所引起的各种疾病的预防或治疗药是有用的，例如(a)艾滋病、癌症、器官移植后、骨髄移植后和血液透析后等免疫缺陷状态下的HCMV的再活化所致的间质性肺炎、视网膜炎、胃肠炎、脑炎等各种疾病；(b)HCMV感染由孕妇波及到胎儿所致的先天性CMV感染症；(c)由上述先天性CMV感染症引起的流产、死产、新生儿死亡；(d)上述先天性CMV感染症未致死亡时引起的低出生体重、肝脾肿大、黄疸、血小板减少性紫癜、小头畸形、精神发育障碍、智力发育迟缓、脉络膜视网膜炎或听觉障碍；(e)新生儿期或婴儿期因HCMV感染而发病的肝功能异常、间质性肺炎或单核细胞增多症等(非专利文献3、4和5)。另外，含有本发明的特别优选的人单克隆抗体的医药组合物，在极少量时即有效。
此外，近来，作为抗HCMV抗体，还进行了以gH、gL等gB糖蛋白以外的各种表面抗原为靶标的研究，但当考虑到下述(1) (3)的情况时，像本发明抗体这样，与gB糖蛋白、 特别是ADl区域特异性结合且具有高中和活性的抗体作为HCMV感染症的预防或治疗药是非常有用的。(1)有文献指出，为了抑制HCMV等在生物体内的病毒增殖，不仅中和活性很重要， 而且阻止细胞间感染也很重要(非专利文献12和13)，并且，在最近的gB糖蛋白的研究中，有文献表明，对于病毒粒子侵入细胞和细胞间感染，gB发挥了重要的作用(Isaacson， Μ.K. et al.，Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment， assembly, or egress. J. Virology，2009 ；83 :p3891_3903)，针对gB的抗体很有可能还有助于抑制细胞间感染。(2)在HCMV感染所必需的gB糖蛋白中，ADl区域对于gB的功能和立体结构的形成是必需的部分(Qadri, I. et al. ,Assembly of conformational-dependent neutralizing domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus. J. Gen. Virol, 1992 ；73 ； p2913_2921 ；禾口Britt，W. J. et al. ,Antigenic domain is required for oligomerization of human cytomegalovirus glycoprotein B. J. Virol. , 2005 ；79 :p4066_4079)，并且其在临床分离的病毒株中也是作为突变少的部分而已知的，因而针对ADl的抗体可能是广谱的抗体。(3)与AD2区域的抗体相比，对涉及gB上的较长区域的不连续表位进行识别的 ADl抗体的特异性高，因而认为与其他生物分子发生交叉反应而产生无法预料的副作用的可能性低。
图1是用流程图表示产生本发明的抗HCMV抗体的抗体产生细胞克隆的分离步骤的图。图2是对构成EV2038 CDR-H3的16个残基的氨基酸进行非保守性氨基酸取代时， 评价对于ADl的结合能力。图3是对EV2038H链的121、123、124、1 位进行保守性氨基酸取代时，评价对于 ADl的结合能力。图4是将EV2038H链的125位的脯氨酸取代成除脯氨酸和精氨酸以外的所有氨基酸时，评价对于ADl的结合能力。图5是对构成EV2038 CDR-H3的氨基酸中在上述图2的非保守性氨基酸取代时对于ADl的结合能力未降低的氨基酸残基进行保守性氨基酸取代时，评价对于ADl的结合能力。图6是在构成EV2038⑶R-H3的氨基酸中在非保守性氨基酸取代时对于ADl的结合能力降低的氨基酸残基中，以除125位的脯氨酸以外的残基(121、123、1M和1 位的共四个残基)为对象，制作共四种在两处或四处同时进行取代的变异体(两处取代体I124V/GU6A、I124V/G126S ；四处取代体L121I/W123Y/I124V/GU6A、L121I/W123Y/ I1MV/GU6S)，评价对于ADl的结合能力。图7是在构成EV2038⑶R-H3的氨基酸中在非保守性氨基酸取代时对于ADl的结合能力降低的氨基酸残基中，以除125位的脯氨酸以外的残基(121、123、1M和1 位的共四个残基)为对象，制作缺失、插入的各一种变异体(E122del和GU6_D127insE)，评价对于 ADl的结合能力。图8是EV2038⑶R-H2区域的79位的氨基酸残基的变异体对于ADl的结合能力的评价。图9中，(A)图示出在表位区域的解析中使用的gB糖蛋白ADl区域的缺失变异体的克隆，(B)是示出使用这些缺失变异体的蛋白免疫印迹分析结果的图。图10中，㈧是示出使用肽阵列的EV2038的表位·定位的结果的图。(B)中，在 gB糖蛋白的氨基酸序列上图示出上述解析结果，并且示出了使用EV2038的缺失变异体的解析结果、以及过去曾报道过的ITC52的表位序列。图11是示出本发明的抗HCMV抗体的中和活性评价结果的图表。㈧是示出在补体存在下作为阴性对照的对HCMV无特异性的人单克隆抗体(hlgG)、和作为抗ADl抗体的 EV2001(在专利文献5中公开)对于人巨细胞病毒(AD169株)的中和活性的图表；(B)是示出在补体存在下hlgG和抗HCVM单克隆抗体(EV2038和HCMV16)对于人巨细胞病毒(AD169 株)的中和活性的图表；(C)是示出在不存在补体的情况下作为阴性对照的hlgG和EV2001 对于人巨细胞病毒(AD169株)的中和活性的图表；(D)是示出在不存在补体的情况下hlgG 和抗HCMV单克隆抗体(EV2038和HCMV16)对于人巨细胞病毒(AD169株)的中和活性的图表。
具体实施例方式1.本发明的抗体或其抗原结合片段根据本申请发明的一个实施方式，提供与人巨细胞病毒(HCMV)的gB糖蛋白特异性结合且能够中和其生物活性的抗体或其抗原结合片段。在更具体的实施方式中，提供与 HCMV的gB糖蛋白的ADl区域中存在的不连续表位特异性结合、且能够中和该蛋白的生物活性的抗体或其抗原结合片段。“人巨细胞病毒(HCMV)的gB糖蛋白”(或者“HCMV gB糖蛋白”或“HCMB-gB糖蛋白”)是构成HCMV的外壳的主要糖蛋白之一，已知其有助于病毒粒子侵入细胞、细胞融合和病毒的细胞间感染。HCMV gB糖蛋白的氨基酸序列(HCMV病毒的代表株AD169株的氨基酸序列)能够从可公开利用的序列数据库(Swiss-Prot)中以登录号P06473的蛋白质的氨基酸序列(序列号137)而获得。“人巨细胞病毒(HCMV)的gB糖蛋白的ADl区域”或“HCMV gB糖蛋白ADl区域”， 是指由HCMV gB糖蛋白的氨基酸序列中552-635位的连续氨基酸残基构成的区域(Wagner 等，Journal of Virology, Vol. 66, No. 9，Sept. 1992，p. 5290—5297)。本说明书中，“表位”以本领域中通常使用的含义来使用，是指作为抗体结合的对象的、抗原分子的较小的部分结构(岩波生物学事典第4版(1996年第1次印刷发行))。根据本发明的更具体的实施方式，ADl区域中存在的不连续表位存在于由人巨细胞病毒(HCMV)gB糖蛋白的549 580位的连续氨基酸残基构成的氨基酸序列(序列号23) 和596 640位的连续氨基酸残基构成的氨基酸序列(序列号24)的区域中。更具体而言， 上述不连续表位由序列号25的氨基酸序列、序列号沈的氨基酸序列和序列号27的氨基酸
13序列构成。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有(a)包含序列号2或6的氨基酸序列的重链(H链)、和(b)包含序列号4或8的氨基酸序列的轻链(L链)；该抗体或抗原结合片段与人巨细胞病毒的gB糖蛋白特异性结合，能够中和其生物活性。或者，本发明的抗体或其抗原结合片段含有(a)包含序列号10的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)、和(b)包含序列号12的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)；该抗体或抗原结合片段与与人巨细胞病毒的gB糖蛋白特异性结合，能够中和其生物活性。或者，本发明的抗体或其抗原结合片段中，(i)重链的可变区的CDR(互补决定区，Complementarity Determining Region) 1、 ⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别含有(a)序列号13的氨基酸序列、(b)序列号14的氨基酸序列、和(c)序列号15的氨基酸序列；(ii)轻链的可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别含有(a)序列号16的氨基酸序列、(b)序列号17的氨基酸序列、和(c)序列号18的氨基酸序列，该抗体或抗原结合片段与人巨细胞病毒的gB糖蛋白特异性结合，能够中和其生物活性。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还包含与人巨细胞病毒的gB糖蛋白特异性结合且能够中和其生物活性的、上述抗体或抗原结合片段的功能性等价物，例如含有(a)序列号2或6的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、 添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号2或6的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的重链(H链)；以及(b)序列号4或8的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、 添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号4或8的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的轻链(L链)。或者，上述抗体或抗原结合片段的功能性等价物含有(a)序列号10的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号10的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列构成的重链可变区(HCVR)；以及(b)序列号12的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号12的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列构成的轻链可变区(LCVR)。或者，上述抗体或抗原结合片段的功能性等价物含有
(i)(a)选自由序列号13的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的重链CDR1、(b)选自由序列号14的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的重链CDR2、 禾口(c)选自由序列号15的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、和序列号22所示的氨基酸序列组成的组中的重链CDR3 ；以及(ii)(a)选自由序列号16的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDR1、(b)选自由序列号17的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDR2、 禾口(C)选自由序列号18的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDR3。上述功能性等价物的氨基酸序列中的突变数的上限，以是否与HCMV的gB糖蛋白特异性结合且能够中和其生物活性为指标来决定。HCMV的中和活性例如可以通过后述的实施例9和10中记载的方法来评价。另外，细胞间感染抑制能力的评价例如可以通过实施例 11所示的方法来评价。本说明书中使用的“抗体”这一用语，是指四条多肽链、即两条重(H)链和两条轻 (L)链通过二硫键相互连接而构成的免疫球蛋白分子。本申请发明中的单克隆抗体也由分别包含两条轻链(L链)和重链(H链)的免疫球蛋白分子构成。各H链由H链可变区(有时称为“HCVR”或“VH”)、H链恒定区(H链恒定区包括三个结构域，有时分别称为“CH1”、 “CH2”、“CH3”(总称CH))构成。各L链由L链可变区(有时称为“LCVR”或“八”)和L链恒定区(L链恒定区包括一个结构域，有时称为“CJ)构成。特别是HCVR和LCVR，从与抗体的结合特异性相关的方面来看是很重要的。抗体主要通过LCVR和HCVR的氨基酸残基与靶抗原相互作用，因此可变区内的氨基酸序列与位于可变区外的序列相比，在各个抗体之间的差异更大。此外，在HCVR和LCVR中，还可以进一步细分成在各种抗体间保持更恒定的、称为骨架区(FR)的区域和称为互补决定区(CDR)的超可变区。HCVR和LCVR分别包括三个CDR和四个FR，它们依次按照FRl、CDRl、FR2、CDR2、 FR3、⑶R3、FR4的顺序从氨基末端排列至羧基末端。抗体的“抗原结合片段”(或简称为“抗体片段”)这一用语，是指具有与抗原(例如HCMV)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。需要说明的是，该片段还包括具有与抗原特异性结合的最小限度的氨基酸序列的肽。另外，“抗原结合片段”中还包括具有与抗原特异性结合的抗体的可变区、互补决定区的单链抗体(scFV)、双特异性抗原、多特异性抗原等。需要说明的是，本说明书中，为了简化，也将“抗体或抗原结合片段”简称为“抗体”。“能够中和HCMV的生物活性的抗体”，是指通过与HCMV或HCMV感染细胞结合而抑制HCMV的生物活性的抗体。作为“HCMV的生物活性”，代表性地包含引起以下(a) (e)所例示的疾病的HCMV 的活性，但不限定于此，也包括可诱发因活化的HCMV的活动而引起的各种疾病的HCMV的活性(a)艾滋病、癌症、器官移植后、骨髄移植后、血液透析后等免疫缺陷状态下的 HCMV的再活化所致的间质性肺炎、视网膜炎、胃肠炎、脑炎等各种疾病；(b)HCMV感染由孕妇波及到胎儿所致的先天性CMV感染症；(c)由上述先天性CMV感染症引起的流产、死产、新生儿死亡；(d)上述先天性CMV感染症未致死亡时引起的低出生体重、肝脾肿大、黄疸、血小板减少性紫癜、小头畸形、精神发育障碍、智力发育迟缓、脉络膜视网膜炎或听觉障碍；(e)新生儿或婴儿期因HCMV感染而发病的肝功能异常、间质性肺炎、单核细胞增多症等(非专利文献3、4和5)。本说明书中使用的“由HCMV引起的疾病”这一用语，包括表明或者可以认为患有该疾病的被测对象具有HCMV是该疾病的病理生理原因、或者是使该疾病恶化的原因之一的疾病以及其他疾病。因此，可以预测对于HCMV的生物活性为病因的疾病，通过抑制HCMV 的生物活性，可以缓和该疾病的症状和/或发展。这样的疾病例如通过使用上述抗HCMV抗体可以使症状缓和或治愈。具体而言，通过提高患该疾病的被测对象的生物学流体中的抗 HCMV抗体浓度(例如，提高被测对象的血清、血浆、滑液中的抗HCMV抗体的浓度)，可以证明上述疾病。本说明书中使用的“抑制效果”、“抑制”(阻害)、“抑制”(抑制)、“能够抑制”等用语是指，使起因于抗原(HCMV)的生物活性降低约5 100%、优选10 100%、更优选20 100%、更优选30 100%、更优选40 100%、更优选50 100%、更优选60 100%、更优选70 100%、进一步优选80 100%。可变区的氨基酸序列承担着一大半的抗体-抗原相互作用，因此如果将以特定的天然产生型的抗体为来源的可变区序列或CDR部分的序列移植至具有不同性质的不同抗体来源的恒定区或骨架序列，构建以上述状态含有上述可变区序列或CDR部分的序列的表达载体，则能够表达仿效特定的天然产生型抗体的性质的重组抗体。因此，在重新制作与原来的抗体具有同样的结合特性的完整重组抗体时，不需要获得特定抗体的全部序列。只要有该抗体的重链和轻链的可变区序列或CDR部分的序列， 对于该目的而言有时也是足够的。序列号13、14和15是分别与重链的⑶R1、⑶R2和⑶R3对应的氨基酸序列。另夕卜， 序列号16、17和18是分别与轻链的⑶R1、⑶R2和⑶R3对应的氨基酸序列。因此，本发明的优选抗体是序列号13、14、15、16、17、和18分别与重链的⑶Rl、⑶R2和⑶R3、以及轻链的 ⑶R1、⑶R2和⑶R3对应的情况。但是，只要是与HCMV特异性结合且能够中和其生物活性的单克隆抗体，则不需要序列号13、14、15、16、17、和18分别与重链的⑶Rl、CDR2和CDR3、 以及轻链的⑶R1、⑶R2和⑶R3对应。特别是重链的⑶R-3，可以是选自序列号22所示的氨基酸序列组中的氨基酸序列。另外，只要具有上述中和活性，则CDR序列可以是在选自序列号13、14、15、16、17和18的各组中的氨基酸序列中具有1个 几个(具体而言，为1 9个、1 8个、1 7个、1 6个、1 5个、1 4个、1 3个、1 2个或1个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列。CDR以外的氨基酸序列没有特别限定，CDR以外的氨基酸序列来源于其他抗体、特别是其他种属的抗体的所谓CDR移植抗体也包括在本发明的抗体中。其中，优选CDR以外的氨基酸序列也来源于人的抗体，根据需要骨架区(FR)也可以具有1个 几个(具体个数与上述相同)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变。这些抗体的制作方法可以使用公知的方法(Riechmann L, et al.，Reshaping human antibodies for therapy. Nature，332 :323_327，1988)。本发明中，当然优选完全人抗体。本发明的蛋白质的氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合是指，在同一序列中任意的1个或多个氨基酸序列中的位置上，具有1个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加，可以同时发生缺失、取代、插入和添加中的两种以上。构成自然界的蛋白质的氨基酸，可以根据其侧链的特性进行分组，例如，作为具有同样特性的氨基酸组，可以分类为芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、中性氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有烃链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)、及其他(甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)的组等。作为包括非天然型氨基酸在内的能够相互取代的氨基酸残基的例子，还有下述的分组，同一组中所含的氨基酸残基能够相互取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、 环己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4_ 二氨基丁酸、2，3_ 二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。本发明中，进一步优选的抗体含有(a)序列号10的氨基酸序列；序列号10的氨基酸序列中具有1个 几个(具体而言，为1 9个、1 8个、1 7个、1 6个、1 5个、1 4个、1 3个、1 2个或1 个)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列；或与序列号10的氨基酸序列具有95%以上(优选96%以上、97%以上、98%以上、 99%以上或99. 5%以上)的同一性的氨基酸序列所示的重链可变区(HCVR)；和(b)序列号12的氨基酸序列；序列号12的氨基酸序列中具有1个 几个(具体个数与上述相同)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列；或与序列号12的氨基酸序列具有95%以上(具体的百分数与上述相同)的同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区(LCVR)。需要说明的是，氨基酸序列或碱基序列的同一性可以使用Karlin和Altschul提出的算法 BLAST (Proc. Natl. Acad. ki. USA 872264-2268,1990 ；proc Natl Acad Sci USA 90 :5873,1993)来确定。已开发出基于BLAST的算法的、称为BLASTN和BLASTX的程序 (Altschul SF, et al J Mol Biol 215:403,1990)。使用 BLASTN 分析碱基序列时，参数例如设为score = 100、wordlength = 12。另外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如设为score = 50,wordlength = 3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，利用各程序的默认参数。本发明中，进一步优选的抗体含有(a)序列号10的氨基酸序列所示的重链可变区(HCVR)和(b)序列号12的氨基酸序列所示的轻链可变区(LCVR)。本发明中，进一步优选的抗体含有(a)序列号6的氨基酸序列；序列号6的氨基酸序列中具有1个 几个(具体个数与上述相同)氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列；或与序列号6的氨基酸序列具有 95%以上(具体的百分数与上述相同)的同一性的氨基酸序列所示的重链(H链)；和(b) 序列号8的氨基酸序列；序列号8的氨基酸序列中具有1个 几个(具体个数与上述相同) 氨基酸残基的缺失、取代、插1入、添加或这些1突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列；或与序列号8的氨基酸序列具有95%以上(具体的百分数与上述相同)的同一性的氨基酸序列所示的轻链(L链)。本发明中最优选的抗体为含有序列号6的氨基酸序列所示的重链(H链)和序列号8的氨基酸序列所示的轻链(L链)的完全人单克隆抗体。另外，本发明中优选的抗体的类(亚类)为IgGl(A)0上述本发明的抗HCMV抗体或其抗原结合片段的特征在于，与导致各种疾病的 HCMV特异性结合且中和其生物活性，与现有的抗HCMV抗体相比具有更高的中和能力。在此，“特异性结合”是指识别规定的抗原并与其结合。典型地，本发明的抗体与HCMV(特别是人HCMV)的解离常数(Kd值)优选为 IX IO-7M以下，更优选为IX 10- 以下，进一步优选为IX IOl以下，最优选为IX IO-iciMW 下。为了测定抗体与HCMV的解离常数，可以使用公知的方法。例如，可以利用固定在芯片上的抗HCMV抗体，通过BIAC0RET100 (注册商标)等蛋白质相互作用分析装置进行测定。关于抗HCMV抗体的中和能力，可以通过考察用免疫染色法测得的感染阻止率或空斑形成阻止率来进行评价。即，在将HCMV的代表株AD169株或Towne株接种到能够感染的细胞培养体系中时，预先使其与各种浓度的抗HCMV抗体接触一定时间，然后将它们接种至细胞，感染M小时后通过免疫染色测定HCMV感染细胞数并求出感染阻止率，或者在感染 5 6天后由所形成的空斑数求出其阻止率，由此能够测定抗HCMV抗体的中和活性。本发明的抗HCMV抗体或其抗原结合片段，以对于AD169株的中和活性计，优选在 1 μ g/mL(约7nM)以下、更优选在0. 1 μ g/mL(约0. 7nM)以下、进一步更优选在0. 05 μ g/ mL(约0. 3nM)以下、最优选在约0.03 μ g/mL(约0.2ηΜ)以下具有约50%的空斑形成阻止能力。另外，作为细胞间感染阻止能力，可以通过将预先感染了 HCMV的细胞培养一定时间后，在该细胞培养体系中添加各种浓度的抗HCMV抗体来评价细胞间感染的抑制效果。本发明的抗HCMV抗体或其抗原结合片段，优选在终浓度2μ g/mL(约13nM)以下、 更优选在0. 5μ g/mL (约3nM)以下、进一步更优选在0. 2 μ g/mL (约0. 13nM)以下具有50% 以上的细胞间感染阻止能力。需要说明的是，本申请发明的抗体只要以完全长度的抗体或其抗原结合片段、或者表示可变区的序列号6、8、10或12的氨基酸序列、表示互补决定区(CDR)的序列号13 18的氨基酸序列为基础，则利用该技术领域中的公知技术，就可以得到与HCMV特异性结合且能够中和其生物活性的重组人单克隆抗体、单克隆抗体(还包括嵌合抗体、人源化抗
18体)、或它们的抗原结合片段。这些抗体属于本申请发明的技术范围内。例如，重链和轻链的信号序列在蛋白质成熟的过程中被切断，对最终的抗体特性没有贡献，但为了追加欠缺的序列，可以将克隆化的cDNA序列利用连接法或PCR扩增法组合到合成寡核苷酸中。取而代之，也可以以一组短的、具有重复序列的寡核苷酸的形式合成整个可变区， 并通过PCR扩增法进行组合，从而制作完全人工的可变区克隆。2.编码本发明的抗体等的核酸根据本申请发明的另一实施方式，提供一种分离的核酸，其编码与HCMV特异性结合且能够中和其生物活性的抗HCMV单克隆抗体或其抗原结合片段，所述核酸选自以下核酸编码选自由序列号2、4、6、8、10、12、13 18和22组成的组中的氨基酸序列的核酸、以及与该核酸在高严格条件下杂交的核酸。上述核酸优选为DNA或RNA，更优选为DNA。下述的分离的核酸也包含在本申请发明中其编码与HCMV结合且能够中和其生物活性的抗HCMV单克隆抗体或其抗原结合片段，且该分离的核酸与编码选自由2、4、6、8、 10、12、13 18和22组成的组中的氨基酸序列的核酸具有高同一性。在此，“具有高同一性” 是指能够在高严格条件下与规定的核酸序列杂交的程度的序列同一性，例如，具有60%、 70%、80%、90%或95%、或者超过上述程度的同一性。“高严格条件”例如为5XSSC、5X邓哈特溶液、0.5% SDS、50 %甲酰胺、50°C 的条件(例如，参照 J. Sambrook 等的 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，特另lj是 11. 45 节"Conditions for Hybridization of Oligonucleotide ftObes”)。在这些条件下，可以期待有效地得到温度越高则具有越高同一性的多核苷酸(例如，DNA)。其中，作为影响杂交的严格性的要素，认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个要素，本领域技术人员通过适当选择这些要素能够实现同样的严格性。作为在上述高严格条件下杂交的核酸，包含与编码序列号2、4、6、8、10、12、13 18和22中任一种氨基酸序列的核酸具有例如70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、 97%以上或99%以上的同一性的核酸。碱基序列的同一性可以利用上述的同一性检索算法等来确定(Proc. Natl. Acad. Sci.USA 872264-2268,1990 ；Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)。另外，本发明中优选的核酸为同时编码序列号10和12的氨基酸序列的DNA，进一步优选为同时编码序列号6和8的氨基酸序列的DNA。进一步更优选的核酸为同时编码序列号2和4的氨基酸序列的DNA。更进一步优选的核酸为同时含有序列号5和7的核酸的核酸，更进一步优选的核酸为含有序列号1和3的核酸这两者的核酸。3.本发日月的jH本、宿t细朐,禾Π抗体的泡K乍方法本发明还涉及重组有上述核酸的载体和导入有该载体的宿主细胞、以及使用它们的抗体的制作方法。本发明的抗体也可以作为使用公知方法得到的重组人抗体来制作(参照Nature， 312 643,1984,Nature, 321 :522，1986等)。例如，本发明的抗体可以通过将导入有本发明的载体的宿主细胞进行培养并从培养上清等中纯化所产生的抗体来制作。更具体而言，可以通过下述方法制造将编码Vh和\的cDNA分别插入到含有编码由同一细胞或不同的人细胞制作的人抗体Ch和/或人抗体Q的基因的动物细胞用表达载体中以构建人抗体表达载体，并导入到动物细胞中进行表达。用于重组编码本发明的抗体的￥11或\的核酸的载体没有限定，优选蛋白质基因等的表达中通用的、特别是适合于抗体基因的表达的载体或高表达用载体。作为优选的例子， 可列举出含有EF启动子和/或CMV增强子的载体。另外，通常分别制作重组有编码Vh或八的核酸的表达载体，并共转染到宿主细胞中，但也可以重组到单一的表达载体中。用于导入表达载体的宿主细胞没有限定，优选蛋白质基因等的表达中通用的、特别是适合于抗体基因的表达的细胞。例如，可列举出细菌(大肠杆菌等)、放线菌、酵母、昆虫细胞(SF9等)、哺乳类细胞(C0S-1、CH0、骨髓瘤细胞等)。为了在工业上生产重组抗体，通常利用稳定地、以高水平生产该抗体的重组动物细胞株，例如CHO细胞株。这种重组细胞株的制作、克隆化、用于高表达的基因扩增和筛选可以利用公知的方法(例如，参照 Omasa T. J. Biosci. Bioeng.，94，600-605，2002 等)。本发明除了包含由两条重链和两条轻链构成的抗体以外，还包含本发明的抗体的抗原结合片段。作为抗原结合片段，例如有Fab (抗原结合片段，fragment of antigen binding)、Fab’、F(ab’)2，作为通过接头等将抗体的活性片段结合而成的物质，例如有单链抗体(single chain Fv :scFv)、二硫键稳定抗体(disulfide stabilized Fv:dsFv)，作为含有抗体的活性片段的肽，例如可列举出含有CDR的肽。这些物质可以通过将本发明的抗体用适当的蛋白分解酶进行处理的方法或基因重组技术等公知的方法进行制造。抗体的纯化可以使用盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法或亲和色谱法等公知的纯化手段进行。除此之外，通过近年开发的、利用基因工程学技术在噬菌体表面表达重组抗体的噬菌体展示抗体技术，以噬菌体融合蛋白的形式表达人工地使vH、八基因改组〔ny 'j > 夕)而多样化的 scFv (单链可变区片段，single chain Fragment of variable region) 抗体，也可以得到特异抗体。该技术可以避免免疫，并且作为代替细胞融合法的人源化抗体制作技术受到很高的评价。只要是使用该技术，以本申请说明书中的序列号2、4、6、8、10、 12、13 18和22的氨基酸序列为参考而制作的特异抗体或其抗原结合片段，均属于本申请发明的技术范围内。此外，将近年开发的通过抗体的糖链部分的修饰来大幅改善抗体的ADCC活性的 P0TELLIGENT技术应用于本申请发明的抗体而得到的抗体(参照Niwa R. , et al，Clin. Cancer Res.，10，6248-6255 (2004))、将改善CDC活性的C0MPLEGENT技术应用于本申请发明的抗体而得到的抗体(参照Kanda S.，et al,Glycobiology, 17,104-118(2007))也属于本发明的技术范围。另外，作为抗体制作的方法，通常利用小鼠、兔、山羊等实验动物来获取多克隆抗体或单克隆抗体，但这样得到的抗体具有所使用的动物种类的特征性序列，因此如果直接施用于人则会被人免疫系统作为异物识别，可能会引起人抗动物抗体的应答(即，产生抗体的抗体)。本发明的抗HCMV单克隆抗体或其抗原结合片段，可以由健康人等的血液来源的
20抗体产生细胞获得，其为完全人抗体。该完全人抗体即使作为抗体药物施用于人体，也不具有免疫原性，不会观察到免疫反应。另夕卜，本申请发明的抗HCMV单克隆抗体，由于具有比以往的抗HCMV单克隆抗体更高的中和能力，因此利用更少的给药量就可以期望相同程度的治疗效果。接下来，对得到本发明的抗HCMV单克隆抗体及其抗原结合片段的步骤进行说明， 但得到本发明的抗体等的方法不受这些记载的任何限制，如上所述，当然可以进行该技术领域中的通常的变更。本发明的抗HCMV单克隆抗体及其抗原结合片段可以通过下述方法获得经过各种步骤从健康人的血液中分离产生该抗体的细胞克隆，从抗体产生细胞克隆的培养上清中获得抗体，对所得的抗体进行亲和纯化。1)针对HCMV的完全人抗体产生细胞克隆的分离从健康人的血液中分离B淋巴细胞，诱导该B淋巴细胞的增殖。增殖诱导的方法本身是公知的，例如可以通过使用癌的诱导因子“艾伯斯坦-巴尔病毒(EB病毒)” (Epstein-Barr virus)(以下，称为 EBV)的转化法(D. Kozbor 等)进行。S卩，用EBV感染上述B淋巴细胞，进行增殖诱导，将增殖的细胞作为抗体产生细胞文库。2)由抗体产生细胞文库回收单克隆抗体由增殖诱导的细胞回收单克隆抗体的方法可以通过单克隆抗体的制作中常用的公知方法进行。从所述抗体产生细胞文库中选择产生与HCMV结合的抗体的淋巴细胞克隆，由其培养上清中取出抗体。即，通过有限稀释法从所述抗体产生细胞文库中选择产生与HCMV结合的抗体的细胞群(克隆)。为了检测与HCMV结合的克隆，优选采用使用HCMV来源的抗原和小鼠抗人IgG标记抗体的ELISA。通过培养选择出的抗体阳性细胞群，并反复筛选，可以得到仅产生目标抗体的细胞群(克隆)。图1中示出表示直到上述抗体产生细胞克隆的分离为止的步骤的流程图。3)使用蛋白A或G的亲和纯化为了纯化抗HCMV抗体，可以在滚瓶、2升装的转瓶、或其他培养体系中增殖所选择的细胞。将所得到的培养上清过滤、浓缩后，供给到利用蛋白A或者蛋白G-琼脂糖凝胶(GE Healthcare公司)等进行的亲和层析中，由此可以纯化该蛋白质。将缓冲液更换为PBSjlJ 用OD28tl或优选浊度计分析，可以判断浓度。同种型可以通过同种型抗原特异性的方法来考察。这样得到的抗HCMV抗体是由在人体内致敏的B淋巴细胞制作的完全人抗体，因此针对抗体产生免疫反应的可能性低。另外，关于抗体产生细胞克隆的制作，特点还在于利用了具有感染B淋巴细胞并诱导其增殖的活性的EB病毒。EB病毒法的优点在于，能够制作在人体内产生的天然的抗体以及能够得到亲和性高的抗体。例如，已知针对HCMV的人抗体比人工免疫小鼠而制作的抗体的亲和性高约10 100 倍。通过EB病毒感染而增殖的B淋巴细胞群成为抗体产生细胞的文库。由该文库分离特定的抗体产生细胞克隆，可以得到人抗体。4.含有本发明的抗体的医药组合物接下来，本发明提供一种用于预防或治疗人巨细胞病毒(HCMV)相关疾病的医药组合物，其含有上述抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。本发明的抗HCMV抗体或其抗原结合片段对于HCMV具有高于现有的抗HCMV抗体的中和能力，因此作为HCMV相关疾病(因HCMV而引起的各种疾病)的预防或治疗药是有用的。因HCMV而引起的疾病是指预测通过抑制HCMV活性可缓和该疾病的症状和/或发展的疾病。本说明书中使用的“HCMV相关疾病”这一用语，包括表明或者可以认为患有该疾病的被测对象具有HCMV是该疾病的病理生理原因、或者是使该疾病恶化的原因之一的疾病以及其他疾病。即，本发明的抗HCMV抗体或其抗原结合片段对于HCMV具有高中和能力，因此也可以期待作为因HCMV而引起的各种疾病、例如(a)艾滋病、癌症、器官移植后、骨髄移植后、血液透析后等免疫缺陷状态下的HCMV的再活化所致的间质性肺炎、视网膜炎、胃肠炎、脑炎等各种疾病；(b)HCMV感染由孕妇波及到胎儿所致的先天性CMV感染症；(c)由上述先天性CMV感染症引起的流产、死产、新生儿死亡；(d)上述先天性CMV感染症未致死亡时引起的低出生体重、肝脾肿大、黄疸、血小板减少性紫癜、小头畸形、精神发育障碍、智力发育迟缓、脉络膜视网膜炎或听觉障碍；(e)新生儿期或婴儿期因HCMV感染而发病的肝功能异常、间质性肺炎或单核细胞增多症等的预防或治疗药(非专利文献3、4和5)。本说明书中使用的“作为医药品可接受的载体”中，包含生理学上可适用的任意的、或者全部的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延缓剂等。作为医药品可接受的载体的例子，包括水、盐类溶液、磷酸缓冲生理盐水、葡聚糖、 甘油、乙醇等中的一种或多种、以及它们的组合。作为注射剂等使用时，组合物中优选含有 PH调节剂、等渗剂，例如糖、甘露醇、山梨醇等多元醇、或氯化钠。作为医药品可接受的载体中，还可以含有润湿剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂等用于提高抗体或抗体部分的保存性或有效性的少量的辅助物质。本发明的组合物可以制成各种剂型。这样的组合物例如包括溶液(例如可注射、 可输液的溶液)、分散液、悬浮液、片剂、胶囊、锭剂(卜口一^")、丸剂、粉末、脂质体、栓剂等液体、半固体、固体的剂型。优选的剂型根据所期望的给药形态和治疗的适用例而异。通常优选的组合物为与用于以其他抗体对人进行被动免疫的组合物相同的组合物等可注射或可输液的溶液的形态。优选的给药形态为非经口给药(例如通过静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内)。在优选的实施方式中，抗体通过静脉输液或静脉注射给药。在另一优选的实施方式中，抗体通过肌肉内注射或皮下注射给药。本发明的抗体和抗体片段可以混合到适于非经口给药的医药品组合物中。使用单一种类的抗体或抗体部分时，优选作为含有0. 1 250mg/mL抗体的可注射的制剂进行制备。另一方面，混合多种抗体使用时，优选作为含有0.001 lOOmg/mL抗体的可注射的制剂进行制备。另外，该多种抗体的混合比例可以适当设定。
可注射的制剂可以通过将有效成分溶解于液体中而得到的物质或使有效成分冷冻干燥而得到的物质加入到弗林特(7 U >卜)瓶、棕色瓶、安瓿或预充式注射器中而构成。缓冲剂可以采用PH5.0 7.0(最适情况下为pH6.0)的L-组氨酸(1 50mM)，最适情况下可以采用5 IOmM的L-组氨酸。其他合适的缓冲剂包括琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾，但不限定于此。为了改变浓度0 300mM的溶液(就液体剂型而言，最适情况为150mM)的渗透压，可以使用氯化钠。冷冻干燥的剂型中可以含有冷冻保护物质、主要是 0 10% (最适情况为0. 5 5. 0% )的蔗糖。其他合适的冷冻保护物质包括甘露醇、海藻糖和乳糖。冷冻干燥的剂型中可以含有增量剂、主要是1 10%的甘露醇(最适情况为 2 4% )。液体和冷冻干燥的剂型这两者中可以使用稳定剂、主要是1 50mM(最适情况为5 IOmM)的L-蛋氨酸。其他合适的稳定剂包括甘氨酸、精氨酸和Polysorbate 80等， Polysorbate 80的情况下，可以含有O 0. 05% (最适情况为0. 005 0. 01% )。其他表面活性剂包括Polysorbate 20和BRIJ表面活性剂，但不限定于此。本医药组合物通常在制造和贮藏的条件下必须无菌且稳定。该组合物可以配方为溶液、微型乳剂、分散液、脂质体或适合高药物浓度的其他规定构造。无菌的可注射溶液可以通过将必要量的活性化合物(即抗体或抗体部分)与根据需要使用的上述成分中的一种或组合一起混合到适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备。通常，将活性化合物混合到含有基本的分散介质和从上述列举的物质中选择的所需的其他成分的无菌载体(vehicle) 中，由此制备分散液。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末制剂的情况下，优选的制备方法为前述的该灭菌过滤溶液的冷冻真空干燥和喷雾干燥，由此，得到除活性成分的粉末之外还含有任意的其他所需成分的组合物。溶液的适当的流动性例如可以通过下述方式维持使用卵磷脂等的包衣；或者，分散液的情况下维持必要的粒度；或者，使用表面活性剂。 可注射组合物的长期吸收可以通过在该组合物中含有使吸收延缓的药剂、例如单硬脂酸盐或明胶来进行。本医药组合物中还可以混合有辅助性的活性化合物。在某个实施方式中，将本发明的抗体或抗体部分与对于治疗HCMV引起的疾病有用的一种或多种其他治疗药一起配方，或者与这样的其他治疗药同时给药。例如，本发明的抗HCMV抗体或抗体部分可以和与其他靶标结合的一种或多种其他抗体(例如，与HCMV的其他结合位点结合的抗体)一起配方，或者与这样的其他抗体同时给药。此外，本发明的一种或多种抗体可以与前述治疗药中的两种或两种以上组合使用。基于这样的组合的疗法能够有利地利用更低用量的所给药的治疗药，因此，可以避免各种单一疗法可能伴随的毒性或并发症。需要说明的是，本说明书中出现的核苷酸或氨基酸序列与序列号的关系如下所述。序列号1表示含有信号序列的、编码针对HCMV的gB糖蛋白的ADl区域的抗体(以下，“抗 ADl抗体” )(EV2038)的H链的核苷酸序列。序列号2表示含有信号序列的、抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列。序列号3表示含有信号序列的、编码抗ADl抗体(EV2038)的L链的核苷酸序列。
序列号4表示含有信号序列的、抗ADl抗体(EV2038)的L链的氨基酸序列。序列号5表示不含信号序列的、编码抗ADl抗体(EV2038)的H链的核苷酸序列。序列号6表示不含信号序列的、抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列。序列号7表示不含信号序列的、编码抗ADl抗体(EV2038)的L链的核苷酸序列。序列号8表示不含信号序列的、抗ADl抗体(EV2038)的L链的氨基酸序列。序列号9表示编码抗ADl抗体(EV2038)的H链可变区的核苷酸序列。序列号10表示抗ADl抗体(EV2038)的H链可变区的氨基酸序列。序列号11表示编码抗ADl抗体(EV2038)的L链可变区的核苷酸序列。序列号12表示抗ADl抗体(EV2038)的L链可变区的氨基酸序列。序列号13表示抗ADl抗体(EV2038)的H链CDRl的氨基酸序列。序列号14表示抗ADl抗体(EV2038)的H链CDR2的氨基酸序列。序列号15表示抗ADl抗体(EV2038)的H链CDR3的氨基酸序列。序列号16表示抗ADl抗体(EV2038)的L链CDRl的氨基酸序列。序列号17表示抗ADl抗体(EV2038)的L链CDR2的氨基酸序列。序列号18表示抗ADl抗体(EV2038)的L链CDR3的氨基酸序列。序列号19表示实施例中制作EV2038 CDR-H3变异体时使用的38Hind-S引物的核苷酸序列。序列号20表示实施例中制作EV2038的⑶R-H3变异体时使用的38Not_A引物的核苷酸序列。序列号21表示实施例中制作EV2038的CDR-H3变异体时使用的碱基序列确认用引物的核苷酸序列。序列号22
表示抗ADl抗体的CDR-H3的氨基酸序列中的共有氨基酸序列。序列号23表示通过实施例中所示的缺失突变法确定为表位存在区域的、HCMV gB糖蛋白ADl 区域的549位 580位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。序列号M表示通过实施例中所示的缺失突变法确定为表位存在区域的、HCMV gB糖蛋白ADl 区域的596位 640位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。序列号25表示通过实施例中所示的肽阵列法确定为表位区域的、HCMV gB糖蛋白ADl区域的549位 560位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。序列号沈表示通过实施例中所示的肽阵列法确定为表位区域的、HCMV gB糖蛋白ADl区域的569位 576位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。序列号27表示通过实施例中所示的肽阵列法确定为表位区域的、HCMV gB糖蛋白ADl区域的625位 632位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。序列号观表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的117位的缬氨酸 (V)取代成赖氨酸(K)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号四表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的118位的苏氨酸 (T)取代成色氨酸(W)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号30表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的119位的精氨酸 (R)取代成缬氨酸(V)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号31表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的120位的天冬氨酸(D)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号32表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成谷氨酸(E)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号33表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)取代成亮氨酸(L)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号34表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成苏氨酸(T)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号35表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成天冬氨酸(D)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号36表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成精氨酸(R)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号37表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成苯丙氨酸(F)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号38表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的127位的天冬氨酸(D)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号39表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成天冬酰胺(N)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号40表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成天冬酰胺(N)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号41表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的130位的蛋氨酸 (M)取代成谷氨酰胺(Q)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号42表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的131位的天冬氨酸(D)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号43表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的132位的缬氨酸 (V)取代成赖氨酸(K)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号44表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号45表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成缬氨酸(V)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号46表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号47表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成苯丙氨酸(F)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号48表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸(L)取代成脯氨酸(P)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号49表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成酪氨酸(Y)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号50表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成苯丙氨酸(F)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号51表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成脯氨酸(P)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号52表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成亮氨酸(L)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号53表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的123位的色氨酸 (W)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号54表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成亮氨酸(L)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号55表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成蛋氨酸(M)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号56表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成脯氨酸(P)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号57表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成缬氨酸(V)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号58表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号59表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成脯氨酸(P)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号60表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号61表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸(G)取代成丝氨酸( 而得到的变异体的氨基酸序列。序列号62表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成天冬酰胺(N)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号63表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)取代成苏氨酸(T)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号64表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成甘氨酸(G)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号65表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号66表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号67表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的i25位的脯氨酸 (P)取代成亮氨酸(L)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号68表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成缬氨酸(V)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号69表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成丝氨酸( 而得到的变异体的氨基酸序列。序列号70表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成苏氨酸(T)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号71表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成天冬酰胺(N)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号72表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成谷氨酰胺(Q)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号73表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成天冬氨酸(D)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号74表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸
28(P)取代成谷氨酸(E)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号75表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成赖氨酸(K)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号76表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成组氨酸(H)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号77表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成半胱氨酸(C)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号78表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成蛋氨酸(M)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号79表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成酪氨酸(Y)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号80表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成色氨酸(W)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号81表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的125位的脯氨酸 (P)取代成苯丙氨酸(F)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号82表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的117位的缬氨酸 (V)取代成亮氨酸(L)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号83表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的117位的缬氨酸 (V)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号84表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的118位的苏氨酸 (T)取代成丝氨酸( 而得到的变异体的氨基酸序列。序列号85表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的118位的苏氨酸 (T)取代成赖氨酸(K)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号86表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的119位的精氨酸 (R)取代成赖氨酸(K)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号87表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的119位的精氨酸(R)取代成苏氨酸(T)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号88表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的120位的天冬氨酸(D)取代成谷氨酸(E)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号89表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的120位的天冬氨酸(D)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号90表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)取代成天冬氨酸(D)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号91表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号92表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的127位的天冬氨酸(D)取代成谷氨酸(E)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号93表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的127位的天冬氨酸(D)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号94表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成苯丙氨酸(F)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号95表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成色氨酸(W)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号96表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成苯丙氨酸(F)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号97表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的酪氨酸 (Y)取代成色氨酸(W)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号98表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的130位的蛋氨酸 (M)取代成苯丙氨酸(F)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号99表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的130位的蛋氨酸 (M)取代成异亮氨酸(I)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号100表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的131位的天冬氨酸(D)取代成谷氨酸(E)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号101表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的131位的天冬氨酸(D)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号102表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的132位的缬氨酸 (V)取代成酪氨酸(Y)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号103表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的132位的缬氨酸 (V)取代成丝氨酸( 而得到的变异体的氨基酸序列。序列号104表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成缬氨酸(V)、将1 位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号105表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的IM位的异亮氨酸(I)取代成缬氨酸(V)、将1 位的甘氨酸(G)取代成丝氨酸( 而得到的变异体的氨基酸序列。序列号106表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成异亮氨酸(I)、将123位的色氨酸(W)取代成酪氨酸(Y)、将IM位的异亮氨酸 (I)取代成缬氨酸(V)、将1 位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号107表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的121位的亮氨酸 (L)取代成异亮氨酸(I)、将123位的色氨酸(W)取代成酪氨酸(Y)、将IM位的异亮氨酸 (I)取代成缬氨酸(V)、将1 位的甘氨酸(G)取代成丝氨酸( 而得到的变异体的氨基酸序列。序列号108表示使本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的122位的谷氨酸 (E)缺失而得到的变异体的氨基酸序列。序列号109表示在本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的1 位的甘氨酸 (G)与127位的天冬氨酸(D)之间插入谷氨酸(E)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号110表示将本发明的抗ADl抗体(EV2038)的H链的氨基酸序列中的79位的天冬酰胺 (N)取代成谷氨酰胺(Q)而得到的变异体的氨基酸序列。序列号111表示实施例8中制作、使用的合成肽(表5的肽1)的氨基酸序列。
序列号112
表示实施例
序列号113
表示实施例
序列号114
表示实施例
序列号115
表示实施例
序列号116
表示实施例
序列号117
表示实施例
序列号118
表示实施例
序列号119
表示实施例
序列号120
表示实施例
序列号121
表示实施例
序列号122
表示实施例
序列号U3
表示实施例
序列号1
表示实施例
序列号1
表示实施例
序列号126
表示实施例
序列号127
表示实施例
序列号1
表示实施例
序列号1
表示实施例
序列号130
表示实施例
序列号131
中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽中制作、使用的合成肽
表5的肽幻的氨基酸序列。 表5的肽幻的氨基酸序列。 表5的肽4)的氨基酸序列。 表5的肽幻的氨基酸序列。 表5的肽6)的氨基酸序列。 表5的肽7)的氨基酸序列。 表5的肽8)的氨基酸序列。 表5的肽9)的氨基酸序列。 表5的肽10)的氨基酸序列。 表5的肽11)的氨基酸序列。 表5的肽1 的氨基酸序列。 表5的肽1 的氨基酸序列。 表5的肽14)的氨基酸序列。 表5的肽1 的氨基酸序列。 表5的肽16)的氨基酸序列。 表5的肽17)的氨基酸序列。 表5的肽18)的氨基酸序列。 表5的肽19)的氨基酸序列。 表5的肽20)的氨基酸序列。
表示实施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽21)的氨基酉I序列。
序列号132
表示实施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽22)的氨基酉I序列。
序列号133
表示实施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽23)的氨基酉I序列。
序列号Π4
表示实施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽24)的氨基酉I序列。
序列号135
表示实施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽25)的氨基酉I序列。
序列号136
表示实施例6〗中制作、使用的合成肽(表5的肽26)的氨基酉I序列。序列号137表示人巨细胞病毒(HCMV)的gB糖蛋白的氨基酸序列(Swiss-Prot :P06473)。另外，本说明书的实施例1 6中出现的核苷酸或氨基酸序列与序列号的关系如表1所示。[表1]
含有信号序列无信号序列可变区CDRlCDR2CDR3H链核苷酸序列号159■■氨基酸序列号2610131415L链核苷酸序列号3711---氨基酸序列号4812161718以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的任何限定。如果没有特别说明，则本实施例中使用的步骤可以参照Molecular Cloning =A Laboratory Manual(Third Edition) (Sambrook 等、Cold Spring Harbour Laboratory Press,2001)。实施例实施例1.针对HCMV的完全人抗体产生细胞克隆的分离至抗体产生细胞克隆的分离为止的流程图示于图1。从血清中的抗HCMV抗体值高的人末梢血中分离B淋巴细胞，使其感染EBV。将感染细胞接种到96孔板中，培养约3周后，进行培养上清中的抗HCMV抗体的筛选(一次筛选)。 筛选以针对HCMV 的主要中和表位 ADl 和 AD2(J. Virol.，65，138-146 (1991)，J. Gen. Virol.， 73，2375-2383 (1992)，J. Virol.，66，5290-5297 (1992)，J. Virol.，67，703-710 (1993))的抗体为靶标，使用包覆有GST融合HCMV-ADl或GST融合HCMV-AD2的96孔板，通过ELISA法进行。将确认产生抗HCMV抗体的各孔的细胞进行稀释，分别接种到新的96孔板中。培养约3周后，进行抗HCMV抗体产生的二次筛选。将所得到的抗体阳性孔的细胞以每孔1 30个接种到新的96孔板中。通过该有限稀释培养进行克隆操作的结果，得到产生目标抗体的细胞克隆。实施例2.抗体同种型和亚类的确认使用分离出的抗体产生细胞克隆的培养上清，通过ELISA法确认产生的抗体的同种型(参照文献Curr Protoc Immunol. 2001 May ；Chapter 2 =Unit 2.2)。ELISA 使用包覆有GST融合HCMV-ADl或AD2的96孔板，作为二次抗体，使用各个同种型和亚类特异性的抗体。结果，将所得到的抗HCMV抗体的同种型和亚类示于表2。[表 2]
抗体编号靶抗原亚类EV2038ADlIgGl λ实施例3.编码抗HCMV抗体的DNA的克隆使用Oligo-dT引物，由抗体产生细胞的总RNA进行逆转录，以所得到的cDNA作为模板，利用PCR法进行抗体基因的扩增。PCR中使用的引物基于编码人IgG抗体H链和L链的cDNA的数据库进行设计。为了扩增完全长度的H链cDNA和L链cDNA，5，末端侧引物具有翻译起始位点，3’末端侧引物具有翻译终止位点。实施例4.基于碱基序列的抗体的氨基酸序列的确定将通过PCR法扩增的抗体H链和L链的cDNA插入质粒载体中，利用ABI测序仪确认各自的碱基序列。由所得到的碱基序列确定信号序列、以及抗体H链和L链的氨基酸序列。另外，抗体的互补决定区(OTR)的分析中使用Kabat的方法(www. bioinf. org. uk Dr. Andrew C. R. Martin' s Group, Antibodies :General Information)。所得至 Ij 的抗 HCMV 抗体(EV2038)的⑶R序列示于序列号13 18中。具体而言，EV2038的H链⑶Rl、H链 CDR2、H链CDR3、L链CDRl、L链CDR2和L链CDR3的氨基酸序列分别示于序列号13、14、15、 16,17 和 18 中。另外，为了研究与迄今为止作为ADl抗体被报道的单克隆抗体的类似性，对于可变区的氨基酸序列记载于GenBank等中的抗体，与EV2038的⑶R序列进行比较。用Kabat 法确定已知的人或小鼠来源的ADl抗体的各种CDR序列，分别与同样确定的EV2038的CDR 序列进行比较。表3中，各个CDR的同一性是由作为比较对象的氨基酸残基数(分母)和在该CRD部分中与EV2038位置和种类一致的氨基酸残基数(分子)求得的同一性(% )。另外，总计(％ )如下求得将各个CDR的比较中得到的作为分母的氨基酸残基数与作为分子的氨基酸残基数分别合计，由所得到的总分母和总分子的氨基酸残基数求出同一性(％ )。 如表3所示，可知EV2038与已知的ADl抗体完全没有确认到同一性，与迄今为止报道的 ADl抗体的CDR序列具有很大差异。[表 3]
抗体登录号来源H链CDR的同源性(％)L链CDR的同源性(％)总计 (%)(HCVR/LCVR)CDRlCDR2CDR3CDRlCDR2CDR3ITC63BL26539/L26540人20243231572731ITC52L26537/L26538人4024392314925ITG48L26535/L26536人805662429929ITC39L26533/L26534人20242538433630ITC33L26531/L26532人202425504318307-17U39898/U39901小鼠2035252529182627-156U39899/U39902小鼠402425352992627-287U39900/U39903小鼠2024192714920EV2001*人2024192543922出处W02007/094423实施例5.确认所得抗体基因编码抗HCMV抗体将所得到的H链和L链的cDNA分别插入表达载体中，并同时导入细胞中。基因导入利用阳离子脂质体1J f 7工夕夕S > (Invitrogen)和添加、”H、试剂 anvitrogen)，在制造商推荐的条件下进行(Invitrogen的目录=Cat. No. 18324-111，Cat. No. 18324-012，或Cat. No. 18324-020)。两天后回收培养上清，通过使用包覆有抗人IgG抗体和GST融合HCMV-ADl的96孔板的ELISA法，确认培养上清中的抗体为人IgG抗体、以及与HCMV-ADl结合。实施例6.抗体蛋白的产生将所得到的抗HCMV抗体表达质粒导入CHO细胞中。基因导入采用与上述细胞时同样的方法。通过在筛选标记存在下进行培养，得到稳定产生抗体的CHO细胞克隆。将该稳定产生抗体的CHO细胞在无血清培养基中培养，并回收培养上清。将该培养上清添加到蛋白A柱中，通过亲和纯化得到纯化抗体。柱使用HiTrap rProteinA FF(GE Healthcare公司)的预装柱，纯化条件为柱制造商推荐的条件。纯化后，通过ELISA确认抗体的HCMV-ADl或HCMV-AD2结合性。另外，利用SDS-PAGE进行了约50kDa的抗体H链和约 25kDa的抗体L链的确认。实施例7.变异体的制作及它们的结合活性为了研究影响本发明的抗体或其结合性片段的特性的氨基酸序列，特别对CDR-H3 区域(氨基酸编号117 132)进行了考察。需要说明的是，CDR-H3的氨基酸残基的编号以从包含序列号2所示的信号序列的重链的氨基酸序列的N末端(蛋氨酸)起的顺序表示。构成自然界的蛋白质的氨基酸根据其侧链的特性可进行分组，例如，作为具有同样特性的氨基酸，可以分类为芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、碱性氨基酸 (赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、中性氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有烃链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)、及其他(甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)的组等。本项中，“保守性氨基酸取代”是指特性相似的氨基酸间的取代，即主要为上述相同的组内的氨基酸取代。该取代时，认为不会对原始的蛋白质的特性产生显著影响，或者不会使其发生显著变化。另一方面，“非保守性氨基酸取代”与上述不同，是指取代为与原始的氨基酸的特性有很大不同的氨基酸。(1) EV2038的CDR-H3变异体的制作
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对于构成EV2038的⑶R-H3的16个残基的氨基酸，使用两步PCR法进行各一种的非保守性氨基酸取代，制作变异体(V117K, T118W，R119V，D120I, L121E，E122L，W123T， I124D, P125R, G126F, D127I, Y128N, Y129N, M130Q, D131I, V132K)。首先，利用 38Hind_S( CACCAAGCTTTGTGCAAGAACATGAAGCATC ；序列号19)和取代部位的反向引物的引物对得到前半部的基因片段，利用取代部位的正向引物和38Not-A (ATAAGAATGCGGCCGCGCCGTCGCACTCA TTTACC ；序列号20)的引物对得到后半部的基因片段。以它们作为模板进行第二次PCR， 得到完全长度的变异体抗体基因。之后，将抗体基因通过Not I的限制酶处理使末端粘性化后，重组到抗体产生用质粒中。各变异体的碱基序列的确认使用碱基序列确认用引物 (ACCAGACATAATAGCTGACAG ；序列号21)，利用3130基因分析仪(ABI公司)根据推荐的操作规程进行确认。(2) EV2038的CDR-H3变异体的抗体表达确认根据Lipofectamine LTX (Invitrogen公司)的推荐操作规程，将所得的变异体质粒(H链)与L链的原始质粒一起共同基因导入到CHO细胞中，采集48小时后的培养上清。 在固定有抗人IgG抗体(0. 25 μ g/孔)的酶标板(Immuno plate) (Maxi sorp，Nunc公司) 中，使连续稀释的培养上清在室温下反应1小时。作为二次抗体，使抗人免疫球蛋白Gy和抗人免疫球蛋白G λ (MBL公司)同样在室温下反应1小时。作为显色剂，添加50 μ L/mL的含有TMB底物的Sure Blue (MPL公司)，在室温下静置30分钟后，加入等量的1. 5M磷酸，使用酶标仪(680XR、BIO-RAD公司)测定450nm的吸收波长。由、链和λ链的吸光度判断抗体的有无并定量。(3)利用ELISA评价EV2038的CDR-H3变异体对于ADl的结合能力在固定有5 μ g/mL的ADl的酶标板(Poly sorp，Nunc公司)中，使通过系列稀释以λ链为基准调节为1 μ g/mL浓度的抗体与其反应。之后，与上述同样地进行ELISA。由所得到的变异体和EV2038 (原始)在450nm的吸光度评价变异体对于ADl抗原的结合能力。 结果，EV2038⑶R-H3的除122位以外的、121 1 位残基的非保守性氨基酸取代显著降低了对于ADl的结合能力，因此暗示这些残基作为ADl的抗体结合部位(〃，卜一 )很重要(图2)。(4) EV2038 的 CDR-H3 变异体的制作 2关于非保守性氨基酸取代中对于ADl的结合能力降低的5个氨基酸残基中的121 位、123位、IM位和1 位的四处氨基酸残基，进行了取代成特性近似的氨基酸的尝试。所使用的氨基酸分别制作5种，具体而言，制作(图3)所示的变异体。需要说明的是，关于 125位的脯氨酸，取代成除原始以外的所有天然氨基酸(图4)。变异体如前所述进行制作。(5)利用ELISA评价EV2038的CDR-H3变异体对于ADl的结合能力在固定有5 μ g/mL的ADl的酶标板(Poly sorp, Nunc公司)中，使通过系列稀释以入链为基准调节为1 μ g/mL浓度的抗体与其反应。之后，与上述同样地进行ELISA，评价变异体对于ADl的结合能力。关于121、123、1对、1沈位的氨基酸，在按照保守性氨基酸进行氨基酸取代时，大部分保持了对于ADl的结合能力(图3)。但是，关于125位的脯氨酸， 在利用其他所有天然型氨基酸(19种)进行取代时，均未确认到对于ADl的结合能力(图 4)。由此表明，在本发明中的EV2038的⑶R-H3中，125位的脯氨酸是该抗体的ADl结合特性所必需的氨基酸。
(6) EV2038 的 CDR-H3 变异体的制作 3关于非保守性氨基酸取代中对于ADl的结合能力未降低的氨基酸残基(117 120 位、122位、127 132位的共11个残基)，也利用同样的方法实施保守性氨基酸取代，并确认ADl的结合能力的评价。结果可知具有该区域中的保守性氨基酸取代的变异体(V117L， V117I, T118S, T118K, R119K, R119T, D120E, D120A, E122D, E122A, D127E, D127A, Y128F, Y128W, Y129F, Y129W, M130F, M130I, D131E, D131A, V132Y, V132S)，与非保守性氨基酸取代时同样，保持了 ADl的结合能力(图5)。(7) EV2038 的 CDR-H3 变异体的制作 4在非保守性氨基酸取代时对于ADl的结合能力降低的氨基酸残基中，以除125位的脯氨酸以外的残基(121、123、1M和1 位的共四个残基)为对象，制作共四种在两处或四处同时进行取代的变异体(两处取代体I124V/G126A，I1MV/GU6S ；四处取代体 L121I/W123Y/I124V/G126A, L121I/W123Y/I124V/GU6S)，评价对于 ADl 的结合能力。结果可知，这些重复取代的变异体均保持了对于ADl的结合能力(图6)。(8)EV2038 的 CDR-H3 变异体的制作 5在非保守性氨基酸取代时对于ADl的结合能力降低的氨基酸残基中，以除125位的脯氨酸以外的残基(121、123、1M和1 位的共四个残基)为对象，制作缺失、插入的各一种变异体(E122del和GU6_D127insE)，评价对于ADl的结合能力。结果，E122del和 GU6_D127insE对于ADl的结合能力均完全消失。由此暗示该部位(121 1 位)的氨基酸残基数(6个残基)对于与ADl的结合很重要(图7)。综合这些结果，认为EV2038的⑶R-H3的氨基酸序列为下述的共有序列。XnXnXnXnXlXnX2X3PX4XnXnXnXnXnXn (序列号 22)其中，Xn =所有天然型氨基酸& = L、I、V、F 或 AX2 = W、γ 或 F)(3 = I、V、L 或M)(4 = G、S、A 或 T(9) EV2038的CDR-H2变异体的制作为了考察CDR-H3以外的保守性取代是否影响对于ADl的结合能力，利用与其他变异体同样的方法，制作使位于EV2038的CDR-H2中的N79变为N79Q的变异体，并确认对于 ADl的结合能力。该结果证明，即使是使位于⑶R-H2中的N79变为N79Q的变异体，也未丧失对于ADl的结合能力(图8)。需要说明的是，本项中制作的变异体的H链的氨基酸序列(也含有信号序列)的序列号的一览示于表4。[表 4]
权利要求
1.一种抗体或其抗原结合片段，与人巨细胞病毒HCMV的gB糖蛋白的ADl区域结合， 其识别存在于ADl区域中的序列号25的氨基酸序列、序列号沈的氨基酸序列和序列号27 的氨基酸序列构成的不连续序列作为表位。
2.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体为与人巨细胞病毒HCMV的gB糖蛋白的ADl 区域特异性结合、且能够中和其生物活性的单克隆抗体，其中，(i)重链的可变区含有(a)选自由序列号13的氨基酸序列、和序列号13的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的重链⑶Rl的氨基酸序列、(b)选自由序列号14的氨基酸序列、和序列号14的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的重链CDR2的氨基酸序列、和(c)选自由序列号15的氨基酸序列、序列号15的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、和序列号22所示的氨基酸序列组成的组中的重链CDR3的氨基酸序列；以及( )轻链的可变区含有(a)选自由序列号16的氨基酸序列、和序列号16的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDRl的氨基酸序列、(b)选自由序列号17的氨基酸序列、和序列号17的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDR2的氨基酸序列、和(c)选自由序列号18的氨基酸序列、和序列号18的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列组成的组中的轻链CDR3的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其与由HCMV-gB糖蛋白的549 580 位的连续氨基酸残基构成的氨基酸序列(序列号2 和596 640位的连续氨基酸残基构成的氨基酸序列(序列号24)的区域中存在的2个以上的不连续序列构成的表位特异性结I=I ο
4.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其识别存在于HCMV-gB糖蛋白的ADl 区域中的序列号25的氨基酸序列、序列号沈的氨基酸序列和序列号27的氨基酸序列构成的不连续序列作为表位。
5.如权利要求3或4所述的抗体或其抗原结合片段，其含有⑴(a)包含序列号13的氨基酸序列的重链CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列号14的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、和(c)选自由序列号22的氨基酸序列组成的组中的重链CDR3的氨基酸序列；以及( )(a)包含序列号16的氨基酸序列的轻链CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列号17的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列号18的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其含有⑴(a)包含序列号13的氨基酸序列的重链CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列号14的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列号15的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；以及( )(a)包含序列号16的氨基酸序列的轻链CDRl的氨基酸序列、(b)包含序列号17的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、和(c)包含序列号18的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
7.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其含有(a)由序列号10的氨基酸序列、序列号10的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号10的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列构成的重链可变区(HCVR)；以及(b)由序列号12的氨基酸序列、序列号12的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号12的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列构成的轻链可变区(LCVR)。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其含有(a)包含序列号10的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)、和(b)包含序列号12的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)。
9.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其含有(a)序列号2或6的氨基酸序列、序列号2或6的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、 或与序列号2或6的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的重链(H链)； 以及(b)序列号4或8的氨基酸序列、序列号4或8的氨基酸序列中具有1个 几个氨基酸残基的缺失、取代、插入、添加或这些突变中任意两种以上的组合的突变的氨基酸序列、或与序列号4或8的氨基酸序列具有95%以上的同一性的氨基酸序列所示的轻链(L链)。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其含有(a)包含序列号2或6的氨基酸序列的重链(H链)、和(b)包含序列号4或8的氨基酸序列的轻链(L链)。
11.如权利要求1 10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为人单克隆抗体。
12.如权利要求1 11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的类 (亚类)为 IgGl(A)0
13.如权利要求1 12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其对于HCMV的实验室株AD169在人成纤维细胞存在下的50%空斑形成阻止浓度为0. 05μ g/mL (约0. 3nM)以下。
14.如权利要求1 13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其在预先用HCMV的实验室株AD169感染人成纤维细胞MRC-5的体系中，在0. 2 μ g/mL (约1. 3nM)以下具有50% 以上的细胞间感染阻止能力。
15.一种用于预防或治疗人巨细胞病毒HCMV相关疾病的医药组合物，其含有权利要求 1 14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的医药组合物，其中，HCMV相关疾病为(a)免疫缺陷状态下的 HCMV的再活化所致的间质性肺炎、视网膜炎、胃肠炎或脑炎；(b)HCMV感染由孕妇波及到胎儿所致的先天性CMV感染症；(c)由所述先天性CMV感染症引起的流产、死产、新生儿死亡； (d)所述先天性CMV感染症未致死亡时引起的低出生体重、肝脾肿大、黄疸、血小板减少性紫癜、小头畸形、精神发育障碍、智力发育迟缓、脉络膜视网膜炎或听觉障碍；或者(e)在新生儿期或婴儿期因HCMV感染而发病的肝功能异常、间质性肺炎或单核细胞增多症。
17.一种分离的核酸，其编码与HCMV gB糖蛋白的ADl区域特异性结合、且能够中和其生物活性的抗HCMV单克隆抗体或其抗原结合片段，所述核酸选自以下核酸编码选自由序列号2、4、6、8、10、12、13 18和22组成的组中的氨基酸序列的核酸、以及与该核酸在高严格条件下杂交的核酸。
18.—种载体，其中，重组有权利要求17所述的核酸。
19.一种宿主细胞，其中，导入有权利要求18所述的载体。
20.权利要求1 14中任一项所述的抗体或抗原结合片段的制作方法，其中，包括培养权利要求19所述的宿主细胞的步骤。
全文摘要
本发明提供一种医药组合物，其含有与导致各种疾病状态的人巨细胞病毒HCMV的gB糖蛋白的AD1区域特异性结合、对HCMV具有优异的中和能力的单克隆抗体及其抗原结合片段。本发明提供与HCMV的AD1区域的不连续序列特异性结合、对HCMV具有优异的中和能力和细胞间感染阻止能力的单克隆抗体及其抗原结合片段，以及含有该抗体或片段的医药组合物等。
文档编号A61P7/00GK102378814SQ201080014988
公开日2012年3月14日 申请日期2010年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者寅岛崇, 栗野里香, 高田贤藏 申请人:株式会社伊贝克