呈递空肠弯曲杆菌n-聚糖或其衍生物的肠沙门氏菌的制作方法

专利名称：呈递空肠弯曲杆菌n-聚糖或其衍生物的肠沙门氏菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，其包含至少一种空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni)pgl操纵子或其功能衍生物，并且在其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物。此外，本发明涉及其医学用途、由其制备的药物组合物、食品添加剂和饲料添加剂，以及用于治疗和/或预防弯曲杆菌感染和任选沙门氏菌感染的方法和用于制备这些沙门氏菌菌株的方法，所述弯曲杆菌感染特别是由空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌(C. lari)、大肠弯曲杆菌(C. coli)、乌普萨拉弯曲杆菌 (C. upsaliensis)和胎儿弯曲杆菌(C. fetus)引起的感染。相关
背景技术：
空肠弯曲杆菌(C. jejuni)是食物传播的病原体，它是发达国家人急性胃肠炎的主要病因。它的常规宿主是家畜，特别是鸡和牛。空肠弯曲杆菌感染也与若干长期后果有关，最严重的就是自身免疫性疾病Miller-Fisher综合征和格-巴(Guillain-Barr6)综合征。它们是由针对病原体表面上哺乳动物神经节苷脂结构的模拟的哺乳动物宿主抗体所引发，该病原体然后也攻击宿主本身的神经节苷脂。这种分子模拟是为什么现在没有可用的针对空肠弯曲杆菌的有效疫苗的原因之一，因为它排除了使用减毒或杀死的空肠弯曲杆菌细胞作为疫苗。美国专利2007/06M61教导了一种由任选体外连接载体蛋白的至少一种空肠弯曲杆菌荚膜多糖(CPQ组成的疫苗。注射该缀合物到小鼠或猿中保护了它们免受之后空肠弯曲杆菌的鼻内攻击。制备这种疫苗需要分离和纯化CPS，以及化学连接到载体蛋白和进一步的纯化步骤。Poly 等 anfection and Immunity, 75 :3425-3433,2008)描述了当前作为候选疫苗测试的缺乏神经节苷脂模拟结构的空肠弯曲杆菌菌株。糖基化一度被认为是特有的真核现象，但后来被证明在古生菌和真细菌领域中均广泛存在。比起真核糖蛋白中观察到的，细菌的0-连接和N-连接与更广范围的糖形成。原核生物中蛋白的糖苷N-糖基化在空肠弯曲杆菌中首次得到证明(Szymanski等，Molecular Microbiology 32 1022-1030，1999)。空肠弯曲杆菌的糖基化机制已被表征，且甚至已成功地转移给大肠杆菌，在大肠杆菌中证实了蛋白质的活性N-糖基化(Wacker等，Science, 298 :1790-1793,2002).称为pgl的空肠弯曲杆菌基因座(用于蛋白质糖基化)参与多种蛋白质的糖基化。它的突变沉默导致多种蛋白质免疫原性的丧失。美国专利申请2006/01657 Al鉴定了一种特异和高免疫原性的七糖，其为至
少几种弯曲杆菌种和许多作为人和兽病原体重要的菌株所共有。该七糖有如下的结构式 ⑴GalNAc-al, 4-GalNAc-al, 4-[Glc- β _1，3] GalNAc-al，4-Gal-NAc-al， 4-GalNAc-al，3_Bac，其中Bac(亦称为杆菌胺(kicillosamine))是2，4_ 二乙酰氨基_2，4，6三脱氧-D-吡喃葡萄糖，GalNAc是N-乙酰基-半乳糖胺，Glc是葡萄糖。该聚糖部分是多种糖蛋白的组分。在空肠弯曲杆菌中，N-聚糖对于空肠弯曲杆菌与宿主细胞的相互作用是重要的。糖基化机制的突变导致小鼠肠道建群(colonization)减少。此外，含有(i)所述七糖或其缀合物或者(ii)针对所述七糖的抗体的药物组合物被建议用于家畜(尤其家禽)的接种用途。沙门氏菌属是肠杆菌科的成员。该属由兼性厌氧且生有鞭毛(能动)的革兰氏阴性杆菌组成。它们有三种主要的抗原“H”抗原或鞭毛抗原、“0”抗原或菌体抗原(LPS部分的一部分)和“Vi”抗原或荚膜抗原(在其他的肠杆菌中称作“K”)。沙门氏菌也具有革兰氏阴性菌的LPS内毒素特征。LPS由三个结构域组成脂质A部分(亦称作内毒素)通过其脂肪酸链将LPS分子锚定在外膜中。它通过由庚糖和KDO (3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸)组成的内核与含有己糖和N-乙酰己糖的外核连接。与外核的最后一个葡萄糖连接的是聚合0-抗原区。该区由16至> 100个含4-6个单糖的寡糖结构的重复组成。内毒素脂质A部分引起发热，并可激活补体、激肽和凝血因子。对于制备和呈递细菌的免疫原，沙门氏菌菌株已引人关注了一段时间。例如，通过基因组整合将编码用于志贺氏杆菌0-抗原生物合成的酶的基因整合到鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌的aroA接种菌株中，其之后能产生杂合LPS (Falt等，Microbial Pathogenesis 20 :11-30,1996) ο同样，将痢疾沙门氏菌(Salmonella dysenteriae) 0_抗原生物合成所需的簇克隆到稳定表达载体中，然后将稳定表达载体转移到伤寒热接种菌株Ty21a中。所得菌株产生杂合LPS，并诱导针对痢疾沙门氏菌攻击的保护性免疫(DE Qui Xu等，Vaccine 25 :6167-6175,2007)。美国专利6，399，074 Bl公开了一种活体减毒沙门氏菌疫苗，用于保护鸟类免受禽类致病性革兰氏阴性微生物的感染。该疫苗是重组的沙门氏菌菌株，其表达禽类致病性革兰氏阴性微生物的0-抗原，例如在家禽中致病的大肠杆菌078。重组沙门氏菌菌株因为 0-抗原聚合酶rfz (新基因术语wzy)中的突变而不表达沙门氏菌0-抗原。鉴于上述现有技术，本发明的目的是提供一种安全有效、易于大规模生产、长效且廉价的疫苗组合物，用于预防和/或治疗人和动物中的弯曲杆菌感染，特别是家畜、更特别是家禽中的弯曲杆菌感染。该目的的解决是通过在第一方面提供肠沙门氏菌，其包含至少一种空肠弯曲杆菌 Pgl操纵子或其功能衍生物，并且在其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其 N-聚糖衍生物。可用于本发明的沙门氏菌菌株可以是被或可被充分减毒以使得能够将其以活和/ 或死的形式不致病地给予人和/或动物的任何菌株。优选的沙门氏菌菌株是选自以下的肠沙门氏菌菌株鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、海德尔堡沙门氏菌(Salmonella heidelberg)、鸡沙门氏菌(Salmonella gallinorum)、哈达尔沙门氏菌(Salmonella hadar)、阿哥纳沙门氏菌(Salmonella agona)、肯塔基沙门氏菌(Salmonella kentucky)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)菌株，更优选鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)菌株。鼠伤寒沙门氏菌尤其可用于接种目的，因为基因组序列已经充分表征，并且许多动物研究证实了其安全的医学应用。本文所用术语“pgl操纵子”指能够将由本发明的沙门氏菌菌株产生的同源或异源结构N-糖基化的任何生理学活性N-糖基化空肠弯曲杆菌基因簇。空肠弯曲杆菌的pgl操纵子编码为合成空肠弯曲杆菌N-聚糖七糖、将其转运通过内膜和转移至蛋白质所需的所有酶。PglD、E、F编码参与杆菌胺生物合成的酶，I^glC将磷酸化杆菌胺转移至十一异戊烯磷酸，而Ι^1Α、Η和J添加GalNAc残基。分支的Glc通过I^glI连接。已完成七糖的转移通过I^glK的作用完成，而寡糖基转移酶I^glB将N-聚糖转移至蛋白质。pgl操纵子的功能衍生物是衍生自任何空肠弯曲杆菌pgl操纵子的基因簇，该操纵子具有核苷酸或完整基因的缺失、突变和/或取代，但仍然能产生可与由本发明的沙门氏菌菌株产生的同源或异源结构连接的可连接的寡糖或多糖。可将一种或多种Pgl操纵子或其衍生物整合到沙门氏菌菌株的染色体中，或者可将它/它们作为至少一个质粒的一部分引入。优选染色体整合，因为它相比质粒载体更为稳定，质粒载体在增殖过程中可能发生丢失。应当注意，本发明的沙门氏菌菌株可包含产生一种或多种N-聚糖或其衍生物的多于一种的Pgl操纵子或其衍生物。事实上，优选本发明的菌株具有产生多于一种N-聚糖结构的多于一种类型的Pgl操纵子，其对于在人或动物中引发针对不同的空肠弯曲杆菌菌株的更多样化的免疫应答可能是有利的。也应当注意，空肠弯曲杆菌N-聚糖的表达水平可任选通过使用pgl操纵子上游的不同启动子调节，启动子包括但不限于核糖体蛋白基因(例如spc或rpsm)的启动子以及来自抗生素抗性编码基因(如bla或类似基因)的启动子，优选强启动子。这种类型的调节可用于质粒编码的Pgl操纵子或是基因组整合的Pgl操纵子。此外，质粒稳定性可任选通过在质粒上包含必需基因同时在本发明的沙门氏菌菌株基因组中缺失这些基因来增强。 优选的靶标涵盖例如编码t-RNA转移酶(如CysS)的基因。在一个优选的实施方案中，本发明的沙门氏菌菌株是包含至少一种pgl操纵子的菌株，其中通过突变和/或部分或完全缺失使用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因失活，优选通过部分和/或完全缺失D、E、F、G基因。在一个最优选的实施方案中，pgl操纵子的pglE、F和G基因完全缺失，pglD基因部分缺失，例如pglD开放阅读框(ORF)在270个碱基对之后终止(全长ORF包含612个碱基对)。在另一个优选的实施方案中，使pgl操纵子的pglB基因失活，意指对应的寡糖基转移酶B不表达或至少失去酶活性。pglB基因产物将N-聚糖转移到下文进一步描述的特异性多肽接受位点。转移酶失活导致N-聚糖或N-聚糖衍生物与沙门氏菌0-抗原接纳体脂质A核心专一地结合。在一个最优选的实施方案中，pgl衍生物中，使用于杆菌胺生物合成(pgD、E、F、G) 和转移的一个或多个基因失活，且也使PglB基因失活。该实施方案导致GIcNAc交换为杆菌胺，引起增加的细胞呈递以及修饰七糖转移到脂质A核心而非多肽接纳体。至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物可以是由任何空肠弯曲杆菌 Pgl操纵子或其功能衍生物产生的任何N-聚糖。当然优选N-聚糖仍然有免疫原性，即引发空肠弯曲杆菌特异的免疫应答。在一个优选实施方案中，N-聚糖是上述式(I)的七糖，即GalNAc-al， 4-GalNAc-al,4-[Glc- β -1,3]GalNAc-al,4-Gal-NAc-al,4-GalN Ac-al，3_Bac，其中 Bac (亦称为杆菌胺)是2，4- 二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖。其中用于杆菌胺生物合成的基因失活、优选大部分或完全缺失的优选pgl操纵子，导致合成N-聚糖衍生物，即式(II)的七糖，为GalNAC-al，4-GalNAC-al，4-[GlC-i3-l， 3]GalNAc-al，4-Gal-NAc-al，4-GalN Ac-al，3-GlcNAc。意想不到地，式(II)的N-聚糖衍生物以比式⑴的N-聚糖高的量呈递在本发明的沙门氏菌菌株细胞表面上，且也有免疫原性。这在下文实施例部分通过实验证实。在一个优选的实施方案中，由至少一种pgl操纵子或其衍生物产生的N-聚糖或衍生物可与最终被转移至细胞表面并在细胞表面上呈递的至少一种同源或异源沙门氏菌多肽连接。优选地，至少一种N-聚糖或N-聚糖衍生物与含有至少一种共有序列肽段N-Z-S/ T (见Nita-Lazar M等，Glycobiology. 2005 ； 15 (4) :361-7)的多肽连接，该共有序列肽段优选D/E-X-N-Z-S/T(SEQ ID NO :1)，其中X和Z可以是非Pro的任何天然氨基酸(见Kowarik 等· EMBO J. 2006 ；25(9) :1957-66)。与N-聚糖(衍生物)连接的多肽可以是任何类型的多肽，例如纯多肽(仅氨基酸)或翻译后修饰多肽(例如脂连多肽)。对于作为N-聚糖(衍生物)载体的异源多肽，优选地，它们包含将N联缀合物导向细胞外膜的信号序列 MKKILLSVLTTFVAVVLAAC(SEQ ID NO :2)，其中 LAAC 基序(SEQ ID NO: 3)用于酰化将多肽锚定在外膜上的半胱氨酸残基(亦参见Kowarik等，EMBO J. 5月3日； 25(9) 1957-66，2006)。在最优选的实施方案中，由至少一种pgl操纵子或其衍生物产生的至少一种N-聚糖或其衍生物与沙门氏菌脂质A核心或其等功能衍生物连接。沙门氏菌的脂质A核心是由己糖、N-乙酰己糖、庚糖和KDO (3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸)组成的寡糖结构，其通过两个葡糖胺与将该结构锚定到细菌外膜中的六个脂肪酸链连接。脂质A核心的等功能衍生物能够接纳一种或多种聚糖或其衍生物，并将它们呈递到细胞表面上。应当注意，在该情况下， N-聚糖或其衍生物不是N-连接的，因为沙门氏菌结构脂质A不是多肽。N-聚糖优选与脂质A核心或其等功能衍生物中的GlcII连接。优选地，至少一种N-聚糖或其衍生物占据LPS (脂多糖)中0-抗原侧链的位置。 沙门氏菌的内和外脂质A核心保持不变，而0-抗原生物合成通过wbaP的突变而废止。N-聚糖然后通过0-抗原连接酶WaaL转移，并与脂质A外核心寡糖结构的GlcII残基连接。优选且对于医学用途非常重要的是，本发明的沙门氏菌菌株当以活的和/或失活形式给予动物或人时不引发致病作用。技术人员知道许多通过突变对有毒力的沙门氏菌种减毒的方法。用于本发明中对沙门氏菌菌株减毒的优选突变选自pab、pur、ar0、ar0A、asd、 dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、 poxA和galU。可存在这些突变中的一种或多种。更优选突变aroA、cya和/或crp。沙门氏菌的0-抗原生物合成基因在rfb基因座中成簇，该基因座是沙门氏菌染色体的高变DNA区。已将部分或完全失活与沙门氏菌菌株的减毒相关联。另一方面，0-抗原也是在宿主中诱导免疫的重要抗原决定簇。在一个特别优选的实施方案中，本发明的沙门氏菌菌株通过0-抗原表达的部分或完全失活减毒，优选通过rfb基因簇中、更优选WbaP基因中的一个或多个突变和/或缺失，最优选wbaP基因的缺失。应当理解，本文所用术语“rfb基因座”和“wbaP基因”意在涵盖能够表达0-抗原或相关抗原的任何沙门氏菌菌株中的任何对应基因座和基因。
WbaP基因产物是磷酸半乳糖基转移酶，其通过将磷酸半乳糖添加到十一异戊烯磷酸来开始0-抗原生物合成。其失活/缺失导致0-抗原合成的完全废止，0-抗原合成的糖产物与空肠弯曲杆菌N-聚糖(衍生物)竞争脂质载体十一异戊烯磷酸和通过连接酶WaaL 的转移。细菌中的Pgl基因座诱导的蛋白质N-糖基化和wzy依赖性0-抗原合成是同源过程。据发现，沙门氏菌0-抗原连接酶WaaL具有不严格的底物特异性，其可将空肠弯曲杆菌 N-聚糖转移到沙门氏菌脂质A核心。因此，在一个最优选的实施方案中，本发明的沙门氏菌菌株在WbaP基因中突变， 使磷酸半乳糖基转移酶失活。应当注意，以前没有描述该类型的0-抗原失活用于接种目的，且其优于现在已知的0-抗原阴性突变体，因为它被遗传限定且使得能够增加沙门氏菌菌株细胞表面上呈递的空肠弯曲杆菌N-聚糖(衍生物)的量。因此，作为一项独立发明，本发明还涉及在WbaP基因中突变(优选缺失)且从而失活的沙门氏菌菌株，其可用于沙门氏菌菌株的疫苗用途，同样也可用于作为异源抗原 (优选糖基化抗原，更优选N-糖基化抗原)载体的沙门氏菌菌株。在一个最优选的实施方案中，本发明涉及肠沙门氏菌，优选鼠伤寒血清变型菌株， 其(a)包含(i)至少一种空肠弯曲杆菌pgl操纵子或其功能衍生物，优选至少一种Pgl操纵子，其中用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因失活，和(ii)导致0-抗原生物合成完全失活的WbaP基因中的突变和/或缺失，(b)并在其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物，优选(I)GalNAc-al，4-GalNAc-al，4_[Glc- β -1,3]GalNAc-al，4-Gal-NAc-al，4-GalNAc-al，
3-2，4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖和 / 或(II) GalNAc-al, 4-GalNAc-al,
4-[Glc-β -1,3]GalNAc-al，4-Gal-NAc-al，4-GalNAc-al，3-GlcNAc。上述的本发明沙门氏菌菌株是高度免疫原性的，且产生针对空肠弯曲杆菌感染的免疫应答。此外，一旦被制备，它们便可容易地增殖和大规模生产。作为一项附加优势，将其给予动物或人提供针对空肠弯曲杆菌感染和沙门氏菌感染的免疫。它们可作为死的或活的疫苗给予，活的疫苗使得能够在宿主中长期增殖和维持免疫刺激以及无佐剂的完全免疫应答。因此，本发明还涉及本发明活或死的沙门氏菌菌株的医学用途，特别是用于制备药物，优选疫苗。优选地，所述药物可用于预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染和任选沙门氏菌感染，感染优选家畜、更优选牛和家禽、最优选家禽(例如鸡、火鸡、鹅和鸭)中的感染。本发明的第三方面涉及药物组合物、食品或饲料(添加剂)，其包含死或活的本发明肠沙门氏菌和生理学上可接受的赋形剂。例如，本发明的药物组合物可通过包含至少一种质粒编码的或染色体整合的pgl 操纵子或其衍生物的本发明沙门氏菌株的中等或大规模培养来制备。这些沙门氏菌可直接用于或经配制以适应特定的人或动物靶标和特定的给药途径。因为明显的原因，优选包含活的沙门氏菌的药物组合物。备选地，本发明涉及用于人或动物、优选家畜、更优选家禽的食品或饲料，其包含死或活的本发明肠沙门氏菌和生理学上可接受的赋形剂和/或食物。例如，这样的饲料极大地减少家禽群的空肠弯曲杆菌建群，因此降低人被空肠弯曲杆菌感染以及通过污染的肉感染沙门氏菌的机会。本发明的第四方面涉及用于治疗和/或预防空肠弯曲杆菌感染和任选沙门氏菌感染的方法，包括将本发明的肠沙门氏菌、药物组合物、食品或饲料按生理学有效量给予有需要的人或动物。对于治疗和/或预防用途，本发明的药物组合物可以任何常规剂型以任何常规方式给药。给药途径包括但不限于静脉内、肌内、皮下、鼻内、滑膜内、通过输注、舌下、透皮、口服(例如管饲法)、局部或通过吸入。优选的给药模式是口服、静脉内和鼻内，最优选口服和鼻内。 本发明的沙门氏菌可单独给药或与包括其它活性成分在内的佐剂联合给药，该佐剂增强细菌的稳定性和/或免疫原性、有助于给予包含它们的药物组合物、提供增加的溶解性或分散性、增加增殖活性、提供辅助治疗等。本文所述的沙门氏菌药学剂型包含本领域普通技术人员已知的药学上可接受的载体和/或佐剂。这些载体和佐剂包括，例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、 血清蛋白、缓冲物质、水、盐、电解质、基于纤维素的物质、明胶、水、凡士林、动物油或植物油、矿物油或合成油、盐水、葡萄糖或其他糖和二醇化合物(例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)、抗氧化剂、乳酸盐(酯)等。优选的剂型包括片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、 乳剂、可复溶的粉剂和透皮贴剂。制备剂型的方法是公知的，例如参见H. C.Ansel和 N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第 5 片反，Lea and Febiger (1990)禾口尤其 Pastoret 等，Veterinary Vaccinology, Elsevier 1999 年 3 月)。剂量水平和要求为本领域所熟知，并可由本领域技术人员从适合特定患者的可用方法和技术中选择。本领域技术人员将认识到，可能需要较低或较高的剂量，视具体因素而定。 例如，特定的剂量和治疗方案取决于例如患者(人或动物)的一般健康特征、患者病症的严重性和疗程或对病症的处置和治疗医师或兽医的判断。在口服疫苗的一个优选实施方案中，方案组成如下将包含质粒上的或整合到染色体中的Pgl操纵子或其衍生物的沙门氏菌以每只小鸡大约106cfu(菌落形成单位)在小鸡孵化后的第1或2天给予，以及在孵化后第14或21天使用相同量的细菌进行加强免疫。 这两次给予为免疫系统提供足够的刺激，以建立针对空肠弯曲杆菌N-聚糖或其衍生物以及沙门氏菌蛋白质的应答，对之后小鸡的建群提供保护。接种小鸡的备选方法是在孵化后第1或2天通过静脉内注射灭活(例如，热灭活或福尔马林灭活)的细菌，以及在第14或 21天进行加强免疫。作为进一步的选择，小鸡也可在直到3周龄的较晚时间点通过静脉内使用热灭活或福尔马林灭活细菌或者胃内使用活的细菌仅接种一次。最后但非最不重要地，本发明涉及一种制备本发明肠沙门氏菌的方法，其包括以下步骤(i)优选通过至少一种质粒载体或通过基因组整合，将至少一种空肠弯曲杆菌 Pgl操纵子或其功能衍生物、优选至少一种Pgl操纵子引入肠沙门氏菌，其中用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因、优选所有基因失活，和(ii)优选在wbaP基因中引入导致0-抗原生物合成完全失活的突变和/或缺失。
接下来，参照特定实施方案和实验进一步说明本发明，它们不应被理解为限制由所附权利要求提出的本发明的范围。附1是在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌上展示的空肠弯曲杆菌N-聚糖示意图。A)显示空肠弯曲杆菌N-聚糖到产生0-抗原且以pgl_操纵子(“mut”是指I^glB 通过2个点突变失活)为特征的菌株中的鼠伤寒沙门氏菌脂质A核心的转移；B)显示无任何0-抗原且以pgl3_操纵子为特征的鼠伤寒沙门氏菌AwbaP菌株， pgl3mut操纵子中缺失用于杆菌胺生物合成的基因；C)阐明pgl3mut操纵子中的缺失。图2证明了空肠弯曲杆菌N-聚糖在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌上的展示A)显示携带所示质粒的野生型和AwbaP鼠伤寒沙门氏菌菌株的蛋白酶K处理的全细胞提取物的SDS-PAGE的抗空肠弯曲杆菌N-聚糖免疫印迹，和证明空肠弯曲杆菌N-聚糖在鼠伤寒沙门氏菌脂质A核心上的展示。B)是蛋白酶K处理的野生型和AwbaP鼠伤寒沙门氏菌全细胞提取物的银染 SDS-PAGE (左侧图)和SDS-PAGE的抗沙门氏菌B群0-抗原免疫印迹(右侧图)。它证实 AwbaP菌株中缺乏聚0-抗原。C)显示带有整合的空载体(对照)或整合的pgl3_操纵子的AwbaP鼠伤寒沙门氏菌菌株的SDS-PAGE的抗空肠弯曲杆菌N-聚糖免疫印迹，和证明空肠弯曲杆菌N-聚糖通过整合的pgl3_操纵子在AwbaP鼠伤寒沙门氏菌脂质A核心上的表达。D)在左侧图中描述了使用热杀死AwbaP鼠伤寒沙门氏菌静脉内感染鼠的血清的免疫印迹，其展示在还原端带有GIcNAc且由pgl3mut编码的空肠弯曲杆菌N-聚糖。识别野生型空肠弯曲杆菌细胞和81-176pglB空肠弯曲杆菌细胞是明显的。右侧图显示小鼠血清免疫印迹分析中所用样品的考马斯染SDS-PAGE。图3描述了用于证明AwbaP鼠伤寒沙门氏菌减毒的体外测试A)显示AwbaP鼠伤寒沙门氏菌对人血清中补体的敏感性增加补体介导杀死卡那霉素抗性的鼠伤寒血清变型野生型菌株M939、0-抗原阴性AwbaP: cat (SKIll)和补体突变型(complemented mutant) AwbaP: :pKI9(SKI33)的测试通过将野生型、AwbaP 禾口 AwbaP: :pKI9(SKI33)沙门氏菌的1 1 1混合物与20%人血清或20%热灭活人血清一起孵育所示的时间点。通过涂板到分化培养基上来分析存活。B)描述了除使用热灭活血清的不同之外的A)中实验设置的结果。在存活方面没有菌株受到影响。C)阐述了 AwbaP鼠伤寒沙门氏菌在游动性方面相比野生型鼠伤寒沙门氏菌和非运动性菌株fliGHI:TnlO的缺陷。图4证明AwbaP鼠伤寒沙门氏菌在与野生型鼠伤寒沙门氏菌的共感染实验中建群能力降低。A)图示在感染后第1-3天的粪便中和感染后第4天的盲肠内含物中测定的 ΔwbaP(SKI 12)和野生型鼠伤寒血清变型的竞争指数(Cl ；(突变型/野生型)输出/(突变型/野生型)输入)，证明AwbaP鼠伤寒沙门氏菌与野生型相比建群能力降低。B)感染后第4天在mLN、脾和肝中的Cl。实施例细菌菌株和牛长条件用于实施例所列实验的细菌菌株汇总于表1。将细菌培养在Luria-Bertani (LB) 培养基(10g/l Bacto胰蛋白胨、5g/l Bacto酵母提取物、5g/l NaCl)中。LB琼脂平板补充有1. 5% (w/v)琼脂。抗生素按如下终浓度使用氨苄青霉素(amp) 100 μ g/ml，卡那霉素 (kan) 50 μ g/ml，氯霉素(cam) 25 μ g/ml，链霉素(str印)50 μ g/ml，四环素(tet) 10 μ g/ml。实施例1-空肠弯曲杆菌N-聚糖在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌脂质A核心上的展示Wzy依赖性0-抗原生物合成和空肠弯曲杆菌N-聚糖生物合成是同源过程 (Feldman 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ； 102 (8) :3016-21，2005)，二者都是从寡糖结构在十一异戊烯磷酸连接体上的装配开始。对于联合两条途径以将空肠弯曲杆菌N-聚糖展示在沙门氏菌脂质A核心上的可能性，探究了两条途径的同源性及鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌0-抗原连接酶WaaL不严格的底物特异性(Falt等，Microbial Pathogenesis 20 :11-30, 1996 ；De Qui Xu 等，Vaccine 25 :6167-6175,2007) 将含有带失活I^glB的空肠弯曲杆菌pgl_操纵子的质粒(pACYCpglmut ；Wacker等 2002)通过电穿孔引入鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌菌株中。作为阴性对照，使用相应的空载体PACYC184。通过SDS-PAGE和随后使用抗空肠弯曲杆菌N-聚糖抗血清的免疫印迹来测试转化突变型的糖缀合物的空肠弯曲杆菌N-聚糖展示(Amber 2008)。样品如下制备将20D_/ ml当量的含有pACYC184或pACYpgl_的鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌对数期生长培养物以16，OOOg离心2min，弃去上清液。将细胞重悬于100 μ 1 L3mmli样品缓冲液(0. 065M Tris-HCl pH 6.8,2% SDS(w/v),5% β-巯基乙醇(ν/ν)、10% 甘油(ν/ν)、0. 05% 溴酚蓝 (w/v))，并在95°C裂解5min。冷却到室温后，加入蛋白酶KO^ibco/Life Technologies) (终浓度为0. 4mg/ml)，并在60°C孵育lh，然后将等份上样到15 %十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中。为检测空肠弯曲杆菌N-聚糖，使用抗空肠弯曲杆菌 N-聚糖的兔多克隆抗血清(S. Amber，博士论文，ETH Zurich, Department of Biological Science. Zurich, 2008) 使用制造商推荐的山羊抗兔IgG-HRP缀合物(Santa Cruz)和 ECL (Amersham)完成信号的可视化。当细胞中含有pACYCpglmut时，可在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌脂质A核心上检测到空肠弯曲杆菌N-聚糖(图2A泳道2)，但是若将空载体时引入细胞中时，则检测不到(图 2A泳道1)。这表明，鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌WaaL将空肠弯曲杆菌N-聚糖从十一异戊烯磷酸转移到脂质A核心。实施例2-在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌中构建WbaP缺失和增加空肠弯曲杆菌 N-聚糖在0-抗原阴性菌株中的展示假定0-抗原生物合成缺失废止0-抗原生物合成途径和空肠弯曲杆菌N-聚糖生物合成之间对脂质载体十一异戊烯磷酸的竞争。按照所述(Datsenko和 Wanner，PNAS USA97(12) :6640-5,2000)构建野生型鼠伤寒沙门氏菌SL1344的wbaP缺失突变型。合成与质粒pKD3的模板DNA退火的引物RfbPHlPl (序列见表1)和RfbP H2P2，质粒pKD3携带两侧为FRT (FLP识别靶标)位点的氯霉素抗性基因。这些引物也含有对应紧邻wbaP基因上游和下游的区的40-45个另外的核苷酸。按照所述(Datsenko和Warmer，见上文)，它们用于扩增用于wbaP基因框内缺失的基因盒。在鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株SL1344中来自质粒pKD46的λ红色重组酶(λ Red recombinase)的阿拉伯糖诱导的表达后，重组酶与通过电穿孔引入的PCR产物的氯霉素盒交换靶基因。通过涂板到氯霉素板上37°C过夜选择转化突变型，并通过PCR证实cat基因在基因组中正确位置的存在情况。所得氯霉素抗性克隆(wbaP::cat)称为SKIll。移除氯霉素抗性盒可通过使用编码识别侧翼FRT区的FLP重组酶的pCP20，所得菌株经PCR验证后称为 SKI12(亦参见 Hg, Endt 等，Inf. Immun.，77，2568，2009 年 6 月)。所得菌株的糖缀合物的表型分析通过SDS-PAGE和随后银对糖缀合物的染色来进行。对于SDS-PAGE，样品如下制备将20D6QQ/ml当量的野生型鼠伤寒沙门氏菌或AwbaP鼠伤寒沙门氏菌(SKI12)的对数期菌生长培养物以16，OOOg离心aiiin，弃去上清液。将细胞重悬于 100 μ 1 Lammli 样品缓冲液(ο. 065M Tris-HCl pH 6.8,2% SDS(w/v),5% β-巯基乙醇(ν/ν)、10%甘油(ν/ν)、0· 05%溴酚蓝(w/v))，并在95°C裂解5min。冷却到室温后， 加入蛋白酶K(Gibco/Life "Technologies)(终浓度为0. %ig/ml)并在60°C孵育lh，然后将等份上样到12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中。为检测鼠伤寒沙门氏菌0-抗原，使用沙门氏菌0抗血清B群因子1、4、5、12 (Difco)。使用制造商推荐的山羊抗兔IgG-HRP缀合物(Santa Cruz)和ECL(Amersham)完成信号的可视化。对于染色，使用 Tsai 和 Frasch 的方法(Tsai 和 Frasch, Anal. Biochem. 119(1) 115-9，1982)。野生型肠沙门氏菌中缺失编码磷酸半乳糖基转移酶的基因WbaP导致0-抗原生物合成的废止，如图2B中所示。SDS-PAGE和随后的糖缀合物银染以及SDS-PAGE和之后使用沙门氏菌B群特异性抗-0-抗血清的免疫印迹，显示鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌野生型菌株的典型脂多糖梯状图案，而在AwbaP菌株中不存在该图案。测试了该0-抗原阴性鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌AwbaP SKI12在其细胞表面上展示空肠弯曲杆菌N-聚糖的能力。通过电穿孔引入质粒pACYCpgl_或pACYC184。按照实施例1所述分析转化突变型的糖缀合物。相比含有野生型，在含有AwbaP菌株的泳道中可检测到较高强度的空肠弯曲杆菌N-聚糖(图2A泳道2对比泳道4)。当空载体pACYC184 存在于鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌AwbaP SKI12中时，检测不到空肠弯曲杆菌N-聚糖。这证明，在AwbaP菌株中更多空肠弯曲杆菌N-聚糖被转移到脂质A核心。实施例3 构建导致鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌上空肠弯曲N-聚糖展示增加的改变的空肠弯曲杆菌Pglmut操纵子在空肠弯曲杆菌中，N-聚糖被合成为七糖feilNAC5 (Glc)-Bac,其中还原末端的糖 Bac是2，4- 二乙酰氨基-2，4，6三脱氧-D-吡喃葡萄糖。在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中不合成Bac，除非异源表达空肠弯曲杆菌N-聚糖生物合成机制。在共表达空肠弯曲杆菌 N-聚糖生物合成机制的大肠杆菌野生型细胞中，合成两种不同类型的N-聚糖，一种在还原端带有Bac，一种带有GlcNAc。该现象可归因于WecA的作用，WecA是参与糖脂生物合成的 UDP-GlcNAc H^一异戊烯磷酸 GlcNAc-I-磷酸转移酶(Linton D.等，Mol. Microbiol.， 55(6) 1695-703，2005)。由于已知鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌0-抗原连接酶WaaL可将含 GlcNAc的结构转移到脂质A核心，故推断，含GIcNAc的N-聚糖相比含Bac的N-聚糖可能是更好的WaaL底物。构建pgl_操纵子，其缺失用于杆菌胺生物合成的基因，即pglD、E、F、 G。编码I^glE、F、G的基因完全缺失，而编码I^glD的基因部分缺失。改变的pgl操纵子中的 PglD开放阅读框(ORF)在270个碱基对后终止，而全长ORF包含612个碱基对。构建该改变的Pglmut操纵子的步骤是使用大肠杆菌DH5 α作为质粒增殖的宿主菌株进行，步骤如下 用Alw44I和SmaI消化pACYCpglmut DNA,然后用DNA聚合酶I Klenow片段补平Alw44I 突出端并重新连接。将所得操纵子称为pACYCpgl3mut，并转化到AwbaP菌株中。按照实施例1所述分析所得转化突变型的糖缀合物。当与野生型相比时，在含有带pgl3mut操纵子的Δ wbaP菌株的泳道中相比含有带pglmut操纵子的Δ wbaP菌株的泳道中，可检测到较高强度的空肠弯曲杆菌N-聚糖(图2A泳道5对比泳道4)。总而言之，当用抗空肠弯曲杆菌N-聚糖抗血清调查时，带pgl3mut的AwbaP菌株显示最高强度，因此证明空肠弯曲杆菌 N-聚糖展示在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌脂质A核心上的最高水平。
实施例4 将pgl3mut操纵子整合到0_抗原阴性鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌 AwbaP菌株基因组中 为保证空肠弯曲杆菌N-聚糖持续体内展示在鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌Δ wbaP 菌株脂质A核心上，将pgl3mut操纵子整合到Δ wbaP菌株SKI 12基因组中pagC基因下游。涉及带oriR6K的自杀质粒的所有克隆步骤在CC118 λ pir大肠杆菌中进行。最终整合的自杀质粒PKI15如下构建与沙门氏菌基因组中的靶区同源的512bp序列通过PCR 扩增，引物为 3' PagC Fw NotI 和 3' PagC Rev SacII (序列见表 1)。用 SacII 和 NotI 将所得DNA片段插入PSB377中，并在验证插入序列后将质粒称为pKI14。PKI15通过用BamHI 和EheI消化pACYCpgl3mut DNA及同时用BamHI和SmaI消化pKI14来构建。然后将从 pACYCpgl3mut切下的11083bp片段与pKI14骨架连接。因为将自杀质粒电穿孔到沙门氏菌菌株中的效率非常低，故首先通过电穿孔将ΡΚΙ15或ρΚΙ14引入大肠杆菌SmlO λ pir中接合。含有PKI15或pKI14的511110入？化然后与51(112接合。为了杂交，将40D600当量的含有pKI15和SKI12的SmlO λ pir对数期后期培养物离心，并用ImL LB洗涤3次。将沉淀重悬于100 μ 1 LB、混合并以3cm的直径涂布到LB琼脂平板上，然后在37°C孵育过夜。次日早晨用ImL LB将细菌从平板上洗下，并将数种稀释物涂布到LB (+str印+tet)上以选择接合体。所得菌株称为 SKi;34(SKI12: :pKI14)和 SKI!35 (SKI12: :ρΚΙ15)。为测试含有整合的pgl3mut簇或作为阴性对照的整合空载体的0-抗原阴性菌株脂质A核心上的空肠弯曲杆菌N-聚糖，按照实施例1所述制备和分析SKI34和SKI35的全细胞提取物。图2C是用抗空肠弯曲杆菌N-聚糖抗血清检测的免疫印迹，其显示在含 5ΚΙ35 的泳道2中的强信号，但是含SKI34的泳道1中没有信号。这证明了空肠弯曲杆菌N-聚糖从整合的Pgl3mut操纵子到鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌脂质A核心的有效转移。实施例5 :pgl3mut操纵子编码的聚糖的免疫原性为了研究pgl3_编码聚糖的免疫原性，用热灭活细菌SKI12+pMLpgl3_感染小鼠，并对小鼠血清测试抗空肠弯曲杆菌N-聚糖抗体。实验如下进行小鼠感染实验按照之前所述(Stecher，Hapfelmeier等，Infection Infect Immun. 2004年 7 月； 72(7) :4138-502004)，沙门氏菌感染在RCHCLJurich的单独通风的笼子中进行。对于静脉内感染，将切IO5CFU的携带pMLBAD (对照)或pMLpgl3mut的热灭活鼠伤寒沙门氏菌SL1344wbaP(SKI 12)注射到小鼠尾部静脉中。在感染后第四天分析血清后，在第36天用相同的细菌菌株再次注射小鼠并在第50天分析血清。小鼠血清分析通过针对空肠弯曲杆菌81-176和81_176pglB(阴性对照)的全细胞提取物的免疫印迹来对小鼠血清分析抗空肠弯曲杆菌抗体的产生。空肠弯曲杆菌81-176pglB不产生糖基化蛋白质，作为阴性对照。全细胞提取物通过用Iml PBS从汇合细菌生长的平板上收获空肠弯曲杆菌来制备。在用PBS调节样品至相同光密度后，通过室温16000x g离心aiiin 收集细胞。将细胞在 Lammli 样品缓冲液(0.065M Tris-HCl pH 6.8,2% SDS(w/v),5% β-巯基乙醇(ν/ν)、10%甘油(ν/ν)、0.05%溴酚蓝(w/v))中于95°C裂解5min，用PBS添加至如前所确定的相同终体积，以在每个样品中得到相同数量的细胞。这通过SDS-PAGE 分离等体积的各样品之后用考马斯蓝对蛋白质染色来证实。此外，使用糖基化和未糖基化的蛋白AcrA使针对空肠弯曲杆菌N-聚糖的免疫应答可视化。对于小鼠血清的分析，通过 SDS-PAGE分离等体积的全细胞提取物以及等量的糖基化和未糖基化的AcrA，然后将这些蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上以进行免疫印迹检测。小鼠血清在第一孵育步骤中作为第一抗血清。结合的IgG通过抗小鼠IgG-HRP缀合物(Bethyl Laboratories)鉴定。根据制造商的说明用ECL(Amersham)进行检测。

图1D)显示再次感染后61天的小鼠血清中抗空肠弯曲杆菌N-聚糖-IgG的存在情况。抗体不识别未糖基化的AcrA或未糖基化的空肠弯曲杆菌蛋白质提取物，从而证明了对多糖的特异性。用对照菌株感染小鼠血清观察不到空肠弯曲杆菌N-聚糖特异性反应(数据未显示)。 实施例6 鼠伤寒沙门氏菌Δ WbaP的减毒表型鼠伤寒沙门氏菌AwbaP的减毒通过若干体外方法和一种体内方法测试。体外方法由测试突变型以及野生型的血清抗性、移动性和对抗微生物肽模拟多粘菌素B的抗性组成。在体内共感染实验中分析AwbaP的建群能力。血清抗性分析基本按照所述(Bengoechea，Najdenski等2004)测试补体的杀菌活性。简言之，将取自对数生长培养物的鼠伤寒血清变型wbaP: :cat (SKIll)、鼠伤寒血清变型野生型SL1344菌株的卡那霉素抗性衍生菌株M939 (aph整合到sopE下游)和鼠伤寒血清变型 AwbaP: :pKI9(SKI33)细胞以等量混合(M393 为 3xl08cfu/ml ；SKIll 和 SKI33 为 4xl08cfu/ ml)，在使用前在无菌Ix PBS中稀释切104倍。将该稀释的细菌培养物与不含针对鼠伤寒血清变型LPS的抗体的20%人血清以1 1混合，并在37°C轻微搅拌下孵育。在混合后第 0、15、30min取整分试样，并通过加入脑心浸液肉汤猝灭补体活性。将整分试样置于冰上，直到涂板在LB (str印、kan)上以选择野生型、涂板在LB (Sm、Cam)上以选择wbaP: cat和涂板在LB(Sm、Tet)上以测定Δ wbaP: :pKI9CFU。用其中补体在56°C热灭活30min的血清进行相同实验。数据显示为log CFU平均值士标准差。图3A显示AwbaP鼠伤寒沙门氏菌的血清抗性比野生型降低在与20%人血清孵育30min之后，AwbaP的数目减少为孵育期开始时的六十分之一。图3B描述作为阴性对照的与热灭活血清一起孵育的相同菌株。游动性测定因为细菌的游动性是已知的毒力因子，故在软的琼脂平板(0. 3% (w/v)琼脂、5g/1 NaClUOg/1 Baceto胰蛋白胨)上测试细菌的游动性。将1 μ 1鼠伤寒血清变型野生型 (SL1344)、鼠伤寒血清变型Δ wbaP (SKI 12)、鼠伤寒血清变型Δ wbaP: :pKI9 (SKI33)或鼠伤寒血清变型fliGHI: :Τη10(Μ933)的过夜培养物点在平板中央，通过在37°C孵育4. 75h和 9.证后测量可见菌斑的直径来定量游动性。每个实验均在两个不同的地方做三个重复，数据显示为平均值士标准差。如图3C中所示，AwbaP(SKI12)的游动性与野生型相比大大降低，但仍高于非游动性对照fliGHI: TnlO。多粘菌素B抗件分析在使用前，将10D_/ml当量的鼠伤寒血清变型野生型SL1344菌株或鼠伤寒血清变型AwbaP(SKI12)的指数生长培养物离心，重悬于150 μ 1冷的无菌Ix PBS中并稀释 5 X IO6倍。对于测定，将45 μ 1稀释的培养物与5 μ 1多粘菌素B (Sigma，1 μ g/ml终浓度) 或5μ1 PBS混合，并在37°C轻微搅拌下孵育lh。加入80μ1 LB后，将细菌涂板于含链霉素的LB琼脂平板上。存活率(survival efficiency)通过将肽处理培养物的CFU(菌落形成单位)除以未处理培养物的CFU再乘以100来计算。测定通过两次独立实验各进行三次， 数据显示为平均值士标准差。图3D中证实AwbaP鼠伤寒沙门氏菌的多粘菌素B抗性相比野生型降低。AwbaP在共感染实验中的津群能力在共感染实验中测试AwbaP鼠伤寒沙门氏菌的建群能力，其中用AwbaP突变型和野生型菌株胃内感染小鼠。通过管饲法用20mg链霉素预处理C57BL/6小鼠(SPF ；RCHCI， Zurich的群体)。24h后，对小鼠接种5 X IO7CFU的所示的鼠伤寒血清变型菌株或菌株混合物。按照之前所述(Barthel,Hapfelmeier等2003)，通过涂板到MacConkey琼脂平板(含 50yg/ml链霉素)上测定新鲜粪粒、肠系膜淋巴结(mLN)、脾和盲肠内含物中的细菌载量 (CFU)。在涂板后，竞争指数(Cl)按照如下公式确定CI =(突变型/野生型)输出/ (突变型/野生型)输入。进行鼠伤寒血清变型野生型(M939)和Δ wbaP菌株(SKIll)的共感染实验。对5只链霉素处理小鼠胃内感染AwbaP菌株(SKIll)和野生型菌株的1 2混合物(共5Χ IO7CFU)。在感染后第1、2和3天的粪便中测定2种菌株的比率(Cl ；竞争指数，见材料与方法)。检测到Δ wbaP菌株数目相比野生型减少(每天一个对数级)，证明 AwbaP菌株(SKIll)与野生型鼠伤寒血清变型相比在肠道中确实具有严重的竞争缺陷(ρ > 0. 05 ；图4Α)。此外，感染后第4天两种菌株在全身性部位(mLN、肝、脾)的CI也证明鼠伤寒血清变型AwbaP(SKIU)显著的竞争缺陷。然而，缺陷不如在肠中显著(图4B)。表1 本研究中所用的用于WbaP缺失的菌株、质粒和引物鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌菌林菌林基因型和表型来源或参考SL1344野生型；strepRHoiseth, S. K.和 B. A. Stocker, Nature 291:238-239, 1981SKIllSL 1344Awdo/>: .cat; strepK, camR本研究SKI12SLU^hwbaP; strepK本研究SKI34SKI12::pKI14; strepK, tetK本研究SKI35SKI12::pKI15; strepK, tetK本研究大肠杆菌菌林
权利要求
1.肠沙门氏菌，其特征在于，其包含至少一种空肠弯曲杆菌Pgl操纵子或其功能衍生物，并且在其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物。
2.权利要求1的肠沙门氏菌，选自鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、鸡沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌、阿哥纳沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌和婴儿沙门氏菌，更优选鼠伤寒血清变型肠沙门氏菌菌株。
3.权利要求1或2的肠沙门氏菌，其包含至少一种pgl操纵子，其中通过突变和/或部分或完全缺失使用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因失活，优选通过部分和/或完全缺失基因 pgl D、E、F、G。
4.权利要求1-3中任一项的肠沙门氏菌，其包含至少一种pgl操纵子，其中通过突变和 /或缺失使PglB基因产物失活。
5.权利要求1-4中任一项的肠沙门氏菌，其中至少一种N-聚糖具有式(I) GalNAc-al，4-GalNAc-al，4_[Glc- β -1,3]GalNAc-al，4-Gal-NAc-al，4-GalNAc-al，3-Bac,其中Bac (亦称为杆菌胺)是2，4_ 二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖。
6.权利要求1-4中任一项的肠沙门氏菌，其中至少一种N-聚糖衍生物具有式(II) GalNAc-al，4-GalNAc-al，4_[Glc- β -1,3]GalNAc-al，4-Gal-NAc-al，4-GalNAc-al，3-GlcNAc。
7.权利要求1-6中任一项的肠沙门氏菌，其中所述N-聚糖或衍生物与被转移至细胞表面并在细胞表面上呈递的至少一种同源或异源沙门氏菌多肽连接，优选与含有至少一种共有序列肽段N-Z-S/T的至少一种多肽连接，所述共有序列肽段更优选D/E-X-N-Z-S/T (SEQ ID NO :1)，其中X和Z可以是非Pro的任何天然氨基酸。
8.权利要求1-6中任一项的肠沙门氏菌，其中所述至少一种N-聚糖或其衍生物与沙门氏菌脂质A核心或其等功能衍生物连接。
9.权利要求1-8中任一项的肠沙门氏菌，其中对所述沙门氏菌菌株减毒，优选通过选自以下的突变减毒pab、pur、aro、aroA、asd、dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、 htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA 禾口 galU，更优选突变 aroA、cya 禾口 crp。
10.权利要求1-9中任一项的肠沙门氏菌，其中通过O-抗原表达的部分或完全失活对所述沙门氏菌菌株减毒，优选通过rfb基因簇中、更优选wbaP基因中的一个或多个突变和 /或缺失，最优选wbaP基因的缺失。
11.权利要求1-10中任一项的肠沙门氏菌，优选鼠伤寒血清变型菌株，其特征在于，(a)其包含(i)至少一种空肠弯曲杆菌Pgl操纵子或其功能衍生物，优选至少一种Pgl操纵子，其中用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因失活，和( )导致0-抗原生物合成完全失活的wbaP基因中的突变和/或缺失，(b)并在其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物，优选(I)GalNAc-al，4-GalNAc-al，4_[Glc- β _1，3]GalNAc-al，4-Gal-NAc-al,4-GalNAc-al，3-2，4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧-D-吡喃葡萄糖和 / 或(II) GalNAc-al，4-GalNAc-al，4-[Glc-β -1,3]GalNAc-al，4-Gal-NAc-al，4-GalNAc-al，3-GlcNAc。
12.前述权利要求中任一项的肠沙门氏菌在制备药物中的用途，所述肠沙门氏菌优选活的肠沙门氏菌，所述药物优选疫苗。
13.权利要求12的用途，用于制备用于预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染和任选沙门氏菌感染的药物，优选疫苗，所述感染优选家畜、更优选牛和家禽、最优选家禽中的感染。
14.药物组合物、食品或饲料、食品或饲料添加剂，其包含前述权利要求中任一项的肠沙门氏菌和任选的生理学上可接受的赋形剂，所述肠沙门氏菌优选活的肠沙门氏菌。
15.用于治疗和/或预防空肠弯曲杆菌感染和任选沙门氏菌感染的方法，包括将肠沙门氏菌、包含肠沙门氏菌的药物组合物、食品或饲料按生理学有效量给予有需要的人或动物。
16.用于制备权利要求1-11中任一项的肠沙门氏菌的方法，包括以下步骤(i)通过至少一种质粒载体或通过基因组整合，将至少一种空肠弯曲杆菌Pgl操纵子或其功能衍生物、优选至少一种Pgl操纵子引入肠沙门氏菌，其中用于杆菌胺生物合成的一个或多个基因、优选所有基因失活，和( )优选在wbaP基因中引入导致0-抗原生物合成完全失活的突变和/或缺失。
全文摘要
本发明涉及肠沙门氏菌，其包含至少一种空肠弯曲杆菌pgl操纵子或其功能衍生物，并且在其细胞表面上呈递至少一种空肠弯曲杆菌N-聚糖或其N-聚糖衍生物。此外，本发明涉及其医学用途和药物组合物，以及用于治疗和/或预防弯曲杆菌感染和任选沙门氏菌感染的方法和用于制备这些沙门氏菌菌株的方法。
文档编号A61K39/106GK102365359SQ201080015941
公开日2012年2月29日 申请日期2010年3月25日 优先权日2009年3月27日
发明者F·施瓦茨, K·伊尔格, M·阿比, S·阿姆伯, U·阿胡贾 申请人:瑞士联邦苏黎世技术大学