专利名称：精氨酸酶的定向位点聚乙二醇化及其作为抗癌和抗病毒试剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及为增加精氨酸酶的血清或循环半衰期并提高其药代动力学性质、体内生物学活性、稳定性并降低对该酶的体内免疫反应(免疫原性)的目的而对该酶进行的修饰。更具体地说，本发明涉及通过遗传修饰编码精氨酸酶的基因使单聚乙二醇 (monopolyethylene glycol)与精氨酸酶发生的位点特异性共价偶联，以生成单-和位点-特异性聚乙二醇化精氨酸酶，这成为众多精氨酸依赖型疾病例如各种癌症和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的有效措施。
背景技术：
精氨酸酶精氨酸酶是含有受金属激活的氢氧化物离子的锰金属酶，所述离子是催化水解和水合反应的金属酶中的关键亲核物质。精氨酸酶将天然存在的精氨酸转化为鸟氨酸和尿素。所述酶存在于包括细菌和人类在内的很多活体生物中(Jenkinson等，1996，Comp Biochem Physiol B Biochem MoI Biol,114 :107-32)。精氨酸酶的聚乙二醇化精氨酸酶可以用作治疗剂并通过肠胃外施用于各种病状。然而，肠胃外施用的精氨酸酶(其是一种蛋白)可能具有免疫原性并且具有短的药理学半衰期。因此，在患者中难以实现该蛋白的治疗有用的血液水平。这些问题可以通过将该蛋白与聚合物例如聚乙二醇(PEG)偶联来克服。具有惰性的、非毒性的生物降解性聚合物PEG与分子的共价结合在生物技术和医药中具有重要的应用。据报道，具有生物学和药学活性的蛋白的聚乙二醇化提高了药代动力学，从而延长了持续时间、改善了安全性(例如更低的毒性、免疫原性和抗原性)、增加了功效、降低了给药频率、提高了药物溶解度和稳定性、降低了蛋白质水解性并促进了药物的可控释放(Roberts 等，2002，Adv Drug Deliv Rev, 54 :459-76 ；Harris & Chess，2003，Nat Rev Drug Discov,2 :214-221)。通过本领域中的常规方法生成的PEG-蛋白偶联物含有不均一的物种，各自结合有数量不定(从O至该蛋白具有的氨基数)的PEG分子。即使对于结合有相同数目的PEG 分子的物种，在该蛋白上的结合位点在这些物种之间也是不同的。然而，这种非特异性的聚乙二醇化可能得到部分无活性或基本无活性的偶联物。活性的降低可能是在PEG结合于不正确位点时遮蔽了该蛋白的活性受体结合域而造成的。因此，明确需要生成能够保留亲本蛋白的活性的均一(homogeneous)的聚乙二醇化蛋白分子并且使得临床用途所需的正确和一致的剂量的施用成为可能的更好的方法。通过氨基酸剥夺的癌症治疗氨基酸剥夺疗法是用于一些癌症治疗的有效措施。虽然正常细胞不需要精氨酸， 但是很多癌细胞系就这种氨基酸而言是营养缺陷型的。很多证据表明，体外精氨酸耗损 (利用精氨酸降解酶或使用缺乏精氨酸的介质)导致大范围的癌细胞的迅速破坏(Scott et al. ,2000, Br J Cancer，83 :800-10)。酶(其是一种蛋白)的直接使用存在免疫原性、 抗原性和短的循环半衰期的问题。通过精氨酸剥夺对病毒讲行的抑制病毒感染是死亡的主要原因之一，每年数百万的死亡病例直接归因于若干种病毒，包括肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。然而，使用目前的抗病毒疗法还存在若干问题。首先，有效的抗病毒药物相对较少。很多现有的抗病毒物质导致不利的或不希望的副作用。大部分有效的疗法(例如接种疫苗)只对单个病毒株具有高特异性。病毒经常发生突变，使得其对药物或疫苗产生抗性。需要不具有与现有技术有关的所述问题的抑制病毒复制的方法。过去30年的研究表明，病毒的体外复制需要胞外精氨酸。过去这通过如下方法来实现使组织培养物培养基缺乏精氨酸，并对作为增补物使用的血清进行透析以获得没有精氨酸的培养基。使用这种方法来实现精氨酸剥夺导致很多不同的病毒家族的复制受到抑制，所述病毒家族包括腺病毒(Rouse等，1963，Virology, 20 =357-365)和孢疹病毒 (Tankersley,1964，J Bacteriol,87 :609-13)。人类免疫缺陷病毒(HIV)获得性免疫缺陷综合征(AIDQ是一种致命的疾病，据报道，该疾病的病例在过去数年内急剧增加。AIDS病毒在1983年首次得到鉴定。该疾病具有数个名称和首字母缩略名。它是第三个已知的T-嗜淋巴细胞病毒(HTLV-III)，并且具有在免疫系统的细胞内复制的能力，导致深度的细胞破坏。AIDS病毒式一种逆转录病毒(一种在复制期间使用逆转录酶的病毒)。目前已报道有两种明显不同的HIV病毒家族，即HIV-I和HIV-2。本文中使用的首字母缩略名“HIV”一般表示人类免疫缺陷病毒。HIV复制据信是精氨酸依赖型的，因此精氨酸的消耗将抑制HIV复制。
发明内容
本发明的一个目的是提供新型的PEG-精氨酸酶偶联物，所述偶联物基本上是均一的并且具有共价结合到精氨酸酶分子上的特异性位点的PEG部分。本发明的两个优选的实施方式是Cys45-人类精氨酸酶I (HAI)和Cys161-热溶芽孢杆菌(Bacillus caldovelox) 精氨酸酶(BCA)。本发明的另一个目的是提供制备定向位点、单聚乙二醇化精氨酸酶偶联物，所述偶联物具有强力的抗癌和抗病毒效果。本发明的一个特定的实施方式包括三个基本步骤。 第一步骤是用于编码精氨酸酶的基因的遗传修饰，使所得到的精氨酸酶将在给定的位置上具有单个自由的半胱氨酸残基。第二步骤是在选定的系统中表达经修饰的基因以生成所期望的精氨酸酶。表达系统可以是人类细胞或组织或者其它的生物体，包括例如细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或转基因动物。第三步骤是精氨酸酶的所述自由的半胱氨酸残基与PEG化合物的马来酰亚胺基团(MAL)之间的偶联，这导致所述PEG 化合物与精氨酸酶的所述自由的半胱氨酸之间发生共价结合。本发明的另一个目的是提供了通过精氨酸消耗治疗病毒感染的方法。该治疗方法采用均一的单聚乙二醇化精氨酸酶来抑制病毒的复制。本发明的另一个目的是提供抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的方法。该方法采用均一的单聚乙二醇化精氨酸酶来抑制HIV的复制。本发明的另一个目的是提供通过用另外的氨基酸残基(例如脯氨酸)取代热溶芽孢杆菌精氨酸酶位置20 (或者HAI和其它精氨酸酶的对应位置)上的缬氨酸来增强精氨酸酶的酶促活性的方法。本发明的又一个目的是提供增强精氨酸酶的酶促活性的方法，所述方法通过用钴取代天然金属辅因子锰来实现。表征本发明的各种新颖性特征在所附的并构成本公开内容的一部分的权利要求书中具体指出。为了更好地理解本发明、本发明的操作优点以及使用本发明所实现的具体目标，应参考附图以及随后的其中展示并描述本发明的优选实施方式的具体实施方式
部分。
图1显示了人类精氨酸酶I的核苷酸序列(a) (SEQ ID No 1)及其根据本发明为定向位点聚乙二醇化所设计的突变核苷酸酶序列(b) (SEQ ID No 2)；热溶芽孢杆菌精氨酸酶的核苷酸序列(c) (SEQ ID No 3)及其根据本发明为定向位点聚乙二醇化所设计的突变核苷酸酶序列(d) (SEQ ID No :4)。图2显示了人类精氨酸酶I的氨基酸序列(a) (SEQ ID No :5)及其根据本发明为 Cys45定向位点聚乙二醇化所设计的经修饰的氨基酸酶序列(b)(SEQ ID No 6)；热溶芽孢杆菌精氨酸酶的氨基酸序列(c) (SEQ ID No:7)及其根据本发明为Cys161定向位点聚乙二醇化所设计的经修饰的氨基酸酶序列(d) (SEQ ID No 8)。图3显示了为Cys45定向位点聚乙二醇化所设计的人类精氨酸酶I突变体(C168S/ C303S)的核苷酸序列和氨基酸序列(a) (SEQ ID No :9和SEQ ID No :10)，为Cys45定向位点聚乙二醇化所设计的带有6XHis标签的人类精氨酸酶I突变体(C168S/C303S)的核苷酸序列和氨基酸序列(b) (SEQ ID No :11和SEQ ID No 12)的比对，为Cys161定向位点聚乙二醇化所设计的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体(S161C)的核苷酸序列和氨基酸序列(c) (SEQ ID No:13和SEQ ID No :14)，为Cys161定向位点聚乙二醇化所设计的带有6XHis标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体(S161C)的核苷酸序列和氨基酸序列(d) (SEQ ID No :15和SEQ ID No 16)的比对。图4显示了(a)野生型人类精氨酸酶I的晶体结构(使用Cn3D 4. 1软件从NCBI 网站下载)，其中示出Cys45远离活性位点；(b)野生型热溶芽孢杆菌精氨酸酶的晶体结构， 其中示出Ser161远离活性位点。图5显示了用于具有单链mPEG-马来酰亚胺(20kDa)的带有6XHis标签的人类精氨酸酶I突变体的Cys45-特异性单聚乙二醇化的偶联程序，其中示出马来酰亚胺的双键与巯基发生烷基化反应而形成稳定的硫醚键，和(b)用于带有6XHis标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体的Cys161-特异性单聚乙二醇化的对应程序。图6显示了利用含有精氨酸酶基因的大肠杆菌(E. coli)BL21-DE3在2升发酵罐中发酵的时间过程，其中示出分批发酵获得的结果(al)和补料-分批发酵获得的结果 (a2)；分批发酵的时间关系曲线图(bl)和补料-分批发酵的时间关系曲线图(1^2)，其中示出诸如温度、搅拌速率、PH、溶解氧值等参数的变化；来自螯合型FF s印harose(琼脂糖)柱的带有6XHis标签的人类精氨酸酶I突变体的洗脱曲线(c)，第一峰为蛋白杂质，第二峰为经纯化的人类精氨酸酶I ；和来自螯合型FF sepharose柱的带有6XHis标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体的洗脱曲线(d)，第一峰为蛋白杂质，第二峰为经纯化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶。图7显示了含有带6XHis标签的人类精氨酸酶I突变体(a)和带6XHis标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体(b)的不同组分的SDS-PAGE分析。图8显示了(a)没有聚乙二醇化的人类精氨酸酶I突变体和Cys45聚乙二醇化的人类精氨酸酶I突变体的SDS-PAGE分析(泳道1 蛋白分子量标记，泳道2 没有聚乙二醇化的人类精氨酸酶I突变体，和泳道3 :Cys45聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)) ； (b) 没有聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体和Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶的SDS-PAGE分析(泳道1 蛋白分子量标记，泳道2 没有聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体，和泳道3 =Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20))。图9显示了(a)腹膜内注射到BALB/c小鼠中的单剂量非聚乙二醇化的和Cys45 聚乙二醇化的人类精氨酸酶I(HAI-PEG20)的药代动力学曲线，和(b)腹膜内注射到 BALB/c小鼠中的单剂量非聚乙二醇化的和Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶 (BCA-PEG20)的药代动力学曲线。图10显示了腹膜内注射到BALB/c小鼠中长达14天的单剂量Cys45聚乙二醇化的人类精氨酸酶I (HAI-PEG20)的药效动力学曲线，和(b)腹膜内注射到BALB/c小鼠中长达 14天的单剂量Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20)的药效动力学曲线。图11显示了在研究过程中用不同药物注射的异种移植有HepIBB人类肝癌细胞的 BALB/c裸小鼠(a)、用Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶注射的异种移植有MCF-7 人类乳癌细胞的BALB/c裸小鼠(b)、用不同药物注射的异种移植有A549肺癌细胞的BALB/ c裸小鼠(c)和用不同药物注射的异种移植有HCT-15结肠直肠癌细胞的BALB/c裸小鼠(d) 的平均体重(士标准误差(s. e. m.))。图12显示了(a)非聚乙二醇化的和Cys45聚乙二醇化的人类精氨酸酶 I (HAI-PEG20)在皮下移植有H印人类肝肿瘤细胞的BALB/c裸小鼠中的体内活性(功效)；(b) Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA-PEG20)在皮下移植有MCF-7人类乳癌细胞的BALB/c裸小鼠中的体内活性；(C)Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶在皮下带有A549肺癌异种移植物的BALB/c裸小鼠中的体内功效；(d)Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶在皮下带有A549肺癌异种移植物的BALB/c裸小鼠中的体内功效 (数据表示为肿瘤体积的增大倍数的平均数士s. e. m) ； (e)Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶在皮下带有HCT-15结肠直肠癌异种移植物的BALB/c裸小鼠中的体内功效；和 (f)Cys161聚乙二醇化的热溶芽孢杆菌精氨酸酶在皮下带有HCT-15结肠直肠癌异种移植物的BALB/c裸小鼠中的体内功效(数据表示为肿瘤体积的增大倍数的平均数士s. e. m)。图13显示了 Cys45聚乙二醇化的人类精氨酸酶I (HAI-PEG20)的HIV抑制测定。图14显示了叠氮胸腺嘧啶脱氧核苷(azido-thymidine，AZT)的HIV抑制测定。图15显示了 Cys45聚乙二醇化的人类精氨酸酶I (HAI-PEG20)的细胞毒性。图16显示了带有不同金属辅因子即Mn2+和Co2+的人类精氨酸酶I的稳态动力学的比较。图17显示了热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)的V20P突变体和由Mn2+(BCAWTMn2+)或 Co2+取代的野生型BCA的稳态动力学的比较。
具体实施例方式人类精氨酸酶I基因(HAI)的克降人类精氨酸酶I的基因序列如图Ia所示(SEQ ID No 1)。通过聚合酶链式反应 (PCR)由pAED4/HAI质粒产生带有6XHis标签的人类精氨酸酶I的基因(HAI)，其中使用如下寡聚核苷酸以在5'末端产生NdeI位点和在3'末端产生BamHI位点引物HuAr07-F: 5‘ GAT. ATA. CAT. ATG. CAT. CAC. CAT. CAC 3' (SEQ ID NO : 17)和引物 HuAr08-R 5' AGT. GCA. GGA. TCC. TTA. CTT. AGG. TGG. GTT. AAG. GTA. GTC 3' (SEQ ID NO 18)。PCR 产物用 NdeI 和BamHI切割并亚克隆到pET3a表达质粒载体(Strategene)中。pET3a大肠杆菌表达质粒载体含有T7启动子。所述T7启动子定位于基因10前导序列片段的的上游。通过对人类精氨酸酶I的整个编码区进行DNA测序来证实序列的正确性(图la)。该质粒表示为pET3a/HAI。m^^fflfflfMMilSlga (BCA)的克降热溶芽孢杆菌精氨酸酶的基因序列如图Ic所示(SEQ ID No 3)。使用NdeI和 BamHI限制酶从质粒pUC57/BCA上切下带有6XHis标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶的基因 (BCA)。将插入片段亚克隆到pET3a表达质粒载体(Strategene)中。通过对热溶芽孢杆菌精氨酸酶的整个编码区进行测序来证实序列的正确性(图 Ic)。该质粒表示为pET3a/BCA。HAI的诱变使用质粒pET3a/HAI作为模板，根据QuikChange 定向位点诱变试剂盒 (Strategene)进行定向位点诱变。使用如下诱变引物(分别为SEQ ID No 19、20、21和22) 将Cys168和Cys3tl3残基的密码子分别突变为Ser168和Ser3tl3的密码子Cys168密码子突变为Ser168密码子弓丨物 HuArO I-F 5 ‘ GGG. TGA. CTC. CCT. CTA. TAT. CTG. CCA. AGG 3 ‘
引物 HuAr02-R 5 ‘ CCT. TGG. CAG. ATA. TAG. AGG. GAG. TCA. CCC 3 ‘Cys3tl3密码子突变为Ser3tl3密码子弓丨物 HuAr03-F 5 ‘ GCA. ATA. ACC. TTG. GCT. TCT. TTC. GGA. CTT. GC 3 ‘弓丨物 HuAr04-R 5 ‘ GCA. AGT. CCG. AAA. GAA. GCC. AAG. GTT. ATT. GC 3 ‘。首先将突变质粒转化到感受态大肠杆菌Top 10细胞。通过DNA测序证实突变质粒的序列。为定向位点聚乙二醇化设计的HAI突变体的基因序列如图Ib所示(SEQ ID No 2)。然后将突变质粒转化到大肠杆菌BL21-DE3细胞中进行蛋白表达。野生型HAI的氨基酸序列如图2a所示(SEQ ID No :5)。C168S/C303S突变体的氨基酸序列如图2b (SEQ ID No 6)、图3a(SEQ ID No :10)、图北(SEQ ID No :12)所示。如图2b所示，人类精氨酸酶I中的两个半胱氨酸残基被丝氨酸残基代替。这两个丝氨酸残基标有下划线。仅呈现的Cys是 Cys45。该突变体称为C168S/C303S，其只含有一个单独的Cys残基(也标有下划线)。野生型HAI的晶体结构如图如所示。根据该结构，进行用于构建C168S/C303S突变体的推理蛋白质药物设计(rational protein drug design)。在图2d中显示，热溶芽孢杆菌精氨酸酶中的一个丝氨酸残基被半胱氨酸残基代替。该半胱氨酸残基标有下划线。6XHis标签区域也标有下划线并且定位在C末端。该突变体称为S161C。带有6XHiSU^mmmmmmmmnmt使带有含突变精氨酸酶基因的质粒的大肠杆菌BL21-DE3在37°C在LB培养基中生长过夜，所述突变精氨酸酶基因编码带有6XHis标签的人类精氨酸酶I，所述LB培养基含有80 μ g/mL氨苄青霉素。将接种物按1 25稀释并使其在摇瓶中生长到OD6tltl为约0. 8， 或者按1 10稀释并使其在发酵罐中生长到0D_为约15。然后用0. 4mM IPTG对细胞进行4小时的诱导。细菌细胞通过离心收集、重悬在50mM Tris,0. IM NaClUOmM MnCl2(pH 7.4)中，并通过高压勻浆进行破碎。通过经缓冲液A(0. 02M磷酸钠，0. 5M NaCl, pH 7. 4)平衡的螯合型FF sepharose (GE Healthcare)柱(5. OcmX9cm ；床体积为 176mL)纯化带有 6XHis 标签的人类精氨酸酶I。带有6XHis标签的精氨酸酶用0. 15至0.25M梯度的咪唑进行洗脱(图6a 和图6b)。流速为20mL/min (毫升/分钟)。收集含有经纯化的精氨酸酶的组分(图7a和图7b)。经纯化的精氨酸酶的产率为约^Omg/L细胞培养物。重复带有6XHis标签的人类精氨酸酶I的上述提取程序以获得经纯化的带有 6XHis标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶。带有6XHis标签的精氨酸酶的定向位点聚乙二醇化图5显示了用于将带有6 XHis标签的人类精氨酸酶I突变体与单链mPEG-马来酰亚胺(20kDa)偶联(称为HAI-PEG20)的Cys45_特异性单聚乙二醇化的程序。马来酰亚胺的双键经历了与巯基的烷基化反应而形成稳定的硫醚键。图恥显示了用于将带有6XHis 标签的热溶芽孢杆菌精氨酸酶突变体与单链mPEG-马来酰亚胺(20kDa)(称为BCA-PEG20) 的Cys161-特异性单聚乙二醇化的偶联程序。使用带有IOK(截留值)膜(Millipore)的 Millipore Tangential Flow Filtration 系统(500mL)，将 1 克带有 6XHis 标签的精氨酸酶在0.02M磷酸钠、0. 5M NaCl, pH 7. 4中进行渗滤。精氨酸酶的浓度最终稀释到约^iig/ mL。将10摩尔的摩尔超量的还原剂Tris (2-羧乙基)膦(TCEP)添加到1摩尔的精氨酸酶中进行还原，并在室温下温和搅拌4小时。按20摩尔的摩尔超量的mPEG-马来酰亚胺或 mPEG-MAL(20kDa) (Sunbright)比1摩尔的精氨酸酶将mPEG-马来酰亚胺添加到经还原的精氨酸酶中并在4°C搅拌过夜。通过SDS-PAGE监测定向位点聚乙二醇化的进程(图8a和8b)。在上述条件下， 人类精氨酸酶I上的位置45处的半胱氨酸的自由巯基通过稳定的硫醚键特异性地连接到mPEG-MAL(20kDa)的经激活的马来酰亚胺基团上。最终偶联产物包含优势量的Cys45聚乙二醇化人类精氨酸酶I、未偶联的人类精氨酸酶I和m PEG-MAL(20kDa)。对于热溶芽孢杆菌精氨酸酶，类似地，位置161处的半胱氨酸残基通过稳定的硫醚键特异性地连接到mPEG-MAL (20kDa)的经激活的马来酰亚胺基团上。mPEG-MAL (20kDa)聚乙二醇化精氨酸酶就更长的半衰期而言相对于 mPEG-MAL(5kDa)聚乙二醇化精氨酸酶是有利的，并且就更好的溶解性而言相对于 mPEG-MAL (40kDa)聚乙二醇化精氨酸酶是有利的。在2升发酵罐中的分批发酵将含有精氨酸酶基因的大肠杆菌BL21-DE3株保存在_80°C。为了制备用于分批发酵和补料-分批发酵的种子接种物，将100 μ 1上述菌株的冷冻储存液转移到装有SOmL发酵培养基的250mL培养瓶中。将细菌培养物在37°C和pH 7. 0于以250rpm旋转的定轨摇床中培养。当在约8至10小时0D600nm达到5. 5至6.0时，终止培养。将12mL(l%)种子接种物导入到装有1200mL经高压灭菌的滋养发酵培养基的2L发酵罐中。在37°C的温度进行分批发酵。通过添加氢氧化钠和盐酸将PH保持在7.0。通过以1至4L/分钟导入空气并将发酵罐的搅拌速度调节为300至1200rpm，将溶解氧水平控制为高于30%空气饱和度。当 0D600nm在5小时为约11. 0时，将异丙基- β -D-硫代半乳糖-P(IPTG) (IOOmM)(热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)的蛋白表达的诱导剂)导入发酵液至0.5mM的终浓度。导入IPTG后， 继续发酵到9小时(当OD 600nm为约16. 4时)。IPTG导入后4小时，收获发酵细胞用于 BCA的分离和纯化。前述菌株以约105mg/L的发酵培养基的量生成活性BCA。发酵的时间过程作图于图6al中。显示诸如温度、搅拌速率、pH、溶解氧值等参数的变化的该分批发酵的时间关系曲线图在图6bl中示出。在2升发酵罐中讲行的补料-分批发酵使用高细胞密度培养物在37°C、pH 7. 0进行补料-分批发酵，并在整个发酵过程中将溶解氧保持在高于30%空气饱和度。用于制备种子接种物的程序与上述分批发酵的类似。发酵最初通过将5mL(l% )种子接种物导入装有500mL经高压灭菌的滋养发酵培养基的2L发酵罐中而采用分批培养策略开始。溶解氧在分批培养周期中的生长期逐渐降低到约30%空气饱和度。一旦溶解氧水平增加到高于80% (表示碳源消耗)，则添加补充性滋养培养基开始P02 stat补料-分批策略。在该策略中，补料速度调整为将溶解氧水平保持低于60%，这在发酵过程中提供了最小但是足够量的碳源。当在18小时0D600nm为约100 时，将异丙基-β-D-硫代半乳糖-P(IPTG) (IOOmM)向发酵液中导入至0. 5mM的终浓度。导入IPTG后，继续发酵到28小时(当OD 600nm为约186. 8时)。IPTG导入后10小时，收获发酵细胞用于BCA的分离和纯化。前述菌株以约1489. 6mg/L的发酵培养基的量生成活性 BCA。这高于所有其他所报道的不同类型精氨酸酶的产率。发酵的时间过程作图于图6a2 中。显示诸如温度、搅拌速率、PH、溶解氧值等参数的变化的该分批发酵的时间关系曲线图在图6b2中示出。分批发酵和补料-分批发酵的比较下表1比较了分批发酵和补料-分批发酵的结果。该比较证明，就培养物0D600、 细胞干重和每升培养物的BCA产率而言，补料-分批发酵远远优于分批发酵。表 权利要求
1.一种包含PEG部分的PEG-精氨酸酶偶联物，所述PEG部分在预定位置共价结合到精氨酸酶上，并且所述PEG =精氨酸酶偶联物就分子量而言是均一的。
2.如权利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述PEG部分与所述精氨酸酶的比例基本为1。
3.如权利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述PEG部分具有10，000至 30, 000的分子量。
4.如权利要求3所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述PEG部分具有约20，000的分子量。
5.如权利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述预定位置是所述精氨酸酶的 Cys45并且所述精氨酸酶为人类精氨酸酶I。
6.如权利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述预定位置是所述精氨酸酶的 Cys161并且所述精氨酸酶为热溶芽孢杆菌(Bacillus caldovelox)精氨酸酶。
7.如权利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述PEG部分是聚乙二醇。
8.如权利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述PEG部分具有单链。
9.如权利要求1所述的PEG-精氨酸酶偶联物，其中所述PEG部分具有支链。
10.一种制备PEG-精氨酸酶偶联物的方法，所述方法包括如下步骤(a)指定精氨酸酶上的至少一个结合位置，其中在所述位置处的氨基酸残基用于与 PEG部分形成共价键；(b)修饰编码所述精氨酸酶的基因，其中如果在所述结合位置处的氨基酸残基的密码子是半胱氨酸密码子，则将所述密码子改变为编码半胱氨酸的密码子，并且如果所述基因具有编码不在所述结合位置、从所述精氨酸酶暴露并且能够与PEG部分形成共价键的半胱氨酸残基的第二密码子，则将所述密码子改变为编码不是半胱氨酸的氨基酸的密码子；(c)在宿主中表达所述基因以生成所述精氨酸酶；和(d)通过所述精氨酸酶的所述结合位置处的所述氨基酸和PEG部分之间的共价键将所述精氨酸酶蛋白与所述PEG部分偶联以获得分子量上均一的PEG-精氨酸酶偶联物。
11.如权利要求10所述的方法，其中在步骤(c)中生成的所述精氨酸酶含有单个半胱氨酸残基。
12.如权利要求11所述的方法，其中在步骤(c)使用的所述宿主选自由细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞、酵母细胞和转基因动物组成的组。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述基因编码人类精氨酸酶I，并且在步骤(c)中生成的所述精氨酸酶的所述结合位置处的所述氨基酸残基为Cys45。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述基因编码热溶芽孢杆菌精氨酸酶，并且在步骤(c)中生成的所述精氨酸酶的所述结合位置处的所述氨基酸残基为Cys161。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述共价键是在来自在所述结合位置处的所述氨基酸的硫醇基和来自所述PEG部分的马来酰亚胺基之间形成的硫醚键。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述PEG部分具有约20，000的分子量，并且具有直链或支链。
17.一种药物组合物，所述药物组合物包含分子量上均一的PEG-精氨酸酶偶联物和药学可接受的载体、赋形剂或辅助试剂。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述PEG-精氨酸酶在人类精氨酸酶I和 PEG部分之间形成，所述人类精氨酸酶I具有在位置45处用于与所述PEG部分共价结合的唯一的半胱氨酸残基。
19.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述PEG-精氨酸酶在热溶芽孢杆菌精氨酸酶和PEG部分之间形成，所述热溶芽孢杆菌精氨酸酶具有在位置161处用于与所述PEG部分共价结合的唯一的半胱氨酸残基。
20.如权利要求17所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗精氨酸酶依赖型疾病。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述精氨酸酶依赖型疾病是基本不表达 OTC的具有ADI敏感性的或具有ADI抗性的癌症。
22.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述精氨酸酶依赖型疾病是被选自由HIV、 C型肝炎病毒和B型肝炎病毒组成的组的病毒引起的感染。
全文摘要
单聚乙二醇化精氨酸酶偶联物及其制备方法。所述单聚乙二醇化精氨酸酶在分子量上是均一的，并且显示出用于治疗癌症和病毒感染的治疗效果。制备所述精氨酸酶偶联物的方法包括遗传修饰编码精氨酸酶的基因使得PEG部分能够在预定的特异性目标位点结合到该酶上的主要步骤。这通过除去位于该酶的不期望的位点的PEG结合氨基酸残基同时在该酶的期望的位点保留(或增加，如果需要的话)PEG结合氨基酸残基来实现。如此制备的两种示例性的单聚乙二醇化精氨酸酶偶联物是人类精氨酸酶I(HAI)和热溶芽孢杆菌精氨酸酶(BCA)，在所述人类精氨酸酶I中，聚乙二醇(PEG)部分位点特异性地共价结合到该酶的Cys45；在所述热溶芽孢杆菌精氨酸酶中，聚乙二醇(PEG)部分位点特异性地共价结合到该酶的Cys161。
文档编号A61P35/00GK102481345SQ201080023256
公开日2012年5月30日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者劳伟雄, 梁润松 申请人:香港理工大学