神经退行性疾病的基因治疗的制作方法

专利名称：神经退行性疾病的基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及基因治疗方法。特别地，本发明涉及用于治疗影响运动功能(如由脑和/或脊髓的疾病或损伤影响的运动功能)的疾病的方法和组合物。
背景技术：
基因治疗是新兴的治疗影响中枢神经系统(CNS)疾病的治疗模式。通过发展能够有效感染有丝分裂后神经元的病毒载体促进了 CNS基因治疗。中枢神经系统由脊髓和脑组成。脊髓从外周神经系统向脑传导感觉信息并从脑向不同效应器传导运动信息。关于用来向中枢神经系统基因传递的病毒载体的综述，见Davidson等，Nature Rev. (2003)4 353-364。由于其具有有利的毒性和免疫原性特征、能够转化神经细胞、并能够介导在CNS 中的长效表达，腺相关病毒(AAV)载体被认为可用于CNS基因治疗(Kaplitt等，Nat. Genet. (1994)8 148-154 ；Bartlett 等，Hum. Gene Ther. (1998)9 :1181_1186 ；及 Passini 等，J. Neurosci. (2002)22 :6437_6446)。AAV载体一个有用的性质在于一些AAV载体在神经细胞中进行逆行和/或顺行运输的能力。脑区域中的神经元通过轴突与末梢脑区域互相连接，从而为载体传递提供了一个转运系统。例如，可以在或接近神经元轴突末端处给药AAV载体。神经元内吞AAV载体， 并以逆行的方式将其沿轴突向细胞体传送。已显示腺病毒、HSV和假狂犬病病毒具有相似的向脑中末梢结构传递基因的性质(Soudas等，FASEB J. (2001) 15:2283-2285 ；Breakefield 等，New Biol. (1991)3 :203_218 ；和 deFalco 等，Science (2001) 291 :2608_2613)。一些实验已经报道通过AAV血清型2(AAV2)的脑部转化限定于颅内注射点(Kaplitt 等，Nat. Genet. (1994)8 148-154 ；Passini 等，J. Neurosci. (2002) 22 6437-6446 ；和 Chamberlin 等，Brain Res. (1998)793:169-175)。还有一些证据表明亲神经病毒载体(包括AAV和慢病毒载体)的逆行轴突运输还能发生在正常大鼠脑的选择回路(Kaspar 等，Mol. Ther. (2002)5 :50_56 ；Kasper 等，Science (2003) 301 :839_842 以及 Azzouz 等，Nature (2004) 429 :413_417)。Roaul 等，Nat. Med. (2005) 11(4) :423_428 及 Ralph等，Nat. Med. (2005) 11(4) :429_433报道了在治疗相关ALS啮齿动物模型中，肌内注射表达沉默人Cu/Zn过氧化物歧化酶(SODl)干扰RNA的慢病毒延迟了肌萎缩性侧索硬化 (ALS)的疾病发病。通过AAV载体转化的细胞可以表达治疗性转基因产物(如酶或神经营养因子)以介导细胞内的有益效果。这些细胞还可以分泌治疗性转基因产物，其可能随后被末梢细胞吸收，在那儿介导其有益效果。这个过程已被描述为交叉校正(Neufeld等， Science (1970) 169 :141_146)。上述重组AAV载体的一个性质是需要单链DNA (ssDNA) AAV基因组在表达编码的转基因前必须被转变成双链DNA(dsDNA)。这一步能用自身互补载体来规避，该载体包装折叠成dsDNA的反向重复基因组、而不需DNA合成或多个载体基因组间碱基配对，从而增加AAV 介导的基因转移效率。关于自身互补AAV载体的综述，见例如，McCarty, D. M. Molec. Ther. (2008) 16 1648-1656。脊髓性肌萎缩(SMA)是一种常染色体隐形遗传神经肌肉疾病，其由运动神经元生存I(SMNl)基因的突变和编码的SMN蛋白的缺失引起(Lefebvre等，Cell (1995)80 155-165)。SMN的缺失导致了脊髓腹(前)角的运动神经元变性，其导致了负责爬行、 走、颈部控制和吞咽的近端肌肉、以及控制呼吸和咳嗽的不随意肌的减弱(Sumner C. J.， NeuroRx (2006) 3 235-245)。因此，SMA患者表现出肺炎和其他肺部问题(如限制性肺病) 增加的趋势。疾病的发病和严重程度部分由表型修饰基因SMN2确定，SMN2能够产生少量的 SMN(Monani 等，Hum. MoI. Genet. (1999)8 1177-1183 ；Lorson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1999)96 :6307-6311))。因此，具有高SMN2拷贝数(3_4个拷贝)的患者表现出较不严重形式的疾病(称为II或III型)，而1-2个拷贝的SMN2通常导致更严重的I型疾病(Campbell 等，Am. J. Hum. Genet. (1997)61 40-50 ；Lefebvre 等，Nat. Genet. (1997) 16 265-269)。目前，对于SMA没有有效治疗。治疗这种单基因疾病的基本策略是增加SMA患者中的SMN水平。实现这个策略的一种方法是用激活SMN2启动子或纠正SMN2前mRNA剪接模式的小分子调节内源性SMN2 基因。也能用反义寡核苷酸和反式剪接RNA实现SMN2剪接的改变。然而，尽管在体外调节 SMN2增加了 SMN水平并重建了 SMA细胞系的核芽(gems)，用小分子药物的功效研究还没有转化成临床上可测量到的改善(Oskoui等，Nerotherapeutics (2008) 5 499-506)。

发明内容
本发明是基于以下发现，传统重组AAV (rAAV)病毒粒子和重组自身互补AAV载体 (scAAV)能够将基因传递到CNS，在CNS中成功表达并治疗神经退行疾病。这种用于传递编码导致至少部分纠正神经病理的治疗性分子的基因的治疗方法提供了用于治疗包括SMA 的多种神经退行疾病的非常可取的方法。因此在一个实施方案中，本发明涉及一种自身互补腺相关病毒(scAAV)载体，其包括编码调节具有运动神经元疾病的受试者运动功能的蛋白质的多核苷酸。在某些实施方案中，运动神经元疾病选自脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)或外伤性脊髓损伤。在另外的实施方案中，在scAAV载体中才存在的多核苷酸编码一种运动神经元生存(SMN)蛋白。在某些实施方案中，SMN蛋白是人SMN-1。在又一实施方案中，SMN-I包括与图9B中所述序列具有至少90%序列同源性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，SMN-I 包括图9B中所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，本发明涉及重组AAV病毒粒子，其包括如上所述的scAAV载体。
在另外的实施方案中，本发明涉及包括上述重组AAV病毒粒子和药学上可接受的赋形剂的组合物。在又一实施方案中，本发明涉及调节具有运动神经元疾病的受试者的运动功能的方法，其包括向受试者细胞给药治疗有效剂量的上述组合物。在某些实施方案中，将组合物在体外给药细胞以转化细胞，并且将转化细胞给药到受试者。在可选实施方案中，将组合物在体内给药细胞。在又一实施方案中，本发明涉及向具有脊髓性肌萎缩(SMA)的受试者提供SMN蛋白的方法，其包括向需要的受试者细胞给药包含上述AAV载体的重组AAV病毒粒子。在某些实施方案中，体外将组合物给药细胞以转化细胞、并将转化细胞给药到受试者。在可选实施方案中，体内将组合物给药细胞。在上述每一种方法中，能通过直接脊髓注射给药组合物。在其他实施方案中，通过脑室内注射给药组合物。在另外的实施方案中，将组合物给药一侧脑室。在某些实施方案中，将组合物给药两个侧脑室。在其他实施方案中，通过脑室内注射和直接脊髓注射给药组合物。在另外的实施方案中，通过鞘内注射给药组合物。鉴于在此的本发明的公开，本领域技术人员将容易想到发明主旨的这些和其他实施方案。


图1显示用AAVhSMNl治疗相对未治疗的SMA小鼠的存活。用AAVhSMNl治疗增加了 SMA小鼠的存活。未治疗SMA小鼠(η = 34，开放圆圈)具有15天的寿命中间值。在PO 用AAVhSMNl治疗的SMA小鼠(η = 24，闭合圆圈)具有50天的寿命中间值(ρ < 0. 0001)， 其寿命增加了 +233%。图2A-2C显示基因治疗治疗对脊髓中SMN水平的影响。显示了与未治疗SMA和野生型小鼠相比、在腰椎(图2Α)、胸椎(图2Β)和颈椎(图2C)区段注射的hSMN蛋白质水平。 在注射后16、58-66和120-220天进行脊髓腰椎、胸椎和颈椎段的免疫印迹。定量来自三段的免疫印迹，并且，为控制蛋白质水平、用微管蛋白标准化SMN，并以年龄相当野生型的百分比做曲线。关键字(以及η值)SMA，未治疗的敲除(基因小鼠)(在16天η = 5)； AAV, AAV8-hSMN 治疗的 SMA 小鼠(16 天，η = 7，在 58-66 天，η = 5) ；scAAV, scAAV8_hSMN 治疗的SMA小鼠(在每个时间点η = 5)。数值代表平均值士平均标准误差。图3A-3J显示在治疗和未治疗SMA小鼠的脊髓运动神经元中hSMN蛋白的亚细胞分布和表达。在转化细胞的细胞质中检测到大量的hSMN蛋白(图3A和3B)。而且，如以插图中放大的成对芽(gem-)样结构(箭头)所表明，在核中检测到hSMN蛋白(图3A)。还在神经元的树突(图3B和3C)和轴突(图3D)中检测到hSMN蛋白。在未治疗SMA小鼠组织切片中未检测到hSMN蛋白(图3E)。hSMN蛋白(图3F)和小鼠ChAT (图3G)的共定位显示转化细胞的亚群是运动神经元(图3H和31)。在16天(白柱)和58-66天(黑柱)测定了 hSMN蛋白免疫阳性的ChAT细胞的百分比(图3J)。数值代表平均值士平均标准误差。图4显示在治疗和未治疗SMA小鼠脊髓中的运动神经元细胞数。显示了每组在 IOym组织切片上计数的ChAT免疫阳性神经元的平均数。数字代表来自颈椎、胸椎、腰椎和骶段不同水平的每10个切片的计数。数值代表平均值士平均标准误差。关键字Λρ
<0. 05 ；**，P < 0. 01 ；***，P < 0. 001。图5A-5C显示来自治疗和未治疗SMA小鼠中肌肉组的肌纤维横断面积。AAVhSilNl 治疗增加了来自多个肌肉组的肌纤维横断面积。来自16天(图5Α)和58-66天(图5Β) 的四头肌、腓肠肌和肋间肌肉的堆积图显示，肌纤维尺寸的分布在治疗SMA和野生型小鼠间是相似的。在16天总体平均值显示经治疗的肌纤维横断面积显著增加(图5C)。而且， 在58-66天，在腓肠肌和肋间肌肉中，治疗SMA小鼠和年龄相当的野生型之间的平均面积是统计学相似的(图5C)。数值代表平均值士平均标准误差。关键字WT，未治疗野生型； HET，未治疗杂合体；SMA，未治疗敲除型；AAV，AAVhSMNl治疗的SMA小鼠Λ ρ < 0. 05广，ρ
<0. 01 ；***，ρ < 0. 001。图6A-6F显示在治疗和未治疗SMA小鼠肌肉中NMJ的结构。在四头肌、腓肠肌和肋间肌中的结构通过基因治疗得到了改善。显示了来自16天未治疗SMA(图6Α)、治疗SMA(图 6Β)和未治疗野生型(图6C)小鼠、和来自58-66天治疗SMA(图6D)和未治疗野生型(图 6E)小鼠的四头肌神经肌接头(NMJ)。分别用神经丝蛋白抗体(绿色)和α -金环蛇毒素染色(红色)标记前突触和后突触NMJ。在主要组中的箭头指向下面插图中重点标记的NMJ。 在每个动物的每种肌肉中随机计数了至少100个NMJ。正常的NMJ被定义为如图6Α所示的具有并未呈现出神经丝蛋白异常堆积的前突触末端。图6F中的数值代表平均值士平均标准误差。关键字WT，未治疗野生型；HET，未治疗杂合体；SMA，未治疗敲除型；AAV，AAVhSilNl 治疗的 SMA 小鼠；* ；ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01 ；***，ρ < 0. 001。比例尺设定20 μ m。图7A-7F显示了治疗和未治疗SMA小鼠中的行为试验的结果。治疗SMA小鼠在行为试验中表现出显著的改善。治疗SMA(星号)和未治疗野生型(WT)小鼠在16天基本上比未治疗SMA小鼠(标有‘X’)好(图7A)。从11天及以后，治疗SMA小鼠比未治疗SMA 对照明显更重(图7B)。在正位反射(图7C)、负趋地性(图7D)、握力(图7E)和后肢伸展(图7F)试验中，治疗SMA小鼠的表现显著强于未治疗SMA小鼠。治疗SMA小鼠在12-16 天在正位反射和负趋地性实验中与野生型和杂合体小鼠统计学上相同(图7C和7D)。数值代表平均值士平均标准误差。关键字未治疗WT(开放圆圈)，未治疗杂合体(开放三角)；未治疗SMA (开放正方形)；AAVhSMNl治疗的SMA小鼠(闭合正方形);p < 0. 05 ； **，ρ < 0. 01 ；***，ρ < 0. 001。图8显示scAAVhS丽1治疗和未治疗小鼠的存活。用scAAVhS丽1治疗增加了 SMA 小鼠的存活。在PO用SCAAVhSMNl治疗的SMA小鼠(η = 17，闭合三角)具有157天的寿命中间值(Ρ< 0. 0001)，与之相比未治疗SMA小鼠为16天(η = 47，开放圆圈)。图9A_9B(SEQ ID NOS 1和2)显示代表性人运动神经元生存(SMNl)基因的编码 DNA序列(图9A)和对应氨基酸序列(图9B)。图10A-10F显示scAAV8_hSMN表达增加了 SMA小鼠的运动神经元计数并改善了 NMJ。图IOA显示了在注射后16天在胸-腰段与hSMN表达共定位的mChAT免疫阳性细胞的百分比。图10B-10F显示在腰椎(图10B)、胸椎(图10C)和颈椎段(图10D)的mChAT免疫阳性细胞的平均数，以及在16、58-66和214-269天在四头肌(图10E)和肋间肌肉(图 10F)中的萎缩NMJ的平均百分比。作为图IOE和IOF的参照，在16天、在未治疗SMA小鼠的四头肌和肋间肌肉中75-90%的NMJ含有异常萎缩结构(见图6F)。关键字和η值SMA，未治疗敲除型(白柱，在16天η = 8)，AAV, AAV8_hSMN(阴影柱，在16天η = 8，在58-66 天η = 5) ；scAAV，scAAV8-hS丽(黑柱，在每一时间点η = 5) ；WT，未治疗WT (方格柱，在16 天η = 8，在58-66和216-269天每一个η = 5)。数值代表平均值士平均标准误差。在16 天以单向ANOVA和Bonferroni多重post hoc分析进行统计学比较(图10B-10F)。非配对双尾学生t-检验比较了 1)在16天(图10A)和58-66天(图10B-10D)的两个载体；2) 用scAAV8-hS丽治疗的在58-66天和214-269天组的相对ChAT细胞数(图10B-10D) ；3) 在214-269天、在年龄相当的未治疗WT和scAAV8-hS丽治疗SMA小鼠之间的异常匪J相对数(E, F) ；*ρ < 0. 05 ；**p < 0. 01 ；***p < 0. 001。
具体实施例方式除非另外指出，本发明的实践将采用本领域技术中的常规化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的方法。这样的技术在文献中有充分解释。见，例如Fundamental Virology,第二版，vol. I&II (B. N. Fields 禾口 D. Μ· Knipe 编)；Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-FV (D. M. Weir 禾口 CC. Blackwell 编，Blackwell Scientific Publications) ；Τ.Ε.Creighton, Proteins :Structures and Molecular Properties(W. H. Freeman 禾口 Company,1993) ；A. L. Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers, Inc., current addition) ；Sambrook,^, Molecular Cloning :A Laboratory Manual ( M 2 1989) ；Methods In Enzymology(S. Colowick 禾口 N. Kaplan 编，Academic Press, Inc.)。所有在此引用的文献、专利和专利申请，无论在前还是在后，都以其全部内容引入在本文中作为参考。1.定义在本发明描述中，将使用以下术语，旨在定义为如下所示。必须注意到，除非内容另外清晰指明，在此说明书和附加权利要求中所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。因此，例如，“白细胞介素受体”包括两个或多个这种受体的混合物，等等。在此可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”、或编码其的核苷酸序列分别指蛋白质和核苷酸序列，其代表天然序列、其变体或其片段。只要蛋白质保持所需要的活性，全长蛋白质(无论有没有信号序列)、其片段、以及带有天然序列修饰(如(性质上保守的或非保守的)缺失、添加及替换)的蛋白质均可在此使用。这些修饰可以是蓄意的(如通过定点突变)、或者可以是偶然的(如通过生产蛋白质的宿主的突变或者由于PCR扩增错误)。因而，基本上与亲代序列同源的活性蛋白质，如具有保持天然分子所需活性的70%. . .80%.. .85% ...90% ...95% ...98% ... 99%等的同源性的蛋白质，被涵盖在此使用。“天然”多肽，如运动神经元生存(SMN)多肽，指与来源于天然的相应分子具有相同氨基酸序列的多肽。此天然序列能从自然中分离、或者通过重组或合成的方法生产。术语 “天然”序列特别地包含自然发生的特定分子的截短或分泌形式(如细胞外结构域序列)、 自然发生的变体形式(如可选剪接形式)和自然发生的多肽的等位基因变体。在本发明的各种实施方案中，在此公开的天然分子是包括如附图所示全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列。然而，尽管附图中公开的一些分子以在图中指定的氨基酸位置1的蛋氨酸残基开始，对于特定分子，可以使用图中位于氨基酸位置1上游或下游的其他蛋氨酸残基作为起始氨基酸残基。可选地，根据使用的表达系统，在此所述的分子可能缺少N末端蛋氨酸残基。通过“变体”意指在此所定义的活性多肽，其与相应的全长天然序列、缺少信号肽的多肽、多肽的细胞外区域、有或无信号肽、或者在此公开的全长多肽序列的任何其他片段具有至少大约80%的氨基酸序列同源性。此类多肽变体包括(例如)在全长天然氨基酸序列的N和/或C末端增加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常地，变体与相应全长天然序列相比，具有至少大约80 %的氨基酸序列同源性、或者至少大约81 %的氨基酸序列同源性、或者至少大约82%的氨基酸序列同源性、或者至少大约83%的氨基酸序列同源性、 或者至少大约84%的氨基酸序列同源性、或者至少大约85%的氨基酸序列同源性、或者至少大约86%的氨基酸序列同源性、或者至少大约87%的氨基酸序列同源性、或者至少大约 88%的氨基酸序列同源性、或者至少大约89%的氨基酸序列同源性、或者至少大约90%的氨基酸序列同源性、或者至少大约91 %的氨基酸序列同源性、或者至少大约92%的氨基酸序列同源性、或者至少大约93%的氨基酸序列同源性、或者至少大约94%的氨基酸序列同源性、或者至少大约95%的氨基酸序列同源性、或者至少大约96%的氨基酸序列同源性、 或者至少大约97%的氨基酸序列同源性、或者至少大约98%的氨基酸序列同源性、或者至少大约99%的氨基酸序列同源性。通常地，变体多肽长度是至少大约10个氨基酸，如至少大约20个氨基酸、例如至少大约30个氨基酸、或者至少大约40个氨基酸、或者至少大约50 个氨基酸、或者至少大约60个氨基酸、或者至少大约70个氨基酸、或者至少大约80个氨基酸、或者至少大约90个氨基酸、或者至少大约100个氨基酸、或者至少大约150个氨基酸、 或者至少大约200个氨基酸、或者至少大约300个氨基酸、或更多。特别优选的变体包括性质保守的替换，S卩，在其副链相关的氨基酸家族发生的那些替换。特别地，氨基酸通常被分为四个家族(1)酸性的_天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性的_赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)非带电、极性的-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类在芳香族氨基酸。例如，能合理预期分开地用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸、用丝氨酸置换苏氨酸、或用结构相关的氨基酸置换氨基酸的类似保守性置换，将不会对生物活性有较大的影响。例如，目标多肽可以包括多至大约5-10个保守的或非保守的氨基酸替换、或者甚至多至约15-25或50个保守或非保守氨基酸替换、或者5-50间的任何数字，只要分子所需的功能保持完整。“同源性"指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的百分比同源性。当在分子的限定长度上、两个DNA或两个多肽序列呈现至少大约50%、优选至少大约75%、更优选至少大约80% -85%、优选至少大约90%、最优选至少大约95% -98%序列同源性时，其相互间为 “实质上同源的”。如在此所用的，实质上同源也指序列相对于特定DNA或多肽序列表现为完全同源性。通常，“同源性”意指两个多核苷酸或多肽序列的分别的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的确切一致性。能够通过比对序列、计数两个被比对序列间匹配的确切数字、 除以较短序列的长度、并将结果乘以100，直接比较两个分子间的序列信息以确定百分比同源性。能使用容易得到的的计算机程序辅助分析，如ALIGN，Dayhoff, Μ. 0. in Atlasof Protein Sequence and Structure M. 0. Dayhoff ^m, 5 Suppl. 3 :353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC,其米用了 Smith 禾口 Waterman 的 Advances in Appl. Math. 2 :482_489，1981中用于肽分析的局部同源性算法。用于确定核苷酸序列同源性的程序在Wisconsin序列分析软件包(Wisconsin Sequence Analysis Package，第8版，来自Genetics Computer Group，麦迪逊，威斯康辛州)中可以获得，例如 BESTFIT,FASTA和GAP程序，其也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序可以用制造商推荐的缺省参数很容易地使用，并在上述的Wisconsin序列分析软件包有所描述。例如，使用以缺省计分表格和六个核苷酸位置的空隙罚分的Smith和Waterman同源性算法能确定相对参照序列的特定核苷酸序列的百分比同源性。在本发明上下文中建立百分比同源性的另一方法是使用爱丁堡大学版权的、由 John F. ColIins禾口 Shane S. Sturrok开发的、由 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View,力口利福尼亚州)公司发布的MPSRCH程序软件包。从这个软件包组件能使用Smith-Waterman 算法，其中缺省参数被用于计分表格(例如，空隙开放罚分为12、空隙延长罚分为1、及空隙为6)。从数据生成的“匹配”值反映了“序列同源性”。用于计算序列间百分比同源性或相似度的其他合适的程序是本领域公知的，例如，另一比对程序是BLAST，以缺省参数使用。例如，能够用以下缺省参数使用BLASTN和BLASTP 基因代码=标准；过滤=无；链=两条；截断值=60 ；预期=10 ；矩阵=BL0SUM62 ；说明=50个序列；分类用=高分值；数据库=非冗余的，基因库+EMBL+DDBJ+PDB+基因库CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。这些程序的细节为本领域熟知。可选地，能通过在同源性区域间形成稳定双链的条件下杂交、随后用单链特异性核酸酶消化、确定消化片段的大小来确定同源性。可在例如为特定系统定义的严谨条件下、 在Southern杂交实验中鉴定实质上同源的DNA序列。限定合适的杂交条件在本领域技术的范围内。见，例如 Sambrook 等，上述；DNA Cloning，上述；Nucleic Acid Hybridization, 上述。通过术语“退化变体”指在其核苷酸序列中含有变化的多核苷酸，该多核苷酸编码与退化变体源自的多核苷酸编码的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是当位于适当调节序列的控制下在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。通过5’(氨基) 端的起始密码和3’(羧基)端的翻译终止子确定编码序列的边界。转录终止序列可位于编码序列的3’端。通过“载体”指任何遗传因素，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，当其与适当的控制成分相连时能够复制，并能够将基因序列转移至细胞。因此，术语包含克隆和表达载体，如病毒载体。通过“重组载体”指包括能够在体内表达的异源核酸序列的载体。通过“重组病毒”指被遗传改变(例如通过向颗粒中添加或插入异源核酸构建体) 的病毒。术语“转基因”指被引入细胞中并能够在适当的条件下转录成RNA，并且可选地翻译和/或表达的多核苷酸。一方面，它赋予引入它的细胞所需的性质，或在其他方面导致期望的治疗或诊断结果。
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用于指病毒滴度的术语“基因组颗粒(gp) ”或“基因组等同物”，指不考虑感染性和功能的含有重组AAV DNA基因组的病毒粒子的数量。可通过文中实施例或例如Clark等， Hum. Gene Ther. (1999) 10 :1031_1039 ；和 Veldwi jk等，Mol. Ther. (2002) 6 :272_278所述的步骤测定在特定载体制备物中的基因组颗粒的数量。用于指病毒滴度的术语“感染单位(iu) ”、“感染性颗粒”或“复制单位”，指通过例如McLaughlin等，J.Virol. (1988) 62 1963-1973所述的感染中心分析(也被称为复制中心分析)测定的感染性重组AAV载体颗粒的数量。用于指病毒滴度的术语“转化单位(tu) ”，指导致如本文实施例中或例如Xiao等， Exp. Neurobiol. (1997) 144 :113_124 ；或 Fisher 等，J. Virol. (1996)70 520-532 (LFU 分析)所述的功能分析中测定的功能性转基因产物生产的感染性重组AAV载体颗粒的数量。术语“转染”用来指细胞吸收外源DNA，当外源DNA已被引入细胞膜内部时，细胞被“转染”。通常许多转染技术在本领域中已知。见，例如Graham等(1973) Virology，52 456, Sambrook ^ (1989)Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories，纽约，Davis 等(1986)Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, 和Chu等(1981)Gene 13:197。能使用此类技术向适当的宿主细胞内引入一个或多个外源 DNA部分。术语“异源的”当其涉及如编码序列和控制序列的核酸序列时，其指通常不连接在一起、和/或通常与特定细胞不相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源的”区域是另一个核苷酸分子内或与其连接的核酸片段，其通常与自然界中另外的分子不相关。例如， 核酸构建体的异源区域能够包括以自然界中编码序列不相关序列为侧翼的编码序列。异源编码序列的另一例子是构建体，其编码序列自身不存在于自然(如具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。相似地，为了本发明的目的，用通常不存在于细胞的构建体转染的细胞被认为是异源的。如在此所用，等位基因变异或天然发生突变事件不产生异源DNA。“核酸”序列指DNA或RNA序列。术语捕获的序列包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物，如但不局限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙定基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌酐、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、 1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤苷、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫脲嘧啶、β -D-甘露糖苷Q核苷、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-Ν6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine (无中译文)、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶、 5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、_尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、 尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶和2、6_ 二氨基嘌呤。术语DNA “控制序列”总体指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控区、复制起始点、内部核糖体进入部位(“IRES”)、增强子、等等，其共同地在受体细胞提供编码序列的复制、转录和翻译。只要被选定的编码序列能在适当的宿主细胞内被复制、转录和翻译，并不总是需要所有这些控制系列都存在。此处所用的术语“启动子”在其一般意义上指含有DNA调控序列的核苷酸区域，其中调控序列来自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的基因。转录启动子能包括“诱导型启动子”(其中有效连接至启动子的多核苷酸序列的表达是被分析物、 辅因子、调控蛋白质等诱导)、“抑制型启动子”(其中有效连接至启动子的多核苷酸序列的表达是被分析物、辅因子、调控蛋白质等诱导)、和“组成型启动子”。“有效连接”指元素的排列，其中所述成分如此配置以完成它们的常规功能。因此， 有效连接至编码序列的调控序列能够影响编码序列的表达。调控序列不需要与编码序列连续，只要其能发挥功能指导编码序列的表达。因此，例如，插入的未翻译但转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，而启动子序列仍被认为是“有效连接”至编码序列。术语“神经系统”包括中枢神经系统和外周神经系统。术语“中枢神经系统，，或 “CNS”包括脊椎动物的脑和脊髓的所有细胞和组织。术语“外周神经系统”指脑和脊髓外的神经系统部分的所有细胞和组织。因此，术语“神经系统”包括但不局限于神经细胞、胶质细胞、星状细胞、脑脊液(CSF)中的细胞、间质间隙中的细胞、脊髓保护膜中的细胞、硬脑膜外细胞(即，硬脑膜外的细胞)、与神经组织相邻的或接触的或被神经组织支配的非神经组织中的细胞、在神经外膜、神经束膜、神经内膜、索、神经束中的细胞，等等。用于本发明目的的“活性的”或“活性”指保持相应的天然的或天然发生的多肽生物活性的治疗性蛋白质的形式。活性可以大于、等于或小于相应的天然的或天然发生的多肽所观察到的活性。当指核酸序列时，通过“分离的”指指定的分子存在于基本上无相同类型的其他生物大分子的情况下。因此，“编码特定多肽的分离的核酸分子”指该核酸分子实质上不含不编码目标多肽的其他核酸分子；然而，分子可以包括一些额外的不有害影响组合物基本特性的碱基或部分。为描述在本申请中在特定核酸分子中核苷酸序列的相对位置，如，当特定核苷酸序列被描述为位于相对另外一个序列的“上游”、“下游”、“3-端(3’)”或“5-端(5’)”时， 应当理解，如本领域中常规所指的，其指在DNA分子的“正义”或“编码”链中序列的位置。术语“大约”，特别是在指给定的量时，指包含正或负5%的偏差。术语“受试者”、“个体”或“患者”在此可以互换使用，指脊椎动物、优选哺乳动物。 哺乳动物包括但不局限于小鼠、啮齿类、猿类、人类、耕作动物、运动动物和宠物。在此应用的术语“调节”指改变效果或结果的数量或强度，如增强、增加、减少、减小或消除。如在此应用的，术语“改善”与“缓和”是同义词，指减少或减轻。例如，人们可以通过使疾病或疾病的症状更不严重来改善疾病或病的症状。如文中提供的，术语“治疗性”、“有效剂量”或“治疗有效剂量”组合物或制剂，指足够剂量的组合物或制剂以提供所需反应，如预防、延迟发生或减轻受试者的症状或获得所需的生物效果，如纠正神经疾病(例如与运动神经疾病如脊髓性肌萎缩(SMA)相关的细胞病理)。术语“治疗性纠正”指导致预防或延迟发生或减轻受试者体内症状的纠正程度。 所需的确切量根据受试者不同而不同，依赖于受试者的物种、年龄和概况、需要治疗疾病的严重程度、及特定目标大分子、给药模式等等。本领域技术人员使用常规实验可以确定任何个体案例中适当的“有效”量。“治疗”或“治疗”特定疾病包括(1)预防疾病，即，预防疾病的发展或导致在可
11能暴露于或易罹患疾病但还没有经历或表现疾病症状的受试者体内发生的疾病程度较轻； (2)抑制疾病，即，阻滞疾病发展或逆转疾病状态；或(3)减轻疾病的症状，即，降低受试者经历症状的数量、以及改变与疾病相关的细胞病理。2.执行发明的方式在详细描述本发明之前，应当理解本发明不局限于特定的成分或过程参数，当然就其本身而言是可以变动的。还应当理解文中应用的术语仅仅是为了描述发明特定的实施方案，而并无意于限制。尽管在本发明的实践中能够使用许多类似于或等同于在此描述的方法和材料，在此描述了优选的材料和方法。本发明的核心是发现向脊髓性肌萎缩(SMA)的侵略性小鼠模型的CNS传递含有人运动神经元生存1 (hS丽1) cDNA的rAAV病毒粒子产生了遍布脊髓的SilNl的表达。治疗的 SMA小鼠比未治疗的、年龄相当的突变型含有更高数量的运动神经元。另外，肌纤维大小的评估证明，来自治疗的SMA小鼠的不同肌肉群的单独肌纤维的大小与野生型小鼠中观察到的那些接近。而且，在治疗SMA小鼠中神经肌接头(NMJ)结构与野生型小鼠相似，与之相反， 未治疗的SMA小鼠在前突触末端表现出神经丝蛋白的异常聚集。治疗的SMA小鼠还在许多行为试验中表现出显著的改善，说明NMJ具有功能。重要的是，重组AAV治疗小鼠与其未治疗对应物相比具有显著延长的寿命。甚至与用常规的、非自身互补rAAV载体治疗相比，用自身互补rAAV载体治疗的SMA小鼠也表现出生存中值的惊人改善。这些结果表明，CNS定向、AAV介导的SilNl基因增加在治疗SMA的神经和肌肉病变方面是非常有效的，证实了应用病毒基因治疗作为治疗方案用于治疗和预防神经和肌肉病变(如SMA、以及影响运动功能的其他疾病)。在此描述的基因治疗技术可以单独应用，或者与传统药物联合应用。为了进一步理解本发明，以下提供关于运动神经元病理和治疗性分子的详细讨论，以及用于本发明的各种基因传递方法。运动神经元病理和治疗性分子本发明主旨提供了调节、纠正或增加具有运动神经元疾病或运动神经元损伤的受试者的运动功能的组合物和方法。仅为了说明目的，受试者可能患有一种或多种脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)、或外伤性脊髓损伤。不受特定理论约束，与运动神经元损伤相关的病理可以包括皮质脊髓束和脊神经前根中的运动神经元退行、神经胶质增生、神经丝蛋白异常、有髓纤维损失。例如，已经发现了两种类型的发病影响上运动神经元(皮质和脑干运动神经元) 的延髓发病，影响面部肌肉、说话和吞咽；和影响下部运动神经元(脊髓运动神经元)的四肢发病，反映为痉挛、全身虚弱、肌肉萎缩、麻痹和呼吸衰竭。在ALS中，受试者既有延髓又有四肢发病。在PLS中，受试者仅有延髓发病。因此，在某些实施方案中，向受试者提供编码生物活性分子的rAAV构建体，其在 CNS中表达导致了至少部分纠正神经病理和/或稳定疾病进展，如预防、延缓发病或减轻受试者的症状或获得所需的生物效果，包括例如与上述运动神经元疾病相关的细胞病理的改变。通过实施例的方式，rAAV构建体中存在的转基因可以是(但不局限于)运动神经元生存蛋白(通过SMNl基因或SMN2基因)、胰岛素生长因子(IGF-I)、钙结合蛋白D28、微清蛋白、HIFl-α、SIRT-2，、VEGF如VEGF165、CNTF (睫状神经营养因子)、音猬因子(shh)、 红细胞生成素(EPO)、赖氨酰氧化酶(LOX)、原颗粒体蛋白、催乳素、生长素释放肽、神经丝抑蛋白、血管生成素、和胎盘催乳素。SMA(—种常染色体隐性遗传神经肌肉疾病)的分子基础是运动神经元生存基因 1 (SMNl)的杂合缺失，其也被称为SMN端粒型。在人体内发现一个SMm基因几乎同样的拷贝(称为SMN2，其也被称为SMN着丝粒型)，并且调节疾病严重程度。正常SMNl基因的表达单独导致运动神经元生存(SMN)蛋白的表达。SMN2基因表达导致大约10-20%的SMN蛋白和80-90%不稳定的/无功能的SMN δ 7蛋白。仅有10%的SMN2转录物编码与SilNl相同的功能性全长蛋白。两种基因间的这个功能区别来自翻译沉默性突变，然而其破坏了导致外显子7在多数SMN2转录物中遗漏的外显子剪接增强子。SMN蛋白在剪接体组装中起到已确定的作用，而且还可以介导神经元的轴突和神经末梢中的mRNA运输。各种SilNl分子和SMN蛋白的核苷酸和氨基酸序列是已知的。见，例如，图9Α-9Β ； NCBI 登录号 ΝΜ_000344(人)、ΝΡ_000335 (人)、ΝΜ_011420(小鼠)、EU791616(猪)、 NM_001131470 (猩猩)、NM_131191(斑马鱼)、BC062404(大鼠)、ΝΜ_001009328 (猫)、 ΝΜ_001003226 (狗)、NM_175701 (奶牛)。相似地，各种SMN2序列是已知的。见，例如NCBI 登录号匪_022876、匪_022877、匪_017411川6_008728、8(_000908、80)70242、00185039(均为人)。由于其在不同水平轴索中的多种作用，胰岛素样生长因子(IGF-I)是治疗包括运动神经元疾病的神经退行疾病的治疗性蛋白质(见Dore等，Trends Neurosci (1997) 20 326-331)。例如，在脑中它被认为降低了神经元和神经胶质的凋亡，保护神经元免遭铁、秋水仙碱、钙去稳定剂、过氧化物和细胞因子的毒性。其还可以调节乙酰胆碱和谷氨酸神经递质的释放，并且诱导神经丝蛋白、微管蛋白和鞘磷脂碱性蛋白的表达。在脊髓中，IGF-I被认为调节ChAT的活性并减轻胆碱能表型的缺失、增强运动神经元出芽、增强髓鞘形成、抑制脱髓鞘、刺激运动神经元从前体细胞的增殖和分化、及促进神经膜细胞分裂、成熟和生长。 在肌肉中，IGF-I显示诱导乙酰胆碱受体聚集物在神经肌接头处形成、并增加神经肌肉功能和肌肉强度。IGF-I基因具有复杂的结构，其在本领域是公知的。其具有至少两个来自基因转录子的可变剪接mRNA产物。有一个153个氨基酸的肽，已知有包括IGF-IA或IGF-IEa的多个命名，并且有一个195个氨基酸的肽，已知有包括IGF-IB或IGF-IEb的多个命名。Eb形式在人类也被称为Ec。IGF-I的成熟形式是70个氨基酸的多肽。IGF-IEa和IGF-IEb都含有70个氨基酸的成熟肽，然而其碳末端延伸的序列和长度不同。IGF-I蛋白，以及IGF-IEa 和IGF-IEb的肽序列是已知的，并且在例如国际申请号WO 2007/146046中有所描述，在此以其整体引入作为参考。人IGF-I的基因组和功能cDNA，以及关于IGF-I基因及其产物的其他信息在Unigene登录号NM_000618中能够得到。钙结合蛋白D28K(也称为钙结合蛋白D28)和微清蛋白是被认为涉及钙缓冲的钙结合蛋白。不受特定理论约束，钙平衡看起来在具有运动神经元疾病(例如，ALS)的受试者中被改变，并且低水平的钙结合蛋白-D28K和/或微清蛋白可以通过降低其处理增加的钙负荷的能力增加运动神经元的易损伤性。这种降低可导致细胞损伤和最终的运动神经元死亡。进一步的证据表明，富含钙结合蛋白质(如钙结合蛋白D28K和微清蛋白)的神经元可抵抗退行。HIF-I是一种杂合二聚体蛋白质，其由两个亚单位组成⑴一个组成型表达的β 亚单位，也称为芳烃核转运蛋白(ARNT)(其被其他相关转录因子共享(例如，二噁英/芳烃受体(DR/AhR))；和(ii) 一个α亚单位(见，例如国际公开号WO 96/39426，其描述了最近的HIF-I α的亲和纯化和分子克隆。两个亚单位均为碱性螺旋-噜扑-螺旋(bHLH)-PAS 家族转录因子的成员。这些结构域调控DNA结合和二聚化。转录激活结构域位于蛋白质的 C-末端。碱性区域由大约15个主要的负责直接DNA结合的碱性氨基酸组成。这个区域临近两个两亲性α螺旋，被不同长度的噜扑所分开，其形成了家族成员间主要的二聚体界面 (Moore 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97 10436-10441)。PAS 结构域包含 200-300 个氨基酸，其含有大约50个氨基酸的两个松散保守的主要疏水区，被命名为PAS A和PAS B。HIF-I α亚单位在含氧量正常的条件中不稳定，在正常的含氧水平下在培养细胞中高表达此亚单位能诱导通常被缺氧诱导的基因表达。用来自转录激活蛋白(如单纯疱疹病毒 (HSV)VP16, NF κ B或酵母转录因子GAL4和GCN4)的强反式激活结构域替代缺氧诱导因子蛋白的C末端(或反式激活)区域，被设计用来稳定含氧量正常条件下的蛋白质，并提供强组成型转录激活。见，例如，国际文献号WO 2008/042420中关于代表性稳定缺氧诱导因子蛋白的描述和序列，该缺氧诱导因子蛋白是由来自HIF-Ια的DNA结合和二聚体结构域和来自HSV VP16蛋白的反式激活结构域组成的杂合/嵌合融合蛋白质，在此以其整体引入作为参考。还见，美国专利号6，432，927和7，053，062关于组成型稳定杂合体HIF-I α的描述，此两篇在此以其整体引入作为参考。血管内皮生长因子(VEre)家族的成员属于最有效的血管生物学调节剂。它们调节血管发生、血管生成以及血管维持。已描述了 VEGF的四种不同分子变体。165个氨基酸的变体是在正常细胞和组织中发现的主要分子形式。还已知丰度较低的、在116和159 位之间删除44个氨基酸的较短形式(VEGF121)、在116位添加了 24个碱性残基的较长形式 (VEGF189)、以及具有41个氨基酸插入的另一较长形式(VEGF2tl6,其包括VEGF189中发现的24 氨基酸的插入)。VEGF121和VEGF165是可溶蛋白质。VEGF■和VEGF2tl6看起来是与细胞最相关的。VEGF的所有版本是有生物活性的。见，例如Tischer等，J. Biol. Chem. (1991)266 11947-11954，描述了 VEGF165 (也见 GenBank 登录号 AB021221) ,VEGF121 (也见 GenBank 登录号 AF214570)和 VEGF189 的序列；而 Houck 等，Mol. Endocrinol. (1991)5 1806-1814 描述了 VEGF206的序列。CNTF(睫状神经营养因子)是外周神经和中枢神经神经系统中的神经胶质细胞表达的神经细胞因子。通常因其在支持和存活非神经的和神经细胞类型中的功能来识别 CNTF。见，例如 Vergara，C 禾口 Ramirez，B ；Brain Res, Brain Res. Rev. (2004)47 :161—73。音猥因子(Shh)控制重要的发育过程，包括神经和神经胶质细胞的存活。促红细胞生成素(EPO)是红系祖细胞的主要调节剂。然而，它功能性地表达在神经系统中，并据报道具有神经保护作用。见，例如Bartesaghi，S.，2005. Neurotoxicology, 26 :923-8。编码人和其他哺乳动物EPO的基因已被克隆、测序并表达，且在物种间显示编码区序列的高度同源性。Wen等，Blood(1993)82 :1507-1516。编码天然人EPO的基因序列，以及获得其的方法在例如美国专利号4，954，437和4，703，008中有所描述，在此将其全部引入作为参考，以及 Jacobs 等(1985)Nature 313 :806_810 ；Lin 等(1985)Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 :7580 ；国际公开号WO 85/02610 ；和欧洲专利申请号232，034B1。另外， 编码天然猫科、犬科和猪EPO的基因序列是已知的，并可容易地获得(GenBank登录号分别为L10606 ；L13027 ；和L10607)，编码猴子(猕猴，Macaca mulatto)的基因序列也是已知的并可获得(GenBank登录号L 10609)。赖氨酸氧化酶(LOX)氧化肽基赖氨酸的侧链，从而将某些赖氨酸残基转化为 α -氨基己二酸_ δ -半醛。这是翻译后改变，例如，其能够使胶原和弹性蛋白的组分链共价交联。它稳定了细胞外基质中的这些蛋白质的纤维沉积。LOX还可以在多种阳离子蛋白质中氧化赖氨酸，这表明其功能比稳定或细胞外基质更广。LOX作为前体蛋白被合成；其作为前LOX出现于细胞、并被蛋白水解加工成活性酶。见，例如Lucero，HA和Kagan，HM, Cell. MoI.Life Sci(2006)63 :2304-2316。前颗粒体蛋白(PGRN)是多效性蛋白质。基因中的突变引起额颞叶退化。CNS中的PGRN通过小胶质细胞和神经元表达，并在脑发育中发挥作用。PGRN还涉及包括发育、伤口修复和肿瘤形成的多种“组织建模”过程。PGRN被弹性蛋白酶转变成颗粒体蛋白(GRN)。 因为前颗粒体蛋白具有营养特性，GRN更类似于炎性介质。CNS疾病动物模型的基因表达研究显示，与小胶质细胞激活和炎症相关的PRGN不同增加。PGRN表达的增加可能与小胶质细胞激活和神经炎症密切相关。而且，在包括运动神经元疾病和阿尔茨海默病的许多神经退化疾病中，在激活小胶质细胞中PGRN表达增加。研究已经将PGRN中的突变作为神经退化疾病的起因，并表明在神经生存中PGRN功能的重要性。少突神经胶质细胞，CNS中的髓鞘生成细胞，在整个成年期持续通过少突胶质细胞前体细胞(OPCs)产生，并为成人CNS中鞘磷脂损伤的内在修复所必需。在成人CNS中调节OPC增殖和新的成髓鞘少突神经胶质细胞生成的生理事件是众所周知的。最近已有报道具有多发硬化(MS，一种脱髓鞘疾病)的患者在妊娠的第三个月具有降低的复发率，表明激素影响少突胶质细胞生成。MS患者的减免期与活性白质病变的数量和大小的降低有关。小鼠的妊娠导致了母体CNS中新的少突神经胶质细胞生成和有髓鞘的轴突细胞数目的增加(Gregg等，J. Neurosci. (2007)27:1812-1823)。催乳素，一种在妊娠末期达高峰的激素，显示能调节妊娠期OPC增殖并促进未交配雌性小鼠的白质修复(Gregg等，J. Neurosci. (2007)27 1812-1823)。人胎盘催乳素(hPL，一种也是在妊娠的第三个月达高峰的激素)可能对少突胶质细胞生成有类似的影响。hPL具有一些与人生长激素(hGH)和催乳素性质上相似的生物学活性，并且看起来是IGF-I产生的主要调节剂。已显示hGH和IGF-I都是成人CNS中髓鞘形成的刺激剂(Carson 等，Neuron (1993) 10 :729_740，Peltwon 等，Neurology (1977) 27 282-288)。因此，涉及脱髓鞘的CNS疾病(如MS、ALS、中风和脊髓损伤)的治疗可能获益于基于PRL或hPL的治疗，如通过脑室内注射表达rhPRL或hPL的病毒载体。生长素释放肽是生长激素释放的介质，是一种胃激素。见，例如Wu等，Ann. Surg. (2004)239 :464ο神经丝氨酸蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员。在某些CNS疾病中，神经丝氨酸蛋白能潜在地通过阻断tPA的作用发挥神经保护作用。见，例如Galliciotti，G和 Sonderegger, P, Front Biosci (2006) 11 33 ；Simonin 等，(2006)26 10614 ；Miranda, E 和Lomas, DA, Cell MoI Life Sci (2006) 63 :709。血管生成素是RNA酶超家族成员。它是循环的正常成分，但也涉及作为在运动神经元疾病的风险因子。在本发明的某些组合物和方法中，编码一种以上上述治疗性分子的一种以上转基因能够被传递，其中每一转基因均有效连接至启动子以使得转基因能从单一 AAV载体表达。在另外的方法中，转基因可被有效连接至相同的启动子。每个转基因编码一个生物活性分子，其在CNS中的表达导致神经病理的至少部分纠正。此外，在一个以上转基因被传递的情况中，转基因可通过一个以上AAV载体传递，其中每个AAV载体含有有效连接至一启动子的一转基因。(如在任何不同分析和动物模型中测得的，保持所需生物活性的)天然分子、及其活性片段和类似物，包括在此进一步描述的那些，将被用于本发明。编码用于本发明的所需蛋白质的多核苷酸能够使用分子生物学的标准技术制备。 例如，能使用重组的方法(如通过从表达基因的细胞筛选cDNA和基因组库、或通过已知包含该基因的载体衍生基因)获得编码上述分子的多核苷酸序列。还可以基于已知序列合成(而不是克隆)生产感兴趣的基因。能使用特定系列的适当的密码子设计分子。然后从用标准方法制备的重叠寡核苷酸组装完整序列并组装成完整的编码序列。见，例如Edge， Nature (1981) 292 756 ；Nambair 等，Science (1984) 223 1299 ；和 Jay 等，J. Biol. Chem. (1984)259 :6311ο因此，特定的核酸序列能获自包含所需序列的载体、或在适当的时候使用本领域已知的多种寡核苷酸合成技术(如定点突变和聚合酶链反应(PCR)技术)全部或部分合成。见，例如Sambrook，上述。获得编码所需序列的核苷酸序列的一种方法是通过退火在常规自动化多核苷酸合成仪中生产的重叠合成寡核苷酸的互补组、而后用适当的DNA连接酶连接，并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。见，例如Jayaraman等，Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88 4084-4088 另外，寡核苷酸指导的合成(Jones 等，Nature (1986) 54 :75_82)、 事先存在的核苷酸区域的寡核苷酸指导的突变(Riechmarm等，Nature (1988) 332 :323_327 和Verhoeyen等，Science (1988) 239 1534-1536)、及使用T4 DNA聚合酶的缺口寡核苷酸的酶法填补(Queen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1989) 86 10029-10033)能被用于提供用于本发明主旨方法的分子。一旦生成，使用如下进一步描述的重组病毒载体传递构建体。AAV基因传递技术使用任意几个rAAV基因传递技术向间题受试者传递上述构建体。用于基因传递的几个AAV介导的方法是本领域已知的。如下面进一步描述的，能够将基因直接传递给受试者，或可选地在体外传递给适当的细胞(如来自受试者的细胞)、并将细胞重新移植给受试者。已经开发了用于基因传递的多种AAV载体系统。使用本领域已知的技术能够容易地构建AAV载体。见，例如美国专利号5，173，414和5，139，941 ；国际公开号WO 92/01070 (公布于 1992 年 1 月 23 日)和 WO 93/03769 (公布于 1993 年 3 月 4 日)；Lebkowski 等，Molec. Cell. Biol. (1988)8 :3988_3996 ；Vincent 等，Vaccines90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter, BJ. Current Opinion in Biotechnology(1992)3 533-539 ；Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol, and Immunol. (1992) 158: 97-129 ；Kotin, R. Μ. Human Gene Therapy(1994) 5 :793_801 ；Shelling 禾口 Smith，Gene Therapy (1994) 1 :165-169 ；及 Zhou 等，J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875。下面还进一步详述了 AAV载体系统。AAV基因组是含有大约4681个核苷酸的线性、单链DNA分子。AAV基因组一般包含一个在每个末端以反向末端重复(ITRs)为侧翼的内部非重复的基因组。ITR大约有145 个碱基对长。ITR具有多种功能，包括提供DNA复制起点及包装用于病毒基因组的信号。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。 r印和cap基因编码允许病毒复制和包装成病毒粒子的病毒蛋白质。特别地，从AAV r印区表达一个至少四个病毒蛋白的家族，R印78,Rep 68,Rep 52、和R印40，根据其表观分子量命名。AAV cap区编码至少三个蛋白质，VPI、VP2和VP3。AAV已被设计成通过删除AAV基因组的内部非重复部分(即r印和cap基因)及在ITR间插入异源基因来传递目标基因。异源基因通常被功能性连接至能够在适当的条件下启动患者目标细胞中基因表达的(组成型、细胞特异型或诱导型)。每种类型启动子的例子是本领域中公知的。还能包括终止信号如多聚核苷酸位点。AAV是辅助依赖性病毒；即，它需要与辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘) 共同感染以形成AAV病毒粒子。在缺乏与辅助病毒共同感染时，AAV形成潜伏状态，在此状态中病毒基因组插入到宿主细胞染色体，但是并不生产感染性病毒粒子。随后辅助病毒感染能“拯救”整合的基因组，允许其复制、并将其基因组包装至感染性AAV病毒粒子。因为 AAV能够感染来自不同种的细胞，辅助病毒必须是与宿主细胞同种的。因此，例如，人的AAV 将在犬类腺病毒共同感染的犬类细胞中复制。可以使用下面更详细描述的本领域公知的各种技术生产包含目标基因的重组AAV 病毒粒子。野生型AAV和辅助病毒可被用于提供用来生产rAAV病毒粒子必要的复制功能 (见，例如美国专利号5，139，941，在此以其全文引入作为参考)。可选地，含有辅助功能基因的质粒与以一种公知辅助病毒感染组合能被用做复制功能的来源(见，例如美国专利号 5，622，856和美国专利号5，139，941，两者均在此以全文引入作为参考)。相似地，含有辅助功能基因的质粒可以与以野生型AAV感染组合使用，以提供必要的复制功能。当与rAAV载体组合使用时，这三种方法每一种都足以生产rAAV病毒粒子。本领域技术人员也能使用本领域公知的其他方法生产rAAV病毒粒子。在本发明的一实施方案中，使用一个三次感染的方法(详细描述于美国专利号 6，001, 650中，在此以其整体引入作为参考)生产rAAV病毒粒子，因为这种方法不需要使用感染性辅助病毒，使得生产的rAAV病毒粒子没有任何可检测的辅助病毒存在。通过使用三个用于rAAV病毒粒子生产的载体完成这个一个AAV辅助功能载体、一个附属功能载体、和一个rAAV表达载体。然而，本领域技术人员应当理解，这些载体编码的核酸序列能以多种组合在两个或多个载体上提供。如在此解释的，AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能序列”(即r印和cap)，其反向用于生产性AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体生产， 而不产生任何可检测的野生型AAV病毒粒子(即含有功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。此种载体的一个例子，PHLP19，描述于美国专利号6，001，650中，在此以其全文引人做为参考。AAV辅助功能载体的I^p和cap基因能够来自如上面解释的任何已知AAV血清型。例如，AAV辅助功能载体可以具有来自AAV-2的r印基因和来自AAV-6的cap基因；本领域技术人员将认识到其它rep和cap基因组合是可能的，限定特征是支持rAAV病毒粒子生产的能力。附属功能载体编码AAV依赖其复制的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能(即，“附属功能”)的核苷酸序列。附属功能包括那些AAV复制所需的功能，包括但不局限于，涉及 AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成、以及AAV 衣壳装配的那些部分。基于病毒的附属功能能够来自任何已知的辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒、和牛痘病毒)。在一实施方案中，使用附属功能质粒pLaden05(关于pLaden05的详细内容描述在美国专利号6，004, 797中，在此以其全文引人做为参考)。此质粒提供了一套完整的用于AAV载体生产的腺病毒附属功能，但缺少形成复制全能性腺病毒的必要成分。为了进一步理解AAV，下面提供了更详细的关于重组AAV表达载体和AAV辅助和附属功能的讨论。重组AAV表达载体使用已知技术构建重组AAV(rAAV)表达载体，以至少提供作为在转录方向上的有效连接成分、包括转录起始区、目标多核苷酸和转录终止区的控制元素。选择在目标细胞中 (如在哺乳动物细胞中)有功能的控制元素。得到的含有有效连接成分的构建体与功能性 AAVITR序列(5'和3')相结合。AAV ITR区的核酸序列是已知的。AAV-2的序列见，例如Kotin，R. M. (1994)Human Gene Therapy 5 793-801 ；Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication，，in Fundamental Virology，第二版(B. N. Fields 和 D. Μ. Knipe 编)。在本发明的载体中使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列，而且可以(如通过核苷酸的插入、缺失、或替换) 被改变。另外，AAV ITR可以衍生自几个AAV血清型的任何一个，包括但不局限于，AAV-1、 AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9 等。而且，在 AAV 表达载体中在所选核苷酸序列两边的5'和3' ITR不需要一定是相同的或来自于相同的AAV血清型或分离群，只要其功能为，即，能够从宿主细胞基因组或载体切除和挽救目标序列，以及当在细胞中存在AAV Rep基因产物时，能够将DNA分子整合至受体细胞基因组中。用于常规AAV载体的适当的多核苷酸分子是少于或大约5千碱基(kb)的大小。选定的多核苷酸序列被有效连接至在受试者体内指导其转录或表达的控制元素上。此类控制元素能够包含通常与选定基因相关的控制序列。可选地，能够使用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包括来自于编码哺乳动物或病毒基因序列的那些。启动子的非限制性例子包括但不局限于，巨细胞病毒(CMV)启动子(Kaplitt等，Nat. Genet. (1994)8 :148_154)、 CMV/ 人 β 3-球蛋白启动子(Mandel 等，J. Neurosci. (1998) 18 :4271_4284)、GFAP 启动子(Xu等，Gene Ther. (2001) 8 1323-1332)、1. 8_kb的神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子 (Klein 等，Exp. Neurol. (1998) 150 183-194)、鸡 β 肌动蛋白(CBA)启动子(Miyazaki, Gene(1989)79 :269-277)、β-葡糖苷酸酶(GUSB)启动子(Shipley 等，Genetics (1991) 10 1009-1018)、和如分离自人泛素A、人泛素B、和人泛素C的那些泛素启动子，如美国专利号6，667，174中所描述的，在此以其全文引入作为参考。为了延长表达，可以另外将其他调控元素(如，例如土拨鼠肝炎病毒调控后元素(WPRE) (Donello等，J.Virol. (1998)72
185085-5092)或者牛生长激素(BGH)多腺苷酸位点)有效连接至转基因。另外，来自非病毒基因(如鼠科金属硫因蛋白基因)的序列也将被发现用于文中。此类启动子序列可以从例如Stratagene (圣地亚哥，加利福尼亚州)购买。对于一些CNS基因治疗应用，可能有必要控制转录活性。为了此目的，能够通过包括各种调控元素和药物响应性启动子(如(例如)Haberma等，Gene Ther. (1998)5. 1604-16011 ；和 Ye 等，Science (1995) 283 :88_91 所述)，获得使用病毒载体基因表达的药理调控。能通过向AAV基因组(已从其中切出了主要AAV开放阅读框(“ORFs”))中直接插入选定序列、构建具有AAV ITR结合的目标多核苷酸分子的AAV表达载体。还能删除 AAV基因组的其他部分，只要保留足够的ITR部分以保证复制和包装功能。能使用本领域熟知技术设计此类构建体。见，例如美国专利号5，173，414和5，139,941 ；国际公开号WO 92/01070(1992 年 1 月 23 日公开)和 WO 93/03769(1993 年 3 月 4 日公开)；Lebkowski 等，(1988)Molec. Cell. Biol. 8 :3988-3996 ;Vincent 等(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter(1992)Current Opinion in Biotechnology 3 533-539 ；Muzyczka(1992)Current Topics in Microbiol and Immunol. 158 97-129 ； Kotin (1994)Human Gene Therapy 5 :793_801 ；Shelling 禾口 Smith(1994)Gene Therapy 1 165-169 ；及 Zhou 等(1994) J. Exp. Med. 179 :1867-1875。可选地，能使用(如，Sambrook等上述的)标准连接技术，从病毒基因组或从包含其的另一载体上切出AAV ITR并融合另一载体中存在的所选核酸构建体的5'和3'端。例如，能够在 20mM Tris-Cl pH 7.5、10mM MgCl2UOmM DTT、33yg/ml BSAU0mM-50mM NaCl, 及或者40 μ M ΑΤΡ、0.01-0.02(韦斯)单位T4DNA连接酶中在0°C完成(对于“粘性末端” 连接)或者在ImM ATP,0. 3-0. 6 (韦斯)单位T4 DNA连接酶中在14°C完成(对于“钝性末端”的连接)。通常在30-100 μ g/ml总DNA浓度(总终浓度为5_100nM)中进行分子间的 “粘性末端”连接。含有ITR的AAV载体已在例如美国专利号5，139，941中有所描述。特别地，其中描述的几个AAV载体可获自美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，登录号为53222、 53223、53224、53225 和 53226。在某些实施方案中，rAAV表达载体提供为自身互补rAAV构建体。通常，rAAVDNA 作为长度大约为4600核苷酸的单链DNA(ssDNA)分子被包装入病毒衣壳。病毒感染细胞后， 单个DNA链被转变成双链DNA (dsDNA)形式。只有dsDNA对细胞的蛋白质是有用的，细胞将其所含的基因或多基因转录成RNA。因此，AAV常规复制策略需要从新合成互补DNA链。在表达前将ssDNA AAV基因组转变成dsDNA的这个步骤能够通过使用自身互补载体来避免。通过碱基配对来自两个感染病毒的互补链生产自身互补载体，其不需要DNA合成 (见，例如Nakai等，J.Virol. (2000)74:9451-9463)。这种链间碱基配对或链退火(SA)是可能的，因为AAV以相同效率包装正或负DNA链(Berns, K. I.，Microbiol. Rev. (1990)54 316-329)。因此，并不被理论所限制，通过SA或DNA合成的dsDNA转变的需求能通过包装作为单分子的两个链来完全避免。这能够通过利用在AAV复制循环期间AAV生产二聚体反向重复基因组的倾向性来实现。如果这些二聚体足够小，它们能够以常规AAV基因组相同的方式被包装，ssDNA分子的两半能够折叠和碱基配对以形成一半长度的dsDNA分子。dsDNA的转变不依赖于宿主细胞DNA合成和载体浓缩(McCarty等，Gene Ther. (2001)8 1248-1254)。scAAV病毒构建体包括大约4. 6kb并且能够被包装入正常AAV衣壳。每个已知的 AAV血清型能够以相似效率包装scAAV基因组(见，例如Sipo等，Gene Ther. (2007) 14 1319-1329)。因此，在本发明的某些实施方案中，scAAV载体包括选自AAVl、AAV2、AAV3、 八八￥4、44￥5、44￥6、44￥7、44￥8、或44￥9血清型的衣壳蛋白。然而，scAAV载体可以包括来自任何已知血清型的衣壳蛋白或本领域已知的修饰衣壳蛋白。这些scAAV载体还可以是假型载体，其含有在第二种AAV血清型衣壳中的一种AAV血清型基因组。此类载体可包括(例如)含有AAV2衣壳和AAVl基因组的AAV载体、或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体(Auricchio 等，(2001) Hum. Mol. Genet. ,10(26) :3075_81)。首先，相信在scAAV载体中的转基因序列能仅含有大约2. 2kb。然而，它看起来比之前所认为的具有更大的包装能力。例如，Wu等，Human Gene Ther. (2007) 18 171-182成功包装了超过3300bp的scAAV-2构建体，并且证明为完全DNA酶抗性的二聚体反向重复基因组。当在培养细胞中检测时，这些载体产生了 ssAAV上预期的转化效率的增加。能通过产生约一半常规基因组大小的载体质粒组合选择纯化感染性双链形式，或通过使用约一半基因组大小的载体质粒(在提供双链病毒合成的AAV病毒的一个末端决定序列中具有一个突变)，生产scAAV载体。这两种方法均生成共价连接在一末端重复的+ 和-链病毒基因组。特别地，正常单体AAV基因组的生成依赖于每一圈DNA合成中两个ITR依次的有效分辨率。此反应被两个较长的AAV R印同型的ssDNA内切酶活性介导。在末端决定位点缺刻ITR，随后是由宿主DNA聚合酶从缺口延长DNA。在末端决定位点被在另一端起始的复制复合体接触前，当Rep不能缺刻末端决定位点时就形成了二聚体基因组。通过抑制一末端重复的分辨率能大大增加在scAAV pr印中二聚体基因组的产量。 这可以通过从一个ITR删除末端决定位点序列来容易地完成，这样使得Rep蛋白不能产生重要的 ssDNA缺刻(见，例如 McCarty 等，Gene Ther. (2003) 10 :2112_2118 和 Wang 等，Gene Ther. (2003) 10 2105-2111)。然后在另一 ITR起始的复制复合体通过发夹结构复制并回到起始端。复制进行到模板分子的一端，在每一端留下dsDNA反向重复及野生型ITR，并在中间留下突变ITR。然后此二聚体反向重复能够从两个野生型ITR端进行正常数轮复制。每一个被取代的子链包含每一端的ssDNA反向重复和完整ITR并在中间有突变ITR。在取代链的3'端开始包装入AAV衣壳。从具有一突变ITR的构建体的scAAV生产通常产生超过 90%的二聚体基因组。从突变ITR构建体生产和纯化scAAV载体与常规ssAAV相同，如下所述。然而，如果使用点杂交或Southern杂交，优选将载体DNA在碱性条件下应用于杂交膜上以防止互补链的再退火。另外，可能在离突变ITR足够近的地方产生一个假的Rep缺刻位点，会允许末端分辨率和单体基因组的产生。通常能通过转基因盒转变关于突变与野生型末端重复将此避免。见，例如McCarty, D. M.，Molec. Ther. (2008) 16 1648-1656 ；McCarty 等，Gene Ther. (2001)8 1248-1254 ；McCarty 等，Gene Ther. (2003) 10 :2112_2118 ；Wang 等，Gene Ther. (2003) 10 :2105_2111) ；Wu 等，Human Gene Ther. (2007) 18 :171_182 ；美国专利公开号2007/0243168和2007/0253936，在此以其全文引入做为参考；以及在此用于生产scAAV 构建体的方法的实施例。为了本发明的目的，用于从AAV表达载体(既包括常规的也包括sc载体)生产 rAAV病毒粒子的适当的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞，其能够或者已经被用于异源DNA分子的受体，并且其能够生长于例如悬浮培养基、生物反应器、 等等。术语包括被转化的初始细胞的后代。因此，用于文中的“宿主细胞”通常指被外源DNA 序列转化的细胞。在本发明的实践中优选来自人稳定细胞系293 (能容易地通过例如美国典型培养物保藏中心以登录号ATCC CRL1573获得)的细胞。特别地，人细胞系293是被5 型腺病毒DNA片段转化(Graham等(1977) J. Gen. Virol. 36 59)并且表达腺病毒Ela和Elb 基因(Aiello等(1979) Virology 94:460)的人胚胎肾细胞系。293细胞系很容易被转化， 并且提供生产rAAV病毒粒子的特别方便的平台。AAV辅助功能含有上述AAV表达载体的宿主细胞一定被赋予能够提供AAV辅助功能，以便复制和包装以AAVITR为侧翼的核苷酸序列，从而产生rAAV病毒粒子。AAV辅助功能通常是AAV 衍生的编码序列，其能够被表达以提供AAV基因产物，其转而反式作用于生产型AAV复制。 在此应用AAV辅助功能以互补AAV表达载体所缺少的必要的AAV功能。因此，AAV辅助功能包括一个或两个主要的AAV0RF，即I^p和cap编码区，或其功能同源物。通过“AAVrep 编码区”指 AAV 基因组的 art 识别区(art-recognized region)， 其编码复制蛋白R印78,Rep 68,Rep 52和R印40。这些R印表达产物已显示具有很多功能，包括识别、结合及缺刻DNA复制的AAV起点、DNA解链酶活性和调节从AAV (或者其他异源性)启动子的转录。R印表达产物总体在AAV基因组复制中是必需的。对于AAV r印编码区的描述，见，例如，Muzyczka，N. (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158 97-129 ；和Kotin，R.M. (1994)Human Gene Therapy 5 :793_801。MV rep编码区适当的同源物包括人疱疹病毒6(HHV-6)r印基因，其也已知能介导AAV-2DNA复制(Thomson等(1994) Virology 204:304-311)。通过“AAV cap编码区”指编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同源物的AAV 基因组的art识别区(art-recognized region) 0这些Cap表达产物供给包装功能，其总体上为包装病毒基因组所必需。对于AAV cap编码区的描述，见，例如，Muzyczka，N.和Kotin， R. Μ.(上述)。通过在转染AAV表达载体之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞将AAV辅助功能引入宿主细胞。因此AAV辅助构建体被用于提供AAV r印和/或cap基因的至少瞬时表达以互补缺失生产型AAV转染所必需的AAV功能。AAV辅助构建体缺少AAV ITR，而不能复制、也不能包装它们自身。这些构建体能够是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，例如通常应用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，其编码Rep和Cap表达产物。见，例如 Samulski 等(1989) J. Virol. 63 :3822_3828 ；和McCarty 等(1991) J. Virol. 65 2936-2945。已经描述了许多编码R印和/或Cap表达产物的其他载体。见，例如美国专利号 5，139，941。AAV附属功能
宿主细胞(或包装细胞)也必须被赋予能够提供非AAV衍生的功能，或“附属功能”，以生产rAAV病毒粒子。附属功能是非AAV衍生的病毒和/或细胞功能，AAV依赖于其进行复制。因此，附属功能包括至少那些在AAV复制中所需的非AAV蛋白质和RNA，包括涉及AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物合成和AAV 衣壳装配的那些。基于病毒的附属功能能够来自于任何已知的辅助病毒。特别地，能够使用本领域技术人员已知的方法将附属功能引入并随后表达于宿主细胞中。通常通过用不相关辅助病毒感染宿主细胞提供附属功能。已知许多合适的辅助病毒，包括腺病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒1和2型；以及牛痘病毒。在此也可以发现非病毒辅助功能的用途，如使用任何不同已知试剂细胞同步化所提供的那些。见，例如Buller 等(1981)J. Virol. 40 :241_247 ；McPherson 等(1985)Virology 147 :217_222 ；Schlehofer 等(1986)Virology 152 :110_117。可选地，能够使用上述的附属功能载体提供附属功能。见，例如美国专利号 6，004，797和国际公开号WO 01/83797，在此以其全文引入做为参考。提供附属功能的核酸序列能够来自天然来源，如来自腺病毒颗粒基因组，或使用本领域已知的重组或合成方法构建。如上面所解释的，已证实对于附属辅助功能并不需要完全互补的腺病毒基因。特别地，已显示不能进行DNA复制及后期基因合成的腺病毒突变体可允许AAV复制。Ito等， (1970) J. Gen. Virol. 9 243 ；Ishibashi 等，(1971) Virology 45 :317。相似地，已显示在E2B 和E3区域的突变体支持AAV复制，表明E2B和E3区域可能不涉及提供附属功能。Carter 等，(1983)Virologyl26 :505。然而，在El区域缺陷、或者具有删除E4区域的腺病毒不能支持AAV复制。因此，ElA和E4区域可能直接或间接为AAV复制所必需。Laughlin等，(1982) J. Virol. 41 868 Janik 等，(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA78 1925 ；Carter 等，(1983) Virology 126:505。其他鉴定的 Ad 突变体包括ElB(Laughlin 等(1982)，上述 Janik 等(1981)，上述；Ostrove 等，(1980) Virology 104:502) ；E2A(Handa 等，(1975) J. Gen. Virol. 29 239 ；Strauss 等，(1976) J. Virol. 17 140 ；Myers 等，(1980) J. Virol. 35 665 ； Jay 等，(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 2927 ；Myers 等，(1981) J. Biol. Chem. 256 567) ；E2B(Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen 编，I99O)) ；E3 (Carter 等(1983)，上述)；和 E4 (Carter 等 (1983)，上述；Carter (1995))。尽管在ElB编码区具有突变的腺病毒提供的附属功能研究产生了矛盾的结果，Samulski 等，(1988) J. Virol. 62 206-210 已报道 ElB55k 是 AAV 病毒粒子生产所必需，而ElB19k不是。此外，国际公开WO 97/17458和Matshushita等，(1998) Gene Therapy 5 :938_945，描述了编码各种Ad基因的附属功能载体。特别优选的附属功能载体包括腺病毒VARNA编码区域、腺病毒E40RF6编码区域、腺病毒E2A72kD编码区域、腺病毒ElA编码区域、以及缺少完整ElB55k编码区的腺病毒ElB区域。此类载体在国际公开号 WO 01/83797中有描述。作为用辅助病毒感染宿主细胞、或用附属功能载体转染宿主细胞的结果，附属功能被表达，其反式激活AAV辅助构建体以生产AAV R印和/或Cap蛋白。R印表达产物从 AAV表达载体切除重组DNA (包括目标DNA)。Itep蛋白还服务于复制AAV基因组。表达的 Cap蛋白装配成衣壳，而重组AAV基因组被包装入衣壳。因此，跟着发生了生产型AAV复制， 并且DNA被包装入rAAV病毒粒子。“重组AAV病毒粒子”或“rAAV病毒粒子”在此被定义为感染性、复制缺陷病毒，包括AAV蛋白外壳，其包装两边以AAV ITR为侧翼的异源目标核苷酸序列。重组AAV复制后，能使用多种常规纯化方法(如柱层析、CsCl梯度、等等)从宿主细胞纯化rAAV病毒粒子。例如，能够使用多个柱纯化步骤，如阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱上的纯化。见，例如国际公开号WO 02/12455。而且，如果使用感染表达附属功能，能用已知方法灭活残留辅助病毒。例如，能通过加热至大约60°C (例如)20分钟或更长，将腺病毒灭活。这种治疗有效地仅灭活辅助病毒，因为AAV是极端热稳定的而辅助腺病毒是不耐热的。然后，能够使用下述的技术，用得到的含有目标核苷酸序列的rAAV病毒粒子进行基因传递。组合物和传递A.组合物一旦生产出来，编码目标基因的rAAV病毒粒子将被配方成适于传递的组合物。组合物将包括足够的遗传物质以生成治疗有效剂量的目标基因，即，足够剂量以(1)防止疾病发展或在有可能暴露于疾病或者有患病倾向但还未经历或表现出疾病症状的受试者体内导致疾病以较轻强度发生；(2)抑制疾病，即阻滞发展或逆转疾病的状态；或(3)减轻疾病症状，即降低受试者经历的症状数量，以及改变疾病相关的细胞病理。恰当的剂量还依赖于接受治疗的哺乳动物(例如人或非人灵长类动物或其他哺乳动物)、年龄和被治疗受试者的概况、治疗的疾病的严重性、给药模式、以及其他因素。本领域技术人员能很容易地确定恰当的有效剂量，并且下面提供了代表性剂量。组合物还包含药学可接受赋形剂。此类赋形剂包括任何药学制剂，其自身不诱导有害于接受组合物的个体的抗体产生，并且其可以被给药而不产生过度毒性。药学可接受赋形剂包括但不局限于，山梨醇、多种TWEEN化合物的任何一种、以及液体(如水、盐水、甘油和酒精)。其中药学可接受的盐类能包括，例如，无机酸盐类(如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等)；及有机酸盐(如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、等等)。另外，辅助的物质(如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等等)可以出现在此赋形剂中。药学可接受赋形剂的深入讨论可以在REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co. ,N. J. 1991) 中找到。配方可以是液体或(例如冻干的)固体。配方还可以作为气雾剂给药。一个特别有用的配方包括目标rAAV病毒粒子与一种或多种二元或多元醇和(可选的)去污剂(如山梨醇酯)的组合。见，例如美国专利号6，764，845，在此以其全文引入做为参考。B.传递通常地，使用体内或体外转化技术将重组病毒粒子弓丨入受试者。如果在体外转化， 将从受试者中移出所需的受体细胞、用重组载体转化、再引入受试者。可选地，能使用同种的或异种的细胞(其中那些细胞在受试者内不产生不恰当的免疫反应)。用于向哺乳动物宿主细胞传递的适当的细胞包括来自器官、肿瘤或细胞系的哺乳动物细胞类型。例如，能使用人类、小鼠、山羊、绵羊、牛、狗、猫、和猪细胞。使用的合适的细胞类型包括但不局限于成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、角化细胞、造血细胞、上皮细胞、肌细胞、神经细胞和干细胞。另外，能在体外转化神经祖细胞，然后将其传送到CNS。能够在适当的培养基中通过组合重组病毒和所需细胞转化细胞，并且使用常规技术如Southern杂交和/或PCR，或通过使用选择性标记筛选那些带有目标DNA的细胞。然后如上所述，能将转化的细胞配方成药学组合物，并通过下面描述的各种技术将一种或多种剂量的组合物引入受试者。对于体内传递，将重组病毒粒子配方成药物组合物，并以指定的方式直接给药一种或多种剂量。对于鉴别人脑中的结构，见例如The Human Brain Surface， Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply,第二版 eds. Deutero 等，Springer Vela, 1999 ；Atlas ofthe Human Brain, eds. Mai 等，Academic Press ；1997 ；禾口 Co-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain :3_Dimensional Proportional System :An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack 等，Thyme Medical Pub.，1988。对于鉴别小鼠脑中的结构，见，例如The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates，第二版，Academic Press，2000。如果需要，可以将人脑与其他哺乳动物脑的类似结构关联。例如，多数哺乳动物(包括人类和啮齿类)表现出内嗅海马投射物的类似局部解剖结构，其具有在投射至海马背侧或中隔极点的外侧和内侧内嗅皮层的外侧部分的神经元，而至腹侧海马的投射主要来自在嗅皮层内侧部分的神经元(Principles of Neural Science,第四版，eds Kandel 等，McGraw-Hill, 1991 ;The Rat Nervous System,第二版， ed. Paxinos, Academic Press，1995)。而且，内嗅皮层的II层细胞投射至齿状回，并且它们终止于齿状回分子层的外侧三分之二。来自III层细胞的轴突双向投射至海马的CAl和 CA3海马角区，终止于多洼层分子层。为了向中枢神经系统的特定区域、特别是脑部特定区域特异性传递载体，可以通过立体定位微注射给药。例如，在手术当天，患者带有固定到位(螺旋固定于头颅)的立体定位框基。使用高分辨MRI对带有立体定位框基(MRI兼容，带可信标记)的脑部成像。然后将MRI影像传送至运行立体定位软件的电脑。使用一系列冠状、矢状和轴向图像来确定载体注射的目标位置和轨迹。软件直接将轨迹翻译成适于立体定位框的3维坐标。在入口上打出钻孔，并将带有针的立体定位器植入指定的深度。然后注射在药物可接受媒介中的载体。然后通过直接注射将载体给药至初始目标位点，并沿轴突逆向运输至远端目标位点。 可以使用另外的给药途径(例如在直接目视下的表层皮质应用、或其他非立体定位应用)。在本发明中能够使用任何血清型的重组AAV，其中重组AAV可以是自身互补AAV或非自身互补AAV。在发明的某些实施方案中使用的病毒载体血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、 AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、和 AAV9(见，例如 Gao 等(2002)PNAS，99 :11854_11859 ；禾口 Viral Vectors for Gene Therapy :Methods and Protocols, ed. Machida,Humana Press, 2003)。还能使用在此所述的之外的其他血清型。而且，在此描述的方法中也能使用假型AAV 载体。假型AAV载体是在第二种AAV血清型衣壳中含有一种AAV血清型基因组的那些；例如，含有AAV2衣壳和AAVl基因组的AAV载体或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体 (Auricchio 等，(2001) Hum. MoI. Genet. ,10(26) :3075_81)。通过使用针、导管或相关仪器、使用本领域已知的神经外科技术(如通过立体定位注射)注射入例如脑室区(如一个或两个侧脑室)以及注射入纹状体(如纹状体的尾状核和壳核)、小脑、脊髓、和神经肌接头，可以将重组病毒粒子或体外转化的细胞直接传送到神经组织(如外周神经、视网膜、脊神经节、神经肌接头、及CNS)(见，例如Stein等，J Virol 73 :3424-3429，1999 ；Davidson 等，PNAS 97 :3428_3432，2000 ；Davidson 等，Nat. Genet. 3 219-223,1993 及 Alisky 和 Davidson，Hum. Gene Ther. 11 :2315_2329，2000)。在一个说明性实施方案中，通过向受试者或患者的脊髓直接注射高滴度载体溶液实现传递。在另一说明性实施方案中，涉及一种方法，其通过向受试者脑的小脑的深部小脑核(DCN)区至少一个区域给药含有转基因的重组AAV载体来传递转基因到受试者脊髓和/ 或脑干区。在小脑深部是称之为深部小脑核的灰质，被称为内(顶)核、间位(间位)核和侧(齿状)核。如在此所用的，术语“深部小脑核”总体指这三个区域，其中可能靶标这三个区域的一个或多个。病毒传递是在有助于转基因在脊髓和/或脑干区域表达的条件下、 在受试者脊髓的至少一个亚区进行。这些亚区包括一个或多个颈椎、胸椎、腰椎或骶。不受限于理论，本发明的一个实施方案在于能够向脊髓的每个区域提供治疗性分子(例如蛋白质或多肽)。可以通过向DCN注射AAV载体(包括scAAV载体)来实现这个目的。而且，靶标每个脊髓区域的单个神经板可能是重要的。神经板是脑和脊髓区域中特异的亚区。在某些实施方案中可能希望靶标某脊髓区域的特定神经板。因为运动神经元损伤也可能发生在上运动神经元，可能还希望向脑干区域提供治疗性分子(例如蛋白质或肽)。 在一个实施方案中，可能希望提供治疗性分子到脊髓(包括某些或所有亚区)和脑干(包括某些或所有亚区)。本发明使用向DCN中引入AAV载体以实现上述治疗性分子向脊髓区和/或脑干的传递。靶标脊髓(如神经节)的另一方法是通过鞘内传递、而不是注射到脊髓组织本身。 此种传送有很多优点。目标蛋白被释放到周围CSF，而且与病毒不同，被释放蛋白质能够渗透脊髓实质，正如其在急性鞘内注射后表现的那样。事实上，病毒载体的鞘内传递能够保持局部表达。鞘内基因治疗的另一个优点是鞘内方式模拟了已在人体中常规使用的腰椎穿刺 (即脊髓穿刺)给药。用于给药重组载体或转化细胞的另一方法是通过向脊神经节(DRG)神经元传递， 例如通过注射到硬膜外腔并随后扩散到DRG。例如，重组载体或转化的细胞能够在蛋白质扩散至DRG的条件下、通过鞘内插管被传递。见，例如，Chiang等，Acta Anaesthesiol. Sin. (2000) 38 31-36 Jain, K. K. ，Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9 :2403_2410。然而，另外一种给药至CNS的模式使用对流增强传递(CED)系统，其为载体的任何非手动传递。在CED的一个实施方案中，通过使用非手动传递系统产生压力梯度。通过使用 CED，重组载体能被传递到CNS大片区域的很多细胞。而且，被传递的载体在CNS细胞(例如神经胶质细胞)中有效地表达转基因。任何对流增强传递设备可适用于传递重组载体。 在一优选的实施方案中，设备是渗透泵或输液泵。渗透泵和输液泵均可从多个厂商(例如 Alzet Corporation,Hamilton Corporation, Alza, Inc.中白洛阿尔托,力口利福尼亚州)处买至IJ。通常以下面的CED设备传递重组载体。导管、插管或其他注射设备被插入所选受试者的CNS组织。立体定位图和定位设备是可买到的，例如购自ASI Instruments，沃伦，密歇根州。还可以使用从CT和/或MRI影像得到的解剖图进行定位，以帮助指导注射设备至所选靶标。而且，因为在此描述的方法能够实践以至于受试者相对大面积地吸收重组载体，所以需要比较少的输液管。因为外科并发症通常与渗透数量相关，这种传递模式能服务于降低使用传统传递技术所见的副作用。关于CED传递的详细描述，见美国专利号6，309，634，在此以其全文引入做为参考。侧脑室内、或脑室内传递重组AAV载体可以在一个或多个脑室进行，脑室中充满着脑脊液(CSF)。CSF是充满脑室的澄清液体，其存在于蛛网膜下腔，而且环绕脑和脊髓。CSF由脉络丛产生，并通过渗出或传输脑组织液到脑室中。脉络丛是沿侧脑室底部和第三和第四脑室顶部排列的结构。某些研究表明，这些结构能够每天产生400-600CCS液体，符合每天四次充满中枢神经系统的量。在成年人中，此液体的体积被计算出有125至 150ml (4-5oz)。CSF是连续形成、循环和吸收。某些研究表明，每天可能产生大约430至 450ml (接近2杯)的CSF。某些计算估计，在成人中生产量等于每分钟大约0. 35ml，在人类婴儿中为每分钟大约0.15。侧脑室的脉络丛生产多数CSF。CSF流经室间孔进入第三脑室，在第三脑室加入了由第三脑室产生的CSF，并继续沿中脑水管流入第四脑室。第四脑室加入了更多的CSF;然后该液体经过马让迪氏孔和卢施卡孔流入蛛网膜下腔。然后CSF循环经过脑基底、向下流及脊髓并向上到达大脑半球。CSF通过蛛网膜绒毛和颅内血管窦排空流入血液。一方面，公开的方法包括向困扰的受试者的CNS给药携带编码治疗性产物的转基因的rAAV病毒粒子，并允许转基因在给药位点附近的CNS内表达，在表达蛋白通过CSF被转运到遍及CSF时、该表达为足够水平以发挥治疗性效果。在一些实施方案中，方法包括给药携带治疗性转基因的高滴度病毒粒子组合物，以便转基因产物以治疗性水平表达于表达产物发生作用最终位点的远端CNS中的第一位点。在实验小鼠中，注射的AAV溶液的总体积为例如1至20 μ 1。对于其他哺乳动物， 包括人类，适当按比例决定体积和传递速率。治疗可以由每个位点单次注射组成、或可以在一个或多个位点重复。能使用多个注射位点。例如，在某些实施方案中，除了第一给药位点夕卜，含有携带转基因的病毒载体的组合物还可以被给药至另一位点，该位点可以是第一给药位点的对侧或同侧。注射可以是单次或多次、单侧或双侧。治疗剂量可以是(连续或间歇的)单剂量规划、或多剂量规划。而且，可以给药给受试者尽可能合适的多剂量。如果是给药多剂量，第一次给药的配方可以与后面的配方相同或不同。因此，例如，第一次给药能以AAV载体的形式，而第二次给药是腺病毒、质粒DNA、 蛋白组合物等等形式。而且，后面的传递也可以是与第二次传递模式相同或不同。另外，受试者可以通过文中公开的传递方法的组合接受本发明的rAAV载体。因此，受试者可以接受至少两个注射位点的AAV载体注射，注射位点选自脑室内注射、直接脊髓注射、鞘内注射和脑实质内脑注射(例如，纹状体、小脑，包括深部小脑核)。在一实施方案中，受试者可以通过以下方式接受rAAV载体1)至少一次脑室内注射，和至少一次直接脊髓注射或2)至少一次脑室内注射和至少一次鞘内注射或3)至少一次脑室内注射和至少一次脑实质内脑注射或4)至少一次直接脊髓注射和至少一次鞘内注射或5)至少一次直接脊髓内注射和至少一次脑实质内脑注射或6)至少一次鞘内注射和至少一次脑实质内脑注射。应当理解通过传递重组病毒粒子能表达一个以上转基因。可选地，如文中所述，也能向受试者传递(每个表达一个或多个不同的转基因的)分开的载体。因此，能够同时或顺序传递多个转基因。而且，还涉及以本发明方法传递的载体和其他合适组合物和治疗组合。另外，能使用蛋白质和核酸治疗的组合。
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确定最有效给药途径和治疗有效剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并随着载体、治疗组合物、靶细胞和被治疗受试者的不同而不同。使用(例如)一个或多个待解决特定疾病的动物模型能够很容易地确定治疗有效剂量。“治疗有效剂量”将落在一个相对宽的范围，其可以通过临床试验确定。例如，对于体内注射rAAV病毒粒子，剂量将大约是约IO6 至IO15个重组病毒基因组粒子，更优选IO8至IO14个基因组粒子重组病毒，或在这些范围中足以提供所需效果的任何剂量。在某些实施方案中，组合物中载体的浓度或滴度是至少为 (a)56，7、8、9、10、15、20、25、或 50(xl012gp/ml) ； (b)56、7、8、9、10、15、20、25、或 50(xl09tu/ ml)；或(c)5、6、7、8、9、10、15、20、25、或 50(xl0lcliu/ml)。对于体外转化，被传递至细胞的rAAV病毒粒子的有效剂量大约是IO8至IO13个重组病毒。在药物组合物中转化细胞的量依次是大约IO4至IOltl个细胞，更优选IO5至IO8个细胞。本领域技术人员通过建立剂量响应曲线的常规试验能很容易地确认其他有效剂量。通常，传递1 μ 1至Iml (如从0. 01至约.5ml)的组合物，例如传递约0. 05至约 0. 3ml (如0. 08,0. 09,0. 1,0.2等，及这些范围内任何数字)的组合物。动物模型可以在适当的动物模型中检测使用包括如上所述转基因的AAV病毒粒子的治疗效果和安全性。例如，显示与人疾病最相似的动物模型包括能自发地发展成特定疾病的高发病率的动物种、或那些已被诱导至疾病的动物种。特别是，已知并且已生成了几种用于SMA的动物模型。见，例如Sumner C. J.， NeuroRx (2006) 3 :235-245 ;Schmid 等，J. Child Neurol. (2007)22:1004-1012。如上面所解释的，SMA(—种常染色体隐性遗传神经肌肉疾病)的分子基础是运动神经元生存基因 (SMNl)的纯合缺失。在人类中发现了与SMm基因几乎相同的拷贝，称为SMN2，其调节着疾病的严重程度。与人相反，小鼠具有相当于SMm的单一基因(SMN)。此基因的纯合缺失对于胚胎是致命的，并导致大量细胞死亡，这表明SMN基因产物对细胞的生存和功能是必需的。向缺少SMN的小鼠中引入SMN2的两个拷贝能挽救胚胎致死率，产生具有SMA表型的小鼠(Monani等，Hum. MoI. Genet. (2000)9:333-339。高拷贝数的SMN2挽救小鼠，是因为在运动神经元中产生了足够的SMN蛋白。也见Hsieh-Li等，Nat. Genet. (2000) 24 :66_70，其报道了表达人SMN2的转基因小鼠系的产生。特别是，在SMN-/-背景中带有SMN2的转基因小鼠显示出与那些SMA患者类似的脊髓和骨骼肌中的病理改变。这些小鼠中病理改变的严重程度与含有外显子7编码区域的SMN蛋白的量相关。此小鼠模型的表型包括运动神经元细胞缺失、骨骼肌萎缩、异常的神经肌接头(NMJ)、行为缺陷、瘫痪和缩短的、大约2周的寿命。 Le 等，Hum. Mol. Genet. (2005) 14 :845_857。相似地，ALS的动物模型是已知的。ALS是致死的神经退行疾病，其特征为皮质、脑干和脊髓中运动神经元的选择性缺失。疾病的进展能导致肢体、中轴和呼吸肌萎缩。运动神经元细胞死亡伴随着反应性神经胶质增生、神经丝蛋白异常和皮质脊髓束和前根中大的有髓鞘纤维的显著缺失。尽管ALS的病因还不清楚，积聚的证据表明，散发的(SALS)和家族的(FALS)ALS共同具有许多相似的病理特征；因此，提供了对其中任一个形式的研究能导致普遍治疗的希望。FALS数量大约占确诊病例的10%，其中的20%与Cu/Zn超氧化物歧化酶(SODI)的显性遗传突变相关。表达突变人SODI蛋白的转基因小鼠(例如S0DIG93A 小鼠)概括了许多ALS的病理特征，并且是研究ALS的可买到的动物模型。对于SALS，牵涉众多病理机制作为根本原因，包括谷氨酸诱导的兴奋性中毒、毒素暴露、蛋白酶体功能障碍、线粒体损伤、神经丝蛋白解体和神经营养支持缺乏。实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)，也称为实验性过敏性脑脊髓炎，提供了 MS的动物模型。EAE与不同形式和阶段的MS非常相像。EAE是急性或慢性复发性、获得性、炎性和脱髓鞘的自身免疫病。为了创建该疾病，用构成髓鞘(环绕神经元的绝缘鞘)的蛋白质注射动物。这些蛋白质在被注射小鼠内诱导了自身免疫反应，其产生与人MS非常接近的疾病过程。EAE在许多不同的动物种(包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、短尾猴、恒河猴和狨猴)中被诱导。脊髓和延髓肌肉萎缩(SBMA)是成人发作的运动神经元疾病，其由雄激素受体 (AR)基因外显子1的三核苷酸重复(TNR)扩张所导致。此疾病特征在于运动和感觉神经元退行、近端肌肉萎缩和内分泌异常(如男子乳腺发育和生育力下降)。只有男性发展症状， 而女性携带者通常无症状。SBMA的分子基础是三核苷酸CAG重复的扩张，三核苷酸CAG重复在雄激素受体(AR)基因的第一个外显子中编码多谷氨酰胺段(polyQ)。病理标记是在脑干和脊髓及其他内脏器官残留的运动神经元中含有带扩张PolyQ的突变和截断AR的核内包涵体(Ni)。已创建了几个转基因小鼠模型用于研究SBMA的发病机制。见，例如Katsimo等， Cytogen. and Genome Res. (2003) 100:243-251。例如，携带在人 AR 启动子下的纯 239CAG 的转基因小鼠模型和携带具有扩张CAG的截短AR的另一个模型显示了脊髓运动神经元的运动损伤和核内Ni。携带具有扩张polyQ的全长人AR的转基因小鼠表明进行性运动损伤和神经病理以及表型的性别差异。这些模型概括了 SBMA中观察到的表型表达。马查多-约瑟夫病(MJD，也称为脊髓小脑共济失调3型，由具有多谷氨酰胺扩张的突变共济失调蛋白3引起。已生成了 MJD、及其他多谷氨酰胺脊髓小脑共济失调的小鼠模型。对于这些模型的综述，见例如Gould，V. F. C. NeuroRX(2005)2 :480-483。因此，本领域的动物模型标准可用于筛选和/或评估本发明方法和组合物在治疗运动神经元疾病方面的活性和/或有效性。发明的试剂盒本发明还提供试剂盒。在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括一个或多个含有编码目标蛋白的重组载体的包装物。试剂盒还可能包含一套合适的说明书，通常为书面说明书，其涉及对于文中所述任何方法的载体的使用。试剂盒可以包括任何常规的、适当的包装中的组分。例如，如果重组载体作为干燥配方被提供(例如，冻干或干粉)，通常使用带有弹性瓶塞的小瓶，以便于通过弹性瓶塞注射液体可以很容易地重悬载体。带有非弹性、可移动的封盖(例如密封的玻璃)或弹性瓶塞的安瓶最方便地用于液体配方。还涵盖与特定装置(如注射器或灌输装置(如微型真空泵))组合使用的包装。涉及使用或重组载体的说明书通常包括用于本方法使用的剂量、给药方案、和给药途径方面的信息。包装物可以是单位剂量、大容积包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明试剂盒中提供的说明书通常为标签上或包装插入物(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面指示，但也可以接受机读的指示(例如，在磁盘或光存储盘上执行的指示)。2.实验下面是实现本发明特定实施方案的例子。提供这些例子仅用于说明性目的，而无意以任何方式限制本发明范围。已经尽力以保证关于所用数字(例如，量、温度等)的精确度，但是，当然应该允许一些实验错误和偏差。材料与方法AAV载体。范例人S^l基因的开放阅读框(开放阅读框序列显示于图9A ；对应的氨基酸序列显示于图9B ；以GenBank登录号NM_000344可找到完整的核苷酸序列)被克隆至一个含有AAV2反向末端重复(ITR)和1.6kb巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或scAAV2 ITR和0. 4kb人β -葡萄糖苷酸酶(⑶SB)启动子的穿梭质粒中。scAAV包装反应中重组基因组的尺寸限制需要小启动子的使用(McCarty，D. M. Molec. Ther. (2008) 16:1648-1656)。因此，选择0. 4kb⑶SB启动子，因为其普遍表达遍及包括脊髓运动神经元的CNS (Passini等，J.Virol. (2001)75:12382-12392)。通过三质粒共转染人293细胞将每个重组质粒包装进AAV血清型8衣壳(见，例如美国专利号6，001，650， 在此以其全文引入做为参考)，并且如以前报道的将病毒粒子柱纯化(0' Riordan等， J.Gene Med. (2000)2 -.444-454.) 得到的载体 AAV2/8_CBA_hSMNl (AAV-hSMNl)和 scAAV2/8-GUSB-hSMNl (scAAV-hSMNl)分别拥有每ml 8. 3el2 和 2. 8el2 基因组拷贝的滴度。动物和方法。交配杂合体(SMNV_、hSMN2+/\ SMNA7+/+)育种对，并且在出生日 (PO)，新生幼鼠接受两个脑半球的侧脑室和上腰脊髓中的总共3次注射，每次2 μ 1。对于 AAV-hSMNl和scAAV-hS丽1，病毒载体总剂量分别是5. OelO和1. 7el0的基因组拷贝。所有的注射用如(Passini等，J.Virol. (2001)75 12382-12392)所述精细拉成的玻璃微管针进行。注射后，幼鼠被剪脚趾并测定基因型(Le等，Hum. MoI. Genet. (2005) 14:845-857)以鉴定 SMA(SMN+、hSMN2+/+、SMNΔ 7+/+)、杂合体和野生型(SMN+/+、hSMN2+/+、SMNΔ 7+/+)小鼠。所有窝被拣选出7个幼鼠以控制存活的幼崽群大小。不注射一些幼崽以生成未治疗对照组。Western杂交。为进行生化分析，在16天和58_66天处死治疗和未治疗小鼠，用磷酸盐缓冲液(PBS)灌注，解剖脊髓并分成腰椎、胸椎和颈椎段，并在液氮中速冻。使用T-Per 裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物(Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)、以50mg/mL浓度将组织勻浆。在10，000RCF下离心6分钟使勻浆物澄清，并使用BCA分析(Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)测量蛋白质浓度。将10-20yg勻浆物蛋白质在4-12% SDS-PAGE上分离，转至硝酸纤维素膜上，并用小鼠单克隆抗-SMN(1 5,000 BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)和兔多克隆抗-β-微管蛋白(1 750，Santa Cruz Biotechnology，圣克鲁斯，加利福尼亚州)抗体检测。用红外线二抗(1 20,000, LI-COR Biosciences，林肯市，内布拉斯加州))孵育膜，通过用Odyssey(LI-C0R Biosciences)定量荧光来观察蛋白质条带。分子量标记物确定了条带大小。免疫组化。为了组化分析，在16天和58-66天处死治疗和未治疗小鼠，用4%多聚甲醛(pH 7.4)灌注，移出脊髓并放置于30%蔗糖中48-72小时，在OCT中包埋并以低温恒温器切成ΙΟμπι的冰冻切片。在室温(RT)下将脊髓切片封闭lh，并随后与小鼠单克隆抗-SMN抗体(1 200稀释)孵育以鉴定AAV来源hSMN的表达，或与山羊多克隆抗-乙酰胆碱转移酶(ChAT)抗体(Millipore ；伯灵顿，马萨诸塞州；1 100稀释)孵育以鉴定脊髓第8层和9层(腹角)的运动神经元，或兔多克隆抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体 (Sigma-Aldrich, 1 2，500稀释)以鉴定星形细胞。在RT下孵育一抗lh，随后在4°C、在湿室中孵育过夜。然后脊髓切片与FITC偶联的抗兔二抗或Gy3偶联的抗山羊二抗(Jackson ImmunoResearch ；西格罗夫，宾夕法尼亚州1 250稀释)在RT下孵育lh。为增加SMN 和ChAT免疫阳性信号，分别根据厂家指导进行TSA信号扩增试剂盒(Perkin Elmer ；沃尔瑟姆，马萨诸塞州)或柠檬酸抗原恢复步骤(Vector Labs;伯灵格姆，加利福尼亚州)。用 Vectashield封片介质(Vector Labs ；伯灵格姆，加利福尼亚州)封盖切片。运动神经元计数。在颈椎、胸椎和腰椎段中计数ChAT免疫阳性细胞数。在沿三个脊髓段纵轴的腹角中以IOOX放大率进行两侧计数。邻近片层至少相隔100微米以防止相同细胞的两次计数。特别注意比较不同动物间的解剖学相匹配片层并且由单一观察者盲法评估所有细胞计数。位于脊髓第8层和第9层、表现出明显高于背景的荧光ChAT信号的细胞被认为是运动神经元。肌纤维大小。为外周组织学分析，如(Avila等，J.Clin. Invest. (2007) 117 659-671)报道，以石蜡处理来自每只小鼠右侧的固定四头肌、腓肠肌和肋间肌、并染色苏木精伊红以确定肌纤维大小。来自每只动物的每个肌肉的大约500个非重叠肌纤维被随机选取并以60X放大率拍照。使用Metamorph软件(Molecular Devices，桑尼维尔，加利福尼亚州)测量每个肌纤维的横断面积。神经肌接头染色(NMJ)。来自每只小鼠左侧的固定肌肉群被保存在PBS中用于NMJ 分析。如(Lesbordes 等，Hum. Mol. Genet. (2003) 12 1233-1239)报道，进行来自四头肌、腓肠肌和肋间肌的所挑肌肉纤维的全部染色。通过与针对150kD神经丝同型的兔多克隆抗体 (NF-M，Millipore，比尔里卡，马萨诸塞州，1 200稀释)在4°C孵育过夜、随后用生物素化抗兔二抗(Jackson ImmunoResearch, 1 200稀释)标记前突触神经末梢。用1 5000 的Alexa 555偶联的α -金环蛇毒素(Molecular Probes，尤金，俄勒R州)在RT下3h标记肌肉终板上的乙酰胆碱受体。将染色的肌纤维固定在载片上，用Vectashield封片，并在落射荧光下观察。为NMJ定量，随机选择来自每只动物的每个肌肉的最小100个NMJ，并在显微镜下评估。使用Zeiss LSM 510-META显微镜捕获共聚焦影像。行为试验。在正位反射中，每只小鼠被放置于仰卧位，并测定小鼠在所有四爪之上重定位自身所花费的时间。对于每只动物重复步骤3次，三个分数的平均值被定为扶正分数。如果小鼠60秒内不反应，试验终止。在负趋地性中，每一只小鼠被放在45°平台上面朝下方。如果小鼠转动180°成“头部向上”位置，则认为实验成功。给每只小鼠三次机会以在180秒或更短的时间完成任务。在握力强度中，前肢和后肢被一起放在线栅上并沿网格横向轻轻拖动。以力传感器(以克为单位)记录阻力。在后肢伸展试验中，通过尾巴将每只小鼠悬吊5秒，在任意系统基础上记录产生的伸展。与野生型小鼠中观察到的类似的两后肢健康伸展给分为4。两后肢的急剧伸展角度或“弱伸展”是3分。一次单腿伸展被定为2分。不表现伸展的小鼠给分为1。最后，当幼鼠将两后肢拉到一起、有效地将其穿过另一个时，出现0分。统计学。用单向ANOVA和Bonferroni多重post hoc比较和非配对双尾学生t_检验分析行为试验、运动神经元数目、肌纤维横截面积和NMJ。用相当于Mantel-Haenszel检验的log-rank检验分析Kaplan-Meier存活曲线。所有的统计学分析用GraphPad Prism v4. 0 (GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行。ρ < 0. 05的值被认为有显著性。
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实施例1使用AAV介导的SMNl传递的治疗显著增加了存活率向生后0天(PO)的SMA小鼠脑室内注射AAV_hSMNl到两侧脑室，并通过直接脊髓注射进上腰脊髓每只小鼠总剂量5. OelO的基因组拷贝。将治疗和未治疗SMA小鼠随机分为存活群(其中所有小鼠保持不被打扰并在人道终点被处死)，或分为年龄相当群(其中所有小鼠在与末期未治疗SMA小鼠做年龄匹配比较16天后被处死)。在存活群中，与未治疗SMA对照的15天相比，以AAV_hSMNl治疗SMA小鼠显示寿命中值显著增加至50天(ρ < 0. 0001,图1)。所有治疗SMA小鼠在15天还活着，与未治疗 SMA小鼠的0%相比，治疗SMA小鼠的87. 5%在19天还活着。Kaplan-Meier曲线表显示治疗的双峰生存分布，其中第一组在17-27天死亡，而第二组在58-66天死亡(图1)。在第一组，大部分治疗SMA小鼠显示了离床活动，但小鼠生长有障碍并且最终发现死于笼中。第二组治疗SMA小鼠在58-66天表现出离床活动和体重增加，但最终发展成严重的后肢坏死，导致动物的安乐死。照这样，58-66天的小鼠与16天的年龄相当群平行分析。实施例2SMN在脊髓中的AAV-介导表达和运动神经元计数在CNS给药AAV-hSMNl之后，hSMN蛋白水平增加遍及脊髓。在AAV治疗SMA小鼠的16天，与未治疗SMA和野生型小鼠相比，在注射腰椎段中的hSMN蛋白水平分别增加了大约34. 0和3. 6倍(图2A)。hSMN蛋白表达的增加延伸至其他段，其包括在16天、胸椎和颈椎脊髓中增加到野生型水平之上>2.0倍(图2B和2C)。在第二组中，hSMN蛋白表达在 AAV治疗SMA小鼠中持续58-66天。注射的腰椎和相邻胸椎和颈椎区分别比年龄相当WT对照高大约2. 5,2. 2和1. 2倍。组织切片的免疫染色显示在16天和58-66天、治疗SMA小鼠脊髓背角和腹角中的 hSMN蛋白(图3)。通过密切检查转化细胞，检测到遍布细胞质及核中纹样结构中以斑点模式的载体来源hSMN的表达(图3A)。而且，hSMN蛋白定位于不同颗粒样结构中的神经突， 该颗粒样结构能被观察到跨越树突和轴突全长(图3B-3D)。在SMA小鼠中很低水平内源性 hSMN蛋白低于细胞中免疫检测阈值(图3E)。ChAT和hSMN的共定位证实了转化细胞的一个亚类实际上是运动神经元(图 3F-3I)。在16天，AAV-hSMNl转化了在脊髓腰椎、胸椎和椎颈段大约18-42%的ChAT阳性细胞(图3J)。此百分数在58-66天更高，其中在三个脊髓段有60-70%的运动神经元表达外源hSMN(图3J)。与未治疗突变体相比，治疗SMA小鼠中运动神经元数目有总体增加(图 4)。然而，在16天和58-66天，与野生型小鼠相比，治疗SMA小鼠中的运动神经元明显更少 (图 4)。进行了来自未治疗、只脑室内(ICV)注射和仅腰椎注射的杂合体小鼠的颈椎组织切片的hSMN免疫染色。单独ICV注射对于脑中明显的AAV转化情况没有贡献，但尽管如此， 生成了用仅腰部注射不能实现的颈部脊髓的实质性靶标。特别是，仅ICV注射导致了颈部脊髓表达hSMN。这与腰椎段的实质内注射相反，该注射显示出很少的颈部脊髓转化，可能是因为处于注射部位的近远端。有时，在未治疗杂合体和野生型小鼠的核内可观察到具有纹样外观的SMN免疫阳性信号。然而，在未治疗SMA小鼠核内观察不到这个免疫染色模式。因此，在PO小鼠中ICV和腰椎注射的组合提供了广泛、普遍的脊髓转化。AAV8-hSMN的ICV注射靶标用于转化的错颈部脊髓。实施例3AAV治疗对肌纤维尺寸、NMJ和行为的影响选择四头肌(近端)、腓肠肌(远端)和肋间肌(呼吸)肌肉用于分析，因为它们显示出明显的退行。在第16天、未治疗SMA小鼠中，肌纤维是小的而且多数单个细胞包含< IOOym2的横截面积(图5Α)。来自未治疗SMA小鼠的少于10%的肌纤维包含大于 200 μ m2的横截面积。相反地，在AAV-hSMNl治疗SMA小鼠中肌纤维尺寸的分布与野生型相似，且许多细胞在16天和58-66天分别具有大于200或大于400 μ m2的横截面积(图5A和 5B)。在16天的整体平均值显示来自治疗SMA小鼠的肌纤维比那些来自未治疗SMA小鼠的大2倍以上(图5C)。另外，在58-66天、治疗SMA小鼠中，四头肌、腓肠肌和肋间肌的平均肌纤维横截面积分别为野生型小鼠的67%、76%和82% (图5C)。来自16天未治疗SMA小鼠的神经肌接头(NMJ)分析显示在前突触末端神经丝蛋白的异常积累(图6A)。在未治疗SMA小鼠中来自四头肌、腓肠肌和肋间肌的大约75-90% 的前突触末端显示出此标志性病理(图6F)。相反地，来自AAV-hSMNl治疗SMA小鼠的大部分前突触末端不含有此萎缩结构(图6B、6D)。在16天和58-66天，分别只有来自SMA小鼠的10-25%和5%的前突触末端显示出此标志性病理(图6F)。然而，与野生型相比，治疗导致了在前突触末端更多的分枝(图6B-6E)。在来自治疗SMA和野生型小鼠的后突触NMJ 上，α-金环蛇毒素染色产生了“饼样”结构，该结构是乙酰胆碱受体功能网络的指示物(图 6Β-6Ε)。 对治疗和非治疗小鼠进行已在此小鼠模型验证了的周期性行为试验(Butchbach 等，Neurobiol. Dis. (2007)27 :207_219 ；El-Khodar 等，Exp. Neurol. (2008)212 :29_43)。治疗SMA小鼠具有良好的身体分值和走动技巧，而未治疗小鼠是不受控制及麻痹的(图7A)。 治疗SMA小鼠比未治疗SMA对照明显更重，尽管它们从未达到野生型的大小(图7B)。治疗 SMA小鼠在扶正延迟中显示出显著改善(图7C)。在治疗SMA小鼠完成负趋地性试验中也有显著的改善，该试验测量空间运动行为(图7D)。另外，治疗SMA小鼠在握力强度和伸展其后肢能力中也显示出显著的改善(图7E、7F)。实施例4使用自身互补AAV对寿命的影响不为理论所限制，由于双链重组基因组，预期自身互补AAV(scAAV)载体具有更快的表达动力学(综述于McCarty，D. Μ. Molec. Ther. (2008) 16 :1648_1656)。这种表达的快速增加可能在高侵略性疾病或介入时间窗口小的病征中是有益的。因此，为确定早期表达是否能够改善效率，设计并检验了一个scAAV载体(scAAV-hSMNl)。使用如实施例1中进行的相同注射位点，将剂量为1. 7el0基因组拷贝的scAAV-hSilNl给药到POSMA小鼠。以scAAV-hSMNl治疗导致了 157天的生存中值引人注目和显著的改善(ρ < 0. 0001)，其相比于AAV-hSMNl治疗和未治疗小鼠分别增加了 +214%和+881% (图8)。 大约42%的scAAV治疗小鼠具有大于1000%的生存中值的增加(对数倍增加)。而且， scAAV2/8-GUSB-hSMNl 治疗导致了 88% 的 SMA 小鼠生存超过 66 天，相反 AAV2/8_CBA_hSMNl 治疗的为0%。scAAV治疗SMA小鼠具有健康的身体分数，养得很好，体重增加，并在其整个生命中保持下地活动。有趣的是，scAAV治疗SMA小鼠仅发展成轻微的后肢坏死，此坏死从不进展成严重的表型。大多数scAAV治疗SMA小鼠死于未预期的及突然出现的呼吸窘迫， 其包括呼吸时听得见的咔哒的喘息和降低的呼吸率。为了更好的理解使用scAAV8-hSMN所观察到的生存率增加的基础，在PO治疗另外的SMA小鼠、并在注射后16或64(58-66d)天处死，从生存曲线中分析长期生存的scAAVS 治疗小鼠(图8)。在16天，来自scAAV8-hS丽组的S丽表达水平大约是那些WT动物中观察到的60-90%。这些水平实质上低于在此时间点的AAV8-hSMN治疗得到的水平。在 scAAV8-hSMN治疗SMA小鼠中，在58-66和120-220天，腰椎和胸椎段的SMN水平分别高于或等于WT水平(图2A和2B)。相反，在所有时间点，颈部脊髓中的SMN水平保持相对低。使用hSMN免疫染色来自注射后16天和157天的未治疗SMA、AAV8_hS丽治疗SMA、 和scAAV8-hSMN治疗SMA小鼠的冰冻组织切片，检测腰椎脊髓中AAV载体向性比较。在使用 AAV8-hSMN的16天观察到与神经胶质细胞形态学一致的弥散hSMN免疫染色模式。hSMN和 mGFAP的双免疫标记证实了 AAV8-hSMN转化细胞的一亚类是星形胶质细胞。相反地，scAAV8 治疗导致了 hSMN仅在具神经细胞形态的不同细胞体中表达，其不与GFAP共定位。hSMN和运动神经元标记物mChAT的双免疫标记证实了 scAAV8-hS丽和AAV8_hSMN转化细胞的一亚类是运动神经元。如以157天的scAAV8-hSMN所示范的，也可以在有两种表达载体的脊髓中间神经元细胞层中观察到hS丽表达。因此，与AAV8-hSMN相反，scAAV8_hS丽治疗SMA小鼠的组织分析显示，hSMN表达很大程度上限制于神经元。此外，hS丽和mChAT的双免疫染色显示，与AAV8-hSMN相比、用scAAV8_hS丽转化的运动神经元百分数显著增加(图10A)。用scAAV更有效的靶标运动神经元与ChAT-阳性细胞数的显著增加有关(图10B-10D)。在16天、对四头肌和肋间肌中NMJ的分析也显示， 与AAV8-hSMN相比、用scAAV-hSMN显著降低了萎缩结构的数量(图IOE和10F)。然而，在 216-269天的异常NMJ数量有所增加，其伴随着scAAV-hSMN组中运动神经元细胞计数的降低(图 10B-10F)。总结而言，在出生时、将AAV8_hSMN注射到SMA小鼠模型的CNS中导致了遍布脊髓的SMN广泛表达，该表达翻译成骨骼肌生理的强劲改善。治疗SMA动物还表现出行为试验上的显著改善，表明神经肌接头是有功能的。重要的是，以AAV8-hSMN治疗增加SMA小鼠寿命中值至50天，相比于未治疗对照为15天。而且，用自身互补AAV载体注射SMA小鼠导致了改善的效率，包括显著延长寿命中值至157天。这些数据表明，CNS定向、AAV介导的SMN 增强在解决严重SMA小鼠模型的神经和肌肉病变中是非常有效的。因此，本发明公开了治疗脊髓疾病的组合物和方法。尽管发明主旨的优选实施例已被详细描述，应当理解在不偏离在此所述的发明精神和范围的情况下能够做明显的变动。
权利要求
1.一种自身互补的腺相关病毒(scAAV)载体，包括编码在有运动神经元疾病的受试者中调节运动功能的蛋白质的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的scAAV载体，其中运动神经元疾病选自脊髓性肌萎缩(SMA)、 肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)、 或外伤性脊髓损伤。
3.根据权利要求2所述的scAAV载体，其中运动神经元疾病是SMA。
4.根据权利要求3所述的scAAV载体，其中多核苷酸编码运动神经元生存(SMN)蛋白。
5.根据权利要求4所述的sckkN载体，其中SMN蛋白由人SMN-I编码。
6.根据权利要求5所述的scAAV载体，其中SMN蛋白包括与图9B所述序列具有至少 90 %序列同源性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的scAAV载体，其中SMN蛋白包括如图9B所述的氨基酸序列。
8.一种重组AAV病毒粒子，包括根据权利要求1-7任一项所述的scAAV载体。
9.一种组合物，包括根据权利要求8所述的重组AAV病毒粒子和药学上可接受的赋形剂。
10.一种在有运动神经元疾病的受试者中调节运动功能的方法，包括向受试者细胞给药治疗有效量的根据权利要求9所述的组合物。
11.一种向有脊髓性肌萎缩(SMA)的受试者提供SMN蛋白的方法，包括向有需要的受试者细胞给药包括根据权利要求4-7任一项所述的AAV载体的重组AAV病毒粒子。
12.根据权利要求10或11任一项所述的方法，其中通过向小脑深部小脑核的至少一个区域给药来给药组合物。
13.根据权利要求10或11任一项所述的方法，其中通过直接脊髓注射给药组合物。
14.根据权利要求10或11任一项所述的方法，其中通过脑室内注射给药组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中给药组合物到至少一个侧脑室。
16.根据权利要求10或11任一项所述的方法，其中通过脑室内注射和直接脊髓注射给药组合物。
17.根据权利要求10或11任一项所述的方法，其中通过鞘内注射给药组合物。
18.根据权利要求8所述的重组AAV病毒粒子在生产用于在有运动神经元疾病的受试者中调节运动功能的药物的用途。
19.包括根据权利要求4-7任一项所述的AAV载体的重组AAV病毒粒子在生产用于向有脊髓性肌萎缩(SMA)的受试者细胞提供SMN蛋白的药剂的用途。
全文摘要
本发明公开了组合物和方法，用于治疗影响运动功能的疾病，例如被脑和/或脊髓疾病或损伤影响的运动功能。本发明还公开了一种自身互补腺相关病毒载体，用于治疗运动神经元疾病，例如脊髓性肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化和外伤性脊髓损伤。
文档编号A61K31/7088GK102459611SQ201080027833
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月27日 优先权日2009年5月2日
发明者L·谢哈布丁, M·A·帕西尼, S·H·程 申请人:建新公司