专利名称：Casb7439构建体的制作方法
CASB7439构建体背景
哺乳动物无刚毛鳞甲同系物(Achaete-Scute homolog)是果蝇无刚毛鳞甲复合物的保守哺乳动物同源物。它们是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH或HLH)基因家族的成员，其充当对于发育必需的谱系特异性转录因子。该家族的一个鼠成员MASH2是胎盘发育必需的，但对于胚体发育并不重要。HASH2,MASH2基因的人直向同源物，在1997年由Alders等人进行克隆(由该作者指名为〃ASCL2〃)。Alders 等人(1997)战皿 Molec. Genet. 6:859-867。如W001/62778中所述，表达研究揭示与相邻正常结肠和其他测试的正常组织比较，HASH2转录物(其中称为CASB7439)在结肠直肠肿瘤中是超表达的。这种基因在具有I 至IV期腺癌的患者中是超表达的。因此，该蛋白质可以视为在用于改善受试者的癌症的免疫治疗方法中有用的癌抗原，例如通过使用重组CASB7439作为抗原特异性癌免疫治疗剂 (ASCI)0发明概述
用于增加CASB7439多肽的重组产生的化合物和方法在本文中提供。在某些实施方案中，提供了修饰的CASB7439多肽，以及包含此类修饰的CASB7439多肽的蛋白质构建体。所述修饰的CASB7439多肽包含用于CASB7439增强产生的至少一个修饰。申请人还公开了包含编码修饰的CASB7439多肽的多核苷酸序列的核酸分子和包含如本文描述的此类修饰的 CASB7439多肽的蛋白质构建体。在特定方面，申请人如下公开了具有氨基酸(aa)序列的蛋白质构建体和编码其的核苷酸序列(DNA)
LVL055 [SEQ ID N0:1 (aa) ；SEQ ID NO:2 (DNA)]；
LVLlll [SEQ ID NO:3 (aa) ；SEQ ID NO:4 (DNA)]；
LVL137 [SEQ ID NO:5 (aa) ；SEQ ID NO:6 (DNA)]；
LVL141 [SEQ ID NO:7 (aa) ；SEQ ID NO:8 (DNA)]；
LVL144 [SEQ ID NO:9 (aa) ；SEQ ID NO:10 (DNA)]；和
LVL168 [SEQ ID NO:11 (aa) ；SEQ ID N0:12 (DNA)]。还公开了利用本文描述的核酸分子用于产生蛋白质构建体的方法和过程。申请人:还公开了免疫原性组合物，这些组合物包含本文描述的一种或多种修饰的 CASB7439多肽或构建体、和药学可接受的载体或赋形剂，其中载体或赋形剂可以任选包含缓冲剂。在某些实施方案中，公开了本文描述的修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体一或编码其的核酸分子一在制备用于治疗结肠直肠癌的药物中的应用。在某些实施方案中， 公开了如本文公开的蛋白质构建体，其用于治疗、特别是结肠直肠癌治疗。在某些实施方案中，公开了用于引发针对具有结肠直肠癌的受试者中的CASB7439的免疫应答的方法，该方法包括(a)选择具有结肠直肠癌的受试者；和(b)给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含如本文描述的修饰的CASB7439多肽或构建体、和药学可接受的载体或赋形剂，其中载体或赋形剂可以任选包含缓冲剂。附图简述
图1/35。该图呈现了描述CASB7439多肽的各个区域的示意图，具体地DNA特异性 (DNA结合)结构域、bHLH结构域和富含脯氨酸的区域。关于细节参见实施例2。图示还显示了下述区域核靶向(灰色箭头)；α螺旋(灰色圆柱体)；卷曲螺旋(黑色圆柱体)；固有无序(黑色箭头)；和低复合性(灰色框)。图2/35。该图呈现了描述与完全CASB7439多肽比对的CASB7439多肽的多个截短 (黑色箭头)的示意图。关于细节参见实施例4。图3/35。该图呈现了 CASB7439的示意图，显示富含脯氨酸的区域的近似定位，以及鉴定和预测的表位。各种实施方案包含通过去除富含脯氨酸的区域内的某些或所有氨基酸修饰的CASB7439多肽。此类修饰的CASB7439多肽保留在CASB7439多肽内的高部分表位。图4/35。显示了在未修饰的CASB7439多肽(SEQ ID NO: 13)序列和起因于对于 CASB7439多肽的下列2个可能修饰的多肽序列之间的比对在第一个可能修饰中21个邻接氨基酸残基(133-153，包括133和153)被缺失；在第二个可能修饰中21个邻接氨基酸残基(131-151，包括131和151)被缺失。进一步地，可以设想对于CASB7439多肽的第三个修饰，其中21个邻接氨基酸残基(132-152，包括132和152)被缺失。如该图中所示，在缺失区域中所得到的修饰的CASB7439多肽序列(插入，有圆圈的)对于所有3个修饰是相同的。 这是因为在SEQ ID NO: 13的位置131-132和152-153上重复的RG氨基酸残基。图5/35。该图呈现了在实施例6的蛋白质构建体之间的氨基酸序列比对。 CASB7439 = HASH2 氨基酸序列(SEQ ID NO: 13);LVL088 (SEQ ID N0:27);LVL111 (SEQ ID NO:3) ；LVL137 (SEQ ID NO:5) ；LVL138 (SEQ ID NO:33) ；LVL168 (SEQ ID N0:11)。图6/；35。该图呈现了在HASH2 (CASB7439)氨基酸序列(SEQ ID N0:13)和下述蛋白质构建体之间的比对LVL168 (SEQ ID N0:ll);pDl/3 (SEQ ID NO:39)；和 LVL144 (SEQ ID N0:9)。图7/35。在正常(12个)和结肠直肠癌(83个)组织中CASB7439 mRNA表达的实时qPCR分析。参见实施例9。图8/35。在各种人结肠直肠(CRC)样品中CASB7439 mRNA和蛋白质表达之间的对应。 (黑色圆圈)代表在结肠癌样品中的CASB7439 mRNA表达，而〇(空心圆圈)代表在正常相邻组织中的CASB7439 mRNA表达。通过免疫荧光检测的CASB7439蛋白质的相应水平在每种样品上方指出(-无表达，+/"极低表达，+低表达，++强表达和+++极强表达)。 CRC 原发性肿瘤，METS 转移性，NAT 正常相邻组织。除其为粘液癌的样品2M40和M762 夕卜，所有样品是结肠腺癌。参见实施例9。图9/35:在这个表中阐述了在用各种CASB7439构建体免疫接种后用于脾细胞再刺激的覆盖整个CASB7439蛋白质序列的肽库。参见实施例10。图10/35。显示了用于T细胞免疫原性研究的CASB7439肽矩阵。参见实施例10。图11/35。在用CASB7439重叠肽(库，矩阵法)再刺激后，在用LVLlll + AS01B 免疫接种的近交小鼠的4个品系(C57BL6、BALBC、CB6F1和C3H)中表示为双重阳性百分比 (IFNY/TNFa)⑶4 T细胞的⑶4应答。参见实施例10，近交小鼠多品系比较实验。图12/35。在用CASB7439重叠肽(库，矩阵法)再刺激后，在用LVLlll + AS15免疫接种的近交小鼠的4个品系中表示为双重阳性百分比(IFNY/TNFa )⑶4 T细胞的⑶4应答。参见实施例10，近交小鼠多品系比较实验。图13/35。在先前段落中讨论的4种近交小鼠品系中⑶4免疫原性CASB7439肽的鉴定。淡灰色=0.2-0.4 %双重阳性(IFN γ/TNFa )⑶4 T细胞；深灰色彡0. 5%双重阳性(IFNY/TNFa )⑶4 T细胞。参见实施例10，近交小鼠多品系比较实验。图14/35。在远交CDl小鼠(AS01B上图；AS15下图)中CD4免疫原性CASB7439肽的鉴定。淡灰色=0.2-0.4 %双重阳性(IFN γ/TNFa )⑶4 T细胞；深灰色彡0. 5%双重阳性(IFNy/TNFa ) T-⑶4细胞。参见实施例10，CASB7439在小鼠中的免疫原性在远交小鼠中的CASB7439 T细胞免疫原性。图15/35。在用CASB7439重叠肽(免疫显性肽的库)再刺激后，在用由AS15配制的 LVL111、LVL168或LVL144免疫接种的个别CDl远交小鼠中表示为双重阳性(IFN γ/TNF a ) 百分比的⑶4和⑶8 T细胞应答。参见实施例10，在远交小鼠中的LVL111、LVL168和LVL144研究。图16/35。在用CASB7439重叠肽(7种肽/库的7个库+肽M (SEQ ID NO:76)) 再刺激后，从用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接种的HLA A2. 1/DR-1转基因小鼠中分离的合并外周血淋巴细胞(PBL)中的⑶4 T细胞应答 (表示为双重阳性百分比(IFN γ/TNF a ))。图17/35。在用CASB7439重叠肽(7种肽的7个库+肽24 (SEQ ID NO:76))再刺激后，从用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接种的 HLA A2. 1/DR-1转基因小鼠中分离的合并PBL中的⑶8 T细胞应答(表示为双重阳性百分比 (IFN y/TNF a ))。图18/35。在用CASB7439重叠肽(7种肽的7个库+肽24 (SEQ ID NO:76))再刺激后，从用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接种的 HLA A2. 1/DR-1转基因小鼠中分离的脾细胞中的CD4 T细胞应答(表示为双重阳性百分比 (IFN y/TNF a ))。图19/35。在用CASB7439重叠肽(7种肽的7个库+肽24 (SEQ ID NO:76))再刺激后，从用由AS15配制的LVL168 (SEQ ID NO: 11)或LVL144 (SEQ ID N0:9)免疫接种的 HLA A2. 1/DR-1转基因小鼠中分离的脾细胞中的CD8 T细胞应答(表示为双重阳性百分比 (IFN y/TNF a ))。图20/35。在 LVLlll + ASOlB 或 LVLlll + AS15 免疫接种后触发的，在 CB6f 1 近交小鼠中的CASB7439特异性抗体应答(IgGl和IgGh)的时间-过程分析。参见实施例10， 在小鼠中CASB7439的免疫原性CASB7439介导的体液应答。图21/35。在用由AS15佐剂配制的LVL111、LVL168或LVL144或用单独的AS15佐剂免疫接种后，在近交CB6fl小鼠中的CASB7439特异性体液应答(IgGl和IgG^i)。参见实施例10，在小鼠中CASB7439的免疫原性CASB7439介导的体液应答。图22/35。在用由AS15佐剂配制的LVL111、LVL168或LVL144或用单独的AS15佐剂免疫接种的CDl远交小鼠中的CASB7439特异性体液免疫应答(IgG滴度);首次用于实验的小鼠用作对照。参见实施例10，CDl小鼠研究。图23/35。在用由ASOlB (上)或AS15 (下)配制的LVLlll免疫接种的CB6fl小鼠中的TC1/CASB7439 #14肿瘤移植物。参见实施例11，研究#1. 1。在上图中，从上到下在曲线图上的曲线次序是‘缓冲液，、LVLlll (10μδ),LVLlll (IOPg)+ AS01B、和 LVLlll ( μδ) + ASOlB0在下图中，在下部的曲线是LVLlll (IOPg)+ AS15。图对/35。来自实施例11，研究#1.2的存活曲线呈现于上、中和下图中。TF 无肿瘤。(上)用盐水缓冲液、不含佐剂的LVLlll或单独的佐剂(AS01或AS15)免疫接种且用 TC1/CASB7439 #14细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。来自用LVLlll免疫接种的组的最后一个存活小鼠首先死亡，随后为来自ASOlB组的最后一只存活小鼠，随后为来自AS15组的最后一只存活小鼠，和来自缓冲液组的最后一只存活小鼠。(中)用单独的AS15或用由 AS15配制的所示剂量的LVLlll免疫接种且用TC1/CASB7439 #14细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。来自AS15组的最后一个存活小鼠首先断气。在其他组中，组具有最少存活者，随后为Wg组，随后为IOPg组，其具有最多的存活者。(下)用单独的ASOlB或用由 ASOlB配制的所示剂量的LVLlll免疫接种且用TC1/CASB7439 #14细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。在该小图中，来自IOPg和ASOlB的组的最后一个存活小鼠在同一天断气。Wg 和30μβ组在最后一天具有相同存活百分率。图25/35。呈现了来自实施例11，研究#1.3的存活曲线。TF 无肿瘤。(上)关于用由AS15配制的LVL111、LVL144或LVL168或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439#14 细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。(下)关于用由AS15配制的LVL111、LVL144或LVL168 或单独的AS15免疫接种且用MC38/CASB7439#35细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。图沈/35。呈现了来自实施例11，研究#1.4的存活曲线。TF 无肿瘤。(上)用由 AS15配制的LVL144或LVL168或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14细胞攻击的 CB6fl小鼠的存活曲线。用LVL144免疫接种的组具有边缘更大的存活百分比。(中)关于用由AS15配制的LVL144或LVL168或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。用LVL144接种的小鼠具有略微更高的存活百分比。(下) 关于用由AS15配制的LVL144或LVL168或单独的AS15免疫接种且用MC38/CASB7439 #35 细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。用LVL144接种的小鼠不具有存活者。图27/35。呈现了来自实施例11，研究#2. 1的存活曲线。TF 无肿瘤。(上)用由 AS15配制的6. 25 Pg LVL168和10 Pg LVL144或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。用LVL168接种的小鼠具有略微更高的存活百分比。(中上)用由AS15配制的3. 1 μδ LVL168和5 μδ LVL144或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。用LVL144接种的小鼠具有略微更高的存活百分比。(中下)用由AS15配制的1.55 μδ LVL168和2. 5 μδ LVL144或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。用LVL144 接种的小鼠具有最高的存活百分比。(下)用由AS15配制的0.77 μg LVL168和1. 25 μg LVL144或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6f 1小鼠的存活曲线。用LVL168接种的小鼠具有略微更高的存活百分比。图观/35。呈现了来自实施例11，研究#2. 2的存活曲线。TF 无肿瘤。(上)用由 AS15配制的6. 25 Pg LVL168或10 Pg LVL144或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的C57B1/6小鼠的存活曲线。(中上)用由AS15配制的3. 1 Pg LVL168或5 μδ LVL144或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的C57B1/6小鼠的存活曲线。(中下)用由AS15配制的1. 55 Pg LVL168或2. 5 Pg LVL144或单独的AS15免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的C57B1/6小鼠的存活曲线。(下)用由AS15配制的 0. 77 μδ LVL168 或 1. 25 μδ LVL144 或单独的 AS15 免疫接种且用 TC1/CASB7439 #14-2 细胞攻击的C57B1/6小鼠的存活曲线。图四/35。呈现了来自实施例11，研究#2. 3的存活曲线。TF 无肿瘤。(上)用由 AS15 配制的 6. 25 μδ LVL168 或 10 μδ LVL144 免疫接种且用 TC1/CASB7439 #14-2 细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。接受LVL168的小鼠组具有最高存活百分比，随后为接受 LVL144的组。在仅接受AS15的组中没有存活者。(中)用由AS15配制的3. 1 μδ LVL168和 5 μδ LVL144免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。接受 LVL168的小鼠组具有最高存活百分比，随后为接受LVL144的组。在仅接受AS15的组中没有存活者。(下)用由AS15配制的1.55 μδ LVL168和2. 5 μδ LVL144免疫接种且用TCl/ CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。接受LVL168的小鼠组具有最高存活百分比，随后为接受LVL144的组。在仅接受AS15的组中没有存活者。盐水缓冲液或单独的AS15用作对照。图30/35。来自实施例11，研究#2. 3的存活曲线。TF 无肿瘤。(上)用由AS15配制的0. 77 μδ LVL168或1. 25 μδ LVL144免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的 CB6fl小鼠的存活曲线。接受LVL168的小鼠组具有最高存活百分比，随后为接受LVL144 的组。在仅接受AS15的组中没有存活者。(中)用由AS15配制的0. 19 μδ LVL168或0. 31 Pg LVL144免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。接受 LVL168的小鼠组具有最高存活百分比。来自接受LVL144的组的最后一个存活小鼠活得比来自AS15组和缓冲液组的最后一个存活者久。(下)用由AS15配制的0. 048 μδ LVL168或 0.078 μδ LVL144免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2细胞攻击的CB6fl小鼠的存活曲线。 接受LVL168的小鼠组具有最高存活百分比。来自接受LVL144的组的最后一个存活小鼠活得比来自AS15组和缓冲液组的最后一个存活者久。盐水缓冲液或单独的AS15用作对照。图31/35。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接种的雄性和雌性CB6fl小鼠中的TC1/CASB7439 #14-2肿瘤移植物；单独的AS15用作对照(上)。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接种的C57B1/6小鼠中的TC1/CASB7439 #14-2肿瘤移植物；单独的AS15用作对照(下)。图32/35。上图用由 AS15 配制的 1 Pg LVL168 免疫接种且用 TC1/CASB7439 #14-2 细胞攻击的雄性和雌性CB6fl小鼠的存活曲线。单独的AS15在雄性和雌性CB6fl小鼠中用作对照。在用LVL168加上AS15免疫接种的CB6fl小鼠中，存在7只无肿瘤(TF)雄性和3 只TF雌性。在接受单独的AS15的小鼠中不存在TF。下图用由AS15配制的1 Pg LVL168 免疫接种且用TC1/CASB7439 #14-2攻击的C57B1/6小鼠的存活曲线。单独的AS15在雄性和雌性C57B1/6小鼠中用作对照。在用LVL168加上AS15免疫接种的C57B1/6小鼠中，存在2只TF雄性和1只TF雌性。在接受单独的AS15的小鼠中，存在5只TF雄性和1只TF 雌性。图33/35。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接种或用单独的AS15免疫接种的雄性(黑色圆圈)和雌性(灰色圆圈)CB6F1小鼠中的CASB7439特异性体液免疫应答(IgG 滴度)(左)。在用由AS15配制的1 Pg LVL168免疫接种或用单独的AS15免疫接种的雄性 (黑色圆圈)和雌性(灰色圆圈)C57/BL6小鼠中的CASB7439特异性体液免疫应答(IgG滴度)(右)。图34/35。在用覆盖整个CASB7439蛋白质序列的46种肽的肽库(参见图9)再刺激后，从用由AS15配制的1 Pg LVL168 (SEQ ID NO: 11)或单独的AS15免疫接种的CB6F1 小鼠中分离的合并PBL中的⑶4 T细胞应答(表示为双重阳性百分比(IFN γ/TNF α ))(上)。 在用CASB7439合并肽，覆盖整个CASB7439蛋白质序列的46种肽的肽库(参见图9)(下左)； CASB7439肽39 (SEQ ID Ν0:91)(中下)；或RPMI (下右)再刺激后，从用由AS15配制的1 ^g LVL168 (SEQ ID NO: 11)或单独的AS15免疫接种的C57/BL6小鼠中分离的合并PBLs中的⑶4 T细胞应答(表示为双重阳性百分比(IFN γ/TNFa ))(下)。图35/35。在用覆盖整个CASB7439蛋白质序列的46种肽的肽库(参见图9)再刺激后，从用由AS15配制的1 Pg LVL168 (SEQ ID NO: 11)或单独的AS15免疫接种的CB6F1 小鼠中分离的合并PBL中的⑶8 T细胞应答(表示为双重阳性百分比(IFN γ/TNF a ))(上)。 在用覆盖整个CASB7439蛋白质序列的46种肽的肽库(参见图9)(下左)；CASB7439肽39 (SEQ ID N0:91)(中下);或RPMI (下右)再刺激后，从用由AS15配制的1 Pg LVL168 (SEQ ID NO: 11)或单独的AS15免疫接种的C57/BL6小鼠中分离的合并PBLs中的CD8 T细胞应答(表示为双重阳性百分比(IFN γ/TNF a ))(下)。发明详述
关于商业可接受的免疫治疗剂的一个障碍是商业可接受量的重组癌抗原的产生。一般而言且非限制性的，关于重组多肽的商业可接受的生产水平是通过宿主细胞产生的总蛋白质的大约5%，如在考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上估计的。存在当通过重组方法产生时天然多肽序列为何可仅获得小量的众多原因。增加多肽产生的方法包括改变宿主表达系统或密码子最佳化。然而，这些标准方法并不一定导致可接受的多肽产生，并且关于某些多肽的生产仍是商业上禁止的。如下文更详细地描述的， 申请人:研究修饰的CASB7439多肽是否将通过重组方法产生可接受的蛋白质水平。在某些实施方案中，提供了修饰的CASB7439多肽，其中修饰由CASB7439多肽的 C末端截短组成，或包含CASB7439多肽的C末端截短，从而使得所有或部分富含脯氨酸的区域被去除。在某些实施方案中，CASB7439多肽修饰由所有或部分富含脯氨酸的区域的缺失组成，或包含所有或部分富含脯氨酸的区域的缺失。在某些实施方案中，提供了修饰的 CASB7439多肽，其保留SEQ ID NO: 13的至少氨基酸残基193，但其中所有或部分富含脯氨酸的区域被缺失。在其他实施方案中，提供了包含如本文描述的修饰的CASB7439多肽的蛋白质构建体。在某些实施方案中，此类蛋白质构建体进一步包含一种或多种异源多肽。在某些实施方案中，异源多肽是融合配偶体，如其他地方更详细地描述的。在特别合适的实施方案中， 此类蛋白质构建体包含定位于修饰的CASB7439多肽N末端的异源多肽。在进一步特别合适的实施方案中，提供了这样的蛋白质构建体，其中异源多肽是定位于修饰的CASB7439多肽N末端的流感嗜血杆菌0 influenzae)蛋白质D的片段(如下文更详细地描述的)。在某些实施方案中，提供了其中异源多肽包含多组氨酸区域的蛋白质构建体。在进一步的实施方案中，多组氨酸序列定位于蛋白质构建体的C末端部分。在其他实施方案中，多组氨酸序列定位于蛋白质构建体的C末端。在进一步的实施方案中，多组氨酸序列定位于蛋白质构建体的N末端部分。在其他实施方案中，多组氨酸序列定位于蛋白质构建体的N末端。在合适的实施方案中，多组氨酸区域包含10个或更多连续组氨酸残基。在特别合适的实施方案中，多组氨酸区域包含定位于修饰的CASB7439多肽N末端的10个或更多连续组氨酸残基。在某些实施方案中，超过一个多组氨酸区域可以包括在本文描述的一个或多个位置上。在某些实施方案中，提供了其中异源多肽是与修饰的CASB7439多肽化学缀合的载体蛋白质的蛋白质构建体。在某些实施方案中，提供了包含为多组氨酸区域的异源多肽和为载体蛋白质的异源多肽的蛋白质构建体。在某些实施方案中，提供了包含为多组氨酸区域的异源多肽和为融合配偶体的异源多肽的蛋白质构建体。在某些实施方案中，提供了包含为多组氨酸区域的异源多肽、为融合配偶体的异源多肽和为载体蛋白质的异源多肽的蛋白质构建体。申请人:还公开了本文段落中描述的每种构建体的实施方案，其中任何异源多肽例如多组氨酸区域中的一些或所有已被去除。用于去除异源多肽的组合物和方法是本领域已知的，包括但不限于用内或外肽酶消化、化学修饰或在异源多肽和分子其余部分之间的键的断裂等。申请人:在本文中还公开了免疫原性组合物，这些组合物包含任何修饰的CASB7439 多肽或包含如本文描述的修饰的CASB7439多肽的蛋白质构建体、和药学可接受的载体或赋形剂，其中载体或赋形剂可以任选包含缓冲剂。在特定方面，这些组合物进一步包含佐齐U。在特定方面，这些组合物包含引发至少THl免疫应答的佐剂。在特定方面，本文描述的佐剂包含下述中的至少一种3D-MPL、QS21和CpG。在某些实施方案中，组合物包含3D-MPL。 在其他实施方案中，组合物包含CpG。在某些实施方案中，组合物包含QS21。在某些实施方案中，组合物包含QS21和胆固醇。在某些实施方案中，组合物包含在脂质体制剂中的胆固醇、3D-MPL 和 QS21。申请人:在本文中还公开了包含编码如本文描述的修饰的CASB7439多肽和构建体的多核苷酸序列的核酸分子。在某些实施方案中，公开了包含如本文描述的此类核酸分子的载体。在某些实施方案中，载体包含原核表达载体。在某些实施方案中，载体包含真核表达载体。在某些实施方案中，编码构建体的多核苷酸序列已就在宿主细胞中的表达进行密码子最佳化。申请人:还公开了包含下述的宿主细胞(i)如本文描述的核酸分子，或(ii)包含如本文描述的核酸分子的载体。在某些实施方案中，宿主细胞选自细菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。某些实施方案提供了包含下述的免疫原性组合物(i)本文描述的核酸分子，或 (ii)包含如本文描述的核酸分子的载体，以及药学可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中，提供了本文描述的修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体(或编码其的核酸分子)在制备用于治疗结肠直肠癌的药物中的应用。在某些实施方案中，公开了用于治疗、特别是结肠直肠癌治疗的本文描述的修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体(或编码其的核酸分子)。在某些实施方案中，提供了用于在具有结肠直肠癌的受试者中引发针对CASB7439的免疫应答的方法，该方法包括(i)选择具有结肠直肠癌的受试者；和 (b)给受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含如本文描述的修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体、和药学可接受的载体或赋形剂，其中载体或赋形剂可以任选包含缓冲剂。在本文公开的方法的某些实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐剂。 在本文公开的方法的某些实施方案中，佐剂引发至少THl免疫应答。在本文公开的方法的某些实施方案中，佐剂包含下述中的至少一种3D-MPL、QS21和CpG。在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者是人受试者。蛋白质构建体 CASB7439 多肽
如其已在本文中命名的，CASB7439也称为HASH2或ASCL2。HASH2是人起源的193氨基酸残基多肽(SEQ ID NO: 13)。参见例如，登记号AAB86993。此处，对CASB7439特征的提及将就SEQ ID NO: 13中提供的多肽序列而言进行。富含脯氨酸的区域
高脯氨酸周期性的区域在SEQ ID NO: 13中在氨基酸127-158的区域中发现。申请人将包括133和153在内的从氨基酸133到氨基酸153的SEQ ID NO: 13区域命名为“富含脯氨酸的”、“多脯氨酸”、“多脯氨酸样的”或“polypro”区域或结构域。相应地，如本文使用的， “富含脯氨酸的”、“多脯氨酸”、“多脯氨酸样的”和“polypro”指CASB7439蛋白质的这个区域(或结构域)。修饰
本公开内容提供了包含CASB7439多肽的蛋白质构建体，所述CASB7439多肽包含至少一个表达增强修饰。在某些实施方案中，CASB7439多肽的部分被去除，所述部分包含所有或部分富含脯氨酸的区域。在某些实施方案中，CASB7439多肽的整个C末端部分被去除，导致包含SEQ ID N0:13的氨基酸残基1_117的截短的CASB7439多肽。在某些实施方案中， 异源多肽置于CASB7439多肽的N末端。如本文使用的，在修饰的CASB7439多肽背景中的“表达增强”或“增强的表达”指， 与包含SEQ ID N0:13的未修饰的CASB7439多肽的其他方面等价的蛋白质构建体的表达比较，即相同载体、宿主细胞等，预期增加包含所述修饰的CASB7439多肽的蛋白质构建体的表达水平的修饰。用于测定蛋白质数量的本领域已知的任何方法可应用于测定，与包含未修饰的CASB7439多肽的其他方面等价的蛋白质构建体比较，包含修饰的CASB7439多肽的给定构建体是否具有增加的表达水平。在某些实施方案中，使用SDS-PAGE和考马斯蓝染色可以评价生产。富含脯氨酸的区域的去除
在某些实施方案中，CASB7439多肽的修饰包含某些富含脯氨酸的区域的缺失。在某些实施方案中，CASB7439多肽的修饰包含所有富含脯氨酸的区域的缺失。在某些实施方案中， 除富含脯氨酸的区域的缺失外，CASB7439多肽的修饰还包含在富含脯氨酸的区域外的氨基酸的缺失。在某些实施方案中，修饰通过SEQ ID N0:13的C末端部分的截短来完成。因此， 在某些实施方案中，生成了蛋白质构建体，其中修饰的CASB7439多肽的C末端氨基酸残基对应于定位于SEQ ID N0:13的富含脯氨酸的区域N末端的残基。在某些实施方案中，生成了蛋白质构建体，其中修饰的CASB7439多肽的C末端氨基酸残基对应于定位于SEQ ID N0:13的富含脯氨酸的区域中的残基。在某些实施方案中，修饰的CASB7439多肽的C末端氨基酸残基对应于 SEQ ID N0:13 的氨基酸残基 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、 145、146、147、148、149、150、151 或 152。在某些实施方案中，修饰包含部分或所有富含脯氨酸的区域的缺失。在某些实施方案中，修饰的CASB7439多肽序列对应于21个或更多邻接氨基酸残基已从其中缺失的 SEQ ID NO: 13。这21个或更多邻接残基对应于从包括端点在内的残基117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151 或 152 中的任何一个开始的 SEQ ID NO: 13的邻接氨基酸序列。在进一步的实施方案中，修饰的CASB7439多肽序列对应于21个邻接氨基酸残基已从其中缺失的SEQ ID NO: 13，所述21个邻接残基从残基131、132和133 中的任何一个开始。在某些实施方案中，修饰的CASB7439多肽序列对应于残基133、134、135、136、 137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153 中的一个或多个已从其中缺失的SEQ ID N0:13。在某些实施方案中，修饰的CASB7439多肽序列对应于从其中2个或更多邻接氨基酸残基已在包括133和153在内的氨基酸残基133-153的区域中缺失的SEQ ID NO: 13。在某些实施方案中，修饰的CASB7439多肽序列对应于SEQ ID NO: 13的包括133 和153在内的残基133到153已从其中缺失的SEQ ID N0:13。示例性非限制性实施方案包括下述
LVL055, SEQ ID N0:1 (aa)；
LVL111, SEQ ID NO:3 (aa)；
LVL137, SEQ ID NO:5 (aa)；
LVL141, SEQ ID NO:7 (aa)；
LVL144, SEQ ID NO:9 (aa)；禾口
LVL168, SEQ ID NO:11 (aa)。异源序歹Ij
在某些实施方案中，修饰的CASB7439多肽与异源多肽组合。术语“异源的”就核酸分子、多肽或另一种细胞组分而言，指示组分在它通常不在自然界中发现处出现和/或它源于与参考分子不同的来源或物种。如本文使用的，“异源”分子包括但不限于融合蛋白、载体蛋白质和纯化标签。在某些实施方案中，异源多肽可以与修饰的CASB7439多肽，即载体蛋白质化学缀合。在其他实施方案中，异源多肽和修饰的CASB7439多肽可以作为单一重组融合蛋白表达。在其他实施方案中，修饰的CASB7439多肽和异源多肽作为单一重组融合蛋白表达且与另一种异源多肽化学缀合。异源多肽可以帮助提供T辅助表位，包括由人识别的T辅助表位。在包含CASB7439 多肽和为融合蛋白的异源多肽的蛋白质构建体的情况下，异源多肽(融合配偶体)可以帮助提供此类表位，或帮助以比天然重组蛋白质更高的收率表达蛋白质(表达增强子)。融合配偶体可以是免疫学融合配偶体和表达增强配偶体。载体蛋白质
载体蛋白质与另一种目的多肽化学缀合。多肽与载体蛋白质的化学偶联可以以本领域已知的任何方式执行。因此，对于直接共价偶联，可以利用碳二亚胺、戊二醛或N_[ Y-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯，利用普通商购可得的异双功能接头例如CDAP和SPDP (使用制造商的说明书)。在偶联反应后，借助于透析法、凝胶过滤法、分级分离法等，可以容易地分离且纯化多肽-载体蛋白质缀合物。在某些实施方案中使用的载体蛋白质的类型将是本领域技术人员容易已知的。某些载体蛋白质的功能是提供细胞因子帮助，以便帮助诱导针对偶联多肽的免疫应答。例如， 可以用于本发明中的载体蛋白质的非详尽列表包括钥孔血蓝蛋白(KLH)，血清白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)，灭活的细菌毒素例如破伤风或白喉毒素(TT和DT)、或其重组片段 (例如，TT的片段C的结构域1、或DT的易位结构域)，或结核菌素(PPD)的纯化蛋白质衍生物。融合配偶体
尽管存在众多基因融合系统的可用性，在大肠埃希杆菌〈Escherichia coli )中的重组蛋白质表达仍是困难的。建立最佳地增强难以表达的蛋白质表达的融合配偶体仍是凭经验的。常见融合配偶体包括麦芽糖结合蛋白(MBP)的C末端、谷胱甘肽S转移酶(GST)At 氧还蛋白(TRX)、NUS A、泛素⑶b)和小泛素样修饰物(SUMO)标签，其各自在文献中得到描述。参见例如，Marblestone (2006)Prot. Sci. 15:182-7 ；Hunt (2QQ5)Protein Exp. & Purifm :1-22 ；Hammarstom 等 M2QQ2) Protein Sci. 11:313—321。免疫原性融合配偶体包括来自流感嗜血杆菌B的蛋白质D和来自流感病毒的非结构蛋白质NSl (血凝素)。另一种免疫学融合配偶体是称为LYTA的蛋白质。可以使用分子的C末端部分。LYTA衍生自肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)，其合成N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶、酰胺酶LYTA(由IytA基因编码Garci a等人(1986 )GeneA , 265-272 )。 可以使用从残基178开始的在C末端中发现的Lyta分子的重复部分，例如残基188-305。 另一种合适的融合配偶体是腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白质或其片段，其中所述CyaA片段保留所述腺苷酸环化酶蛋白质靶向抗原呈递细胞的性质。参见W02005089792。在本发明的一个实施方案中，异源多肽是来自流感嗜血杆菌的蛋白质IYEP O 594 610 Bi)，或其片段。蛋白质D是来自流感嗜血杆菌的IgD结合蛋白(W0 91/18926，授予EP O 594 610 Bi)。在某些情况下，例如在重组免疫原表达系统中，可能希望使用蛋白质D的N 末端片段，例如包含蛋白质D的约100 -约110个N末端氨基酸(GB 9717953. 5)(pDl/3， SEQ ID NO:39)。流感嗜血杆菌蛋白质D作为具有18氨基酸信号序列的前体(SEQ ID N0:41，还参见登记号AAAM998)合成。当信号序列在分泌过程中进行加工时，在前体分子中在位置19 上的半胱氨酸残基变成氨基末端残基。在一个实施方案中，异源多肽序列包含经加工的流感嗜血杆菌蛋白质D分子的前约三分之一，或经加工的蛋白质D的N末端100-110个氨基酸。在一个实施方案中，异源蛋白质包含与经加工的蛋白质D的N末端109个氨基酸连接的氨基酸残基Met-Asp-Pro。在另一个实施方案中，异源蛋白质包含与经加工的蛋白质D (SEQ ID N0:39)的氨基酸残基 2-109连接的氨基酸残基Met-Asp-Pro。在一个实施方案中，修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体与CyaA蛋白质或其片段化学偶联。参见W02005054851。在另一个实施方案中，修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体与志贺毒素的B亚单位或其免疫学功能等价物化学偶联。参见美国专利号6，613，882 ； W002060937 ；W02005112991。多组氨酸标签，无关氨基酸
包括异源多肽通常是有利的，所述异源多肽含有分泌或前导序列、前序列 (pro-sequence)、帮助纯化的序列例如组氨酸标签例如多组氨酸序列(包含多个组氨酸残基)、或用于在重组生产过程中的稳定性的另外序列。组氨酸标签载体和试剂盒是商购可得的。例如，用于将6组氨酸标签加入多肽中的载体可从Roche获得。用于制备且使用加组氨酸标签的多肽的试剂盒可从Qiagen、 Sigma,Thermo Scientific,GE Healthcare及其他获得。组氨酸标签还可以跟随促进使用内肽酶的多组氨酸序列去除的合适氨基酸序列。外肽酶例如Qiagen TAGZyme可以用于去除末端多组氨酸序列，而无需另外序列。在某些实施方案中，多组氨酸序列定位于蛋白质构建体的N末端区域中。在进一步的实施方案中，多组氨酸序列定位于蛋白质构建体的N末端上。在某些实施方案中，多组氨酸序列包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多连续组氨酸。在进一步的实施方案中，多组氨酸序列包含10个连续组氨酸。在某些实施方案中，异源多肽包括多组氨酸序列和一个或多个无关氨基酸。“无关氨基酸”意指这样的一个或多个氨基酸，其不是多组氨酸序列、或融合蛋白的部分，并且不是CASB7439多肽序列的天然部分。例如，无关氨基酸可以是包括以提供肽酶位点的那些， 它们可以仅仅是外来序列，例如克隆人工产物等。编码CASB7439构建体的核酸分子
本公开内容的其他实施方案涉及编码如本文描述的修饰的CASB7439多肽和蛋白质构建体的重组核酸。在特定实施方案中，重组核酸对于在所选原核或真核宿主细胞中的表达进行密码子最佳化。为了促进复制和表达，核酸可以掺入载体内，例如原核或真核表达载体。包括重组修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体-编码核酸的宿主细胞也是本公开内容的特征。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，例如大肠杆菌，以及众多真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母)细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞(例如HEK293、CH0和VERO细胞)。表达载体
为了促进复制和表达，核酸可以掺入载体内，例如原核或真核表达载体。尽管本文公开的核酸可以包括在多种载体(包括例如细菌质粒；噬菌体DNA ；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA组合的载体，所述病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒及许多其他)中的任何一种中，最通常地载体将是适合于生成多肽表达产物的表达载体。在表达载体中，编码蛋白质构建体的核酸一般以对于合适转录控制序列(启动子和任选地一个或多个增强子)的接近性和方向排列，以指导mRNA合成。即，目的多核苷酸序列与合适的转录控制序列可操作地连接。此类启动子的例子包括 CMV的立即早期启动子、LTR或SV40启动子、杆状病毒的多角体启动子、大肠杆菌Iac或trp 启动子、噬菌体T7和λ PL启动子、和已知控制原核或真核细胞或其病毒中基因的表达的其他启动子。表达载体一般还含有用于翻译起始的核糖体结合位点、和转录终止子。载体任选包括用于扩增表达的合适序列。此外，表达载体任选地包含一种或多种选择标记基因，以提供用于选择经转化的宿主细胞的表型性状，例如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。足以指导本领域技术人员的通过重组CASB7439核酸产生的示例性程序可以在下述中发现Sambrook 等人’ Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 片反， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Sambrook ^ Α Molecular Cloning: A Laboratory Manual, % 3 版，Cold Spring Harbor Press, 2001 ；Ausubel 等人，Current Pro toco Is in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (禾口对于 2003 年的增刊);和 Ausubel 等人，Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Pro toco Is in Molecular Biology4 IK, Wiley & Sons，1999。编码蛋白质构建体的示例性核酸分子由SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12表示。与示例性核酸分子共享序列同一性的另外序列变体可以由本领域技术人员产生。一般地，核酸变体将编码相差不超过1%、或 2%、或5%、或10%、或15%、或20%氨基酸残基的多肽。即，所编码的多肽共享至少80%、 或85 %，更通常至少约90 %或更多，例如95 %、98 %、99 %、或99. 5 %序列同一性。本领域技术人员将立即理解，编码蛋白质构建体的多核苷酸序列自身可以共享更少的序列同一性， 这是由于遗传编码的冗余。在某些情况下，相对于本文所示的示例性构建体的氨基酸序列 (例如，除上述修饰外)，修饰的CASB7439多肽或蛋白质构建体具有一个或多个氨基酸修饰。 此类差异可以分别是一个或多个核苷酸或氨基酸的添加、缺失或置换。变体一般相差不超过约1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%或25%或30%核苷酸残基。例如，与SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10 禾口 SEQ ID NO: 12 的示例性CASB7439多肽或蛋白质构建体编码核酸比较，变体CASB7439多肽或蛋白质构建体编码核酸可以包括1或2、或直到5、或直到约10、或直到约15、或直到约50、或直到约100个核苷酸差异。因此，在CASB7439多肽或蛋白质构建体编码核酸背景中的变体，一般与参考序列共享至少70%、或75%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98%、或99%、或99. 5%序列同一性，例如由 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10 和SEQ ID NO: 12举例说明的参考序列，或本文公开的其他示例性CASB7439多肽、蛋白质构建体编码核酸中的任何。另外变体可以通过遗传漂变出现，或可以使用定点或随机诱变、 或通过2个或更多预先存在的变体的重组人工产生。此类另外变体还适合于本文公开的 CASB7439多肽或蛋白质构建体背景中。除先前描述的变体核酸外，与由SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12表示的一种或多种示例性核酸杂交的核酸也可以用于编码本文公开的CASB7439多肽或蛋白质构建体。本领域技术人员应当理解除本文讨论的序列同一性百分比(% )测量外，2个核酸之间的序列相似性的另一个标记是杂交的能力。2 个核酸的序列越相似，它们将在其下杂交的条件越严格。杂交条件的严格性是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。因此，导致特定严格性程度的杂交条件将不同，这取决于杂交的性质、选择的方法、以及杂交核酸序列的组成和长度。一般地，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交的严格性，尽管洗涤时间也影响严格性。一般地，严格条件选择为低于在限定离子强度和PH下关于特定序列的热解链温度(Tm)约5°C - 20°C。1是在其下50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定离子强度和PH下)。对于核酸杂交和严格性计算的条件可以例如在下述中找到=Sambrook等 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Co\A Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001 ；Ti jssen,Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science LtcL，NY，NY，1993 禾口 Ausubel 等人 S^ri Pro toco Is in Molecular Biology,第 4 片反，John Wiley & Sons, Inc.，1999。为了本公开内容的目的，“严格条件”涵盖在其下杂交将仅在杂交分子和靶序列之间存在小于25%错配的情况下发生的条件。“严格条件”可以分解成特定严格水平用于更精确的定义。因此，如本文使用的，“适度严格”条件是在其下具有超过25%序列错配的分子将不杂交的那些；“中严格”的条件是在其下具有超过15%错配的分子将不杂交的那些；并且“高严格”的条件是在其下具有超过10%错配的序列将不杂交的那些。“极高严格”的条件是在其下具有超过6%错配的序列将不杂交的那些。相比之下，在“低严格条件”下杂交的核酸包括具有少得多的序列同一性，或仅在核酸的短子序列上具有序列同一性的那些。 因此，应当理解由本公开内容涵盖的核酸的各种变体能够在严格条件下在基本上其整个长度上与 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10 禾口 SEQ ID NO: 12中的至少一个杂交。蛋白质构建体的产生
本文公开的蛋白质构建体可以使用用于重组蛋白质表达和纯化的充分建立的程序来产生。足以指导本领域技术人员的程序可以在下述参考文献中找到=Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Co1d Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 200 ；禾口 Ausubel ^A Short Pro toco Is in Molecular Biology, % 4 版，John Wiley & Sons, Inc.，999。另外和具体细节在下文中提供。编码蛋白质构建体的重组核酸可以通过多种众所周知程序中的任何引入宿主细胞内，例如电穿孔、脂质体介导的转染(例如使用商购可得的脂质体转染试剂，例如 LIPOFECTAMINE 2000或TRANSFECTIN )、磷酸钙沉淀、感染、转染等，这取决于载体和宿主细胞的选择。宿主细胞可以在适当修饰的常规营养培养基中进行培养，用于激活启动子、选择转化体或扩增插入的多核苷酸序列。培养条件例如温度、PH等一般是对于选择用于表达的宿主细胞先前使用的那些，并且对于本领域技术人员且在本文引用的参考文献中将是显而易见的，包括例如 Freshney Hm^ Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, W^Wi, Wiley- Liss, New ^rk和其中引用的参考文献。在某些实施方案中， 合适的培养温度是16°C ；在其他中37°C。对应于本发明的核酸的表达产物还可以在非动物细胞例如植物、酵母、真菌、细菌等中产生。除Sambrook、Berger和Ausubel外，关于细胞培养的细节可以在下述中找到Payne等人(1992)/ ^ Cell and Tissue Culture in Liquid Systems^o\m Wiley & Sons, Inc. New York, NY ;Gamborg 禾口 Phillips (编辑) (Plant Cell，Tissue and Organ Culture ；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)以及 Atlas 禾口 Parks (编辑 Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL0宿主细胞包括重组蛋白质构建体编码核酸的宿主细胞因此也是本公开内容的特征。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，例如大肠杆菌，以及众多真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )和巴斯德毕赤酵母QPicchia pas tor is))细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。例如经由载体例如表达载体，将重组蛋白质构建体核酸引入(例如转导、转化或转染)宿主细胞内。如本文描述的，载体最一般是质粒，但此类载体还可以是例如病毒颗粒、噬菌体等。合适表达宿主的例子包括细菌细胞例如大肠杆菌、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium )；真菌细胞，例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和粗糙链孢霉(Murospora crassa )；昆虫细胞例如果蝇(Mrosophila )和草地贪夜蛾(Spodop tera ；哺乳动物细胞例如 3T3、COS、CHO、BHK、HEK293 或 Bowes melanoma ；植物细胞包括藻类细胞等。宿主细胞任选就其调节插入序列表达或以所需方式加工表达蛋白质的能力加以选择。蛋白质的此类修饰包括但不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧化、磷酸化、脂质化和酰化)。例如将前体形式切割成成熟形式的蛋白质的翻译后加工(例如通过弗林蛋白酶)任选在宿主细胞背景中执行。不同宿主细胞例如3T3、COS、CHO、HeLa, BHK、MDCK, HEK293、WI38 等具有用于此类翻译后活性的特定细胞机制和特有机制，且可以选择以确保所引入的异种蛋白质的正确修饰和加工。对于本文公开的重组蛋白质构建体的长期、高收率生产，一般使用稳定表达系统。 例如，使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体，将稳定表达蛋白质构建体的核酸分子引入宿主细胞内。在引入载体后，在它们转到选择培养基之前，允许细胞在富集培养基中生长1-2天。选择标记的目的是赋予对于选择的抗性，并且它的存在允许成功表达所引入序列的细胞的生长和回收。例如，稳定转化细胞的抗性组或集落可以使用对于细胞类型合适的组织培养技术进行增殖。用编码蛋白质构建体的核酸转化的宿主细胞任选在适合于来自细胞培养的所编码蛋白质的表达和回收的条件下进行培养。表达的蛋白质构建体可以从重组细胞培养物中回收且纯化，其通过本领域众所周知的许多方法中的任何，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、过滤、超滤、离心、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析(例如使用本文指出的任何加标签系统)、羟磷灰石层析和凝集素层析。需要时，在成熟蛋白质的完成构型中，可以使用蛋白质重折叠步骤。最后，高效液相层析(HPLC)可以用于最后纯化步骤中。除本文指出的参考文献外，多种纯化法是本领域众所周知的，包括例如下述中阐述的那些=Sandana (1997) Bioseparation of Proteins’ Academic Press, Inc.；禾口 Bollag 等 A(1996)Protein Methods，第 2 版Hey-\Ass,Wl ；Walker (1996 Pro tein Pro toco Is HandbookWxxmana Press, NJ, Harris 禾口 Angal (Λ990)Protein Purification Applications: A Practical ApproachVSL Press at Oxford, Oxford, U. K. ；Scopes (1993) VroteinPurification: Principles and PracticeM3M Springer Verlag,NY ；Janson 禾口 Ryden (199^)Protein Purification: Principles， High Resolution Methods and Applications, 第 2 版 Wiley-VCH，NY ；禾口 Walker (Λ998)Protein Protocols on OHKMumana Press，NJ0在特定例子中，经由适合于在原核细胞例如大肠杆菌细胞中的引入和表达的载体将核酸引入细胞内。例如，包括编码蛋白质构建体的多核苷酸序列的核酸可以引入多种商购可得的或专有的(proprietary)载体中的任何内，例如表达载体的pET系列(例如pET9b 和pET2d)。编码序列的表达可通过异丙基β-D-l-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导，导致高水平的蛋白质表达。编码CASB7439蛋白质构建体的多核苷酸序列在噬菌体T7启动子下转录。包括热诱导型XpL启动子的可替代载体例如pURV22也是合适的。将表达载体引入(例如通过电穿孔)合适的细菌宿主内。大肠杆菌的众多合适菌株是可获得的，并且可以由本领域技术人员进行选择(例如BLR DE3、BL21 DE3和Rosetta DE3 菌株已证明对于重组载体的表达是有利的，所述重组载体含有编码蛋白质构建体的多核苷酸序列)。任选地，将编码蛋白质构建体的多核苷酸掺入表达载体内，所述表达载体适合于在真核生物(例如昆虫或哺乳动物细胞)中引入和表达。有利地，此类核酸对于在所选载体 /宿主细胞中的表达进行密码子最佳化。所选细胞可以是克隆扩增的且对于所需蛋白质构建体的表达进行表征。用于密码子最佳化的技术是本领域已知的。此外，在其他常规技术服务中，商业分子生物学服务供应商提供密码子最佳化。原核生物
在细菌系统中，取决于对于表达产物预期的用途，可以选择许多表达载体。例如，当需要大量多肽或其片段用于抗体生产时，有利地采用指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT Gtratagene)，其中目的编码序列例如如本文描述的本发明的多核苷酸可以与β -半乳糖苷酶的用于氨基末端翻译起始甲硫氨酸和后续7个残基的序列在框内一起连接到载体内， 产生催化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白；ρΙΝ载体(Van Heeke & khuster (1989)/召iW Chenf2M 5503-5509);pET载体(Novagen，Madison WI)，其中氨基末端甲硫氨酸与组氨酸标签一起在框内连接；等。在某些实施方案中，合适的载体是PET19 ；在其他中是PET24 ；在其他中是PET26。真核生物
类似地，在酵母例如酿酒酵母中，含有组成型或诱导型启动子例如α因子、醇氧化酶和PGH的许多载体可以用于所需表达产物的产生。关于综述，参见Berger、AuSubel和例如 Grant等人(1987 -,Methods in Enzymologyl^ 516-544 ) 在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多表达系统，包括质粒和基于病毒的系统。免疫原性组合物药学可接受的载体或赋形剂
药学可接受的载体和赋形剂是众所周知的，并且可以由本领域技术人员加以选择。例如，载体或赋形剂可以有利地包括缓冲剂。任选地，载体或赋形剂还含有稳定可溶性和/ 或稳定性的至少一种组分。增溶/稳定剂的例子包括去污剂例如月桂酰肌氨酸和/或吐温。可替代增溶/稳定剂包括精氨酸、和玻璃形成多元醇(例如蔗糖、海藻糖等)。众多药学可接受的载体和/或药学可接受的赋形剂是本领域已知的，并且例如在 Pharmaceutical Sciences, Ε. W. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 5 版 (975)中描述。相应地，合适的赋形剂和载体可以由本领域技术人员加以选择，以产生适合于通过所选施用途径递送给受试者的制剂。
合适的赋形剂包括但不限于甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨糖醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸钠盐、L-脯氨酸、非去污剂磺基甜菜碱、盐酸胍、尿素、氧化三甲胺、KC1、Ca2+、Mg2+、 Mn2+Jn2+和其他二价阳离子相关的盐、二硫苏糖醇、二硫赤藓醇和β-巯基乙醇。其他赋形剂可以是去污剂(包括Tween80、Tween20、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、 月桂酉先麦芽糖苷、Zwittergent 3-08> Zwittergent 3-0> Zwittergent 3-2> Zwittergent 3-4、Zwittergent 3-6、CHAPS、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基三甲铵)。佐剂
任选地，免疫原性组合物还包括佐剂。在适合于施用于受试者例如人受试者的免疫原性组合物背景中，用于引发针对CASB7439的免疫应答的目的，佐剂选择为引发偏于 ThKThl biased)的免疫应答。佐剂一般选择为增强组合物施用于其的受试者或受试者群体中偏于Thl的免疫应答。Thl免疫应答 “!1!1”型免疫应答的特征在于产生11^2和正^^的⑶4+ T辅助细胞的诱导。相比之
下，“Th2”型免疫应答的特征在于产生IL-4、IL-5和IL-13的CD4+辅助细胞的诱导。TLR影响因子(affec tors),包括但不限于3D-MPL
用于与修饰的CASB7439多肽组合使用的一种合适的佐剂是TLR-4调节剂。一个例子是脂质A的无毒衍生物，例如单磷酰脂质A或更具体而言3-脱酰基单磷酰(monophoshoryl) 月旨质 A(3D-MPL)。3D-MPL 在名称 MPL 下由 GlaxoSmithKline Biologicals S. A.销售，并且在文件中自始至终被称为MPL或3D-MPL。参见例如美国专利号4，436，727 ；4, 877，611 ； 4，866，034和4，912，094。3D-MPL主要促进具有IFN-γ (Thl)表型的CD4+ T细胞应答。 3D-MPL可以根据GB2220211 A中公开的方法产生。在化学上，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有这样的粒度，使得它可以通过0. 22 μ m滤器进行无菌过滤。此类制剂在 W094/21292 中描述。在其他实施方案中，脂多糖可以是β (1-6)葡糖胺二糖，如美国专利号6，005，099 和EP专利号0 7 473 Bl中描述的。基于这些参考文献的教导，本领域技术人员将容易地能够产生多种脂多糖，例如3D-MPL。除上述免疫刺激剂(其在结构中类似于LPS或MPL 或3D-MPL的那种)外，为本文MPL结构的子部分的酰化单糖和二糖衍生物也是合适的佐齐U。在其他实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中某些描述为TLR-4激动剂，并且包括但不限于0M174 (2-脱氧-6-o-[2-脱氧_2_[ (R) -3-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-0-膦酰基- β -D-吡喃葡萄糖基]-2-[ (R) -3-羟基十四烷酰氨基]-α -D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯)，(W0 95/ 14026) ；OM 294 DP (3S，9 R) _3—[ (R)-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9 (R)-[ (R)-3-羟基十四烷酰氨基]癸-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(W0 99/64301 和 WO 00/0462)；和 OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[ (R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[ (R)_3_羟基十四烷酰氨基]癸-1，10-二醇，1 -二氢磷酸酯10- (6-氨基己酸酯)(W0 01/46127)。可以使用的其他TLR-4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸盐(AGPs)，例如公开于WO 98/50399或美国专利号6，303，347 (还公开了用于制备AGPs的过程)中的那些，适当地 RC527或或AGPs的药学可接受的盐，例如公开于美国专利号6，764，840中。某些AGPs是TLR-4激动剂，并且某些是TLR-4拮抗剂。两者都认为作为佐剂是有用的。能够通过TLR-4引发信号应答的其他合适的TLR-4配体(Sabroe等人，JI 2003 第1630-5页)是例如来自革兰氏阴性菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，特别是LPS的无毒衍生物(例如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或 90 ；表面活性剂蛋白A、透明质酸寡糖、硫酸肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽、b-防御素-2和胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP 60,70或90。其他合适的 TLR-4 配体是如 WO 2003/011223 和 WO 2003/099195 中所述的，例如在 W02003/011223 的第4-5页上或在W02003/099195的第3_4页上公开的化合物I、化合物II和化合物III， 且特别是在 W02003/011223 中作为 ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、 ER804058、ER804059、ER804442、ER804680 和 ER804764 公开的那些化合物。例如，一种合适的 TLR-4 配体是 ER804057。阜苷佐剂
可以在免疫原性组合物中例如单独或与3D-MPL或本文描述的另一种佐剂组合与 CASB7439 一起使用的其他佐剂是皂苷例如QS21。阜昔在LacaiIle-Dubois,MfPWagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine 第 2 卷第 363-386 页) 中教导。皂苷是广泛分布于植物和海洋动物界中的类固醇或三萜糖苷。皂苷因在水中形成胶体溶液而出名，所述胶体溶液在振荡后发泡，并且用于沉淀胆固醇。当皂苷接近细胞膜时，它们在膜中产生孔样结构，这引起膜爆裂。红细胞的溶血是这种现象的一个例子，这是某些但并非全部皂苷的性质。皂苷特别是免疫学活性的皂苷级分已知作为在用于全身施用的疫苗中的佐剂。 个别皂苷的佐剂和溶血活性已在本领域中得到广泛研究(Lacaille-Dubois和Wagner，同上)。例如，Quil A (衍生自南美洲树Quillaja Saponaria Molina的树皮)及其级分在US 5，057，540 禾口〃Saponins as vaccine adjuvants〃，Kensil, C. R. , Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12( 1-2): 1-55 ；和 EP 0 362 279 Bl 中描述。包含 Quil A 级分的称为免疫刺激复合物(ISCOMS)的特定结构是溶血的，并且已用于疫苗制造中(Morein，B.，EP 0 109 942 Bl ；WO 96/11711 ；WO 96/33739)。溶血皂苷 QS21 和 QS17(Quil A 的 HPLC 纯化级分)已描述为有效的全身佐剂，并且其生产方法公开于美国专利号5，057，540和EP 0 362 279 Bl中。已用于全身疫苗接种研究中的其他皂苷包括衍生自其他植物物种例如石头花属 (Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的那些(Bomford 等人，Vaccine，10 (9) :572-577, 1992)。当连同抗原一起配制时，包含QS21和胆固醇的此类制剂已显示是成功的Thl刺激佐剂。因此，例如，CASB7439可以有利地与包含QS21和胆固醇的组合的佐剂一起用于免疫原性组合物中。免疫剌激性寡聚核酸
用于与CASB7439组合使用的一种合适佐剂是能够通过TLR-9引起信号应答的细菌DNA TLR激动剂，即TLR-9激动剂，更具体而言含有非甲基化CpG核苷酸的DNA，特别是称为CpG 基序的序列背景。含CpG寡核苷酸诱导占优势地Thl应答。此类寡核苷酸是众所周知的， 并且例如在WO 96/02555，WO 99/33488以及美国专利号6，008，200和5，856，462中描述。适当地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。用于在本发明的免疫原性组合物中使用的合适寡核苷酸是含CpG寡核苷酸，任选含有由至少3个、适当地至少6个或更多核苷酸分开的2个或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸随后为鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。在一个特定实施方案中，寡核苷酸中的核苷间是二硫代磷酸酯或适当地硫代硫酸酯键，尽管磷酸二酯和其他核苷间键也在本发明的范围内。在某些实施方案中是具有混合的核苷间键合的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美国专利号5，666，153，5，278，302和WO 95/26204中描述。在一个可替代实施方案中，使用能够通过TLR-9弓丨起信号应答的TLR激动剂。在一个实施方案中，能够通过TLR-9弓丨起信号应答的TLR激动剂是HSP90。不同佐剂例如本文提及那些的组合也可以用于具有CASB7439的组合物中。例如，如已指出的，QS21可以连同 3D-MPL—起配制。QS21 3D-MPL的比值一般将在1 10至10 1的级别中，例如1:5至 5 1，且通常基本上1 1。一般地，比值在2. 5 1至1 1 3D-MPL: QS21的范围中。 另一种组合佐剂是在脂质体制剂中的3DMPL加上QS21，也与CpG组合。具有结肠直肠癌的受试者
用于参与本文描述的方法中的具有结肠直肠癌的受试者的选择可以通过临床诊断、分子诊断或其组合。在某些实施方案中，受试者进行测试，以测定其癌细胞是否表达CASB7439 (HASH2)。用于诊断结肠直肠癌的临床方法是本领域已知的。用于测定癌细胞或组织是否表达CASB7439 (HASH2)的分子技术和方法公开于W001/62778中。实验实施例实施例1
在pET19b载体中生成编码包含CASB7439多肽的蛋白质构建体的2种核酸分子。His标签与CASB7439序列的N末端并列。这些克隆分别命名为LVL007 [SEQ ID NO: 15(aa);SEQ ID NO: 16 (DNA)]和 LVLOlO [SEQ ID NO: 17 (aa);SEQ ID NO: 18 (DNA)] 观察到非故意突变已在LVL007克隆中出现，导致脯氨酸到亮氨酸的一个氨基置换(在就SEQ ID N0:13而言的氨基酸残基17上)。核酸分子对于3种不同宿主细胞类型利用，即大肠杆菌菌株BLR DE3、BL21 DE3 和 Rosetta DE3。诱导以 2 个温度 / 诱导(16°C或 37°C )且用 ImM IPTG 执行。关于方案细节，参见下文材料与方法节段。对于每次诱导收获蛋白质，并且通过蛋白质印迹和通过SDS-PAGE用考马斯蓝染色进行分析。在这些实验中，蛋白质的检测仅在蛋白质印迹中可见。实施例2
执行CASB7439基因的生物信息学分析，揭示下述结构特征 定位于SEQ ID NO: 14的核苷酸2 - 27之间的发夹RNA结构元件 核苷酸序列的62% GC含量
富含精氨酸密码子的核苷酸序列(编码的26/193个氨基酸) 具有高水平的碱性氨基酸残基的氨基酸序列 具有高等电点(11. 18)的氨基酸序列 在氨基酸序列内的低复杂性区域(SEQ ID N0:13的残基7-27 在氨基酸序列内的螺旋-环-螺旋结构域(HLH) (IPR000014) (SEQ ID N0:13的残基 56-108) 在氨基酸序列内的固有无序的第一个区域(SEQ ID NO: 13的残基118-164) 在氨基酸序列内的固有无序的第二个区域(SEQ ID NO: 13的残基118-164)。申请人:还鉴定了从氨基酸127到158的具有高脯氨酸周期性的区域。申请人将 SEQ ID NO: 13 (aa)的包括133和153在内的来自氨基酸133-153的区域指名为富含脯氨酸的区域。富含脯氨酸的区域连同这个实施例中提及的某些其他特征一起，连同在本文中其他地方提及的区域一起以示意方式在图1/35中描述。实施例3
未修饰的CASB7439 DNA核苷酸序列(SEQ ID NO: 14)通过商业DNA合成服务供应商，Geneart (独特标识符0606597)进行密码子最佳化且克隆。Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11D-93053 Regensburg，德国。CASB7439 核苷酸序列通过 PCR 扩增得自克隆，且用于生成2种构建体。在第一种构建体LVL016 [SEQ ID N0:29 (aa)，SEQ ID NO:30 (DNA)]中，将CASB7439序列插入pET21b ( + )载体中与在CASB7439序列的N末端上的PD1/3蛋白质(来自流感嗜血杆菌)融合。在第二种构建体LVL018 [SEQ ID N0:31 (aa)； SEQ ID NO:32 (DNA)]中，将CASB7439插入pET21b ( + )载体中(不含任何蛋白质D组分)。 这些构建体就在16°C和37°C用ImM IPTG在BLR DE3大肠杆菌中的生产进行评估。生产是可通过蛋白质印迹作为不溶性蛋白质检测的，主要在16°C产生。选择4个CASB7439结构域用于进一步研究，以改善蛋白质生产核靶向结构域、富含脯氨酸的区域、DNA结合结构域和HLH结构域。实施例4
选择CASB7439的核靶向结构域、DNA结合结构域、bHLH结构域和富含脯氨酸的区域， 以研究来自包含编码CASB7439多肽的核苷酸序列的构建体的蛋白质生产。CASB7439核苷酸序列的不同区段由本文描述的密码子最佳化的Geneart克隆进行PCR扩增且插入pET19b (+ )载体中，导致具有不同CASB7439序列的5种构建体(以某些方式或完全截短)；每种构建体在CASB7439序列的N末端具有多组氨酸尾部。参见图2/35。在图2/35上显示的这些构建体就在37°C和16°C用ImM IPTG在BLR DE3大肠杆菌菌株中的蛋白质表达进行评估。如图2/35中所述，这些构建体包含全长CASB7439 [LVL060,SEQ ID NO: 19 (aa), SEQ ID NO: 20 (DNA)]；截短以去除核靴向结构域的 CASB7439 [Const-1, SEQ ID N0:21 (aa), SEQ ID NO:22 (DNA)]；截短以去除富含脯氨酸的区域的 CASB7439 [LVL055, SEQ ID N0:1 (aa), SEQ ID NO:2 (DNA)]；截短以去除 DNA 结合结构域的 CASB7439[LVL056，SEQ ID NO:23 (aa), SEQ ID NO:24 (DNA)]；截短以留下碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域的 CASB7439 [LVL057, SEQ ID N0:25 (aa), SEQ ID NO:26 (DNA)]。由于实验误差，Const-I缺乏终止密码子，导致载体核苷酸序列的部分的翻译(导致在C末端区域中具有另外21个氨基酸，从LED...开始)。在16°C温育后LVL055的产生 (C末端截短的)在考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上是可明确检测的。实施例5
基于实施例4中所述的结果，设计新构建体，以(i)去除富含脯氨酸的区域，同时(ii) 保留多肽的C末端部分的其他区域。参见图3/35和4/35的描述，这讨论了(i)在多肽内的各种鉴定或预测表位，和(ii )用于去除富含脯氨酸的区域的各种可替代方法。随后由Geneart (独特标识符0706840)定购编码修饰的CASB7439多肽的密码子最佳化的合成核酸基因序列，消化且平行插入2种不同载体中，以生成下述构建体
(i)LVL088，包含具有21氨基酸富含脯氨酸的区域缺失的CASB7439基因，在pET26b (+ )载体中的C末端上与多组氨酸尾部融合(SEQ ID NO:27 (aa)，SEQ ID NO:28 (DNA))和
(ii)LVLlll，包含具有21氨基酸富含脯氨酸的区域缺失，以及在pET19b( + )载体中的 N末端和C末端的多组氨酸尾部的CASB7439基因(SEQ ID N0:3(aa)，SEQ ID N0:4(DNA))。LVLlll构建体(参见SEQ ID NO:3)根据用于LVL055的相同策略进行克隆，S卩，使用包括由10个组氨酸组成的多组氨酸尾部随后为肠激酶位点的PET19 ( + )载体。这导致在N末端的23氨基酸融合配偶体(SEQ ID NO:42)。生成具有实施例3 (独特标识符0606597)中讨论的密码子最佳化的合成基因的其他构建体，包括下述
LVL090 (包含(从N末端起)在pET21载体中的蛋白质D、全长最佳化的CASB7439和 6-His 的蛋白质构建体)(SEQ ID NO:43 (aa) ；SEQ ID N0:44 (DNA))
LVLl 12(包含(从N末端起)在pSUMO载体中的SUMO蛋白质、全长最佳化的CASB7439 的蛋白质构建体)(SEQ ID N0:45 (aa) ；SEQ ID N0:46 (DNA))
LVLl 13 (包含(从N末端起)在pSUMO载体中的SUMO蛋白质、pDl/3蛋白质、全长最佳化的 CASB7439 的蛋白质构建体)(SEQ ID N0:47 (aa) ；SEQ ID N0:48 (DNA))
LVLl 14 (包含(从N末端起)在pSUMO载体中的SUMO蛋白质、在氨基酸117上截短的 CASB7439 的蛋白质构建体)(SEQ ID N0:49 (aa) ；SEQ ID N0:50 (DNA))
LVLl 15 (包含(从N末端起)在pSUMO载体中的SUMO蛋白质、具有富含脯氨酸的区域去除的修饰的CASB7439的蛋白质构建体)(SEQ ID N0:51 (aa) ；SEQ ID N0:52 (DNA))
未观察到生产改善，尽管执行仅一次重复(数据未显示)。LVL088的生产在37°C和在16°C用ImM IPTG过夜温育后进行分析。当电泳分析时，LVL088生产仅通过蛋白质印迹进行显现。来自4个800 mL培养瓶的一个纯化批次导致0.4 mg蛋白质。另一方面，LVLlll在考马斯蓝染色后是可容易检测的。产生重组蛋白质LVLl 11且经过8个批次进行纯化。估计LVLl 11的几个批次(各自来自4个800 mL培养瓶)，以产生在3. 3 mg/批次到10 mg/批次范围中的纯化蛋白质。因此，LVL088的生产低于对于LVLlll可见的那种。纯化蛋白质也就其与几种抗CASB7439单克隆抗体的反应性进行测试，并且在所有情况下获得阳性反应性。实施例6
研究了 C末端多组氨酸尾部从LVLlll构建体中的去除。编码polypro (-)CASB7439 多肽而无编码C末端多组氨酸的部分的核酸分子通过PCR从LVLlll构建体扩增，且克隆到pET19b载体内。将这种构建体指名为LVL137。LVL137构建体基本上是LVL111，而无编码C末端多组氨酸尾部的核苷酸序列。SEQ ID NO: 5 (aa);SEQ ID NO:6 (DNA)0 C末端多组氨酸尾部的去除对生产水平没有明显影响。如通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析的， LVL137产生与LVLlll相同水平的蛋白质。编码polypro (_)CASB7439 多肽的核酸分子随后通过 PCR 从 Geneart (0706840) 合成的CASB7439序列进行扩增，且克隆到在N末端具有6多组氨酸标签的pET26载体内 (LVL138)。SEQ ID N0:33 (aa);SEQ ID NO:34 (DNA)0这种构建体显示出明显减少水平的蛋白质生产，且难以通过蛋白质印迹检测。
在pETM卡那霉素抗性载体中生成编码在polypro (_)CASB7439多肽的N末端上的6多组氨酸标签的核酸分子。利用新接头设计，以去除在多组氨酸标签序列和CASB7439 基因的5’末端之间产生的发夹结构。具体地，关于蛋白质构建体的前8个氨基酸残基的密码子改变为下述核苷酸序列5，ATG CAT CAT CAT CAT CAT CAT GAC- 3，(SEQ ID NO:35)。 (原始密码子是 5，ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAT..· 3’ (SEQ ID N0:36)。)将这种构建体指名为LVL160。SEQ ID NO:37 (aa) ；SEQ ID NO:38 (DNA)0通过凝胶和蛋白质印迹分析，蛋白质生产看起来与用LVL138获得的那种一样弱。在pETM卡那霉素抗性载体中生成编码在polypro (_)CASB7439多肽的N末端上具有10多组氨酸标签的蛋白质构建体的核酸分子。将这种构建体鉴定为LVL168。SEQ ID NO: 11 (aa);SEQ ID NO: 12 (DNA)0生产水平与对于LVLlll观察到的水平相当。这个实施例中讨论的几种构建体的比对在图5/35中发现。关于这个实施例和实施例1中讨论的构建体的结果在下表1中概括。
权利要求
1.包含至少一种表达增强修饰的修饰的CASB7439多肽，其中所述表达增强修饰包含至少SEQ ID NO: 13的部分或所有富含脯氨酸的区域的缺失。
2.蛋白质构建体，其包含权利要求1的修饰的CASB7439多肽、且进一步包含一种或多种异源多肽。
3.权利要求3的蛋白质构建体，其中所述蛋白质构建体包含选自下述的构建体(a)LVL055 (SEQ ID N0:1)；(b)LVLlll (SEQ ID N0:3)；(c)LVL137 (SEQ ID N0:5)；(d)LVL141 (SEQ ID N0:7)；(e)LVL144 (SEQ ID N0:9)；和(f)LVL168 (SEQ ID NO:11)。
4.免疫原性组合物，其包含权利要求1-3中任一项的蛋白质构建体、和药学可接受的载体或赋形剂，其中所述载体或赋形剂可以任选包含缓冲剂。
5.权利要求4的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述佐剂引发至少Thl免疫应答。
7.权利要求4、5或6的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含下述中的至少一种TLR-4 激动剂、免疫学活性皂苷级分、TLR-9激动剂。
8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述TLR-4激动剂是3D-MPL。
9.权利要求7或8的免疫原性组合物，其中所述TLR-9激动剂是CpG寡核苷酸。
10.权利要求7、8或9的免疫原性组合物，其中所述免疫学活性皂苷级分是QS21。
11.权利要求7-10中任一项的免疫原性组合物，其包含3D-MPL。
12.权利要求7-11中任一项的免疫原性组合物，其包含CpG。
13.权利要求7-12中任一项的免疫原性组合物，其包含QS21。
14.权利要求13的免疫原性组合物，其进一步包含胆固醇。
15.核酸分子，其包含编码权利要求1-3中任一项的蛋白质构建体的多核苷酸序列。
16.在人或非人动物中诱导针对CASB7439的免疫应答的方法，其包括给所述人或非人动物施用有效量的包含佐剂和蛋白质的组合物，所述蛋白质包含选自下述的多肽序列(a)SEQ ID NO:9中所示的多肽序列；和(b)SEQID NO: 11中所示的多肽序列。
17.治疗人或非人动物的方法，其包括步骤(a)选择具有表达CASB7439的癌细胞的人或非人动物；和(b)给所述人或非人动物施用有效量的包含佐剂和蛋白质的组合物，所述蛋白质包含选自下述的多肽(i)SEQ ID NO:9中所示的构建体；禾口(ii)SEQID NO: 11中所示的构建体。
18.如权利要求7-14中定义的免疫原性组合物，其在人或非人动物中诱导针对 CASB7439的免疫应答的方法中使用，所述方法包括施用有效量的所述免疫原性组合物。
19.根据权利要求18的免疫原性组合物，其包括包含选自下述的多肽的蛋白质 (a) SEQ ID NO:9中所示的构建体；和(b)SEQ ID NO: 11中所示的构建体。
20.如权利要求7-14中定义的免疫原性组合物在制备用于在人或非人动物中诱导针对CASB7439的免疫应答的方法中使用的药物中的应用，所述方法包括施用有效量的所述免疫原性组合物。
21.根据权利要求20的应用，其中所述免疫原性组合物包含 包含选自下述的多肽的蛋白质(i)SEQ ID NO:9中所示的构建体；禾口(ii)SEQID N0:11中所示的构建体。
全文摘要
本公开内容涉及用于增加CASB7439多肽的重组生产的化合物和方法，和利用其的方法。
文档编号A61K39/00GK102459324SQ201080033569
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月25日 优先权日2009年5月27日
发明者皮罗尔盖 A., 里瓦 C., 哈维 M., 布莱斯 N. 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司