专利名称：索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及土壤杆菌Agrobacterium sp. ZX09的代谢产物(中文名索拉胶，英文 名Salecan)，特别是索拉胶在预防和治疗便秘中的应用。
背景技术：
便秘不是病，是由多种病理因素引起的一种临床常见症状。由于正常的排便习惯 差异很大，摄食种类及习惯、生活习惯、环境因素、精神状态都可以影响排便习惯。所以，迄 今为止，都很难给便秘下一个确切的定义。国际上有关功能性胃肠病，包括慢性便秘，在诊断、病理生理学以及治疗方面相继 推出罗马I (1994年)和罗马II (2000年)标准。便秘可以简单的描述为以下三种障碍中的 任何一项排便次数的减少，排便困难或排便过硬。由于便秘很少导致住院或死亡，因此它 对健康的危害常被忽视。国内陆续有一些便秘流行病学方面的报道，普遍认为年龄、性别、 职业、文化程度、心理障碍、滥用泻药、不良排便习惯等是便秘的危险因素。由于便秘严重影 响患者的生活质量，严重者可引起心脑血管意外。便秘还是肛肠病发病的诱因。宿便堆积 在肠道里，压迫肠壁，使肠粘膜受伤，肠蠕动变慢。另外宿便产生的毒素被肠道吸收，通过血 液循环到达人体的各个部位，导致面色晦暗、皮肤粗糙、痤疮、肥胖等。特别是中老年人由于 生理性衰退，肠道蠕动能力下降。因此早期预防和合理治疗会减轻便秘带来的严重后果。目前，市场上有4大类的治疗便秘药物。刺激性泻药，药物本身在体内的代谢产物 能够刺激肠壁，使肠蠕动加强而促进排便，代表药物有比沙可啶、双醋酚汀，这类药物作用 强烈，只能临时应用。润滑性泻药，能润滑并刺激肠壁，软化大便，使粪便易于排出，例如开 塞露，但易产生依赖性，不宜长期使用。渗透性泻剂，使肠内容积的渗透压升高，能吸收大量 水分并阻止肠道吸收水分，使肠中容积增大，刺激肠壁，反射性的增加肠蠕动而导泻，代表 药物有硫酸镁，乳果糖，但有器官疾病的人禁用，时常引起胃肠胀气和肠绞痛。还有一类是 容积性泻药，吸水后增加容积，轻度刺激肠蠕动，抵达结肠后被肠道内细菌酵解，增加肠内 渗透压和阻止肠内水分吸收，增强导泻作用，此类药物有羧甲基纤维素、车前子，但由于其 作用力较弱，临床已少应用(郑丽华，贾兰斯.治疗便秘药物的合理选择.中国临床医生 杂，2007(4))。索拉胶是一种土壤杆菌Agrobacterium sp. ZX09分泌产生的胞外多糖，结构为 β-葡聚糖(中国专利，201010146371. 2)(Xiu A, Kong Y, Zhou Μ, Zhu b，Wang S, Zhang J. October 15 2010. The chemical and digestive properties of a soluble glucan from Agrobacterium sp. ZX09. Carbohydrate Polymers, Vol. 82, No. 3, 623-628)。 经过急性毒理学和慢性毒理学的评价，该胶无毒安全。它具有强大的吸水能力，且在人体肠 道中不被吸收的性质。早在上世纪四十年代，就由图伦大学Diluzio博士从酵母细胞壁中分离出β-葡 聚糖。在国际上已有研究报道说，β-葡聚糖和它的衍生物具有多种生物活性，比如抗氧 化剂，抗病毒，抗肿瘤，是激活免疫细胞的钥匙(Sener，G.，Toklu, H. Ζ. , &Cetinel, S.2007. β -Glucanprotects against chronicnicotine—induced oxidative damage in rat kidney and bladder. Environmental Toxicology and Pharmacology, 23, 25 — 32)。 长时间食用含β-葡聚糖的食物能够降低人的血脂和肝脂(Robert Nicolosi, Stacey J Bell, Bruce R Bistrian, Isaac Greenberg, R Armour Forse and George L Blackburn. August 1999. Plasma lipid changes after supplementation with β-glucan fiber from yeast. American Journal of Clinical Nutrition, Vol. 70，No. 2，208-212)。经特 殊步骤萃取且不含内毒素的β-葡聚糖在美国FDA已认定是一种安全的物质，可添加在一 般食品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新结构的、吸水能力强的、不被人体肠道吸收的 β-葡聚糖索拉胶在制备预防或治疗便秘药物方面的应用。实现本发明目的的技术解决方案为索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应 用，索拉胶可直接服用或混于食物中服用，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸收， 增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改善便 秘情况。本发明与现有技术相比，其显著优点(1)菌种的培养操作简便，工艺简单，培养 基为全合成培养基，成份明确，成本低，适宜于工业化生产；(2)索拉胶产量大，提取方法简 便，可直接溶于冷水；(3)索拉胶不被肠道吸收，具有强大的吸水能力，能够有效地刺激肠 胃的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，改善便秘情况(4)通过慢性毒理学评价，索拉 胶安全无毒。
图1是各组小 鼠粪便重量图。
图2是各组小 鼠粪便数量图。
图3是各组小 鼠粪便中含水率图。
图4是各组小 鼠胃蠕动图。
图5是各组小 鼠肠道蠕动图。
图6是各组小 鼠粪便中索拉胶含量图。
图7是各组小 鼠体重变化图。
图8是各组小 鼠器官肝、脾、心重图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步详细描述。本发明索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用，索拉胶可直接服用或混于食 物中服用，疗程为单次或多次，视症状轻重，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸 收，增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改 善便秘情况。以实验小鼠来说，剂量最佳服用量为300mg/kg左右，人类最佳服用量较实验 小鼠为低。
索拉胶结构通式为
—⑶-beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-alpha-D-Glup-(1 — 3)-alpha-D-Glup-(l}n ^
上述结构中的η基指具有10(Γ10000个葡萄糖基相连的聚合物，本发明化合物是其中 η为100 200的化合物。利用土壤杆菌ΖΧ09生产索拉胶，其步骤如下
a、配置培养液:NaH2P04 0. 25%。_2%。，KN03 1. 5%。-4. 5%。，CaCl2 0. 05%。-0. 2%， MgCl2 0. 15%。-0. 55%。，FeS04 · 7H20 0. 004%。-0. 013%。，MnS04 0. 001% -0. 004% , ZnC12 0· 004%。-0· 008%。，NaCl 0-8%,蔗糖 1%_5%，H20 1000 mL, pH 5.5-11。b、将培养液加热110-121 °C灭菌15-30分钟；
C、向冷却至30_37°C的培养液内加入100-200μ 平皿菌落液 d>28 °C 30 °C发酵Μ-4 !形成种子培养液；
e、向冷却至30-37°C的培养液内加入3%-5%的种子培养液
f、在28V 30 °C发酵48 72 h ；
h、向发酵液内注入超过两倍体积的乙醇或丙酮，50-70° C抽真空干燥得到索拉胶粗
P
ΡΠ O下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1 索拉胶粗品的制备
配置培养液，NaH2P04 0. 25g, KN03 1.5 g, CaC12 0. 05g, MgCl2 0. 15g, FeS04 ·7Η20 0. 004 g, MnS04 0. 001 g, ZnC12 0. 004 g, NaCl IOg,蔗糖 10 g, H201000 mL, pH 5. 5， 将培养液加热121°C灭菌15分钟，冷却至30°C接入菌落液200μ ，培养Mh，为种子液。 向灭过菌的培养液中加入3%的种子培养液，发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的乙醇， 50°C抽真空干燥即得到索拉拉胶粗品。实施例2 索拉胶粗品的制备
配置培养液，NaH2P04 2g, KN034. 5 g, CaCl2 0. 2g, MgCl2 0. 55g, FeS04 · 7H20 0. 013 g, MnS04 0. 004 g, ZnC12 0. 008 g, NaCl 80g,蔗糖 50 g, H201000 mL, pH 10， 将培养液加热121°C灭菌30分钟，冷却至37°C接入菌落液200μ ，30°C培养Mh，为种子液。 向灭过菌的培养液中加入5%的种子培养液，发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的丙醇， 70°C抽真空干燥即得到索拉胶粗品。实施例3 索拉胶粗品的制备
配置培养液，NaH2P04 lg, KN032 g, CaCl2 0. lg, MgCl2 0. 3g, FeS04 · 7H20 0. 008 g, MnS04 0. 003 g, ZnC12 0. 006 g, NaCl 30g,蔗糖 30 g, H201000 mL, pH 7，将培养液 加热121°C灭菌20分钟，冷却至32°C接入菌落液200μ ，30°C培养Mh，为种子液。向灭过 菌的培养液中加入4%的种子培养液，发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的丙醇，60°C抽 真空干燥即得到索拉拉胶粗品。实施例4 索拉胶对便秘模型小鼠的实验研究
将索拉胶粗品按灌胃剂量溶解在蒸馏水中。48只C57BL/6J雄鼠购于上海，饲养在 23士 1°C，12小时光照一12小时黑暗循环的动物房。一周后开始实验。将小鼠随机分为6 组，每组8只。CK为正常对照组，vehicle为便秘对照组，Salecan-vL为极低剂量组(灌胃索拉胶粗品的剂量为200mg/kg)，Salecan-L为低剂量组(灌胃索拉胶粗品的剂量为300mg/ kg), Salecan-M为中剂量组(灌胃索拉胶粗品的剂量为500mg/kg)，Salecan-H为高剂量组 (灌胃索拉胶粗品的剂量为1，000mg/kg)。按组别分别灌胃试剂(CK组和vehicle组给予蒸 馏水)。1小时后，继续给小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺(5mg/kg)水溶液(CK组给予蒸馏水)。然 后将小鼠单独饲养，食物和水自由摄取。收集8小时内各只小鼠的粪便，统计数量和重量。 再将粪便置于104°C烘箱烘48小时至恒重，测其粪便的含水率。还是将48只C57BL/6J雄鼠饲养在23士 1°C，12小时光照一12小时黑暗循环的动 物房。一周后开始实验。将小鼠随机分为6组，每组8只。CK为正常对照组，vehicle为便 秘对照组，Salecan-vL为极低剂量组(灌胃索拉胶粗品的剂量为200mg/kg)，Salecan-L为 低剂量组(灌胃索拉胶粗品的剂量为300mg/kg)，Salecan-M为中剂量组(灌胃索拉胶粗品 的剂量为500mg/kg)，Salecan-H为高剂量组(灌胃索拉胶粗品的剂量为l，000mg/kg)。按 组别分别灌胃试剂(CK组和vehicle组给予蒸馏水)。1小时后，继续给小鼠灌胃盐酸洛哌 丁胺(5mg/kg)水溶液(CK组给予蒸馏水)。20分钟后，继续给小鼠灌胃同体积的酚红指示 剂(每50ml含25mg酚红和5g阿拉伯树胶)。20分钟后，断颈处死小鼠。开腹，取出胃和小 肠。胃剪碎后加入25ml 0. IN NaOH勻浆。然后每5ml勻浆液中加0. 5ml的20% Cw/ ν)三氯乙酸。3000rpm离心20分钟后，取出上清液，每Iml上清液加入0. 5N NaOH。用 分光光度计在560nm测其吸光值。取一只小鼠在灌胃酚红指示剂后立即断颈处死的胃部 吸光值作为Y，其他小鼠胃部吸光值作为X，则按公式得到了 gastric emptying(GE) = (1-X/ Y)* 100%
小肠取出后，测量其总长为L和上端到食物前进的最前端为d，按公式就得到了 small intestinal transt (SIT)=L/d*100% 实施例5 索拉胶肠道吸收实验研究
将 40 只 C57BL/6J 小鼠分为 4 组Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各 组分别通过灌胃给予不同剂量的索拉胶粗品水溶液，分别为200mg/kg，300m/kg, 500mg/ kg, 1, 000mg/kgo每只小鼠分别饲养，自由摄取食物和水，然后收集各只小鼠8小时内的粪 便。每份样品取0.5g左右的样重，加6M HCl研磨后转移到20ml的尖头分析管中，并定容 至8ml。然后置于100°C水浴加热0.5小时使索拉胶多糖水解成单糖。冷却至室温后用6M NaOH中和至中性，用蒸馏水定容至20ml。取其Iml于离心管离心，用血糖仪测其上清液即 可得到单糖的含量(见图6)。实施例6 索拉胶慢性毒理学实验研究
将索拉胶粗品研磨至粉状，按5%的比例添加的到动物饲料中，捏成饼状。40只ICR小 鼠购于南京，其中20雄鼠和20只雌鼠。将小鼠分为4组CKm(雄鼠正常对照组)，CKf (雌 鼠正常对照组)，GLm (雄鼠索拉胶组)，GLf (雌鼠索拉胶组)。前两组喂以正常饲料，后两组 喂以含5%索拉胶粗品的饲料。连续喂养3个月，期间跟踪小鼠的体重。3个月后，将小鼠断 颈处死，取其器官肝、脾、心，测其重量。与正常组比较，判断索拉胶的慢性毒理。索拉胶粗品成分见表1。将48只C57BL/6J小鼠分为6组control, vehicle, Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各组分别通过灌胃给予样品。1小时后， 灌胃洛哌丁胺造便秘模型(见表2)。每只小鼠单独饲养，食物和水均自由摄取。分别收集每只小鼠在8小时内的粪便，统计个数(见图1)和重量(见图2)。然后将粪便置于104士 1°C
烘箱，烘48小时至恒重，计算其粪便的含水率(见图3)。
表1索拉胶粗品成分表
权利要求
1. 一种索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用，其特征在于索拉胶可直接服用 或混于食物中服用，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸收，增加了粪便的体积，刺 激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情况。
全文摘要
本发明公开了一种索拉胶作为制备预防和治疗便秘药物的应用，索拉胶可直接服用或混于食物中服用，索拉胶在人体肠道中吸水膨胀而不被肠道吸收，增加了粪便的体积，刺激了胃肠的蠕动，提高粪便的数量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情况。索拉胶的制备操作简便，工艺简单，成本低，适宜于工业化生产；索拉胶具有强大的吸水能力，能够有效地刺激肠胃的蠕动，改善便秘情况的同时具有安全无毒的优点。
文档编号A61P1/10GK102058616SQ20111002848
公开日2011年5月18日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者修爱慧, 周梦怡, 张建法, 朱斌, 詹亦贝 申请人:南京理工大学