专利名称：一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌噬菌体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体及其在养殖环境中的应用，尤其是能够特异性的杀灭养殖环境中鸡白痢沙门氏菌的应用。属于微生物工程领域。
背景技术：
在禽类，沙门氏菌可引起鸡白痢、鸡伤寒和副伤寒。其中，鸡白痢沙门氏菌引起鸡的一种常见多发性传染病，严重影响雏鸡成活率，成年鸡多为慢性或隐性感染，一般不表现明显的临床症状。鸡白痢沙门氏菌感染往往是终生带菌的，感染母鸡所产生的蛋，高达1/3 带菌。带菌蛋的孵化率低，孵出的雏鸡的成活率也低。所以，鸡白痢所造成的经济损失是巨大的。鸡白痢呈世界性分布，美国和欧洲一些国家基本控制了本病，目前该病主要在发展中国家流行，比如中国等。带菌鸡是本病蔓延与传播的重要方式。感染鸡可通过互啄、啄食带菌蛋及皮肤伤口传播。感染禽的粪便、污染的饲料、饮水及笼具也是鸡白痢的来源。控制和解决沙门氏菌污染一直是全世界的难题。养殖场多利用净化手段和饲喂抗生素的方法控制沙门氏菌感染，但由于该病呈垂直和水平两种方式传播，这些控制措施并不理想，并且抗生素的大量使用不仅造成耐药菌株不断出现，而且抗生素残留问题也愈发严重。因此，亟待研究开发一种新型的疗法和产品，以解决和应对细菌对抗生素的耐药性问题，以控制食物细菌性污染。噬菌体是依赖细菌的病毒，能特异性地感染并裂解宿主菌，正是噬菌体特异性裂解细菌，而不影响机体或正常菌群这一特性，使得其有广阔的应用前景。噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时非常有效，且杀死细菌的机制与抗生素不同，不易产生耐药性和残留，是一种潜在的新型抗菌剂。噬菌体的裂解谱正在发生变化，某些噬菌体已不再是单一裂解性的噬菌体，其裂解谱正在扩展，比如，Bielke等Q007)分离到的肠炎沙门氏菌噬菌体成功以1 株克雷白氏杆菌(Klebsiella)和3株大肠杆菌分离株为宿主菌扩增；徐焰等Q007)分离到的大肠杆菌噬菌体XY对5株大肠杆菌具有裂解作用。广谱噬菌体是今后研究的主要方向，克服了噬菌体裂解细菌具有种和型的特异性的缺点，用这种宽噬噬菌体可以治疗细菌混合感染，具有极好的临床价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种宽宿主谱的鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体，它不仅能够有效地杀灭养殖环境中鸡白痢沙门氏菌临床分离株SPu-116 ；而且对鸡白痢沙门氏菌其他临床分离株(SPu-115、SPu-27、SPu_95、SPu_905)、副伤寒沙门氏菌ATCC 50073、 鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、禽沙门氏菌CVCC 2184、大肠杆菌K88或鸡白痢沙门氏菌CMCC 533也具有裂解活性。本发明的另一目的是针对目前禽业养殖中鸡白痢沙门氏菌引起的疾病并没有有效的控制措施，提供一种有效的防治产品。开发对鸡白痢沙门氏菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或与其他噬菌体复配使用，能够有效杀灭养殖场中鸡白痢沙门氏菌，为目前控制养殖环境中鸡白痢沙门氏菌提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供噬菌体来源。本发明的又一目的是提供一种有效的防治手段，将所述的噬菌体制备成液体、冻干粉或药片形式，单独使用或与其他噬菌体复配后，经口服、喷雾或注射等方式，用于杀灭畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、养殖器具或养殖空间环境中的鸡白痢。本发明的目的是这样实现的一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体，其特征在于保藏号为CCTCC M 2011042，该噬菌体命名为PSPu-4-116，其对鸡白痢沙门氏菌(SPu-116, SPu-115、SPu-27、SPu-95、SPu-905)、副伤寒沙门氏菌 ATCC 50073、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、禽沙门氏菌CVCC 2184、大肠杆菌K88或鸡白痢沙门氏菌CMCC 533均具有裂解活性。该噬菌体具有呈正多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约74. 3nm，尾部长约114. 2nm;噬菌体在固体培养基上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1. 5 2mm ；根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类-国际病毒分类委员会第八次报告》为标准，该噬菌体应属于肌尾病毒科。一种上述噬菌体的应用，其特征在于纯化后的噬菌体能够用于抑制鸡白痢沙门氏菌。在噬菌体的应用中，其特征在于用于抑制鸡白痢沙门氏菌是指将纯化的噬菌体制备成液体、冻干粉或药片形式，单独使用或与其他噬菌体复配后用于控制养殖环境中的鸡白痢沙门氏菌。在噬菌体的应用中，其特征在于养殖环境是指畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、 养殖器具或养殖空间环境。在噬菌体的应用中，其特征在于，使用方式为口服、喷雾或注射。本发明的优点在于分离到的鸡白痢沙门氏菌噬菌体对好几个血清型的沙门氏菌具有裂解活性，并且具有跨种属裂解的特性，是一种宽宿主谱的噬菌体；而且，是一种新型的防治畜禽养殖中细菌疾病的产品和手段；经雏鸡试验证明，该噬菌体毒副作用甚小，安全性高；由于制备的噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成滴注液、喷洒液或淋洗液，可以方便有效的杀灭养殖环境中鸡白痢沙门氏菌。
图1为噬菌体PSRi-4-116电镜照片；图2为噬菌体PSPu-4-116双层平板检测结果；图3为噬菌体PSPu-4-116在机体内杀菌结果。
具体实施例方式实施例1、噬菌体PSPu-4-116的分离制备本发明中的粪液污水样品采自南京禄口蛋鸡场粪便池；噬菌体宿主菌为鸡白痢沙门氏菌SPu-116 (从发病肉鸡肠道分离，由本实验室按照国标GB/T 4789. 4-2008分离、鉴定并保存)。将粪液污水样品经双层滤纸过滤，8000rpm离心20min，再分别用0. 45 μ m和0. 22 μ m滤膜过滤上清。取50mL上清，加入500 μ 1噬菌体宿主菌过夜培养物，再加入CaCl2 母液至终浓度2mM混勻后，加入20mLTSB-YE液体培养基，放置于37°C培养12 16h。次日， 取上述培养物以12000rpm离心lOmin，取上清并加入0. 3%氯仿，形成噬菌体原液。取三块1.5% TSB-YE琼脂平板，标记为1、2和3，分别吸取宿主菌液0. ImL滴于正中央，用涂棒将菌液均勻地涂开，5min后，平板1滴加0. 05mL噬菌体原液，平板2滴加 0. 05mL0. 85%生理盐水，平板3不滴加任何溶液，待自然晾干后，置于37°C温箱培养IOh后， 观察三块平板的变化。对上述鉴定后含有噬菌体的水样(即出现空斑的水样)进行以下操作取噬菌体原液0. lmL，进行10倍稀释，取IO2UO4和IO6稀释液各0. ImL与过夜培养的宿主菌液0. ImL 混勻，室温作用15min后，加入约3. 7mL 0.7% LB培养基，混勻后迅速倾倒入TSB-YE琼脂平板上层，摇勻平置5min，待其凝固，置于37°C培养1 后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。实施例2、噬菌体的扩增培养和纯化在形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大的单个噬菌斑，接种于3 5mL TSB-YE液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液0. lmL，混勻，室温作用15min，37°C 培养10 14h，12000rpm，4°C离心lOmin，取上清，加入0. 3%氯仿。取ImL新鲜培养的宿主菌，加0. ImL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1 1、1 10和1 100的比例)。37°C温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入IOOmLTSB-YE液体培养基，再加入CaCl2母液至终浓度2mM，37°C摇振培养12 16h，12000rpm，4°C离心lOmin，取上清，得到大量噬菌体裂解液。在裂解液中加入RNaseA、DNase I至终浓度为1 μ g/mL, 37°C温育30min ；加9. 3g PEG8000,5. 8g NaCl，摇勻至溶解，冰浴Ih或4°C过夜；4°C离心IOOOOrpm lOmin，去上清液； 加2mL SM液，充分洗涤管壁及沉淀，室温作用Ih;通过加入等体积的氯仿抽提，温和振荡 30s ；4°C 5000rpm离心IOmin以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(图2)。纯化的噬菌体命名为PSPu-4-116，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址中国·武汉·武汉大学，保藏号CCTCC M 2011042，分类命名鸡白痢沙门氏菌噬菌体 (Salmonella Pullorum phage)，保藏日期为 2011 年 2 月 21 日。实施例3、噬菌体宽宿主谱检测试验选择27株细菌(包括沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌)对噬菌体PSPu-4-116 的宿主谱进行分析。具体操作如下分别取27株细菌的过夜培养物100 μ 1，滴加在1. 5% TSB-YE平板(针对沙门氏菌)或1. 5% LB平板(针对大肠杆菌和志贺氏菌)中央，用涂棒分别将它们涂制成均勻的菌苔。然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域，取10μ 1 噬菌体PSPu-4-116滴加在菌苔表面，另一个区域滴加10 μ 1生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37°C培养12 16h，观察结果。结果表明(表1)试验选择的细菌菌液在平板上均生长良好。滴加噬菌体 PSPu-4-l 16的区域在SPu-116生长的平板出现不长细菌的透明区域，并且对所收集的27株细菌中的10株有裂解作用，裂解率为37. 04%。说明分离到的噬菌体PSPu-4-116具有跨种属裂解的特性，是一种宽宿主谱的噬菌体。
表1噬菌体宿主谱测定结果
权利要求
1.一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体PSPu-4-116，其特征在于保藏号为CCTCC M 2011042，该噬菌体具有相对较宽宿主谱，对所收集的27株细菌(包括沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌)中的10株有裂解作用，裂解率为37. 04 %。
2.根据权利要求1所述宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体PSPu-4-l16，其特征在于该噬菌体具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，头部直径约74. 3nm，尾部长约114. 2nm，应属于肌尾病毒科；在固体培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1.5 2mm。
3.根据权利要求1所述宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体PSPu-4-l16，其特征在于纯化后的噬菌体能够用于抑制鸡白痢沙门氏菌。
4.根据权利要求3所述，其特征在于用于抑制鸡白痢沙门氏菌是指将纯化的噬菌体制备成液体、冻干粉或药片形式，单独使用或与其他噬菌体复配后用于控制养殖环境中的鸡白痢沙门氏菌。
5.根据权利要求4所述，其特征在于养殖环境是指畜禽体内、畜禽体表、畜禽饲料、 养殖器具或养殖空间环境。
6.根据权利要求4所述，其特征在于，使用方式为口服、喷雾或注射。
全文摘要
本发明涉及一种沙门氏菌噬菌体，特别涉及一种宽宿主谱鸡白痢沙门氏菌强裂解性噬菌体(Salmonella pullorum bacteriophage)。本发明还涉及将所述的噬菌体用于控制养殖环境中的鸡白痢沙门氏菌。上述鸡白痢沙门氏菌噬菌体命名为PSPu-4-116，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2011042。
文档编号A61K35/76GK102296051SQ201110053518
公开日2011年12月28日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者包红朵, 张辉, 王冉 申请人:江苏省农业科学院