专利名称：一种活菌疫苗的高效非注射型传递方法
技术领域：
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种活菌疫苗的高效非注射型传递方法。
背景技术：
病害是制约我国水产养殖业发展的主要瓶颈之一。水产养殖病害防治可以从多方面着手，其中疫苗免疫是当今国际上普遍认可的最为有效的鱼类病害防治手段之一。疫苗的传递(即疫苗导入动物体)方法可简单分为几类，即注射型、浸泡型和口服型。注射方法传递疫苗的优点是免疫效果好，但其缺点是价格昂贵，难以大规模应用。浸泡和口服方法传递疫苗的优点是价格低廉，应用简单，可以广泛应用，但其缺点是疫苗在口服和浸泡过程中易于遭到破坏，从而造成疫苗的免疫效应较差。因此，新型高效的非注射型疫苗传递方法亟待研发。一些学者尝试将口服疫苗包埋于保护性材料，制备成微球胶囊，以此延缓疫苗在胃肠道的降解。然而，目前已报道的微球胶囊传递的口服疫苗的免疫效应仍远低于常规注射法传递的疫苗。因此，如何改善和提高疫苗的口服/浸泡传递效率仍是尚待解决的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种活菌疫苗的高效非注射型传递方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种活菌疫苗的高效非注射型传递方法传递方法是将疫苗作为口服型和浸泡型，而后将口服与浸泡叠加法传递。所述口服与浸泡叠加法传递为首先采用海藻酸钠作为包衣制得海藻酸钠微球口服型疫苗，其次采用海水稀释制得浸泡型疫苗，最后将两种类型的疫苗依次作用继而实现传递。所述口服与浸泡叠加法传递为1)制备海藻酸钠微球口服型疫苗将疫苗菌株在LB培养基中培养至OD6tltl为 0. 8-1，在将其悬浮于普通海水中至终浓度为IxlO9-L 5X109cfu/ml的悬浮液，而后用海藻酸钠、悬浮液、石蜡、乳化剂和氯化钙按5 3 200 1 5比例混合，即海藻酸钠微球口服型疫苗；2)浸泡型疫苗将疫苗菌株在LB培养基中培养至0D_为0. 8_1，并用普通海水中悬浮至终浓度为IxlO8-L 5xl08cfu/ml,即浸泡型疫苗；3)疫苗的免疫传递将步骤1)所得海藻酸钠微球口服型疫苗与步骤2)的浸泡型疫苗依次作用继而实现传递。所述步骤3)中海藻酸钠微球口服型疫苗可与饲料混合。所述疫苗菌株为迟缓爱德华氏菌疫苗菌株15947。本发明具有如下优点1.应用简单。本发明的疫苗传递方法简单易行，只需口服和浸泡。2.价格低廉。本发明的疫苗传递不需要注射，因而大大地降低了疫苗的应用成本。
3.高保护率。本发明的疫苗传递方法具有与注射法几乎相同的高效性。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。实施例1 疫苗的常规单一注射法传递步骤1)疫苗的免疫注射。在LB培养基中于28°C培养迟缓爱德华氏菌疫苗菌株 15947 (购于美国ATCC公司)至OD6tltl为0. 8-1，然后离心(5000g, 4°C ) IOmin0收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为15947悬浮液。将50条牙鲆随机分为2 (每组25条)，分别命名为A和B。将A和B组鱼分别腹腔注射15947悬浮液或PBS (对照组)， 每条鱼的注射量为IOOul。所述LB组成成分按重量百分比计1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,98. 798%蒸溜水。步骤2)疫苗的免疫保护效应检测。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl (保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330) 至0D_为0.7，然后离心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 lxl06cfU/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。在上述步骤1)免疫注射后的第30天，用迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射A和B组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，1条；B组，16条。禾Ij 用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出疫苗的免疫保护效率为93. 8%。实施例2疫苗的口服传递步骤1)疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料的制备。在LB培养基中于28°C培养迟缓爱德华氏菌疫苗菌株15947至0D_为0. 8-1,然后离心(5000g， 4°C ) IOmin0收集菌体，将其悬浮于普通海水中至终浓度为lxl09cfu/ml，即为15947悬浮液。将50ml海藻酸钠(3% )与30ml 15947悬浮液或PBS(对照)混合，随后加入2000ml 石蜡、IOml S-80乳化剂(皆购于美国Sigma公司)以及50ml氯化钙(0. 15M)(购于上海Sangon公司)；将含有15947和PBS对照的混合液分别离心(1000g，IOmin)，收集沉淀；将含有15947和PBS的沉淀分别与IOOOg鱼饲料(购于山东升索渔用饲料研究中心)混合，用F(II)-26.双螺杆挤条制粒机(华南理工大学，广州).加工制成颗粒饲料 (1. 5mmX2. 0mm)，即为疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料。步骤2)疫苗的免疫传递。将50条牙鲆随机分为2 (每组25条)，分别命名为C (样品组)和D (对照组)。将C和D组鱼分别喂食上述步骤1)的疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料，持续3天。步骤3)疫苗的免疫保护效应检测。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl至0D_为0.7，然后离心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 5xl08cfU/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。在上述步骤2)免疫后的第30天，将C和D组鱼在迟缓爱德华氏菌悬液中浸泡6h，随后将两组鱼置入正常海水中养殖。在以后的20天中， 每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目C组，9条；D组，23 条，故疫苗的相对免疫保护效率为60. 9% (按照实施例1步骤2)RPS公式计算)。实施例3 疫苗的浸泡传递步骤1)疫苗浸泡液的制备。在LB培养基中于28°C培养疫苗菌株15947至0D_ 为0.8-1，然后离心(5000g，4°C )10min。收集菌体，将其悬浮于普通海水中至终浓度为 lxl08cfu/ml,即为疫苗浸泡液。 步骤2)疫苗的免疫传递。将50条牙鲆随机分为2 (每组25条)，分别命名为E (样品组)和F(对照组)。将E组鱼在上述步骤1)的疫苗浸泡液中浸泡1小时，将F组鱼在普通海水中浸泡1小时。步骤3)疫苗的免疫保护效应检测。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl 至0D_为0.7，然后离心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 5xl08cfU/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。在上述步骤2)浸泡免疫后的第30天，将E和F组鱼在迟缓爱德华氏菌悬液中浸泡6h，随后将两组鱼置入正常海水中养殖。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目E组，13条；F 组，22条，故疫苗的相对免疫保护效率为40. 9% (按照实施例1步骤2) RPS公式计算)。实施例4疫苗的口服与浸泡叠加法传递步骤1)疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料的制备。同上述实施例 2步骤1)。步骤2)疫苗浸泡液的制备。同上述实施例3步骤1)。步骤3)疫苗的免疫传递。将50条牙鲆随机分为2 (每组25条)，分别命名为G (样品组)和H(对照组)。将G和H组鱼分别喂食上述步骤1)的疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料，3天后将G组鱼在上述实施例2步骤2)的疫苗浸泡液中浸泡1小时， 将H组鱼在普通海水中浸泡1小时。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl 至0D_为0.7，然后离心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 5xl08cfU/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液。在上述步骤3)浸泡免疫后的第30天，将C和D组鱼在迟缓爱德华氏菌悬液中浸泡6h，随后将两组鱼置入正常海水中养殖。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目G组，2条；H 组，23条，故疫苗的相对免疫保护效率为91. 3% (按照实施例1步骤2) RPS公式计算)。因此，疫苗通过口服与浸泡叠加法传递时具有明显高于单独口服或浸泡传递的保护效应，可以达到与常规注射法传递相近的免疫保护效应。上述实施例说明本发明的口服与浸泡叠加法传递活菌疫苗方法是一种较佳的疫苗的实施方式，本发明的疫苗传递方法简单易行，只需口服和浸泡，大大地降低了疫苗的应用成本。同时疫苗传递方法具有与注射法几乎相同的高效性。
本发明的实施方 式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种活菌疫苗的高效非注射型传递方法，其特征在于传递方法是将疫苗作为口服型和浸泡型，而后将口服与浸泡叠加法传递。
2.按权利要求1所述的活菌疫苗的高效非注射型传递方法，其特征在于所述口服与浸泡叠加法传递为首先采用海藻酸钠作为包衣制得海藻酸钠微球口服型疫苗，其次采用海水稀释制得浸泡型疫苗，最后将两种类型的疫苗依次作用继而实现传递。
3.按权利要求2所述的活菌疫苗的高效非注射型传递方法，其特征在于所述口服与浸泡叠加法传递为1)制备海藻酸钠微球口服型疫苗将疫苗菌株在LB培养基中培养至0D_为0.8-1，在将其悬浮于普通海水中至终浓度为IxlO9-L 5X109cfu/ml的悬浮液，而后用海藻酸钠、悬浮液、石蜡、乳化剂和氯化钙按5 3 200 1 5比例混合，即海藻酸钠微球口服型疫苗；2)浸泡型疫苗将疫苗菌株在LB培养基中培养至OD_为0.8-1，并用普通海水中悬浮至终浓度为IxlO8-L 5xl08cfu/ml,即浸泡型疫苗；3)疫苗的免疫传递将步骤1)所得海藻酸钠微球口服型疫苗与步骤2)的浸泡型疫苗依次作用继而实现传递。
4.按权利要求3所述的活菌疫苗的高效非注射型传递方法，其特征在于所述步骤3) 中海藻酸钠微球口服型疫苗可与饲料混合。
5.按权利要求3所述的活菌疫苗的高效非注射型传递方法，其特征在于所述疫苗菌株为迟缓爱德华氏菌疫苗菌株15947。
全文摘要
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种活菌疫苗的高效非注射型传递方法。传递方法是将疫苗作为口服型和浸泡型，而后将口服与浸泡叠加法传递。本发明所得疫苗传递方法避免了常规注射法的局限，简单易行，造价相对低廉，应用范围不受限制，并且具有与注射法几乎相同的高效免疫效应。
文档编号A61K47/36GK102178942SQ20111009319
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者孙黎, 程爽, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所