专利名称：酵母在制备抗球虫病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明公开了酵母菌在制备抗球虫病药物中的应用，可以作为球虫病疫苗的佐剂，用于预防和治疗球虫病，属于医学制药技术领域。
背景技术：
球虫是一种单细胞的寄生性原虫，它广泛寄生在禽类的肠上皮细胞内，可引起宿主严重腹泻、肠道出血、甚至导致死亡，造成严重的经济损失。柔嫩艾美耳球虫是球虫中危害较为严重的一种疾病，在养鸡生产中一直受到人们的重视。但是由于抗药性的出现，使得一些抗球虫药物不能产生很好的防治球虫病作用，药物残留等问题也影响了抗球虫药物研究的进展。免疫保护性疫苗的研究是预防球虫病的一个较为理想的手段，但是目前应用的柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗并不能产理想的免疫保护效果。酵母菌是一种单细胞生物， 属真菌类，是生产面包必不可少的生物松软剂，同时也可用于酿酒。酵母菌中蛋白质含量特别丰富，有较高的营养价值。但是，酵母菌作为疫苗的佐剂并未见报道，也未见其在寄生虫病的预防和治疗中有所应用。
发明内容
本发明提供了酵母菌在制备抗球虫病疫苗中的应用，为一种新的医用用途，用于球虫疾病的预防和治疗。本发明的技术方案是这样实现的酵母菌可接种于300ml YPD培养基中，待菌液饱和后，室温离心收集酵母菌细胞，加入200 μ L细胞裂解液重新悬浮酵母菌细胞，用酸洗过的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超声波超声破碎20min，测定蛋白浓度，配制成1 μ g/μ L的蛋白溶液，-20°C保存备用，作为佐剂与疫苗等量混合即可。将酿酒酵母菌扩增，然后使用玻璃珠和超声波将酵母菌的细胞破碎，与柔嫩艾美耳球虫亚单位疫苗混合后免疫雏鸡，进而检测细胞免疫水平，体液免疫水平以及抗球虫指数，验证以酵母菌作为佐剂的亚单位疫苗对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护作用，为鸡球虫病的防治研究提供理论依据。以下药理实验证明本发明的治疗效果
1、柔嫩艾美耳球虫ROM蛋白与MIC4蛋白的表达
根据GenBank中柔嫩艾美耳球虫ROM (DQ323509)、MIC4 (AJ306453) DNA序列设计并合成两对引物，
ROM-F :5’ -CGGGATCCAACATTTCACTGGACAAGTCG-3’， ROM-R 5' -CCGGAATTCACACGTTACTGCGAACCCGCA-3'； MIC4-F :5’ -CGCGGATCCGAA GGCGAGACAGGGAAACCTGG-3’， MIC4-R 5' -CGGAATTCCTACTGGATGTCACCA CTGTCTGCC-3，。提取柔嫩艾美耳球虫总RNA，RT-PCR扩增ROM基因与MIC4基因，构建重组原核表达质粒pET28a-R0M和pET28a-MIC4，及 I和I酶切鉴定正确后，将两个重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达，经Wfestern-blot鉴定正确后回收ROM蛋白与 MIC4蛋白，将表达的重组蛋白制备成三种亚单位疫苗
(1)ROM蛋白与MIC4蛋白混合后制备的亚单位疫苗(1 μ g/ μ L)；
(2)ROM蛋白制备的亚单位疫苗(1 μ g/μ L)；
(3)MIC4蛋白制备的亚单位疫苗(1μ g/μ L)。
2、酵母菌在柔嫩艾美耳球虫亚单位疫苗中的应用
2. 1试验分组及免疫程序设计
将酵母菌ΑΗ109接种于300ml YPD培养基中，待菌液饱和后，室温1000 X g离心收集酵母菌细胞，加入200 μ L细胞裂解液重新悬浮酵母菌细胞，用酸洗过的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超声波超声破碎20min，测定蛋白浓度，配制成1 μ g/μ L的蛋白溶液，_20°C保存 1日龄雏鸡饲养于无球虫污染的铁笼中，自由采食，自由饮水。6日龄时，将雏鸡随机分为9组，每组20只。试验设计与免疫程序见表1。试验分组情况如下 (Al)将Iml第一种亚单位疫苗与酵母菌破碎蛋白等量混合； (A2)第一种亚单位疫苗；
(Bi)将Iml第二种亚单位疫苗与酵母菌破碎蛋白等量混合； (B2)第二种亚单位疫苗；
(Cl)将Iml第三种亚单位疫苗与酵母菌破碎蛋白等量混合； (C2)第三种亚单位疫苗；
(D)酵母菌破碎蛋白；
(E)红对照组；
(F)白对照组；
将各组蛋白溶液对雏鸡进行肌肉注射IOOPg/只。三免后一周口服接种万.tenella新疆株孢子化卵囊1 X IO4个/只，红白对照组肌肉注射PBS，红对照组最后攻虫，白对照组不攻虫。
表1实验设计与免疫程序
权利要求
1.酵母菌在制备抗球虫病疫苗中的应用。
2.权利要求1所述疫苗的制备方法，包括以下步骤酵母菌可接种于300mlYPD培养基中，待菌液饱和后，室温离心收集酵母菌细胞，加入200 μ L细胞裂解液重新悬浮酵母菌细胞，用酸洗过的玻璃珠破碎酵母菌，然后用超声波超声破碎20min，测定蛋白浓度，配制成 1 μ g/μ L的蛋白溶液，-20°C保存备用，作为佐剂与疫苗等量混合即可。
全文摘要
本发明公开了酵母菌在制备抗球虫病药物中的应用，利用酵母菌能够提高机体非特异性免疫力的作用，将酵母菌应用到寄生虫病领域，将酵母菌细胞破碎后的蛋白作为球虫病疫苗的佐剂，可以明显增强疫苗的免疫保护效果，用于球虫疾病的预防和治疗。
文档编号A61P33/02GK102188703SQ20111010236
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月24日 优先权日2011年4月24日
发明者任文陟, 宫鹏涛, 张国才, 张楠, 张西臣, 李建华, 李淑红, 李 赫, 杨举, 郑君, 陈玉江 申请人:吉林大学