专利名称：硫取代鬼臼类衍生物及其生物转化和分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及鬼白类化合物及其制备方法，尤其涉及硫取代鬼白类衍生物及其生物转化和分离纯化、含量检测方法，本发明还涉及该硫取代鬼白类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于鬼白类化合物及其生物转化领域。
背景技术：
硫取代鬼臼类衍生物是一类鬼臼类化合物，其结构式为图(I)和(II)所示。对鬼臼毒素的C环4位，以P碳硫键芳环取代作为修饰方向所得到的衍生物普遍具有良好的抗肿瘤活性和生物利用度。目前针对鬼臼类衍生物的结构修饰研究，以化学合成方法为主。然而，随着人类 需求的日益增长，化学合成法已显出较大弊端一是规模小、产量低；二是化学残留难以除去，二是生广成本闻。上述这些因素必将导致4-(1,2,4- 二氣唑-3) -4-脱氧_鬼曰毒素等五种硫取代鬼白类衍生物的价格高昂，因此寻找一种适合大规模工业化生产4-(1，2，4_三氮唑-3)-4-脱氧-鬼白毒素等硫取代鬼白类衍生物的方法，成为研发的重中之重。基于生物转化技术具有反应条件温和、E-factor低、质量可控、分离过程简单等优点，越来越多的学者倡导以生物转化技术为代表的绿色制药过程(Curr Opin Chem Biol2009 ；13 43-50)。研究证明利用生物转化对鬼臼毒素进行分子结构修饰具有可行性，如果德安教授(J Aslan Nat Prod Res 1998 ；1(2) :99-120)利用掌叶大黄细胞和青霉菌转化鬼白毒素，使鬼白毒素D环的反式结构转化为顺式结构，得到鬼白苦素；英国诺丁汉大学Broomhead等(Phytochemistryl991 ；30 (5) :1511-1517)发现美国金钟连翅悬浮培养细胞具有将鬼白毒素氧化为鬼白毒酮的能力，同时产生少量的鬼白苦酮。澳大利亚墨尔本大学Teng等(Biocataly Biotransfor 2007 ；25(7) :1_8)以大麦悬浮培养细胞转化鬼臼毒素得到异鬼臼苦酮。综上所述，提供一类具有良好的抗肿瘤活性的硫取代鬼白类衍生物，该硫取代鬼臼类衍生物具有廉价易行的生物转化方法，将具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的之一是提供一类具有抗肿瘤活性的硫取代鬼白类衍生物；本发明目的之二是一种上述硫取代鬼白类衍生物的生物转化方法，该方法切实可行、操作简单、质量可控、成本低、易规模化工业生产；本发明目的之三是提供一种从上述生物转化产物中分离纯化及检测硫取代鬼臼类衍生物含量的方法；本发明目的之四是将所述硫取代鬼白类衍生物应用于制备成抗肿瘤药物。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的式(I)或式(II)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼白类衍生物SZR1式⑴
Xl0
H3CO^^^
权利要求
1.式(I)或式(II)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼白类衍生物 式⑴ Xx0 H3CO^^|^^OCH3OR2 N、n 其中，R1为I L ^JJ R2为CH3或氢；N-NH 或 ， /N==\|AVnh (0YYjxOH cr^^V^WcooH式(II)。
Jdh3co^^^och3OH
2.一种制备含有权利要求I式(I)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼白类衍生物的生物转化产物的方法，包括 (I)将鬼白毒素或4'-去甲表鬼白毒素加入到液体发酵培养基中，接种鬼白类植物内生菌二级液体种子进行发酵培养；(2)发酵培养一段时间后再加入2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养，得到含有式(I)所示的硫取代鬼白类衍生物的生物转化产物。
3.一种制备含有权利要求I式(II)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼白类衍生物的生物转化产物的方法，包括(I)将4'-去甲表鬼白毒素加入到液体发酵培养基中，接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行发酵培养；(2)发酵培养4天后再加入3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养，得到含有4-S-(l，2，4-三氮唑-3) -4-脱氧-4'-去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；(3)将4-5-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4'-去甲基表鬼臼毒素分离纯化后加入到液体发酵培养基中，接种腐殖性土壤真菌二级液体种子进行发酵培养，得到含有4-S-(l，2，4-三氮唑-3)-4-脱氧-4'-去甲基表鬼白酸的生物转化产物。
4.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的鬼白类植物内生菌从八角莲属(Dysosma)、桃儿七属(podophyllum)、山荷叶(Diphylleia)或沙地柏(Sabinavulgaris Ant)中分离得到；优选的，所述的鬼臼类植物内生菌是产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum) Y. J. Tang,其微生物保藏号是CCTCC NO. M2010262 ;所述的腐殖性土壤菌是从湖北恩施或神农架等地的土壤中分离得到；优选的，所述的腐殖性土壤菌是藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi) SH_f 13，其微生物保藏号是 CCTCC N0.M2010038。
5.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤(I)中将鬼臼毒素或4'-去甲基表鬼白毒素作为底物加入到发酵培养基时，所加入用量为至终浓度0. 05-5克/升，优选为0. 2克/升；步骤(2)中在发酵培养基中添加2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑至其终浓度分别为0. 01-5克/升，优选为0. I克/升；步骤(2)中发酵培养4天后再加入2-巯基-1，3，4-噻二唑或3-巯基-1，2，4-三氮唑继续进行发酵培养；所述的发酵培养包括摇瓶级或生物反应器规模的发酵培养；其中，所述的发酵培养温度为15-40°C，优选为30°C ;当采用摇瓶进行发酵培养时，所述的摇床转速为50-300转/分钟，优选的，所述的摇床转速为120转/分钟。
6.按照权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中或步骤(2)中所述的液体发酵培养基组成是酵母膏1-50克/升、硫酸镁0. 5-20克/升、磷酸氢二钾1-20克/升、硫酸亚铁0. 01-10克/升、氯化钾0. 5-20克/升、pH值3-9 ;优选的，所述的液体发酵培养基的组成是酵母膏3克/升，硫酸镁0. 5克/升、磷酸氢二钾I克/升、硫酸亚铁0. 02克/升、氯化钾0. 5克/升、pH值为7 ; 所述的腐殖性土壤菌二级液体种子或鬼白类植物内生菌二级液体种子的制备包括以下步骤(I)培养斜面菌种；(2)培养一级液体种子；(3)培养二级液体种子； 其中，培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为 培养基葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0. 5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、盐酸硫胺0. 05-10克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液I. 0升； 培养条件培养温度为15-40°C ； 培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为 培养基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0. 5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0. 01-10克/升、氯化钾0. 5-40克/升；pH 值 2-9 ； 培养条件培养温度15-40°C，摇床转速为50-300转/分钟； 培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为 培养基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0. 5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0. 01-10克/升、氯化钾0. 5-40克/升；pH 值 2-9 ； 培养条件培养温度15-40°C，摇床转速为50-300转/分钟。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为 培养基葡萄糖30克/升、硫酸镁0. 5克/升、磷酸二氢钾I. 5克/升、盐酸硫胺0. I克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液I. 0升；培养条件培养温度为30°C ； 所述培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0. 5克/升、磷酸氢二钾I克/升、硫酸亚铁0. 01克/升、氯化钾0. 5克/升，pH值7 ;培养条件培养温度30°C，摇床转速为120转/分钟； 所述培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为培养基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸钠2克/升、硫酸镁0. 5克/升、磷酸氢二钾I克/升、硫酸亚铁0. 01克/升、氯化钾0. 5克/升，pH值7 ;培养条件培养温度30°C，摇床转速为120转/分钟。
8.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的分离纯化包括(1)将生物转化产物离心，收集发酵上清液备用；(2)制备发酵上清液待分离纯化样品；(3)依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得；其中，步骤(2)所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；其中，以体积比为20 I的氯仿丙酮作为洗脱液；将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。
9.从权利要求2所述的生物转化产物中分离纯化式(I)所示的具有抗肿瘤活性的硫取代鬼白类衍生物的方法，其特征在于，包括 (I)将生物转化产物离心，收集发酵上清液备用；(2)制备发酵上清液待分离纯化样品 或菌丝体待分离纯化样品；(3)使用硅胶柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化，即得； 步骤(2)所述发酵上清液待分离纯化样品的制备方法，包括将发酵上清液通过液液萃取，收集有机层，浓缩挥干，得到发酵上清液待分离纯化样品；步骤(3)中所述硅胶柱层析为正相硅胶柱层析或反相硅胶柱层析；正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱液平衡；反相硅胶以甲醇拌匀后装柱，以洗脱液平衡；优选的，步骤(3)中将待分离纯化的样品以洗脱液溶解，采用硅胶柱层析吸附，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；以体积比为40 I的氯仿丙酮系统作为洗脱液； 将凝胶以甲醇浸泡，将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶，即得。
10.权利要求I所述的硫取代鬼白类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了硫取代鬼臼类衍生物及其生物转化和分离纯化方法。本发明通过生物转化方法对鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素分子结构进行修饰，得到了具有抗肿瘤活性的式(I)或式(II)所示的硫取代鬼臼类衍生物。体外肿瘤细胞毒性的前期研究表明，本发明硫取代鬼臼类衍生物对BGC823、HepG2、A549等肿瘤细胞生长具有较强的抑制作用，因此能作为抗肿瘤化合物而具有药物开发的潜在价值。本发明采用生物转化方法将鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素转化为硫取代鬼臼类衍生物，具有成本低、E-factor低、操作简单、易培养、质量可控、可有效防止化学残留等优点。
文档编号A61P35/00GK102757443SQ20111010619
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者汤亚杰, 白佳珂 申请人:汤亚杰