专利名称：布氏杆菌病活疫苗的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物疫苗的制备方法，尤其涉及布氏杆菌病疫苗的制备方法及由该方法制备得到的疫苗，本发明属于布氏杆菌病疫苗的生产领域。
背景技术：
布氏杆菌病(全称布鲁士杆菌病(brucellosis)是由布氏杆菌引起的人畜共患的急、慢性传染病。临床特点是缓慢起病，长期发热、多汗、虚弱、全身痛和关节痛，急性期症状多在3 6月内消退。布氏杆菌共分为牛、羊、猪、沙林鼠、绵羊和犬布氏杆菌六种。在中国发现的主要为前三种。布氏杆菌为细小的短杆状或球杆状，不产生芽胞，革兰氏染色阴性的杆菌。布氏杆菌对热敏感，70°C 10分钟即可死亡；阳光直射1小时死亡；在腐败病料中迅速失去活力；一般常用消毒药都能很快将其杀死。潜伏期短者两周，长者可达半年。母牛流产是本病的主要症状，流产多发生于怀孕5-7个月，产出死胎或软弱胎儿。母牛流产后常伴有胎衣不下或子宫内膜炎，阴道内继续排出红褐色恶臭液体，可持续2-3周，患病公牛常发生睾丸炎或附睾炎。人也可感染该病，表现为长期发热、多汗、关节痛、神经痛及肝、脾肿大等症状.该病严重损害人和动物的健康，OIE将其列为B类动物疫病，中国将其列为二类动物疫病.布氏杆菌病对畜牧业和人类健康均构成严重威胁，疫苗免疫是预防和控制布氏杆菌病的主要措施。由于布氏杆菌胞内寄生的特点，只有利福平等少数的几种抗生素对其治疗有效，但这些抗生素的副作用很大，不能长期服用，因此一旦发病并转为慢性则无法根治，并能反复发作。因此，接种疫苗是预防布氏杆菌病的最有效的手段。布氏杆菌活疫苗A19株是防制布氏杆菌病非常有效的弱毒疫苗株，该疫苗适用于牛和羊，且牛每头份免疫剂量为600亿-800亿。现有的布氏杆菌A19株活疫苗的生产规程方法如下一级菌种制备冻干菌种开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白目示琼脂平板或其他适宜培养基上，在36-37°C培养2-3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白目示琼脂斜面培养基，36-37°C培养48-72小时，作为一级种子。在2_8°C保存，使用期应不超过1 个月。二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白际琼脂扁平或其他适宜培养基，置 36-37°C培养48-72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于 1万-2万ml的适宜液体培养基，置36-37°C培养48-72小时，进行纯粹检验后置2_8°C保存，使用期应不超过30天。菌液培养按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基量的-2%接种二级菌种，在36-37°C逐渐增大通气量，培养36小时，培养过程中可根据需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的_2%。按现有的规程进行布氏杆菌活疫苗(A19株)生产所培养得到菌液的活菌数为 800-1000亿/ml，需要对该菌液进行浓缩处理，存在产量低、生产成本高等问题，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的布氏杆菌活疫苗的生产方法中所存在的产量低、生产成本高等问题，提供一种新的布氏杆菌活疫苗的生产方法，该生产方法所培养得到菌液的菌数可达1500-1800亿/ml，具有存在产量高、生产成本低等优点。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种布氏杆菌病活疫苗的制备方法，包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养；其中在菌液培养阶段，液体培养基接种二级菌种后首先按照逐渐增大通气量的方式通入空气进行培养，培养至30h时开始通入纯氧直至培养结束。本发明进一步发现，不同的通入纯氧的方式在培养液的菌数上有着非常显著的差别，为了最大限度的提高培养液的菌数，本发明比较和筛选了不同的通入纯氧的方式，最终发现，采用以下方式通入纯氧，培养液中的菌数产量最高，可达到1700-1800亿/ml 培养至 30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加2m3，使培养液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培养结束。本发明还发现，在菌液培养阶段，通入空气的方式对于培养液的菌数也有一定的影响。本发明通过大量的实验发现，在菌液培养阶段按照以下方式逐步通入空气可以有效的提高培养液菌数液体培养基接种二级菌种后首先按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h。此外，本发明还发现，在菌液培养阶段，50%葡萄糖溶液的加入方式对于培养液菌数也有一定的影响按现有的规程，50%葡萄糖溶液的加入方法为培养过程中根据需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总质量的1 % -2%。本发明通过实验发现，如果在接种时就按最终含量为将50%葡萄糖溶液一次性加入能够有效的提高培养液的细菌数量。本发明方法在菌液培养阶段中选择最适宜该细菌大量繁殖的时段通入纯氧，使培养菌数得到大幅度提高，培养液中菌数可达1500-1900亿/ml，在应用时无需对该菌液进行浓缩处理，具有产量高、生产成本低等优点。
图1本发明制备方法的工艺流程图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养72小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万ml的马丁肉汤液体培养基中，置37°C培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存； 每IOOOml马丁肉汤培养基的成分为牛肉汤500ml猪胃消化液500ml氯化钠2.5gPH6. 4-6. 7灭菌116 °C 30-40 分钟菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的2%接种二级菌种后通入空气并逐渐增大空气的通入量；培养至30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加2m3，使培养液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培养结束。经检验，培养液中菌数为1600亿/ml。实施例2一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养 3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养72小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的2%接种二级菌种后就按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h ；培养至30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加2m3，使培养液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培养结束。经检验，培养液中菌数为1850亿/ml。实施例3一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养 3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养72小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于2万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的2%接种二级菌种后就按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h ；培养至30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加2m3，使培养液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培养结束。经检验，培养液中菌数为1790亿/ml。实施例4一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在36°C培养 2日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36°C培养48小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置36°C 培养48小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万ml的马丁肉汤液体培养基，置36°C培养48小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为2wt%将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的-2%接种二级菌种后就按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/ h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h ；培养至30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，直至3 培养结束。经检验，培养液中菌数为1500亿/ml。实施例5一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在36°C培养 2日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36°C培养60小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置36°C 培养60小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1. 5万ml的马丁肉汤液体培养基，置36°C培养60小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的接种二级菌种后就按照8m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至12m3/h，培养 20h后将空气的通气量进一步增大增至16m3/h ；培养至30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加2m3，使培养液溶氧量DO值保持在95 %~98%,直至3 培养结束。经检验，培养液中菌数为1720亿/ml。实施例6—级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养 3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养48小时，作为一级种子，在2_8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养48小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于2万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为2wt%将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的-2%接种二级菌种后就按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/ h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h ；培养至30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，以后每将通气量增加2m3，使培养液溶氧量DO值保持在95% -98%，直至3 培养结束。经检验，培养液中菌数为1800亿/ml。实施例7一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在36°C培养 3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36°C培养72小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为2wt%将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的-2%接种二级菌种后就按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/ h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h ；培养至30h时按照6m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加lm3，使培养液溶氧量DO值保持在94%，直至3 培养结束。经检验，培养液中菌数为1650亿/ml。实施例8一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养 2日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养48小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按马丁肉汤液体培养基的质量加入0. 01%的消泡剂，灭菌后按最终含量为2wt%将50%葡萄糖溶液一次性加入，按马丁肉汤液体培养基质量的-2%接种二级菌种后就按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第他开始将空气的通气量增至12m3/h， 培养1 后将空气的通气量进一步增大增至16m3/h ；培养至30h时按照6m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加lm3，使培养液溶氧量DO值保持在97%直至3 培养结束。 经检验，培养液中菌数为1620亿/ml。对比实施例1一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养 3日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养72小时，作为一级种子，在2_8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养72小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于2万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养72小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基量的-2%接种二级菌种，在36-37°C逐渐增大通气量，培养36小时，培养过程中可根据需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的_2%。经检验，培养液中菌数为820亿/ml。对比实施例2一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在36°C培养 2日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，36°C培养48小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置36°C 培养48小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1万ml的马丁肉汤液体培养基，置36°C培养48小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基量的-2%接种二级菌种，接种后36-37°C培养，按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h直至3 培养结束。 经检验，培养液中菌数为980亿/ml。对比实施例3一级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养 2日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养48小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养48小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于2万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养48小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；菌液培养按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基量的-2%接种二级菌种，接种后36-37°C培养，按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h直至3 培养结束。 经检验，培养液中菌数为900亿/ml。对比实施例4—级菌种制备布氏杆菌病活疫苗A19株冻干菌种(购自中国兽医药品监察所) 开封后，用蛋白胨水溶解，划线移植于胰蛋白胨琼脂平板或其它适宜培养基上，在37°C培养 2日。选取合格菌落10个以上，移植于胰蛋白胨琼脂斜面培养基，37°C培养60小时，作为一级种子，在2-8°C保存；二级菌种制备取一级菌种接种于胰蛋白胨琼脂扁平或其它适宜培养基，置37°C 培养60小时，肉眼检查纯净后，每个扁平加蛋白胨水适量，将菌苔洗下，接种于1. 5万ml的马丁肉汤液体培养基，置37°C培养60小时，进行纯粹检验后得到二级菌种，置2-8°C保存；
菌液培养按培养基量加入适量的消泡剂，灭菌后按培养基量的-2%接种二级菌种，接种后36-37 培养，按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h直至3 培养结束。 经检验，培养液中菌数为850亿/ml。
权利要求
1.一种布氏杆菌病活疫苗的制备方法，包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养； 其特征在于在菌液培养阶段，液体培养基接种二级菌种后按照逐渐增大通气量的方式通入空气进行培养；培养至30h时开始通入纯氧直至培养结束。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于培养至30h时按照8m3/h的通入量通入纯氧，以后每池将通气量增加2m3，使培养液溶氧量DO值保持在95% -98%,直至3 培养结束。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于液体培养基接种二级菌种后首先按照12m3/h的通入量通入普通空气，从第IOh开始将空气的通气量增至16m3/h，培养20h后将空气的通气量进一步增大增至18m3/h。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于按质量百分比计，所述的液体培养基中含有2%的葡萄糖。
5.由权利要求1-4任何一项制备方法所制备得到的布氏杆菌活疫苗。
6.权利要求5所述的布氏杆菌活疫苗在制备预防布氏杆菌病试剂中的用途。
7.权利要求5所述的布氏杆菌活疫苗在制备治疗布氏杆菌病药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了布氏杆菌病活疫苗的制备方法及其产品。该方法包括一级菌种制备、二级菌种制备和菌液培养；其中，在菌液培养阶段，液体培养基接种二级菌种后按照逐渐增大通气量的方式通入空气进行培养；培养至30h时开始通入纯氧直至36h培养结束。本发明方法在菌液培养阶段中选择最适宜该细菌大量繁殖的时段通入纯氧，使培养菌数得到大幅度提高，培养液中菌数可达1500-1900亿/ml，在应用时无需对该菌液进行浓缩处理，具有产量高、生产成本低等优点。
文档编号A61K39/10GK102258774SQ20111018095
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者付丽杰, 尹尧, 张继东, 柴华, 王 华, 袁明霞, 郑铁鑫 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司