专利名称：一种中药免疫球蛋白复合剂的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽药与饲料添加剂领域，具体是指特效防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的生产方法。本发明适用于猪腹泻的预防和治疗，同时也适用于各种家禽、家畜等动物腹泻疾病的防治。
背景技术：
仔猪腹泻是由猪致病性大肠杆菌、魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌等引起的一种常见传染病，包括猪传染性胃肠炎、流行性腹泻、猪轮状病毒病、猪繁殖呼吸综合症、猪瘟、伪狂犬病和圆环病毒性肠炎等，具有发病急、 传播快、死亡率高等特点，严重危害养猪业的发展。常见的仔猪胃肠道疾病有仔猪白痢、仔猪黄痢、仔猪副伤寒、传染性胃肠炎等。仔猪黄、白痢主要是由埃希氏大肠杆菌引起，一般吮乳仔猪发病率较高，同窝仔猪发病率可达 80 %，其中仔猪白痢的死亡率较低，而仔猪黄痢的死亡率很高，有时甚至会全窝死亡。产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia colt, ETEC)是引起新生和断奶仔猪腹泻的主要致病菌之一(Yokoyam等，199 。初生仔猪和早期断奶仔猪自身免疫功能的不成熟以及早期断奶应激引起的免疫抑制，是造成仔猪对ETEC敏感性增高、抗病力下降，并引发 ETEC感染性腹泻的主要因素。长期以来，仔猪腹泻的防治主要依赖于抗菌药物、大肠杆菌多价苗和基因工程疫苗。然而，抗生素在动物体内会导致药物残留和产生抗药性；用疫苗免疫母猪，虽可提高母乳中免疫球蛋白含量，但母源免疫球蛋白持续时间短，不足以保护仔猪整个生长阶段不致病；口服高免动物血清虽能有效防治该病，但成本较高很难在生产中推广应用。抗生素作为控制细菌感染的有效药物广泛应用于生产中，但抗生素的长期使用引起的耐药性问题和生产中超量使用抗生素的现象越来越突出，但控制效果却并不乐观。抗生素替代品的研究成为畜牧业发展的迫切需求。研制新型的制剂，在防治仔猪腹泻疾病方面，做到治标与治本结合，加快养猪业的发展，实现猪肉产品的绿色无害化，成为人们关注的焦点。
发明内容
本发明的目的在于，提出防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，在中草药基料的基础上添加特异性卵黄免疫球蛋白而形成的，本发明综合了中草药与免疫球蛋白的优点，是一种新型的抗生素替代品，可以替代抗生素，解决了传统用抗生素治疗猪腹泻产生耐药性问题，实现畜禽产品的绿色无害化。一种中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，该中药免疫球蛋白复合剂是在中草药基料基础上添加特异性卵黄免疫球蛋白而制成的，所述的中草药基料是以党参、苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、连翘、败酱草、茯苓、金银花、马齿苋、车前草、鱼腥草、甘草中的2 14种原料调配混勻，经粉碎后混合，制得中草药粉剂，或者利用超声波提取其有效成分，制得中草药提取物粉剂；所述的特异性免疫球蛋白是利用猪腹泻致病性大肠杆菌、魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌制备的单价或多价灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋再经过消毒、分离纯化工艺制备而成的，或由上述疫苗免疫哺乳动物如猪、兔等制备的血清免疫球蛋白；经过粉碎或提取的中草药与特异性免疫球蛋白或卵黄、卵黄卵清按照一定配比与载体复合混勻而成的固体或液体制剂。所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，各中药基料重量相同。所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，复合制剂为粉剂、水剂、颗粒或其他剂型，可以做饲料添加剂和各种药剂。所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，中草药基料采用粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的提取物，在复合制剂中加入的比例为1 99%。所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，特异性卵黄免疫球蛋白为提取，或特异免疫鸡蛋经过消毒后直接打蛋，利用蛋清蛋黄或只用蛋黄，再与权利3中的中草药混合，在复合制剂中加入的比例为0. 1 99%。所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，利用猪腹泻致病性大肠杆菌、魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌等制备的单价或多价灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋采用分离纯化工艺制备而成的。所述的防治猪腹泻中草药免疫球蛋白复合制剂的制备方法，载体包括有机载体与无机载体。1.通过应用猪致病性大肠杆菌K88、K99、9879、F41疫苗免疫蛋鸡，制备了鸡抗猪大肠杆菌特异性高免卵黄免疫球蛋白或特异性血清免疫球蛋白。应用平板式膜超滤技术对卵黄中的免疫球蛋白进行分离，采用真空冷冻干燥工艺，制备了卵黄免疫球蛋白粉剂。2.确定了中草药处方组成，利用超声波技术对中草药进行了提取，采用真空冷冻干燥工艺，制备了中草药粉剂。利用中草药粉剂小鼠腹泻模型进行了治疗性试验；对不同配比的中草药卵黄免疫球蛋白饲料添加剂进行了体外抑菌试验，确定了最佳配比，研制了中草药卵黄免疫球蛋白饲料添加剂(仔猪腹泻康)产品，对早期断奶仔猪腹泻进行了治疗性试验研究。3.本发明创新之处一是研制了中草药卵黄免疫球蛋白复合饲料添加剂新型产品；二是建立了中草药与卵黄免疫球蛋白提取工艺。4.在卵黄免疫球蛋白的提取方法、卵黄免疫球蛋白与中草药组合形成的添加剂配方两方面具有创新，研究成果达到了国内领先水平。5.原料来源广泛，可再生；工艺流程简单，条件温和；整个制备工艺无任何废水、 废气废液产生，无环境污染。6.本发明综合了中草药与免疫球蛋白的优点，是一种新型的抗生素替代品，具有增强机体抗菌、免疫功能，可抑制致病性大肠杆菌等肠道致病菌的生长，是维持仔猪健康所必需。具有创新性，可以替代抗生素，有广阔的市场前景。
具体实施方式
实施例1 原料中草药提取物、卵黄免疫球蛋白、载体1. 1中草药提取物制备按照白头翁、金银花、马齿苋、苦参、车前草、马齿苋、鱼腥草、甘草等中草药 1:1:1:1:1:1:1: 1的重量比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60 90min。超声波频率采用20 40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。1. 2卵黄免疫球蛋白制备1.2. 1鸡蛋免疫制备选择健康产蛋母鸡，用市购或自制的大肠杆菌多价疫苗(如 K88、K99、987P、F41多价疫苗)对蛋鸡胸部肌肉分别多点注射，0. 5mL/只，每周免疫一次，三次免疫后，免疫球蛋白水平达到高效价后，收集鸡蛋(即高免蛋)。1. 2. 2卵黄免疫球蛋白提取方法(以乙酸-乙酸钠缓冲液方法为例)高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0. 5%新洁尔灭溶液中，浸泡lOmin， 再用75%的酒精冲洗，无菌打破蛋壳，倒入消毒好的容器中，用灭菌勺分离出卵黄放入无菌容器。1体积蛋黄加9体积的乙酸-乙酸钠缓冲液(0. 05mol/L, pH为5. 0)，二者搅拌时间为15min，混勻，4°C，静置10h。离心(1900r/min，10°C，IOmin)，弃沉淀。收集沉淀，将沉淀溶于25mmol/L，NaCI溶液中使其成为均一的悬浮液，4°C下滤纸过滤除去其中的脂蛋白沉淀，收集滤液(含有卵黄免疫球蛋白的水溶性蛋白组分-WSF)，得到卵黄免疫球蛋白粗提物冷冻真空干燥一测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性一制成卵黄免疫球蛋白制剂1.3.中药免疫球蛋白复合制剂制备1.3. 1按照中草药提取粉剂、卵黄免疫球蛋白粉剂干粉与玉米芯载体1 0.5 2 的重量比例，先将中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂按比例加入到混合机，混合lmin， 再加入载体混合細in，即得中药免疫球蛋白复合制剂。1. 3. 2利用超声波提取中草药有效成分，合并滤液，浓缩至原液浓度为lg/mL。将制得的中草药液体提取物与液体卵黄免疫球蛋白按照11重量比例混合一制成中草药免疫球蛋白液体一然后采用微波灭菌(温度75 80°C，时间3 8min)—测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性一装瓶处理后一成品。实施例2 原料中草药提取物、卵黄、载体2.1.中草药提取物制备将中草药以党参、白头翁、黄芪、板蓝根、败酱草 1:1:1:1: 1的重量比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合后，用水做溶剂，浸泡时间是 60 90min后，再利用超声波仪器，进行超声波处理，超声波频率采用20 40kHz，超声波处理30min ；过滤后，再经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂，得到中草药提取物组合物的有效成分。2. 2卵黄制备取新鲜高免蛋经过75%的酒精消毒后，再人工打蛋方法得到蛋黄液或通过蛋清/ 蛋黄分离器得到蛋黄液。2. 3中草药与卵黄复合制剂制备将上述2. 1中的中草药提取物与卵黄按照重量比1 1的进行混合后一添加20 80%重量比例的脱脂米糠与0. 5%重量比例的抗氧化剂BHT —混合机混合％iin，混勻后一紫外线灭菌Imin —利用真空包装机进行真空包装一中草药免疫球蛋白粉剂产品。实施例3 原料中草药提取物、卵黄、卵清、载体3. 1中草药提取物制备将中草药以苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、败酱草、甘草1 1 1 1 1 1 1的重量比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60 90min。超声波频率采用20 40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。3. 2卵黄、卵清制备取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳。3. 3中草药卵黄卵清制剂制备将制得的中草药提取物与卵黄和卵清按照1 1的重量比例进行配比一添加 20 60%重量比例的白碳黑，通过混合机混勻一灭菌一中草药免疫球蛋白粉剂一测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性一真空包装一成品实施例4 原料中草药微粉碎或超微粉碎、卵黄免疫球蛋白、载体4. 1中草药微粉碎或超微粉碎按照苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、败酱草、鱼腥草、甘草等中草药 1:1:1:1:1:1:1: 1的重量比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，制备中草药粉剂。4. 2卵黄免疫球蛋白制备(采用水稀释法)高免蛋先用清水洗去蛋壳表面的污物，浸入0.5%新洁尔灭溶液中，浸泡lOmin， 再用75%的酒精冲洗，无菌打破蛋壳。分离蛋清与卵黄，卵黄加9倍无菌水稀释，用HCI调节pH5. 2稀释液混合后，于4°C冷藏证，在4°C IOOOg条件下离心lh，上清液加入饱和硫酸铵及硫酸钠盐析沉淀，离心后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥，即得粗提卵黄免疫球蛋白。4. 3中药免疫球蛋白复合制剂制备按照中草药提取粉剂、卵黄免疫球蛋白粉剂干粉与玉米芯载体1 0.5 2的重量比例，先将中草药提取粉剂与卵黄免疫球蛋白粉剂按比例加入到混合机，混合lmin，添加 20 60%白碳黑，通过混合机混勻^iin —灭菌一中草药免疫球蛋白粉剂一真空包装一成
P
BFI ο实施例5 原料中草药微粉碎或超微粉碎、卵黄、载体5. 1中草药提取物制备按照白头翁、金银花、白头翁、苦参、车前草、黄芪、鱼腥草、甘草等中草药 1:1:1:1:1:1:1: 1的重量比例混合，利用微粉碎机粉碎后混合，再利用超声波提取其有效成分，提取前的浸泡时间是60 90min。超声波频率采用20 40kHz，超声波处理30min。过滤后，经过低温冷冻干燥机或喷雾干燥制成粉剂。5. 2卵黄制备取新鲜高免蛋消毒后，人工打蛋取卵黄或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。
5. 3中草药与卵黄复合制剂制备按照中草药提取物与卵黄重量比1 1的重量比例进行混合后一添加20 80% 脱脂米糠与0. 5%抗氧化剂一通过混合机混合^iin —灭菌一真空包装一中草药免疫球蛋白粉剂产品。实施例6 原料中草药微粉碎或超微粉碎、卵黄卵清、载体6.1按照苦参、白头翁、黄连、车前草等中草药1 :1:1:1:1: 1的重量比例混合，利用超微粉碎或微粉碎机粉碎后混合，制得中草药粉剂。6. 2卵黄卵清制备取新鲜高免蛋消毒后，打蛋取卵黄蛋清，除去蛋壳或通过蛋清/蛋黄分离器得到蛋黄液。6. 3中草药卵黄卵清制剂制备将制得的中草药粉剂与卵黄蛋清按照1 1的重量比例进行配比一添加20 60%重量比例的白碳黑，通过混合机混勻一灭菌一中草药免疫球蛋白粉剂一测定卵黄免疫球蛋白的含量和活性一真空包装一成品需要说明的是，本发明的中草药还可以选自党参、苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、连翘、败酱草、茯苓、金银花、马齿苋、车前草、鱼腥草、甘草中的2 14种原料，按照各种原料等重量的原则调配混勻而成。实施例7 中药免疫球蛋白复合剂的应用采用拌料、饮水或灌服。仔猪黄痢临床应用剂量3. 5g/d.头；仔猪白痢临床应用剂量7. Og/d.头。中药免疫球蛋白复合剂采用实施例1的方法制得。(一 )中药免疫球蛋白复合剂治疗仔猪黄痢临床试验将自然感染确诊为仔猪黄痢的病猪80头随机分为4组，每组20头。药物的高、中、 低剂量组分别每头灌服5g、3. 5g、2g中药免疫球蛋白复合剂，药物对照组灌服3. 5g白头翁散，每天2次，连续3d。给药后每天观察病猪记录精神、食欲和下痢情况，观察至停药后第7 天统计疗效；分别于给药前和停药后第2天采集血样测定血红蛋白(HB)、红细胞(RBC)总数、白细胞(WBC)总数的变化。结果显示中药免疫球蛋白复合剂高、中剂量组的治愈率分别为95%、85%，显著高于药物对照组(70%)和药物低剂量组。药物高、中剂量组的病猪数迅速减少，症状迅速减轻，高剂量组的治愈率和总有效率最高，其次为中剂量组，两组显著高于低剂量组和药物对照组，两组之间的差异不显著；治疗后各组Hb含量和RBC总数有所升高、WBC有所降低， 但无显著性差异(P >0.05)。表明中药免疫球蛋白复合剂高、中剂量组对仔猪黄痢有较好的疗效，推荐中剂量(3. 5g/头)为临床应用剂量。( 二)中药免疫球蛋白复合剂治疗仔猪白痢临床疗效试验将自然感染确诊为仔猪白痢的病猪(10 20日龄)80头随机分为4组，每组20 头。药物的高、中、低剂量组分别每头灌服10g、7g、4g中药免疫球蛋白复合剂，药物对照组每头灌服12g白头翁散，每天2次，连续3d。给药后每天观察病猪记录精神、食欲和下痢情况，观察至停药后第7天统计疗效；分别于给药前和停药后第2天采集血样测定血红蛋白、 红细胞(RBC)总数、白细胞(WBC)总数的变化。观察“中药免疫球蛋白复合剂”对患病仔猪的临床治疗结果。结果显示中药免疫球蛋白复合剂高、中剂量组的治愈率分别为95%、 90%，显著高于药物对照组(80%)和药物低剂量组。白痢仔猪经“中药免疫球蛋白复合剂” 和白头翁散治疗后，病原体感染百分率降低，治疗仔猪白痢前后，红细胞数量、血红蛋白量升高，白细胞总数下降。高剂量组与中剂量组的效果最佳，但二者无显著差异。结果表明， 中药免疫球蛋白复合剂高、中剂量组对仔猪白痢有较好的疗效。推荐中剂量(7g/d.头)为临床应用剂量。 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，该中药免疫球蛋白复合剂是在中草药基料基础上添加特异性卵黄免疫球蛋白而制成的，所述的中草药基料是以党参、 苦参、白头翁、黄连、黄芪、板蓝根、连翘、败酱草、茯苓、金银花、马齿苋、车前草、鱼腥草、甘草中的2 14种原料调配混勻，经粉碎后混合，制得中草药粉剂，或者利用超声波提取其有效成分，制得中草药提取物粉剂；所述的特异性免疫球蛋白是利用猪腹泻致病性大肠杆菌、 魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌制备的单价或多价灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋再经过消毒、分离纯化工艺制备而成的，或由上述疫苗免疫哺乳动物如猪、兔等制备的血清免疫球蛋白；经过粉碎或提取的中草药与特异性免疫球蛋白或卵黄、卵黄卵清按照一定配比与载体复合混勻而成的固体或液体制剂。
2.根据权利要求1所述的中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，其特征在于，各中药基料重量相同。
3.根据权利要求1所述的中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，其特征在于，复合制剂为粉剂、水剂、颗粒或其他剂型，可以做饲料添加剂和各种药剂。
4.根据权利要求1所述的中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，，其特征在于，中草药基料采用粉碎、微粉碎、超微粉碎，或粉碎后的提取物，在复合制剂中加入的比例为1 99%。
5.根据权利要求1所述的中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，其特征在于，特异性卵黄免疫球蛋白为提取，或特异免疫鸡蛋经过消毒后直接打蛋，利用蛋清蛋黄或只用蛋黄，再与所述中草药混合，在复合制剂中加入的比例为0. 1 99%。
6.根据权利要求1所述的中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，其特征在于，利用猪腹泻致病性大肠杆菌、魏氏梭菌和轮状病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒以及产气荚膜梭菌等制备的单价或多价灭活疫苗免疫蛋鸡，其免疫鸡蛋采用分离纯化工艺制备而成的。
7.根据权利要求1所述的中药免疫球蛋白复合剂的制备方法，其特征在于，其特征在于，载体包括有机载体与无机载体。
8.中药免疫球蛋白复合剂作为防治猪腹泻药物的应用。
全文摘要
本发明公开了特效防治猪腹泻免疫球蛋白复合制剂的生产方法。本发明涉及兽药与饲料添加剂领域。本发明是用特异性免疫球蛋白或含有特异性免疫球蛋白的未提取物按一定配比添加部分提取物或粉体等混匀而成。本发明综合了免疫球蛋白提取物或粉体的优点，形成了新型的抗生素替代品，达到标本兼治，可以加快腹泻动物的康复，达到防病与治病目的，同时还降低了成本。是一种安全、无激素的绿色产品，对猪腹泻有特效。采用拌料或饮水。本发明特别适用于猪腹泻的预防和治疗，同时也适用于各种家禽、家畜等动物腹泻疾病的防治。
文档编号A61K9/14GK102302778SQ201110287088
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者方圆, 方希修, 杨廷桂, 王冬梅 申请人:方希修