专利名称：N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及壳聚糖的合成及其负载疫苗纳米粒的制备方法。
背景技术：
壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的产物，是一种天然可再生资源。壳聚糖的化学名称为聚(2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖)。一般而言，甲壳素脱乙酰度在55%以上就可称为壳聚糖。甲壳素广泛存在于低等动植物特别是节肢动物的甲壳中，世界每年可生物合成甲壳素达100亿吨之多，被誉为仅次于纤维素的第二大天然高分子聚合物。因此，壳聚糖是一种总量很大，目前尚未得到充分利用的天然资源。制备纳米载药粒子的过程中，选择包裹药物的基质材料极为重要。壳聚糖作为自然界唯一带有阳离子的天然多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、生物可降解性以及抗菌等特殊功能，广泛应用于医药、功能材料等领域，近年来，在纳米载药、载基因体系中备受关注。但由于壳聚糖的水溶性差，在一定程度上限制了它的应用，对壳聚糖进行化学改性， 可改善它的水溶性、生物活性及力学性能，拓展壳聚糖在上述各领域中的应用。壳聚糖能溶于酸性溶液中，形成直链聚阳离子，但在中性及碱性条件下，壳聚糖不溶于水。壳聚糖分子结构中除了含-OH外，还有活泼的-ΝΗ2。在-OH或-NH2上引入活性基团，能改善壳聚糖的溶解性和生物活性。本发明通过对壳聚糖进行化学改性，引入亲水性强的羟丙基三甲基氯化铵基团，制备N上取代的羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，改善了壳聚糖的水溶性，保持了分子的阳离子性能。Ν-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖由于具备永久正电性和生理环境下的水溶性，可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲水性大分子的转运，提高纳米粒的摄取率。纳米级聚合物粒子通常定义为直径在lO-lOOOnm，N_2_羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒子作为药物控释载体具有其独特的优势，不仅具有良好的生物相容性，药物包封率高，载药量大，高效的药物利用率，稳定性强和释药时间长及改变给药途径等优点，而且还由于N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖具有可溶性，带正电性和附着在生物体粘膜表面所具有的独特的特点，使得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒子适用于具有生物活性大分子药物的包埋和释放，如多肽、蛋白质、核酸、疫苗等。
发明内容
本发明提供了 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现一、将50g脱乙酰度为85%的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在90 120°C下回流搅拌反应lh，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH 的异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1. 5 8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖；二、将2 3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100 150mL体积浓度为1 3%乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500 lOOOr/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0. 1 2mol/L NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH至8 9并有白色沉淀析出，浸泡他后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15 20mL 异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；三、在N2保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75 85°C，每隔浊逐滴加入 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8 14h 后将烧瓶冷却至室温，加入150 300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0. 5h后抽滤，冷冻干燥 24h,完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖； 四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥Mh，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15% 40%，异丁醇的量为每克壳聚糖加入10 30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为Ig 2!^;步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2 27g ；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为Ig 25mL。用上述方法合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实现一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为0. 5 ang/mL的溶液，然后取5mL并滴加1. 25 7. 5mL新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A ；二、溶液A在室温、无菌条件下以900 1300r/min磁力搅拌30s，然后滴加2. 5mL 浓度为0. 5 ;3mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min， 再滴加ImL的PBS，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min，然后滴加ImL的司班-80，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min，获得溶液B ；三、将溶液B于4°C、12000r/min离心2min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入 15mL浓度为0. Olmol/L的PBS悬浮，再加入2mL质量浓度为1 %海藻糖脱脂奶，真空冷冻干燥Mh，获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为 NDV-N-2-HACC-NPs)，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液，蛋白含量为620μ g/mL，血凝价为1 1024，病毒粒子的粒径为20 300nm;步骤二中司班-80在 1400r/min 下乳化 30min。本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成，是将2，3_环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)连接到壳聚糖的氨基上，具有原料易得(2，3-环氧丙基三甲基氯化铵已实现工业化生产)、操作简单、成本低等优点。本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒，使其作为口服递送载体，具备了永久正电性和生理环境下的水溶性，可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲水性载药纳米粒子的转运，提高纳米粒的摄取率。与壳聚糖纳米粒子相比，本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，其粒径容易控制，制备的载药纳米粒粒径小，包封率高(40% 90% )、 载药量大(20% 70%)、制备条件温和、药物毒副作用低、缓释时间长。本发明制备工艺简单，生产成本较低，易于规模化生产。本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，其中病毒含量为106__5EID5Q/0. lmL，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液标准。本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒可用于鸡新城疫免疫，经口服给药，给药量为每只鸡0. 5mL。
图1是具体实施方式
一中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的主要反应过程图；图2是具体实施方式
一中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与现有壳聚糖的傅立叶转换红外线光谱分析图，其中HACC为N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，chitosan 为壳聚糖；图3是具体实施方式
一中现有壳聚糖的屯NMR谱图；图4是具体实施方式
一中 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的屮NMR谱图；图5是具体实施方式
一中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的13C NMR谱图；图具体实施方式
一中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和壳聚糖溶液的透光率对PH的依赖关系图，其中HACC为N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，chitosan为壳聚糖；图具体实施方式
五中制备的新城疫减毒活疫苗N_2_羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的透射电镜图；图8具体实施方式
五中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的透射电镜图；图9具体实施方式
五中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的&切电位图；图10具体实施方式
五中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的粒径分布图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现一、将50g脱乙酰度为85%的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在90 120°C下回流搅拌反应lh，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH 的异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1. 5 8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖；二、将2 3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100 150mL体积浓度为1 3%乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500 lOOOr/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0. 1 2mol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8 9并有白色沉淀析出，浸泡他后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15 20mL异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；三、在队保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75 85°C，每隔浊逐滴加入 2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8 14h 后将烧瓶冷却至室温，加入150 300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0. 5h后抽滤，冷冻干燥 24h,完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥Mh，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15% 40%，异丁醇的量为每克壳聚糖加入10 30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为Ig 2!^;步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2 27g ；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为Ig 25mL。本实施方式步骤四中完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成后可进行分装，充入队密封室温保存。本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的主要反应过程如图1所示；本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与现有壳聚糖相比较，其傅立叶转换红外线光谱分析如图2所示，可见N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的氨基的伸缩振动峰减弱，在HSOcnT1处出现-CH3的C-H弯曲振动强吸收峰，表明引入了羟丙基三甲基氯化铵的季铵盐侧链。壳聚糖的屮NMR谱图如图3所示，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的屮NMR谱图如图4所示，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的13C NMR谱图如图5所示， 表明其结构与预期结构相符。实施例1 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现一、将50g脱乙酰度为85%的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在110°C 下回流搅拌反应lh，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mLNa0H的异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1. 5h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖；二、将3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于150mL体积浓度为2%乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在750r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为 0. lmol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8. 8并有白色沉淀析出，浸泡他后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入20mL异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；三、在队保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至80°C，每隔浊逐滴加入2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应1 后将烧瓶冷却至室温，加入300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0. 5h后抽滤，冷冻干燥Mh，完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥Mh，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为20%，异丁醇的量为每克壳聚糖加入20mL异丁醇；步骤三中2，3_环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3_环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为Ig 2mL;步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为3g ；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为Ig 25mL。本实施方式步骤一中获得脱乙酰处理的壳聚糖的脱乙酰度为95%。本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，经取代度测定，取代度为34%。合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和壳聚糖溶液的透光率对pH的依赖关系如6所示，结果表明，壳聚糖在酸溶液中溶解性良好，但在pH > 6. 5的溶液中急剧下降， 而N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖在水中的溶解性随pH变化较小，说明壳聚糖改性为 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖后其溶解性得到了改善。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同是步骤一中壳聚糖的分子量为71. 3。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同是步骤二中将2. 5g脱乙酰处理的壳聚糖溶于120mL体积浓度为2%乙酸溶液中。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同是步骤三中冷藏处理的无水乙醇的温度为4°C。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式用具体实施方式
一合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实现—、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为0. 5 ang/mL的溶液，然后取5mL并滴加1. 25 7. 5mL新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A ；二、溶液A在室温、无菌条件下以900 1300r/min磁力搅拌30s，然后滴加2. 5mL 浓度为0. 5 ;3mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min， 再滴加ImL的PBS，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min，然后滴加ImL的司班-80，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min，获得溶液B ；三、将溶液B于4°C、12000r/min离心2min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入 15mL浓度为0. 01mol/L的PBS悬浮，再加入2mL质量浓度为1 %的海藻糖脱脂奶，真空冷冻干燥Mh，获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为 NDV-N-2-HACC-NPs)，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液，蛋白含量为620μ g/mL，血凝价为1 1024，病毒粒子的粒径为20 300nm;步骤二中司班-80在 1400r/min 下乳化 30min。
本实施方式步骤二中三聚磷酸钠作为交联剂使用。本实施方式步骤二中滴加ImL的PBS，使其在溶液B中的终浓度为0. 01mol/L ；步骤二中滴加ImL的司班-80，使其在溶液B中的含量为1/104。本实施方式中新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的最大包封率可达90 %，最大载药量为70 %。本实施方式中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，其kta电位为35 70mV，粒径为200 900nm。实施例2 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实现一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为lmg/mL的溶液，然后取5mL 并滴加6. 25mL新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A ；二、溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30s，然后滴加2. 5mL浓度为 lmg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌5min，再滴加ImL的PBS，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌5min，然后滴加ImL的司班-80，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌5min，获得溶液B ；三、将溶液B于4°C、12000r/min离心2min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入 15mL浓度为0. 01mol/L的PBS悬浮，再加入2mL质量浓度为1 %海藻糖脱脂奶，真空冷冻干燥Mh，获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为 NDV-N-2-HACC-NPs)，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液，蛋白含量为620μ g/mL，血凝价为1 1024，病毒粒子的粒径为20 300nm;步骤二中司班-80在 1400r/min 下乳化 30min。本实施方式中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，其透射电镜图见图7和8 ；Zeta电位见图9，Zeta电位为43 46mV ；粒径分布图见图 10,粒径为250 600nm。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五的不同是步骤一中取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为1. 5mg/mL的溶液，然后取5mL并滴加7mL新城疫病毒液。其它步骤及参数与具体实施方式
五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
五的不同是步骤二中溶液A在室温、无菌条件下以llOOr/min磁力搅拌30s，然后滴加2. 5mL浓度为ang/mL的三聚磷酸钠。 其它步骤及参数与具体实施方式
五相同。
权利要求
1.N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成，其特征在于合成方法按以下步骤实现一、将50g脱乙酰度为85%的壳聚糖分散在200mLNaOH的异丁醇溶液中，在90 120°C下回流搅拌反应lh，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH 的异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1. 5 8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖；二、将2 3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100 150mL体积浓度为1 3%乙酸溶液中， 搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500 lOOOr/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0. 1 2mol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8 9并有白色沉淀析出，浸泡他后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15 20mL异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；三、在队保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75 85°C，每隔2h逐滴加入2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8 14h 后将烧瓶冷却至室温，加入150 300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0. 5h后抽滤，冷冻干燥 24h,完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥Mh，即完成 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15% 40%，异丁醇的量为每克壳聚糖加入10 30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2， 3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为Ig 2mL;步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2 27g ；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为Ig 25mL。
2.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成，其特征在于步骤一中步骤一中壳聚糖的分子量为71. 3。
3.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成，其特征在于步骤二中将2. 5g脱乙酰处理的壳聚糖溶于120mL体积浓度为2%乙酸溶液中。
4.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成，其特征在于步骤三中冷藏处理的无水乙醇的温度为4°C。
5.用权利要求1合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于方法按以下步骤实现一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为0.5 ang/mL的溶液，然后取 5mL并滴加1. 25 7. 5mL新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A ；二、溶液A在室温、无菌条件下以900 1300r/min磁力搅拌30s，然后滴加2.5mL浓度为0. 5 ;3mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min，再滴加 ImL的PBS，维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min，然后滴加ImL的司班-80， 维持在5min内勻速滴完，继续磁力搅拌8 30min，获得溶液B ；三、将溶液B于4°C、12000r/min离心2min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入15mL浓度为0. Olmol/L的PBS悬浮，再加入2mL质量浓度为1 %海藻糖脱脂奶，真空冷冻干燥Mh，获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液，蛋白含量为620μ g/mL，血凝价为1 1024，病毒粒子的粒径为20 300nm;步骤二中司班-80在 1400r/min 下乳化 30min。
6.根据权利要求5所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为 1. 5mg/mL的溶液，然后取5mL并滴加7mL新城疫病毒液。
7.根据权利要求5所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中溶液A在室温、无菌条件下以llOOr/min磁力搅拌 30s，然后滴加2. 5mL浓度为ang/mL的三聚磷酸钠。
全文摘要
N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，它涉及壳聚糖的合成及其负载疫苗纳米粒的制备方法。合成脱乙酰处理的壳聚糖；壳聚糖的浸泡处理；粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；精制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。制备N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中加新城疫病毒液，获得溶液A；溶液A中加三聚磷酸钠，PBS和司班-80，获得溶液B；将溶液B离心取沉淀并加PBS悬浮，加海藻糖脱脂奶，冷冻干燥后即完成。本发明制备的纳米粒，粒径容易控制，载药纳米粒粒径小，包封率高、载药量大、制备条件温和、药物毒副作用低、缓释时间长，制备工艺简单，生产成本较低，易于规模化生产。
文档编号A61P31/14GK102432695SQ20111033384
公开日2012年5月2日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者张旭, 赵凯, 金政, 陈刚 申请人:黑龙江大学