专利名称：Plga修饰磁性纳米簇及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种医用药物治疗材料和功能材料、及其制备方法，尤其涉及一种具有缓释功能的PLGA修饰的磁性纳米簇、及其制备方法和应用。
背景技术：
基因治疗是将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的，也就是将外源基因通过基因转移技术将其整合到病人的适当的受体细胞中，使外源基因表达的遗传产物能治疗某种疾病；广义概念的基因治疗，指的是将某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗疾病的目的。早在1991年，中国科学家首先进行了世界首例血友病的基因治疗临床实验，随后，我国科学家利用胸腺激酶基因治疗恶性脑胶质瘤基因治疗方案获准进入I期临床试验，初步的观察表明:生存期超过I年以上者占55%，其中I例已超过三年半，至今仍未见肿瘤复发。此外，采用血管内皮生长因子基因治疗外周梗塞性下肢血管病基因治疗方案也已获准进入临床试验。基因治疗技术需要将遗传物质组装在基因载体上，一般采用病毒介导基因转移，即以病毒为载体，将遗传物质通过基因重组等技术组装于病毒上，然后使重组病毒感染受体宿主细胞。其中，反转录病毒载体具有穿透细胞的能力，可使近100%的受体细胞被感染，转化细胞效率高；其次，它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；再者随机整合的病毒可长期存留，一般无害于细胞；如崔媛媛等(《西安交通大学学报(医学版)》，2007年第6期,第624 625页)公开了源于moloney小鼠白血病病毒的pLSXN反转录病毒载体，制备出介导β -分泌酶底物肽基因表达的反转录病毒载体；专利W001/90390A1公开了一种杆状病毒载体，可用于血管病的基因治疗；专利US20020064520A1还公开了一种用于基因治疗的组合物，以重组病毒颗粒为核心，制成基因导入载体。但反转录病毒载体也存在诸多缺点:这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元；最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性，加上病毒载体在宿主细胞基因组随机插上，人们更是担心其临床应用的安全性。此外广义的基因载体包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、孢疹病毒等病毒载体，同样地，该类病毒载体也存在毒副作用，并且一般认为难以改造成缺陷型病毒，以除去病毒基因和癌基因。并且，用于基因治疗的遗传物质都在在体外和体内不稳定，非常容易被酶等降解，理想的载体系统除了具备安全性外，还应当具有如下特征:可提供长期可控制的持续基因表达，并且能够大规模工业化生产。目前来看，充分发挥基因治疗巨大潜力的障碍仍然是缺乏理想的载体系统，因此，如何制备安全性高、缓释效果好的基因载体一直是基因治疗领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以缓释遗传物质的PLGA修饰的磁性纳米簇，PLGA于磁性纳米粒子交联，将遗传物质包裹，形成的复合结构既能保护遗传物质，又能实现缓释目的，并解决了磁性纳米粒子容易团聚的问题，为基因治疗提供了一种可工业化的基因载体。本发明的第一个目的是提供一种PLGA修饰的磁性纳米簇，包括乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA, Ploylactide-co-glycolide)和能够与所述PLGA交联的磁性纳米颗粒；所述PLGA与所述磁性纳米颗粒交联结合。本发明第二个目的是提供一种所述PLGA修饰的磁性纳米簇组成的纳米簇团，优选地，所述每个纳米簇团由1(Γ20个所述纳米簇组成。本发明的第三个目的是提供一种上述PLGA修饰的磁性纳米簇制备的基因载体材料。其中，所述PLGA修饰的磁性纳米簇粒径优选为7(T300nm,进一步优选为10(T250nm，更优选为 100 200nm。其中，所述PLGA与所述纳米颗粒摩尔比优选为1:5 20，进一步优选为1:5 15 ;更优选为1:10 15。其中，所述PLGA优选为医学上可用的PLGA材料，并且分子量优选为3 X IO3 7 X 104，进一步优选为4父103 6父104，更优选为4 X IO3飞.5 X IO4。所述磁性纳米颗粒可以是任意与所述PLGA交联的磁性纳米颗粒或其组合，如铁、钴、镍、及其氧化物，优选为铁氧体(CoFe2O3和/或BaFe 12019 )、氧化铬(CrO2 )、四氧化三铁(Fe3O4 )、二氧化钴 (CoO2)、或上述物质的任意组合。所述磁性纳米颗粒粒径优选为5 50nm,进一步优选为l(T35nm，更优选为20 25nm。根据本发明所述PLGA修饰的磁性纳米簇，其中，还可以包括用于基因治疗的遗传物质，包括DNA和/或RNA,并优选为siRNA( short interference RNA,小干扰RNA)。所述遗传物质可以负载于载体中。其中，所述遗传物质与PLGA摩尔比优选为1:0.05 0.5，进一步优选为1:0.Γθ.5 ；更优选为1:0.Γ0.2。本发明第四个目的是提供一种上述PLGA修饰的磁性纳米簇的制备方法，步骤包括:
步骤I，制备水相磁性纳米颗粒；
步骤2，所述水相磁性纳米颗粒与PLGA和遗传物质混合反应，使磁性纳米颗粒与PLGA交联形成团簇将所述遗传物质包裹在所述团簇结果中，收集制备的PLGA修饰的磁性纳米簇。其中，所述磁性纳米颗粒可以是任意与所述PLGA交联的磁性纳米颗粒或其组合，如铁、钴、镍、及其氧化物，优选为铁氧体(CoFe2O3和/或BaFe12O19X氧化铬(CrO2)、四氧化三铁(Fe304)、二氧化钴(Co02)、或上述物质的任意组合。所述磁性纳米颗粒粒径优选为5 50nm，进一步优选为l(T35nm，更优选为20 25nm。其中，所述PLGA优选为医用级PLGA材料，分子量优选为3 X 103 7 X 104，进一步优选为4 X IO3 6 X IO4,更优选为4 X IO3 5.5 X IO4。
所述遗传物质包括DNA和/或RNA,并优选为siRNA (short interference RNA,小干扰RNA)。所述遗传物质可以负载于载体中。所述PLGA、遗传物质、以及所述纳米颗粒摩尔比优选为1:0.05、.5:5 20，进一步优选为I:0.1 0.5:5 15 ;更优选为I:0.1 0.2:10 15。根据本发明所述PLGA修饰的磁性纳米簇的制备方法的一种优选实施方式，步骤2中，PLGA与所述遗传物质混合匀化制成初乳，然后与到所述水相磁性纳米颗粒混合反应。本发明上述的PLGA修饰的磁性纳米簇的制备方法，PLGA与磁性纳米颗粒交联时的反应温度优选控制在1(T150°C，进一步优选为2(Tl00°C，更优选为25°C 80°C。本发明上述的PLGA修饰的磁性纳米簇的制备方法，PLGA与磁性纳米颗粒交联时的反应PH值优选控制在4 14，进一步优选为5 13，更优选为5.5 7。本发明上述的PLGA修饰的磁性纳米簇的制备方法，其中，PLGA与所述遗传物质混合匀化时间优选控制在0.5 10h，进一步优选为l 8h，更优选为2 6h。根据本发明所述PLGA修饰的磁性纳米簇的制备方法的进一步优选实施方式，所述PLGA与所述遗传物质混合匀在搅拌下进行，搅拌速度优选控制在40(Tl5000r/m，进一步优选为 50(Tl300r/m，更优选为 60(Tl200r/m。更优选地，所述混合匀在漩涡混合设备中进行，并且漩涡混合速度优选为中速。本发明PLGA修饰的磁性纳米簇表面光滑，颗粒规则无粘连；并且包封率高，遗传物质缓释期可达2周；具有水溶性，和良好的稳定性、生物相容性。本发明PLGA修饰的 磁性纳米簇，可用作MRI造影剂和基因载体材料，体内稳定，降解期可调控。 本发明制备方法操作简单，条件温和，成本低，并且对环境友好。
图1为本发明PLGA修饰的磁性纳米簇团结构示意 图2和图3为本发明制备的PLGA修饰磁性纳米簇电镜照片；
图4本发明PLGA修饰磁性纳米簇组成的磁性纳米簇团电镜照片；
图5为本发明PLGA修饰磁性纳米簇遗传物质缓释曲线。
具体实施例方式本发明提供了一种PLGA修饰的磁性纳米簇、所述纳米簇构成的纳米簇团、基因载体材料、以及制备方法，首先制备水相磁性纳米颗粒，然后与PLGA (或加入遗传物质的混合物)与磁性纳米颗粒交联，制成PLGA修饰的磁性纳米簇组成的磁性纳米簇团。其中，PLGA优选为医用级PLGA材料，为了更好的控制降解和遗传物质缓释速度、以及加工性能，分子量优选为3X IO3 7X 104，进一步优选为4X IO3 6X 104，更优选为4X103 5.5X104。所述遗传物质可以是任意用于基因治疗的遗传物质，如DNA和RNA等。所述磁性纳米颗粒可以是任意与所述PLGA交联的磁性纳米颗粒或其组合，如铁、钴、镍、及其氧化物，优选为铁氧体(CoFe2O3和/或BaFe12O19X氧化铬(CrO2)、四氧化三铁(Fe304)、二氧化钴(CoO2)或上述物质的任意组合。为了更好的控制制备的PLGA修饰的磁性纳米簇的稳定性和缓解周期，所述磁性纳米颗粒粒径优选为5 50nm，进一步优选为l(T35nm，更优选为 2(T25nm。为了安全、有效的使用，遗传物质浓度不宜过低或过高，所述PLGA、遗传物质、以及所述纳米颗粒摩尔比优选为1:0.05、.5:5 20，进一步优选为1:0.Γθ.5:5^15 ;更优选为
1:0.Γθ.2:10 15。为了更快的进行交联反应，交联反应温度一般控制在1(T150°C，进一步优选为2(TlO(rC，更优选为25°C 80°C。交联反应体系pH值不宜酸性过强，一般在彡4，进一步优选为5 13，更优选为5.5 7。当PLGA与遗传物质混合后再与磁性纳米颗粒反应的情况下，混合应当尽可能均匀，一般在40(Tl5000r/m (进一步优选为50(Tl300r/m，更优选为60(Tl200r/m)搅拌速度下，混合匀化0.5 IOh (进一步优选为l 8h，更优选为2飞h)即可。总所周知，磁性纳米材料随着粒径的增加，体外稳定性越差，越容易发生团聚现象，不宜长时间保存，本发明制备的PLGA修饰的磁性纳米簇很好的解决了这一问题，通过形成团簇结构，不仅保留了磁性纳米粒子的特性，同时对团簇大小可进行调节控制，从而更好的控制磁力材料的稳定性和体内降解周期。下面参照附图，对本发明PLGA修饰的磁性纳米簇、所述纳米簇构成的纳米簇团、基因载体材料、以及制备方法进行详细的介绍和描述，以使更好地理解本发明，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。实施例1
传统水热法制备得到Fe3O4水相磁性纳米粒子。将Iml 0.0OlM浓度的siRNA与Iml 0.05M浓度的PLGA在磁力搅拌下混匀，滴加到Iml 0.5M浓度的Fe3O4水相磁性纳米粒子中，pH值调节至8。在25°C下磁力搅拌反应3小时，将获得的悬浮液中的纳米簇离心收集，并用无RNA酶的DEPC水洗涤数次后，常规冷冻干燥保存，得到直径100-200nm的缓释siRNA的PLGA修饰的磁性纳米簇。12天siRNA释放98.9%,缓释周期在两周左右。实施例2
传统水热法制备得到CoO2水相磁性纳米粒子。将Iml 0.0OlM的siRNA与Iml 0.05M的PLGA在磁力搅拌下混匀，然后加入Iml0.5M浓度的传统水热法得到的CoO2磁性纳米粒子，pH值调节至7。在60摄氏度下磁力搅拌反应2小时，将获得的悬浮液中的纳米簇离心收集，并用无RNA酶的DEPC水洗涤数次后，常规冷冻干燥保存，得到直径100-200nm的缓释siRNA的PLGA修饰的磁性纳米簇。12天siRNA释放98%以上，缓释周期在两周左右。实施例3
传统水热法制备得到Fe3O4水相磁性纳米粒子。将Iml 0.0OlM浓度的siRNA与Iml 0.05M浓度的PLGA在磁力搅拌下混匀，然后加入Iml 0.5M浓度的传统水热法得到的Fe3O4磁性纳米粒子，pH值调节至5.5。在60摄氏度下漩涡搅拌反应3小时，将获得的悬浮液中的纳米簇离心收集，并用无RNA酶的DEPC水洗涤数次后，常规冷冻干燥保存，得到直径100-200nm的缓释siRNA的PLGA修饰的磁性纳米簇。
12天siRNA释放99%左右，缓释周期在两周左右。实施例4
传统水热法制备得到Fe3O4水相磁性纳米粒子。将Iml 0.005M浓度的siRNA与Iml 0.0lM浓度的PLGA在磁力搅拌下混匀，然后加入Iml 0.1M浓度传统水热法得到的Fe3O4磁性纳米粒子，pH值调节至10。在60摄氏度下漩涡搅拌反应3小时，将获 得的悬浮液中的纳米簇离心收集，并用无RNA酶的DEPC水洗涤数次后，常规冷冻干燥保存，得到直径50-100nm的缓释siRNA的PLGA修饰的磁性纳米簇。12天siRNA释放99%左右，缓释周期在两周左右。实施例5
传统水热法制备得到Fe3O4水相磁性纳米粒子。将Iml 0.005M浓度的siRNA与Iml 0.0lM浓度的PLGA在磁力搅拌下混匀，然后加入Iml 0.1M浓度传统水热法得到的Fe3O4磁性纳米粒子。在50摄氏度、pH值为10的条件下，漩涡搅拌反应6小时，将获得的悬浮液中的纳米簇离心收集，并用无RNA酶的DEPC水洗涤数次后，常规冷冻干燥保存，得到直径80-150nm的缓释siRNA的PLGA修饰的磁性纳米簇。12天siRNA释放99%左右，缓释周期在两周左右。实施例6
传统水热法制备得到铁氧体水相磁性纳米粒子。将Iml 0.005M浓度的siRNA与Iml 0.0lM浓度的PLGA在磁力搅拌下混匀，然后加入Iml 0.1M浓度传统水热法得到的铁氧体磁性纳米粒子。在100摄氏度、pH值为6的条件下，漩涡搅拌反应4小时，将获得的悬浮液中的纳米簇离心收集，并用无RNA酶的DEPC水洗涤数次后，常规冷冻干燥保存，得到直径50-150nm的缓释siRNA的PLGA修饰的磁性纳米簇。12天siRNA释放99%左右，缓释周期在两周左右。实施例7
传统水热法制备得到Fe3O4水相磁性纳米粒子。将Iml 0.0OlM浓度的siRNA与Iml 0.0lM浓度的PLGA在磁力搅拌下混匀，然后加入Iml 0.5M浓度传统水热法得到的Fe3O4磁性纳米粒子。在15摄氏度、pH值为13的条件下，漩涡搅拌反应8小时，将获得的悬浮液中的纳米簇离心收集，并用无RNA酶的DEPC水洗涤数次后，常规冷冻干燥保存，得到直径100-150nm的缓释siRNA的PLGA修饰的磁性纳米簇。12天siRNA释放99%左右，缓释周期在两周左右。图2和图3给出了本发明上述实施例制备的PLGA修饰的磁性纳米簇外观电镜照片，从图中可以看出，本发明上述实施例制备的PLGA修饰的磁性纳米簇表面光滑、无粘结。图1给出了本发明上述实施例中制备的PLGA修饰的磁性纳米簇图的结构示意图，其中，空白处为PLGA材料1，曲线代表遗传物质2，黑色圆形代表磁性纳米颗粒3。图4给出了本发明上述实施例制备的PLGA修饰的磁性纳米簇组成的纳米簇团的电镜照片，从图中可以看出，所述纳米簇团由1(Γ20个纳米簇组成，并很好的解决了纳米颗粒的团聚问题。
图5为本发明实施例1制备的PLGA修饰的磁性纳米簇进行缓释效果实验得到的结果，从图中可以看出，实施例1制备的纳米簇缓释期在2周左右，12天后释放99%左右；同样地，其它实施例中制备的PLGA修饰的磁性纳米簇舒服效果相似(图中未画出)。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在 本发明的范围内。
权利要求
1.一种PLGA修饰的磁性纳米簇，其特征在于，包括乳酸/羟基乙酸共聚物和能够与所述PLGA交联的磁性纳米颗粒；所述PLGA与所述磁性纳米颗粒交联结合。
2.根据权利要求1所述的PLGA修饰的磁性纳米簇，其特征在于，所述PLGA修饰的磁性纳米簇粒径为70 300nm。
3.根据权利要求1所述的PLGA修饰的磁性纳米簇，其特征在于，所述PLGA分子量为3 X IO3 7 X 104。
4.根据权利要求1所述的PLGA修饰的磁性纳米簇，其特征在于，所述磁性纳米颗粒粒径为5 50nm。
5.根据权利要求1所述的PLGA修饰的磁性纳米簇，其特征在于，还包括用于基因治疗的遗传物质。
6.根据权利要求5所述的PLGA修饰的磁性纳米簇，其特征在于，所述PLGA、遗传物质、以及所述纳米颗粒摩尔比为1:0.05、.5:5 20。
7.—种权利要求1所述PLGA修饰的磁性纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤包括: 步骤I，制备水相磁性纳米颗粒； 步骤2，所述水相磁性纳米颗粒与PLGA和遗传物质混合反应，使磁性纳米颗粒与PLGA交联形成团簇将所述遗传物质包裹在所述团簇结果中，收集制备的PLGA修饰的磁性纳米簇。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，PLGA与磁性纳米颗粒交联时的反应温度控制在1(T150°C。
9.一种包括权利要求1所述PLGA修饰的磁性纳米簇的基因载体材料，其特征在于，包括纳米簇团，所述纳米簇团 包括权利要求1所述的PLGA修饰的磁性纳米簇。
10.根据权利要求9所述的纳米簇团，其特征在于，每个纳米簇团中包括1(Γ20个权利要求I所述的PLGA修饰的磁性纳米簇。
全文摘要
一种PLGA修饰的磁性纳米簇、及其制备方法和应用；首先制备水相磁性纳米颗粒，然后与PLGA(或加入遗传物质的混合物)与磁性纳米颗粒交联，制成PLGA修饰的磁性纳米簇组成的磁性纳米簇团。本发明制备的PLGA修饰的磁性纳米簇，解决了纳米粒子容易团聚的问题；可作为基因载体材料用于基因治疗，具有良好的缓释效果；并且本发明基因载体不涉及病毒载体，安全性能好。
文档编号A61K49/12GK103182088SQ201110446700
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者张先龙, 彭晓春, 程涛, 史思峰, 郭永园 申请人:上海市第六人民医院