专利名称：分枝杆菌抗原组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含M72相关抗原且具有低离子强度的免疫原性组合物。本发明也涉及进一步包含一种或多种免疫刺激剂的这类免疫原性组合物。还提供了用于制备这类免疫原性组合物的方法和相关的试剂盒。
背景技术：
结核病(TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和其他分枝杆菌种的感染引起的慢性传染性疾病。它是世界上发展中国家的一种主要疾病，并成为发达区域日益严重的问题。超过20亿人被认为感染了 TB杆菌，每年新增约940万TB病例和170万死亡病例。其中10%感染TB杆菌的人会发展活动性TB，每位患有活动性TB的人平均每年感染10-15个其他人。尽管在全球的每年发病率已经达到顶峰，但是由于人口增长，死亡数和病例数依然在上升(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。蛋白抗原Mtb72f和M72 (描述为，例如，国际专利申请W02006/117240中)或其片段或衍生物是具有用于治疗或预防结核病的潜在益处的蛋白抗原。为了确保能维持免疫原性，蛋白抗原的配制极端重要。有时使用免疫刺激剂以改善针对任何给定抗原而产生的免疫应答。然而，在免疫原性组合物中包含佐剂会增加成分制备的复杂性以及组合物的分布和配制的复杂性。配制者必须考虑每种佐剂成分以及抗原性成分的制备。具体而言，应当考虑抗原性成分与佐剂成分的相容性。这尤其是在预期将冻干抗原或抗原制剂与佐剂制剂重构的情况下。在这种情况下，重要的是，佐剂制剂的缓冲液对于抗原而言是合适的并且抗原的免疫原性或溶解度不会受到佐剂的影响。发明概述
本发明人已经首次鉴定M72相关抗原对盐的存在特别敏感。不受理论的限制，据信M72相关抗原受被称为“盐析”的现象的不利影响，该现象可以被定义为通过蛋白与盐如氯化钠的相互作用而从其溶液中沉淀。本发明人已经发现，当氯化钠浓度低至150mM时，这些抗原就会聚集和沉淀。因此，包含M72相关抗原的免疫原性组合物的稳定性令人惊讶地可以通过降低氯化钠浓度而改善。因此，本发明提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的导电率是13 mS/cm或更低。额外提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物中的盐浓度是130 mM或更低。本发明还提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物中的氯化钠浓度是130 mM或更低。附图简述
图1.QS21裂解活性曲线
图2.在不同ASA制剂中，每种3D-MPL同类物(congener)的百分比 图3.储存后具有不同 的pH和NaCl浓度的免疫原性组合物的DLS 图4.储存后具有不同的pH和NaCl浓度的免疫原性组合物的浊度测定图5.储存后具有不同的pH和NaCl浓度的免疫原性组合物的抗原稳定性 图6a-6d.储存后具有不同的pH和NaCl浓度的免疫原性组合物的SEC-HPLC分析 图7.储存后具有不同的pH和NaCl浓度的免疫原性组合物的抗原性 图8.NaCl标准溶液的导电率
图9.使用本发明的免疫原性组合物在小鼠中诱导CD4 T细胞应答 图10.使用本发明的免疫原性组合物在小鼠中诱导CD8 T细胞应答 图11.储存后具有不同的pH和NaCl浓度的免疫原性组合物的浊度测定 图12.储存后具有不同的pH和NaCl浓度的免疫原性组合物的DLS 图13.储存后具有不同的NaCl浓度的免疫原性组合物的抗原性。序列标识符简述
SEQ ID No:1M72蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No: 2 编码M72蛋白的核苷酸序列
SEQ ID No:3具有2个N-末端His残基的M72蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No:4 编码具有2个N-末端His残基的M72蛋白的核苷酸序列 SEQ ID No:5Mtb72f蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No: 6 编码Mtb72f蛋白的核苷酸序列
SEQ ID No:7具 有6个N-末端His残基的Mtb72f蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No:8编码具有6个N-末端His残基的Mtb72f蛋白的核苷酸序列
SEQ ID No: 9 CpG寡核苷酸I的核苷酸序列(CpG 1826)
SEQ ID No: 10 CpG寡核苷酸2的核苷酸序列(CpG 1758)
SEQ ID No: 11 CpG寡核苷酸3的核苷酸序列
SEQ ID No: 12 CpG寡核苷酸4的核苷酸序列(CpG 2006)
SEQ ID No: 13 CpG寡核苷酸5的核苷酸序列(CpG 1686)。发明详述
在第一个方面，本发明提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的导电率是13 mS/cm或更低。具体而言，本发明提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物的导电率是12 mS/cm或更低,例如10 mS/cm或更低、8 mS/cm或更低、6 mS/cm或更低、5 mS/cm或更低、4 mS/cm或更低或3 mS/cm或更低。在特定的实施方案中，免疫原性组合物的导电率是2.5 mS/cm或更低，诸如2.25 mS/cm或更低或2.0 mS/cm或更低。在进一步特定的实施方案中，免疫原性组合物的导电率是1.5至2.5 mS/cm。在第二个方面，本发明提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物中的盐浓度是130 mM或更低。具体而言，本发明提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物中的盐浓度是100 mM或更低，例如90 mM或更低、80 mM或更低、70 mM或更低、60 mM或更低、50 mM或更低、或40 mM或更低。在特定的实施方案中，所述组合物中的盐浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低或25 mM或更低。在进一步特定实施方案中，所述组合物中的盐浓度是20至40 mM，诸如25至35 mM。在第三个方面，本发明提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度是130 mM或更低。具体而言，本发明提供包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度是100 mM或更低，例如90 mM或更低、80 mM或更低、70 mM或更低、60 mM或更低、50 mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或15 mM或更低。在特定的实施方案中，所述免疫原性组合物中的氯化钠浓度是10 mM或更低，诸如7.5 mM或更低。合适地，免疫原性组合物中的氯化钠浓度或等于或低于5 mM。在进一步特定的实施方案中，免疫原性组合物基本不含氯化钠。基本不含是指氯化钠浓度为或非常接近0 mM(诸如3 mM或更低、2 mM或更低或I mM或更低)。合适地，免疫原性组合物中的CaCl2浓度将是40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低、15 mM或更低或10 mM或更低。合适地，免疫原性组合物中的MgSO4浓度将是80 mM或更低、60 mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或10 mM或更低。合适地，免疫原性组合物中的順4+、Mg2+和Ca2+离子总浓度将是80 mM或更低、60mM或更低、40 mM或更低、30 mM或更低、20 mM或更低或10 mM或更低。本发明的免疫原性组合物将是含水制剂。本发明的免疫原性组合物的导电率可以使用本领域中已知的技术，例如，使用专用的导电率仪或其他具有测量导电率能力的仪器来进行测量。一种合适的仪器是来自Malvern Instruments (UK)的 Zetasizer Nano ZS0使用已知技术和试剂盒，技术人员可以容易地测试钠离子(Na+)和氯离子(CF)的浓度。例如，可以使用试剂盒诸如来自Biosupply的钠的酶学测定试剂盒(Sodium Enzymatic Assay Kit)(目录号:BQ011EAEL)来测定钠。可以使用试剂盒诸如来自Biosupply的氯的酶学测定试剂盒(Chloride Enzymatic Assay Kit)(目录号:BQ006EAEL)来测定氯。结核病(TB)是一种由结核分枝杆菌(Myco`bacterium tuberculosis)和其他分枝杆菌种的感染引起的慢性传染性疾病。它是世界上发展中国家的一种主要疾病，并成为发达区域日益严重的问题。超过20亿人被认为感染了 TB杆菌，每年新增约940万TB病例和170万死亡病例。其中10%感染TB杆菌的人会发展活动性TB，每位患有活动性TB的人平均每年感染10-15个其他人。尽管在全球的每年发病率已经达到顶峰，但是由于人口增长，死亡数和病例数依然在上升(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。结核分枝杆菌通过呼吸道途径感染个体。肺泡巨噬细胞吞噬该细菌，但它能够通过抑制具有酸性溶酶体的吞噬体融合而存活和增殖。随后发生涉及⑶4+和⑶8+ T细胞的复杂免疫应答，最终导致肉芽肿的形成。结核分枝杆菌成功作为病原体的关键在于该分离但未根除的细菌可长期存在，使得个体容易在随后发展为活动性TB这一事实。在感染后的第一年，少于5%的感染个体会发展活动性TB。该肉芽肿可存在数十年，并被认为在缺乏氧和营养素的休眠状态下包含活结核分枝杆菌。然而，最近表明，大部分处于休眠状态的细菌位于遍布体内的非巨曬细胞的细胞类型中(Locht等人，ExpertOpin.Biol.Ther.2007 7 (11): 1665-1677)。当宿主的天然免疫和病原体之间的平衡发生变化时(例如由于免疫抑制事件)则发生活动性TB的发展(Anderson P Trends inMicrobiology 2007 15(1):7-13; Ehlers S Infection 2009 37 (2):87-95)。也已提出描述潜伏TB和活动性TB之间的平衡的动力学假设(Cardana P-JInflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6:27-39; Cardana P-J Infection 200937(2):80-86)。
尽管感染在相当长时间内可以是无症状的，但是活动性疾病最常显现为肺的急性炎症，从而导致疲劳、体重下降、发烧和持续咳嗽。如果未经治疗，通常可导致严重的并发症和死亡。结核病通常可采用长期抗生素疗法进行控制，尽管该种治疗并不足以防止该疾病的扩散。活跃地感染的个体可以是很大程度上无症状的，但在一定时间具有传染性。此外，尽管对治疗方案的依从性是关键的，但是患者的行为很难监测。一些患者并未完成治疗周期，这可能导致无效治疗和耐药性的形成。多重耐药性TB (MDR-TB)是一种对一线药物没有应答的形式。所有TB病例中有3.3%是MDR-TB，每年估计有440，000新MDR-TB病例发生。当耐受一线药物之上发生耐受二线药物时，产生广泛耐药TB (XDR-TB)。已经在58个国家中验证了几乎无法治疗的XDR-TB (世界卫生组织 Tuberculosis Facts 2010)。即使完成抗生素治疗的整个疗程，结核分枝杆菌的感染可能无法从感染个体根除，并可保留为能够再活化的潜伏感染。为了控制结核病扩散，对疾病的有效疫苗接种计划和准确早期诊断是最为重要的。目前，用活菌接种是诱导保护性免疫最广泛使用的方法。用于该目的的最常用的分枝杆菌是卡介杆菌(BCG)，这是60多年前第一个开发的牛分枝杆菌的无毒性菌株。然而，BCG的安全性和效力成为争论的来源-尽管在儿童中显示了对严重疾病的保护，但是BCG并不能预防成年人中潜伏TB的形成或者肺部疾病的再活化。此外，在一些国家，例如美国，并未用这种药剂来给普通人群接种。有多种蛋白在分枝杆菌感染早期被强烈表达，据显示它们可在动物接种模型中提供保护效力。然而，用感染早期高度表达的抗原接种可能无法提供处理感染后期的最佳免疫应答。对潜伏性感染的·充分控制可能需要T细胞，其特异性针对在该时期表达的特定抗原。直接靶向持续休眠菌的暴露后疫苗可能有助于保护免于TB再活化，从而强化TB控制，或者甚至能清除感染。因此，靶向潜伏TB的疫苗可以显著和经济地降低全球TB感染率。基于后期抗原的亚基疫苗还可与早期抗原联合使用以提供多阶段疫苗。可替代地，早期和/或后期抗原可用于补充和改善BCG接种(通过促进BCG应答或者通过形成高级重组BCG菌株)。蛋白抗原Mtb72f和M72是具有治疗或预防结核病的潜在益处的蛋白抗原。Mtb72f已显示在许多动物模型中提供保护(参见例如:Brandt等人J/7/ect Immun.200472(11):6622-6632; Skeiky 等人7； Immunol.2004 172:7618-7628; Tsenova 等k Infect.1mmun.2006 74(4):2392-2401; Reed 等人 PNAS 2009 106 (7): 2301-2306)。Mtb72f 也已经是临床研究的主题(Von Eschen 等人 2009 /Zaaa/ Vaccines 5 (7): 475-482)。M72是改进的抗原，其相对于Mtb72f包括单一的丝氨酸至丙氨酸的突变，导致改进的稳定性特征。M72相关抗原也已经显示在潜伏性TB模型中是有价值的(国际专利申请W02006/117240)。如本文所用术语“M72相关抗原”指SEQ ID No:1所示M72蛋白及其免疫原性衍生物。如本文所用术语“衍生物”指相对于参考序列，修饰的抗原。免疫原性衍生物与参考序列足够相似，足以保留参考序列的免疫原性特性，且仍然能够允许增强针对参考序列的免疫应答。衍生物可以，例如，包含参考序列的修饰版本，或者可以由参考序列的修饰版本组成。M72相关抗原可以，例如含有小于1500个氨基酸残基，诸如小于1200个氨基酸残基，特别是小于1000个氨基酸残基，特别是小于800个氨基酸残基。T细胞表位是被T细胞(例如，⑶4+或⑶8+ T细胞)识别的氨基酸的短连续片段。T细胞表位的鉴定可通过本领域技术人员已知的表位定位实验实现(参见例如Paul,Fundamental Immunology,第 3 版，243-247 (1993) ; Bei P barth 等人
200521 (Supp 1.1):129-137)。在不同的远系交配群体(诸如人)中，不同的HLA类型表示该特定表位可能不被该群体所有成员所识别。由于T细胞应答在结核病中的关键参与，为了使识别的水平和免疫应答的规模最大化，M72的免疫原性衍生物期望地是含有完整的大多数(或适当地所有)T细胞表位的那种。技术人员将认识到改变、添加或缺失单个氨基酸或少量百分比的氨基酸的M72蛋白的单独取代、缺失或添加是“ 免疫原性衍生物”，其中一种或多种改变导致以功能类似的氨基酸取代氨基酸或者基本不影响免疫原性功能的残基的取代/缺失/添加。提供功能类似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。总体而言，该种保守取代将落入下文限定的氨基酸分组之一，尽管在一些情况下，也可能有其他取代而基本不影响该抗原的免疫原性特性。以下八组各包含了彼此可进行典型保守取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W);
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);以及
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)
(参见例如，Creighton, Proteins 1984)。合适地，该种取代不发生在表位区域，因此对该抗原的免疫原性特性不具有明显影响。免疫原性衍生物还可包括相对于参考序列其中插入了另外氨基酸的那些免疫原性衍生物。合适地，该种插入不发生在表位区域，因此对该抗原的免疫原性特性不具有明显影响。插入的一个实例包括一段短的组氨酸残基(例如，2-6个残基)以帮助目的抗原的表达和/或纯化。免疫原性衍生物包括相对于参考序列氨基酸已经缺失的那些免疫原性衍生物。合适地，该种缺失不发生在表位区域，因此对该抗原的免疫原性特性不具有明显影响。技术人员将认识到特定的免疫原性衍生物可包括取代、缺失和添加(或其任意组合)。两个或更多多肽序列的上下文中的“相同”或百分比“同一性”指，当比较和比对得到比较窗口或指定区域的最大对应(如采用下列序列比较算法之一或通过人工比对和目视观察所测量)时，两个或更多个序列或子序列彼此相同或具有一定百分比的相同(即，相对指定区域70%同一性，任选地75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性)的氨基酸残基。该定义还指测试序列的互补(compliment)。任选地,该同一丨I"生存在于长度至少500个氨基酸的区域，诸如至少600个氨基酸或至少700个氨基酸。合适地，该比较在对应于参考序列全长的窗口进行(相对于衍生物序列)。对于序列比较，将一个序列作为参考序列，将测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，在需要时，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可采用默认程序参数，或指定可选参数。随后序列比较算法将根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。本文所用的“比较窗口 ”指对两个序列进行最佳比对后，其中序列可与相同数量连续位置的参考序列比较的区段。比较序列的比对的方法已为本领域众所周知。比较序列最佳比对可通过下述方法实现，例如，通过Smith & Waterman, Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过 Needleman & ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源性比对算法，通过 Pearson & Lipman, Proc.Nat’7.Acad.ScL USA 85:2444(1988)的相似性搜索法，通过这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包中的GAP,BESTFIT, FASTA 以及 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,WI),或者通过人工比对和目视观察(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology (Au sub el 等人编辑 1995 增补))。一种有用算法的实例为PILEUP。PILEUP采用渐进的、成对比对建立了来自一组相关序列的多重序列比对，从而显示相关性和百分比序列同一性。它还绘制了可显示用于建立比对的聚类关系的树状图或系统树图。PILEUP采用了简化的Feng & Doolittle,J.Mol.EvoL 35:351-360 (1987)的渐进比对法。所采用的方法与 Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-153 (1989)所描述的方法类似。该程序可对最高达300个序列进行比对，每个序列的最大长度为5，000个核苷酸或氨基酸。该多重比对程序始于对两个最为相似的序列的成对比对，从而产生两个比对序列的聚类。然后将该聚类与下一个最相关的序列或比对序列的聚类进行比对。两个序列聚类通过将两个单独序列的成对比对的简单扩展进行比对。最终比对可通过一系列的渐进、成对比对实现。该程序通过指定特定的序列及其氨基酸坐标为序列比较区域并指定程序参数来运 行。使用PILEUP时采用下列参数比较参考序列和其他测试序列以确定百分比序列同一性关系:默认空位权重(3.00),默认空位长度权重(0.10)，以及加权的末端空位。PILEUP可以从GCG序列分析软件包例如7.0版中获取(Devereaux 等人，M/c.Acids Res.12:387-395 (1984))。适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一实例为BLAST和BLAST2.0 算法，其分别描述于 Altschul 攀yL M/c.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和Altschul 等人，7； Mol.Biol.215:403-410 (1990)。进行 BLAST 分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获取(网址在www.ncb1.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSPs)，其中该短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某些正数值阈值得分T。T指邻近字得分阈值(Altschul等人，同前)。这些初始邻近字采样数(word hits)作为种子启动对包含它们的更长HSPs的搜索。该字采样数沿着每个序列的两个方向伸展，直至累计比对得分增加。对核苷酸序列的累计分数采用参数M(对一对匹配残基的奖赏分数；总是>0)和N(对不匹配残基的惩罚分数；总是〈0)进行计算。对于氨基酸序列，可使用得分矩阵来计算累计分数。以下情况下字采样数向各方向的伸展被停止:累计比对分数较其最大获得值小数量X;由于一个或多个负得分残基比对的累积，累计分数降至O或以下；或者达到了任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)的默认值为字长(w) 11，预期(E)10，M=5，N=-4，且同时对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序的默认值为字长3，和预期(E) 10，以及该BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff
&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915 (1989))的比对(B) 50，预期(E)10，M=5, N=-4，且对两条链进行比较。BLAST算法还进行两个序列间的相似性的统计学分析(参见例如，Karlin &Altschul, Proc.Natf 1.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787 (1993))。由 BLAST 算法所提供的一种相似性的量度为最小概率总和(P (N))，它对两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然产生匹配的概率提供了指示。例如，如果测试核酸与参考核酸之间比较得到的最小概率总和小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001时，该核酸被认为与参考核酸相类似。在任意情况下，多肽序列的免疫原性衍生物将具有与参考序列基本相同的活性。基本相同的活性指参考序列在PBMC或全血的用特定抗原的体外再刺激测定(例如，再刺激数小时至长达两周之间，诸如长达一天、I天至I周或者I至2周的时间)中活性的至少50%、合适地至少75%且特别是至少90%，其中该测定通过淋巴组织增殖、培养上清液中细胞因子生成(通过ELISA、CBA等测量)或者胞内和胞外染色(例如，采用特异性针对免疫标记物的抗体，诸如CD3、CD4、CD8、IL2、TNF a、IFN Y、CD40L、CD69等)然后以流式细胞仪表征T和B细胞应答来测量细胞的活化。合适地，基本相同的活性指参考序列在T细胞增殖和/或IFN- y生成测定中的活性的至少50%、合适地至少75%且尤其是至少90%。M72蛋白的特定衍生物包括在N末端具有额外的His残基的那些(例如，两个His残基，如SEQ ID No:7中所提供的；或5个或尤其是6个His残基的多组氨酸标记，其可以用于镍亲和纯化)。Mtb72f (SEQ ID No:5)，其中M72中的初始丝氨酸残基已经被突变，是在N末端具有额外的His残基 的Mtb72f蛋白(例如，两个His残基；或5个或尤其是6个His残基的多组氨酸标记，其可以用于镍亲和纯化)。合适地，M72相关抗原将包含，诸如与M72具有至少70%，诸如至少80%、特别是至少90%、特别是至少95%，例如至少99%同一性的序列。任选地，M72相关抗原将包含，诸如与M72具有至少98%同一性的序列。典型地，M72相关抗原将包含，诸如SEQ ID No:1或3的具有小量缺失插入和/或取代的免疫原性衍生物。实例是在0-5个位置具有最多达5个残基缺失，在0-5五个位置具有最多达5个残基插入和最多达20个残基取代的那些。M72的其他免疫原性衍生物是包含诸如由SEQ ID No:1或3的片段组成的衍生物，所述片段长度为至少500个氨基酸，诸如长度为至少600个氨基酸或长度为至少700个氨基酸。M72相关抗原可以通过前面描述的方法(W02006/117240)、实施例中提供的那些、或与其类似的方法来制备。免疫原性组合物可以包含一个或多个进一步的抗原成分。这样的额外抗原组分本身不需要对组合物中盐的存在敏感。额外的抗原组分可以旨在增强或补充结核病预防和治疗领域中由M72相关抗原要求的免疫应答，或者额外的抗原可以与其他病原体相关且旨在为了方便起见用于和M72相关抗原一起施用。当许多抗原组分存在于制剂中时，这些也可以以个别多肽或融合蛋白的形式提供。在一些情况下，额外的抗原组分可以作为多核苷酸(或多个核苷酸)提供。众所周知的是，对于胃肠外施用，溶液应当具有药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度，以避免细胞变形或裂解。药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度将通常是指溶液将具有约等渗或轻度高渗的重量摩尔渗透压浓度。合适地，本发明的免疫原性组合物将具有250至750 mOsm/kg范围内的重量摩尔渗透压浓度，例如，重量摩尔渗透压浓度可以在250至550 mOsm/kg的范围内，诸如280至500 mOsm/kg的范围内。可以根据本领域中已知的技术，诸如通过使用商业上获得的渗压计，例如从Advanced Instruments Inc.(USA)可获得的Advanced Model 2020测量重量摩尔渗透压浓度。“等渗剂”是生理上可耐受的并赋予制剂合适涨度的化合物，以防跨越与制剂接触的细胞膜的水的净流动。通常，氯化钠(NaCl)用作涨度剂。本发明人已经首次显示M72相关抗原对“盐析”特别敏感，盐析是指溶液中的蛋白在含高浓度盐的溶液中聚集或凝结的过程。因此，提供了可替代的方式以确保本发明的免疫原性组合物具有药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度。在特定的实施方案中，提供进一步包含非离子型涨度剂的免疫原性组合物。用于免疫原性组合物中的非离子型涨度剂需要自身是药学上可接受的，例如适用于人类，并且与M72相关抗原相容并且进一步与其他成分如一种或多种免疫刺激剂相容。在本发明的一 个实施方案中，合适的非离子型涨度剂是多元醇、糖类(尤其是蔗糖、果糖、右旋糖或葡萄糖)或氨基酸如甘氨酸。在一个实施方案中，多元醇是糖醇，尤其是C3-6糖醇。示例性的糖醇包括甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露醇、卫矛醇和艾杜糖醇。在该实施方案的特定实例中，合适的非离子型涨度剂是山梨醇。技术人员将认识到可以通过使用不同涨度剂的混合物获得适当的重量摩尔渗透压浓度。在本发明的特定实施方案中，本发明组合物中的非离子型涨度剂合并蔗糖和/或山梨醇。在一个实施方案中，免疫原性组合物中多元醇的合适浓度为约2.5至约15% (w/v),尤其是约2.5至约10% (w/v)例如约3至约7 % (w/v),诸如约4至约6% (w/v)。在该实施方案的特定实例中，多元醇是山梨醇。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含蔗糖和山梨醇。在这样的情况下，免疫原性组合物可以合适地含有约2.5至约15% (w/v)的鹿糖,和约2.5至约15% (w/v)的山梨醇，特别是约2.5至约10% (w/v)的鹿糖和约2.5至约10% (w/v)的山梨醇,例如,约3至约7% (w/v)的鹿糖,和约3至约7% (w/v)的山梨醇,诸如约4至约6% (w/v)的鹿糖和约4至约6% (w/v)的山梨醇。免疫原性组合物的pH应该适合用于肠胃外施用。通常，pH将在6.0至9.0的范围内。合适地，pH将在7.0至9.0的范围内，特别是7.25至8.75，诸如7.5至8.5，特别是pH 7.75至8.25。约8.0的pH是特别感兴趣的。可以通过使用缓冲剂，包括例如Tris或磷酸盐缓冲剂控制pH。在本发明的特定实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种免疫刺激剂。
在一个实施方案中，免疫刺激剂可以是皂苷。用于本发明的尤其合适的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美树以saponaria Molina的一种阜苷制剂，首次由 Dalsgaard 等人描述于 1974 ( “Saponin adjuvants，，，Archiv.fiir die gesamteVirusforschung,第 44 卷，Springer Verlag, Berlin,第 243-254 页)，其具有佐剂活性。Quil A的纯化部分已通过HPLC分离，其保留佐剂活性，而没有与Quil A (W088/09336)例如QS7和QS21 (也称为QA7和QA21)相关的毒性。QS21是源自Quillaja saponariaMolina的一种天然皂苷，其诱导⑶8+细胞毒性T细胞(CTL)、Thl细胞和主要IgG2a抗体应答。QS21是本发明的上下文中的优选皂苷。在本发明的合适形式中，免疫原性组合物中的阜苷佐剂是MolinaQuil A的衍生物，尤其是Quil A的免疫活性部分，诸如QS17或QS21，合适地是QS21。理想的是，在反应原性较低的组合物中提供QS21，其中它被外源固醇例如胆固醇猝灭。存在着其中QS21被胆固醇猝灭的反应原性较低的组合物的若干种特定形式。在一个特定的实施方案中，皂苷/固醇是脂质体结构的形式(诸如在W096/33739中所述，实施例1)。在该实施方案中，脂质体合适地含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下合适地为非晶性的，例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂基磷脂酰胆碱。月旨质体也可含有带电荷的脂质，其对于由饱和脂质构成的脂质体而言能增加脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下，带电荷脂质的量合适地为1-20% w/w,诸如5-10%。固醇与磷脂的比例为1-50% (mol/mol)，合适地为20-25%。合适的固醇包括￠-谷固醇、豆固醇、麦角固醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个特定的实施方案中，免疫原性组合物包含胆固醇作为固醇。这些固醇是本领域众所周知的，例如胆固醇公开于默克索引(Merck Index,第11版，第341页)，是存在于动物脂肪中的天然存在的固醇。当活性皂苷部分是QS21时，QS21:固醇的比例通常为约1:100至1:1 (w/w)，合适地1:10至1:1 (w/w),特别1:5至1:1 (w/w) o存在适当过量的固醇,QS21:固醇的比例为至少1:2 (w/w) o在一个实施方案中,QS21:固醇的比例为1:5 (w/w) o固醇合适地为胆固醇。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含免疫刺激剂，其是Toll-样受体4(TLR4)激动剂。“TLR激动剂”是指能通过TLR信号转导途径而引起信号转导反应的成分，或者是作为直接配体或者间接通过产生内源或外源配体(Sabroe等人，J Immunol 2003P1630-5)。TLR4激动剂能通过TLR-4信号转导途径而引起信号转导反应。TLR4激动剂的合适实例是脂多糖，合适地是脂质A的无毒衍生物，尤其是单磷酰脂质A或更尤其是3-脱-0-酸化单憐酸脂质A (3D-MPL)。3D-MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N.A.售卖，名称是 MPL，并且在全文中都称为MPL或3D-MPL,参见例如美国专利号4，436，727; 4，877，611; 4，866，034和4，912，094。30-]\0^主要促进具有正^￥ (Thl)表型的CD4+ T细胞应答。可根据GB2220211A所公开的方法产生3D-MPL。从化学上说，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱-0-酰化单磷酰脂质A的混合物 。在本发明的组合物中，小颗粒3D-MPL可用于制备免疫原性组合物。小颗粒3D-MPL的粒径使其可通过0.22 um滤器进行除菌过滤。这样的制剂描述于WO94/21292。合适地，粉末状3D-MPL用于制备本发明的免疫原性组合物。
可使用的其他TLR4激动剂是氨基葡糖苷磷酸烷基酯(AGP)，诸如公开于冊98/50399或美国专利号6，303，347 (也公开了 AGP的制备方法)的那些，合适地是RC527或RC529或美国专利号6，764，840所公开的AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，而一些则是TLR4拮抗剂。其他合适的TLR4激动剂描述于W02003/011223和W02003/099195，诸如W02003/011223的第4_5页或W02003/099195的第3_4页上公开的化合物1、化合物II和化合物III，尤其是公开于W02003/011223的那些化合物ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m ER804058、ER804059、ER804442、ER804680 和 ER804764。例如，一种合适的TLR-4激动剂是ER804057。在一个特定的实施方案中，免疫原性组合物同时包含皂苷和TLR4激动剂。在一个特定的实例中，免疫原性组合物包含QS21和3D-MPL。每份人用剂量的免疫原性组合物中可以使用的TLR-4激动剂诸如脂多糖诸如3D-MPL的量为I至100 Ugo可使用的3D-MPL的水平为约50 ug，例如40至60 ug，合适地为45至55 ug或49至51 ug或50 ug。在一个进一步实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含3D-MPL的水平为约25 ug，例如20至30 ug，合适地为21至29 ug或22至28ug 或 23 至 27 ug 或 24 至 26 ug 或 25 ug。每份人用剂量的免疫原性组合物中可以使用的皂苷诸如QS21的量为I至100 Ugo可使用的QS21水平为约50ug，例如40至60 ug，合适地为45至55 ug或49至51 ug或50Ug0在一个进一步实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含QS21的水平为约25 ug,例如20至30 ug,合适地为21至29 ug或22至28 ug或23至27 ug或24至26 ug或25
Ug0当TLR4激动剂和皂苷同时存在于免疫原性组合物中时，TLR4激动剂与皂苷的重量比合适地为1:5至5:1，合适地为1:2至2:1，`诸如约1:1。例如，在每份人用剂量的免疫原性组合物中，当3D-MPL含量为50ug或25ug时，合适地QS21的含量也可分别为50ug或25ug。本发明的某些免疫原性组合物包含量为I至100 ug QS21和3D-MPL /每个人用剂量，诸如量为10至75 ug/每个人用剂量。本发明的免疫原性组合物可以合适地包含QS21和3D-MPL，其量为15至35 ug/每人用剂量，诸如20至30 ug/每人用剂量。在一个实施方案中，免疫刺激剂是TLR9激动剂，例如W02008/142133所给出的那些。在一个特定的实例中，所述TLR9激动剂是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸。这样的寡核苷酸是众所周知的并描述于例如W096/02555、W099/33488和US5，865，462。用于本文所述的免疫原性组合物的合适的TLR9激动剂是含有CpG的寡核苷酸，任选含有被至少3个、合适地为至少6个或更多个核苷酸分隔的两个或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鸟嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯键，或可能是硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯键和其他核苷酸间键也可使用，包括具有混合核苷酸间键的寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯寡核苷酸的方法描述于US5，666，153、US5, 278，302和W095/26204。考虑了包含不同核苷酸间键的寡核苷酸，例如混合硫代磷酸磷酸二酯类。可使用能稳定寡核苷酸的其他核苷酸间键。适合本文所述的免疫原性组合物所包含的CpG寡核苷酸的实例具有以下序列。在一个实施方案中，这些序列含有经硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。
SK 作酸.1 {SEQ ID No: 9): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
U:核 f 酸 2 {SEQ ID No: 10}: TCT CCC AGC GTG CGC CAT {CpG 1758)
袁核.fl:_ 3 (SEQ ID No: 11): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG 霖核 f!-鑛 4 (SEQ ID Ho: 12): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006):ff 核 f!+-_ 5 {SEQ ID No: 13): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 16€8)可替代的CpG寡核苷酸可包含上述序列，因为其中它们可具有不连续缺失或添加。在一个实施方案中，免疫刺激剂是母育酚。母育酚是本领域众所周知的并描述于EP0382271。在一个特定的实施方案中，母育酚是a-生育酚或其衍生物诸如a -生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯)。本发明也提供本发明免疫原性组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤:
a.冻干M72相关抗原；和
b.用水溶液重构步骤a)的冻干的M72相关抗原，其中所述溶液的导电率是13mS/cm或更低。
在某些实施方案中，所述水溶液的导电率是12 mS/cm或更低，例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一个特定的实施方案中，所述水溶液的导电率是2.5 mS/cm或更低，诸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或更低。合适地，所述水溶液的导电率使得当重构冻干抗原时获得的溶液的导电率是13mS/cm或更低,诸如12 mS/cm或更低,例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一个特定的实施方案中,所述获得的溶液的导电率是2.5 mS/cm或更低,诸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或更低。进一步提供本发明免疫原性组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤:
a.冻干M72相关抗原；和
b.用水溶液重构步骤a)的冻干的M72相关抗原，其中所述溶液中的盐浓度是130mM或更低。在某些实施方案中，所述水溶液中的盐浓度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述水溶液中的盐浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低或25 mM或更低。合适地，所述水溶液中的盐浓度使得当重构冻干抗原时获得的溶液的盐浓度是130 mM或更低，诸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述获得的溶液中的盐浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低，或25 mM或更低。额外地提供本发明免疫原性组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤:
a.冻干M72相关抗原；和
b.用水溶液重构步骤a)的冻干的M72相关抗原，其中所述溶液中的氯化钠浓度是130mM或更低。在某些实施方案中，所述水溶液中的氯化钠浓度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述水溶液中的盐浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低，20 mM或更低，或15 mM或更低。合适地，水溶液中的氯化钠浓度或等于或低于5 mM。合适地，所述水溶液中的氯化钠浓度使得当重构冻干抗原时获得的溶液的氯化钠浓度是130 mM或更低，诸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述获得的溶液中的氯化钠浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低，或25 mM或更低。在一个实施方案中，步骤b)的水溶液(上述)包含皂苷和/或TLR4激动剂，例如QS21和/或3D-MPL。在一个进一步实施方案中，皂苷和/或TLR4激动剂在脂质体制剂中。在一个实施方案中，水溶液包含在脂质体制剂中的TLR4激动剂和皂苷，以及本文所述的非离子型涨度剂，诸如多元醇。尤其是水溶液可以包含山梨醇。还提供试剂盒，所述试剂盒包含:
a.冻干的M72相关抗原；和
b.水溶液，其中所述溶液的导电率是13mS/cm或更低。在某些实施方案中，所述水溶液的导电率是12 mS/cm或更低，例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一个特定的实施方案中，所述水溶液的导电率是2.5 mS/cm或更低，诸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或 更低。合适地，所述水溶液的导电率使得当重构冻干抗原时获得的溶液的导电率是13mS/cm或更低,诸如12 mS/cm或更低,例如10 mS/cm或更低,8 mS/cm或更低,6 mS/cm或更低,5 mS/cm或更低,4 mS/cm或更低,或3 mS/cm或更低。在一个特定的实施方案中,所述获得的溶液的导电率是2.5 mS/cm或更低,诸如2.25 mS/cm或更低,或2.0 mS/cm或更低。额外地提供试剂盒，所述试剂盒包含:
a.冻干的M72相关抗原；和
b.水溶液，其中所述溶液中的盐浓度是130mM或更低。在某些实施方案中，所述水溶液中的盐浓度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述水溶液中的盐浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低或25 mM或更低。合适地，所述水溶液中的盐浓度使得当重构冻干抗原时获得的溶液的盐浓度是130 mM或更低，诸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述获得的溶液中的盐浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低，或25 mM或更低。进一步地提供试剂盒,所述试剂盒包含:
a.冻干的M72相关抗原；和
b.水溶液，其中所述溶液中的氯化钠浓度是130mM或更低。在某些实施方案中，所述水溶液中的氯化钠浓度是100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述水溶液中的盐浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低，20 mM或更低，或15 mM或更低。合适地，溶液中的氯化钠浓度或等于或低于5 mM。
合适地，所述水溶液中的氯化钠浓度使得当重构冻干抗原时获得的溶液的氯化钠浓度是130 mM或更低，诸如100 mM或更低，例如90 mM或更低，80 mM或更低，70 mM或更低，60 mM或更低，50 mM或更低，或40 mM或更低。在一个特定的实施方案中，所述获得的溶液中的氯化钠浓度是35 mM或更低，诸如30 mM或更低，或25 mM或更低。试剂盒可以适于提供单一剂量的免疫原性组合物，诸如单人剂量，或多剂量的免疫原性组合物。用于本发明试剂盒的水溶液可以是本文所定义的任何水溶液。在本发明的特定的实施方案中，水溶液包含呈脂质体形式的TLR4激动剂和/或皂苷。在一个特定的实施方案中，TLR4激动剂是3D-MPL且皂苷是QS21。本文所用的水溶液可包含涨度剂，例如多元醇，诸如山梨醇。关于上面提到的用于产生本发明的免疫原性组合物的试剂盒和方法，可以指出的是，如果存在的话，一种或多种免疫刺激剂和一种或多种涨度剂可以根据需要与抗原共同冻干或含在水溶液中。水溶液可以简单地是注射用水，且免疫原性组合物的所有其他组分与抗原共同冻干。通常，至少一些一种或多种免疫刺激剂和一种或多种涨度剂在水溶液中提供，如果某些组分与冻干相容性较差，诸如脂质体，那么这是特别合适的。在一个实施方案中，水溶液包含免疫刺激剂。在第二个实施方案中，水溶液包括涨度剂，例如非离子涨度齐U，诸如多元醇，特别是山梨醇。在第三个实施方案中，水溶液包含免疫刺激剂和涨度剂，诸如多元醇，特别是山梨醇。试剂盒可以进一步包括指示使用水溶液重构冻干M72相关抗原的说明。根据本发明的免疫原性组合物可以用于药物中，特别是用于预防、治疗或改善分枝杆菌的感染，诸如结核分枝杆菌的感染。免疫原性组合物将通常提供用于施用于人，尽管它们也可能在兽药中诸如施用于牛中是有价值的。提供了本发 明的免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物特别用于预防、治疗或改善分枝杆菌的感染，诸如结核分枝杆菌的感染。还提供了用于预防、治疗或改善分枝杆菌的感染，诸如结核分枝杆菌的感染的方法，所述方法包括施用安全和有效量的本发明的免疫原性组合物。可以出于下述目的提供免疫原性组合物:
-治疗活动性结核；
-预防活动性结核，诸如通过施用于未感染的受试者，或者具有潜伏感染的受试者；
-治疗潜伏结核；
-预防潜伏结核，诸如通过施用于未感染的受试者；或
-预防或延缓结核病的再活化，特别是TB再活化的延缓，例如延缓数月、数年或甚至无限期。术语“活动性感染”指具有已显现的疾病症状和/或损伤(合适地具有显现的疾病症状)的感染，例如，结核分枝杆菌感染。术语“非活动性感染”、“休眠感染”或“潜伏感染”指未显示疾病症状和/或损伤(合适地未显示疾病症状)的感染，例如，结核分枝杆菌感染。具有潜伏感染的受试者将合适地是测试为阳性感染的受试者，例如通过基于pro或T细胞的测定，但所述受试者还没有表现出疾病症状和/或与活动性感染相关的损伤。
术语“原发结核病”指在感染(例如，结核分枝杆菌感染)后直接形成的临床疾病，例如，疾病症状的显现。参见Harrison’s Principles of Internal Medicine,第 150章，pp.953-966 (第 16 版，Braunwald,等人编辑，2005)。术语“继发性结核病”或“原发后结核病”指休眠、非活动性或潜伏性感染(例如，结核分枝杆菌感染)的再活化。参S Principles of Internal Medicine,第150 章，pp.953-966 (第 16 版，Braunwald,等人编辑，2005)。术语“结核病再活化”指感染测试呈阳性(例如，在结核菌素皮试中呈阳性，合适地在体外基于T细胞的测定中呈阳性)但没有明显的疾病症状的个体随后显现疾病症状。合适地，个体将没有再暴露于感染。该阳性诊断测试表明该个体被感染，然而，该个体可能曾显示或未曾显示已进行过充分治疗以将结核病带入非活动性或潜伏状态的活动性疾病的症状。合适地，将免疫原性组合物施用于未感染的受试者或具有分枝杆菌潜伏感染，诸如结核分枝杆菌感染的受试者。施用的免疫原性组合物的体积将根据许多其他因素而变化，诸如特定递送途径，例如肌内、皮下或皮内途径。通常，用于人的单一注射(单位剂量)施用的体积将是50 u I至I ml，诸如100 ill至750 yl，特别是400至600 yl，例如约500 yl。单一剂量内含有的M72相关抗原的量取决于临床需要，但是单一人剂量将通常是I至100 yg，诸如5至50 yg，例如5至20 u g0单一人剂量可以含有约10 y g的M72相关抗原。合适地，本发明的组合物将是稳定的，其中是指在25°C储存24小时的期间过程中，如通过本文中描述的技术所测量的抗原性保留储存前抗原性的至少80%。期望地，在25°C储存24小时的期间后，抗原·性将保留至少85%，诸如至少90%，特别是至少95%。对于特别感兴趣的组合物，在30°C储存24小时的期间后，保留组合物的至少80%，诸如至少85 %，至少90 %，特别是至少95 %的抗原性。现在借助以下非限制性实例将进一步描述本发明。
实施例实施例1:佐剂组合物ASA (山梨醇)的制备
制备佐剂组合物，其包含使用山梨醇作为涨度剂的脂质体制剂中的3-脱-0-酰化单磷酰脂质A和QS21。其制备如下:
A.脂质体的制备方法:
将脂质(DOPC)、胆固醇和3-脱-0-酰化单磷酰脂质A的有机溶液中的混合物真空干燥。然后加入水溶液(磷酸盐缓冲盐水[100 mM NaCl,50 mM磷酸盐pH 6.1])并搅拌容器直到所有脂质呈悬浮状态。用高剪切混合器将该悬浮液预均质，再进行高压均质，直到脂质体大小降低到经DLS测定约为90nm土 10nm。然后将脂质体除菌过滤。B.ASA 制剂:
步骤1:浓缩脂质体的稀释
当稀释10倍时，将Na2/K磷酸盐缓冲液100 mM pH 6.1加入到注射用水中，在最终制剂中达到IOmM磷酸盐缓冲液浓度。再加入30% (w/v)山梨醇的注射用水(WFI)溶液，在最终制剂中达到4.7%的浓度-将其在室温下搅拌15-45分钟。再将浓缩脂质体(分别由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、胆固醇和3D-MPL制成)加入到该混合物中，在最终制剂中达到100 ug/ml 3D-MPL的浓度。然后将混合物在室温下搅拌15-45分钟。步骤2:加入QS21
使用蠕动泵，将QS21贮液加入到稀释的脂质体中，同时磁力搅拌，在最终制剂中达到100 ug/ml的浓度。将混合物搅拌15-45分钟。最终ASA (山梨醇)制剂中含有2 mg DOPC,500 ug胆固醇、100 ug 3D_MPL/ml和
100ug QS21/ml、4.7%山梨醇以及5 mM氯化钠和10 mM磷酸盐。步骤3:检查 pH 为 6.1 ±0.1
步骤4:除菌过滤
使用来自PALL Corporation的聚醚砜(PES)滤器进行除菌过滤。步骤5:在+2°C至+8°C储存
获得佐剂组合物，其包含在脂质体制剂中的3-脱-0-酰化MPL和QS21并含有作为涨度剂的山梨醇(称为ASA (山梨醇))，然后储存在4°C。实施例2:佐剂纟目合物ASA (150 mM NaCl)的制各
使用作为涨度剂的氯化钠制备佐剂组合物，其包含脂质体制剂中的3-脱-0-酰化单磷酰脂质A和QS21。A.脂质体的制备方法:
将脂质(DOPC)、胆固醇和3-脱-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)的有机溶液的混合物真空干燥。再加入磷酸盐缓冲盐水(100 mM NaCl,50 mM磷酸盐pH 6.1)并搅拌容器直到所有脂质呈悬浮状态。再用高剪切混合器将该悬浮液预均质，然后进行高压均质，直到脂质体大小降低到经DLS测定约为90 nm 土 10 nm。然后将脂质体在0.22 um PES膜上除菌过滤。B.ASA 制剂:
步骤1:浓缩脂质体的稀释
当稀释10倍时，将Na2/K磷酸盐缓冲液IOOmM pH6.45和NaCl 1.5M加入到注射用水中，在最终制剂中分别达到IOmM磷酸盐和NaCl 150mM的浓度。将该混合物在室温下搅拌5分钟。再将浓缩脂质体(分别由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的D0PC、胆固醇和3D-MPL制成)加入到该混合物中，在最终制剂中达到100 ug/ml 3D-MPL的浓度。然后将混合物在室温下搅拌5-15分钟。步骤2:加入QS21
将QS21贮液加入到稀释的脂质体中，同时磁力搅拌，在最终制剂中达到100 ug/ml的浓度。将混合物在室温下搅拌。步骤3:检查pH目的为6.1 ±0.1 步骤4:除菌过滤
使用来自PALL Corporation的聚醚砜(PES)滤器上进行除菌过滤。步骤5:在+2 V至+8 V储存
ASA (150 mM NaCl)的最终组合物是2 mg D0PC,500 ug胆固醇、100 ug 3-脱-0-酰化MPLUOO ug QS21/ml、10 mM 磷酸盐和 150 mM NaCl。实施例3:QS21裂解活件
已知QS21能裂解红血细胞(RBC)。测试实施例1中制备的ASA (山梨醇)佐剂组合物，以确保QS21的裂解活性以与包含150mM NaCl的当量佐剂组合物(ASA (150mM NaCl))中所观察到的同样方式被猝灭。通过溶血测定，使用鸡红血细胞(chicken Red Blood cell, RBC)测定QS21的裂解活性。将RBC在550g于4°C离心。弃去上清液。将沉淀小心重悬于PBS缓冲液中达原先体积并且重复同样操作，直到上清液不再呈红色(通常3次)。如果不直接使用的话，将沉淀储存于4°C持续3-4天(并在使用当天再次洗涤)，或者如果在同一天使用的话，将其在缓冲液中稀释约10倍。临时在ASA缓冲液(在测试ASA样品后在盐或在山梨醇缓冲液中)中制作QS21剂量范围曲线并且制备佐剂样品(含50 ug或90 ug QS21当量，即相当于500 ul或900 ulASA当量)。在标准品和样品中用充足缓冲液(含或不含山梨醇，随所测试样品的缓冲液而定)将终体积调节至900ul。因为其为乳色，ASA干扰光密度(OD)。因此制备ASA “空白”并从ASA测试样品的OD值中减去“空白” 0D。这些空白相当于与样品中测试的体积相同的ASA体积，但用缓冲液调节至Iml。这些空白中不加RBC。然后将标准品和样品与RBC —起(将100 ul稀释RBC加入到900 ul标准品和样品中)在室温下(RT)孵育30分钟。再将样品在900g离心5分钟。离心后在540nm处测定光密度。通过限值试验(limit test)进行裂解活性的测定。1.检测限值(LOD)定义为导致下列OD的最低QS21浓度:
-比基础水平更高(0D>0 .1)
-比缓冲液(“0 ug”QS21)的OD高约3倍 -在曲线的上升部分 -对每次试验进行测定
2.如果佐剂样品的OD大于ODmi,则佐剂样品中QS21的裂解活性始终是阳性的。实例QS21曲线
权利要求
1.包含M72相关抗原的免疫原性组合物，其中: (i)所述组合物的导电率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述组合物中盐的浓度是130mM或更低；和/或 (iii)所述组合物中氯化钠的浓度是130mM或更低。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述组合物的导电率是10mS/cm或更低。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中所述组合物的导电率是3mS/cm或更低。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物中盐的浓度是100 mM或更低。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述组合物中盐的浓度是40mM或更低。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物中氯化钠的浓度是100 mM或更低。
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述组合物中氯化钠的浓度是40mM或更低。·
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物中CaCl2的浓度是30 mM或更低。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物中MgSO4的浓度是60或更低。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原性组合物，NH4\Mg2+和Ca2+离子的总浓度是40 mM或更低。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物，进一步包含非离子涨度剂。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述非离子涨度剂是多元醇。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中所述多元醇是山梨醇。
14.根据权利要求13所述的免疫原性组合物，其中所述山梨醇的浓度是约4至约6%(w/v)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述蔗糖的浓度是约4至约 6% (w/v) o
16.根据权利要求1至15中任一项所述的免疫原性组合物，进一步包含一种或多种免疫刺激剂。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激剂是皂苷和/或TLR4激动剂。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述一种或多种免疫刺激剂是脂质体形式。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷是QS21。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述TLR4激动剂是3-脱-0-酰化单磷酰脂质A。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫原性组合物，其中重量摩尔渗透压浓度是 250 至 750 mOsm/kg。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物作为50ul至I ml的单位剂量提供。
23.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，其中所述单位剂量是IOOul至750ul。
24.根据权利要求22或23所述的免疫原性组合物，其中所述单位剂量含有I至100Ug的M72相关抗原。
25.根据权利要求24所述的免疫原性组合物，其中单位剂量含有5至50Ug的M72相关抗原。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物的pH在7.0至9.0的范围内。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原包含与SEQ ID No:1具有至少70%同一性的序列。
28.根据权利要求27所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原由与SEQID No:1具有至少70%同一性的序列组成。
29.根据权利要求28所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原包含与SEQIDNo:1具有至少90%同一性的序列。
30.根据权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原由与SEQID No:1具有至少90%同一性的序列组成。
31.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原包含SEQ ID No:1的氨基酸序列。
32.根据权利要求1至26中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原包含SEQ ID No:3的氨基酸序列。
33.根据权利要求31所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原由SEQID No:1的氨基酸序列组成。
34.根据权利要求32所述的免疫原性组合物，其中所述M72相关抗原由SEQID No: 3的氨基酸序列组成。
35.根据权利要求1至32中任一项所述的免疫原性组合物，其中在250C储存24小时的期间后保持所述免疫原性组合物的至少80%的抗原性。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的免疫原性组合物，其用于药物中。
37.根据权利要求1至35中任一项所述的免疫原性组合物在药物制备中的用途。
38.用于预防、治疗或改善分支杆菌感染、诸如结核分枝杆菌感染的方法，所述方法包括施用安全且有效量的权利要求1至35中任一项的免疫原性组合物。
39.制备权利要求1至35中任一项的免疫原性组合物的工艺，其包括以下步骤: a)冻干M72相关抗原；和 b)用水溶液重构步骤a)的冻干的M72相关抗原，其中: (i)所述溶液的导电率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述溶液中盐的浓度是130mM或更低；和/或 (iii)所述溶液中氯化钠的浓度是130mM或更低。
40.制备权利要求1至35中任一项的稳定的免疫原性组合物的方法，其包括下列步骤: a)冻干M72相关抗原；和 b)用水溶液重构步骤a)的冻干的M72相关抗原，其中: (i)所述溶液的导电率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述溶液中盐的浓度是130mM或更低；和/或 (iii)所述溶液中氯化钠的浓度是130mM或更低； 其中在25 0C储存24小时的期间后保持所述免疫原性组合物的至少80%的抗原性。
41.试剂盒，包含: a)冻干的M72相关抗原；和 b)水溶液，其中: (i)所述溶液的导电率是13mS/cm或更低；和/或 (ii)所述溶液中盐的浓度是130mM或更低；和/或 (iii)所述溶液中氯化钠的浓度是130mM或更低。
42.根据权利要求39所述的工艺、根据权利要求40所述的方法或根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述水溶液包含免疫刺激剂。
43.根据权利要求42所述的工艺、方法或试剂盒，其中所述水溶液包含脂质体制剂中的皂苷和TLR4激动剂，和非离子涨度剂。
44.根据权利要求43所述的工艺、方法或试剂盒，其中所述非离子涨度剂是山梨醇。
45.根据权利要求44所述的工艺、方法或试剂盒，其中所述山梨醇的浓度是约2.5至约15% (w/v)。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的工艺、方法或试剂盒，其中所述皂苷是QS21。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的工艺、方法或试剂盒，其中所述TLR4激动剂是3-脱-O-酸化单憐酸脂质A。
全文摘要
提供了包含M72相关抗原的免疫原性组合物及其在药物中的用途，其中所述组合物的导电率是13mS/cm或更低，或者所述组合物的盐浓度是130mM或更低。
文档编号A61K39/04GK103249431SQ201180060222
公开日2013年8月14日 申请日期2011年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者S.A.G.戈达特, A.拉南, D.I.莱莫伊内 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司