艰难梭状芽胞杆菌毒素a和毒素b蛋白的分离多肽及其用途
【专利摘要】本发明提供了包含在SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列中所示的艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)毒素A和毒素B的受体结合结构域的C-TAB.G5和C-TAB.G5.1分离多肽。所述C-TAB.G5和C-TAB.G5.1分离多肽可用于中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和/或毒素B的毒性作用。
【专利说明】艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B蛋白的分离多肽及其用途
发明领域
[0001]本发明涉及含有艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)毒素A和毒素B的受体结合结构域的分离多肽及其作为疫苗的用途。这种分离多肽提供了对两种毒素的抗毒素免疫。
[0002]发明背景
[0003]艰难梭状芽胞杆菌是医院抗生素相关性腹泻的主要原因并且已经成为医院、疗养院和其它护理机构的主要健康问题。经估计医院的成本在欧洲为20亿美元，在美国为32亿美兀。
[0004]病原体为革兰氏阳性、产孢厌氧细菌，在环境中常见但是也存在于2-3%健康成人群体的肠道中。艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)由正常结肠菌群的破坏引起，这通常是施用抗生素的结果。在暴露于环境中的艰难梭状芽胞杆菌孢子后，生物可定植于肠粘膜，在那里致病毒素的生成可导致CDAD。疾病范围可从轻度单纯性腹泻至重度假膜性结肠炎和中毒性巨结肠。
[0005]CDAD已经在卫生保健机构中日益变得更成问题。最近研究报道，31%接受抗生素的住院患者变得有艰难梭状芽胞杆菌定植而56%变得有定植的那些患者继续发展CDAD。总的而言，艰难梭状芽胞杆菌是造成所有抗生素相关性腹泻的10-25%，50-75%抗生素相关结肠炎和90-100%抗生素相关假膜性结肠炎的原因。CDAD的治疗牵涉停止病因性抗生素，接着用甲硝咕唑(metronidazole)或万古霉素(vancomycin)治疗。停止抗生素治疗后在约20%的患者中出现复发，往往是艰难梭状芽胞杆菌再定植的结果。
[0006]2003年，在加拿大魁北克的艰难梭状芽胞杆菌爆发表明出现了称为北美表现型1/027 (NAPl)，毒性更强的艰难梭状芽胞杆菌菌株。已经将NAPl与和先前菌株相比毒力更强、结果不好及发病率和死亡率更高联系起来。这种菌株的出现增加了在试图控制CDAD发生率中已经遇到的问题。
[0007]用于预防复发性疾病的非达霉素(Fidaxomicin，DijiddG)是第一种新类别的窄谱型大环类抗生素药物(Revill, P.；SerradelI, N.；Bolos, J.(2006).^TiacumicinB:macrolide antibiotic treatment of C.difficile-associated diarrhea' Drugsof the Future31 (6):494 - 497)。它是从放线菌类(actinomycete)桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)亚种hamdenesis获得的发酵产物。非达霉素为非全身性，意味着其最低程度地吸收到血流中，具有杀菌性，并且已经展示出对病原艰难梭状芽胞杆菌的选择性根除，而对构成正常、健康肠道菌群的多个物种的细菌的破坏最小。在结肠中维持正常生理条件可降低艰难梭状芽胞杆菌感染复发的可能性(Johnson，Stuart(2009-06)."Recurrent Clostridium difficile infection:a review of riskfactors, treatments, and outcomes'Journal of Infection58 (6): 403 - 410)。尽管认为引入这种新 类别的抗生素药物会改善对CDAD的治疗，但是尤其是对高危患者例如老年和免疫低下患者而言，仍存在对预防性药物的医疗需求。[0008] CDAD是艰难梭状芽胞杆菌生成的两种外毒素,毒素A和毒素B (也分别称为CTA和CTB)的作用结果。两种毒素均为具有多个功能结构域的高分子量(~300kDa)分泌蛋白(Voth DE 和 Ballard JD, Clinical Microbiology Reviewsl8:247-263 (2005))。两种毒素的N末端结构域含有修饰Rho样GTP酶的ADP葡萄糖基转移酶活性。这种修饰导致失去了肌动蛋白聚合和细胞骨架变化，导致结肠上皮紧密连接破坏。这导致过量液体渗入结肠和引起的腹泻。中央结构域含有疏水性结构域并且预测牵涉膜转运。两种毒素的C末端结构域含有称为重复单元(RU)的多个同源区域，其牵涉毒素与靶细胞的结合(Ho等，PNAS102:18373-18378 (2005)) ?重复单元分类为短(21-30个氨基酸)或长(~50个氨基酸)重复单元。重复单元组合形成聚簇，每个通常含一个长重复单元和3-5个短重复单元。全长毒素A具有39个组织成8个聚簇的重复单元(ARU) (Dove等Infect.1mmun.58:480-488 (1990))，而全长毒素B含24个组织成5个聚簇的重复单兀(BRU)(Barroso 等，Nucleic Acids Res.18:4004(1990) ；Eichel-Streiber 等，Gene96:107-113(1992))。
[0009]来自动物模型和临床的许多研究已经表明抗毒素抗体在防护艰难梭状芽胞杆菌相关疾病中的作用。经福尔马林(formalin)灭活毒素A和毒素B免疫的仓鼠产生高水平的抗毒素抗体并且受保护免受艰难梭状芽胞杆菌的致死性攻毒(Giannasca PJ和Warny M，Vaccine22:848-856 (2004))。另外，被动转运小鼠抗毒素抗体以剂量依赖方式保护仓鼠。Kyne L等(The Lancet357:189-193 (2001))报道，CDAD首次发作期间抗毒素A抗体反应的发展与对疾病复发的防护相关。
[0010]保护性抗毒素抗体识别的决定簇已经定位于含有起受体结合结构域作用的重复单位的 C 末端结构域中。最初,Lyerly 等(Current Microbiology21:29-32 (1990))透露，含33个重复单元的毒素A C末端结构域能够诱导中和抗毒素抗体的生成并且可防止艰难梭状芽胞杆菌感染。在这项研究中，用细菌攻毒之前，仓鼠皮下注射纯化重组多肽多次，然而仅实现部分保护。另一项研究(Ryan等，Infect.1mmun.65:2941-49(1997))显示,含有来自CTA的C末端的720个氨基酸残基和大肠杆菌(E.coli)溶血素A(在霍乱弧菌(Vibriocholerae)中表达)的分泌信号的分离多肽在兔CDAD模型中诱导对小剂量CTA的保护性全身和粘膜免疫。
[0011]还有报道称，对毒素A和B的C末端结构域的抗体反应是实现全面保护所必需的(Kink 和 Williams, Infect.1mmun.66:2018-25(1998)，美国专利 N0.5，736，139(1998))。这项研究揭示，每种毒素的C末端结构域在生成毒素中和抗体中最有效。证明了经口递送的对CTA和CTB的C末端结构域产生的禽类抗体(抗毒素)在仓鼠致死模型中的有效性。结果还表明，抗毒素可能在人类CDAD的治疗和管理中有效。在另一项研究中，报道人抗毒素A和B单克隆抗体赋予了对艰难梭状芽胞杆菌诱导的仓鼠死亡率的防护(Babcock等，Infect.1mmun.74:6339-6347 (2006))。仅用对抗任一毒素的受体结合结构域的抗体观察到保护并且在用抗毒素A和B抗体治疗后观察到保护增强。
[0012]另一方面，Ward等(Infect.1mmun.67:5124-32 (1999))考虑到来自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的14个重复单元(14CTA)以研究佐剂活性。克隆重复单元并且表达具有N末端多组氨酸标签(14CTA-HIS)或与来自破伤风毒素的无毒结合结构域融合(14CTA-TETC)。鼻内施用的两种融合蛋白产生抗毒素A血清抗体，但是在小鼠的粘膜表面无反应。与大肠杆菌不耐热毒素(LT)或其突变形式LTR72联合施用后观察到增强的系统性和粘膜抗毒素A反应。根据数据，Ward等建议使用无毒14CTA-TETC融合蛋白作为对抗梭状芽胞杆菌病原体的人类疫苗中的粘膜佐剂。
[0013]最近对艰难梭状芽胞杆菌毒素的重复单元结构域的生物化学研究已着眼于形成稳定三级结构的最低序列要求(Demarest SJ等，J.Mol.Bi0.346:1197-1206 (2005))。发现源自毒素A的11重复单元肽具有正确的三级结构，但是来自毒素A和B的6和7个重复单元不具有正确的三级结构。发现正确折叠的11重复单元区段维持了受体结合性质。第二项研究检查了含有6、11或15个重复单元的毒素A片段的功能性质(Dingle T，Glycobiologyl8:698-706 (2008))。只有所述11和15个重复单元能够竞争性抑制抗毒素A抗体的毒素中和能力。虽然发现3个片段全部具有红血球凝聚活性，但是较长片段展现出比较短片段更高的红血球凝聚活性。数据表明，在含有大于11-14个重复序列的结构域片段中维持了毒素受体结合结构域结构和免疫原性。
[0014]Thomas 等(TO97/02836，美国专利 N0.5，919，463 (1999))还公开了作为粘膜佐剂的艰难梭状芽胞杆菌毒素A、毒素B及其某些片段(例如，包含一些或全部重复单元的C末端结构域)。他们证实，鼻内施用CTA或CTB显著增强了对多个小鼠腔隙中异种抗原例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、卵清蛋白或钥孔戚血蓝素(KLH)的粘膜免疫反应并且与对螺杆菌(Helicobacter)攻毒的防护相关。另外，评估了毒素A融合蛋白的佐剂活性:包含ARU (毒素A重复单元)的CTA的794个C末端氨基酸残基与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合并且所得多肽GST-ARU在大肠杆菌中表达。这项研究证明在血清和粘膜分泌中，GST-ARU显著增强了对联合施用的抗原的免疫反应。
[0015]这些研究全部表明了包含艰难梭状芽胞杆菌毒素A或毒素B或其片段或其组合的无毒、重组蛋白用于生产抗CDAD活性疫苗的用途。目前，虽然已经在人类I和IIa期研究中评估了由福尔马林解毒的完整毒素A和B组成的候选疫苗，但是抗艰难梭状芽胞杆菌的疫苗无法商购获得。据报道，用这种疫苗肠胃外免疫诱导抗毒素IgG和毒素中和抗体反应(Kotloff KL 等,Infect.1mmun.69:988-995(2001) ；Aboudola S 等,Infect.1mmun.71:1608-1610(2003))。
[0016]文献进一步表明，构建含有艰难梭状芽胞杆菌的完整毒素A和B受体结合结构域或其片段的重组融合蛋白将是有效且具商业利益的疫苗研发方法。Varfolomeeva等(Mol.Genetics, Microb.and Virol.3:6-10 (2003))已经尝试了此类方法，作为毒素 A 的 700 喊基对片段和毒素B的1300碱基对片段的两部分融合蛋白。Belyi和Varfolomeeva(FEMSLetters225:325-9 (2003))也已描述了此方法，证明构建由3个部分组成的重组融合蛋白:由艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的重复单元构成的两个C末端结构域，后面是产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)肠毒素Cpe的片段。融合蛋白在大肠杆菌中表达，但是产物在内含体中累积并且不稳定。而且，在这项研究中获得的纯净产物的产量(50 μ g/100ml培养物)相当低。
[0017]Wilkins 等(TO00/61762，美国专利 N0.6，733，760 (2004))也描述了重组艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B重复单元(重组ARU和重组BRU)及其多糖偶联物用于制备抗CDAD疫苗的用途。在长度上，所得重组ARU蛋白包含867个氨基酸残基，而重组BRU蛋白含有622个氨基酸。与先前提到的研究不同，本文证明了重组ARU和BRU可溶性蛋白在大肠杆菌中的高水平表达。接种重组ARU和多肽偶联的重组ARU的小鼠均维持了高水平的中和抗毒素A抗体并且受高度保护免受艰难梭状芽胞杆菌毒素A的致死性攻毒。另外，Wilkins等建议使用由ARU和BRU组成的重组融合蛋白制备疫苗。
[0018]对研发抗CDAD的疫苗很有兴趣。由ARU和BRU组成的重组融合蛋白作为疫苗可能有用。
[0019]发明概述
[0020]本发明提供了设计、生产和使用来自艰难梭状芽胞杆菌的毒素A和毒素B的新工具和方法。本发明提供了包含SEQ ID N0:2(C-TAB.G5)或其衍生物SEQ ID N0:4(C-TAB.G5.1)的分离多肽C-TAB。C-TAB.G5或C-TAB.G5.1包含毒素A的C末端结构域的19个重复单元，这些重复单元与毒素B的C末端结构域的23个重复单元融合。本发明还包括包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的组合物和制剂。所述组合物或制剂可含分离多肽、附加抗原、佐剂和/或赋形剂。可选地，所述组合物或制剂可基本上由分离多肽组成，没有佐剂或其它活性成分(但是任选地包含赋形剂例如载体、缓冲液和/或稳定剂)。而且，尤其(例如)在患有复发性CDAD的受试者或需要经常和/或长期使用抗生素的受试者中，本发明的组合物或制剂可伴随其它药物例如抗生素一起施用。
[0021]本发明还提供了包含本发明的分离多肽的疫苗。疫苗可进一步包含佐剂，例如明矾、源自ADP-核糖基化外毒素的佐剂等。可按一剂方案、两剂方案(例如在3-20天内，例如在第一剂10-15天后施用)、三剂方案(例如在第一剂约7天和约21天后施用)或三剂以上的方案施用疫苗，优选两剂或三剂方案，其中所述剂量包含20 μ g至200 μ g量的本发明多肽。
[0022]本发明提供了通过向有需要的受试者施用本发明的分离多肽预防、治疗或缓解疾病(例如CDAD)的一种或多种症状的方法。可经肌肉内或通过其它递送途径向受试者施用C-TAB.G5 或 C-TAB.G5.1 分离多肽。
[0023]在一个实施方案中，本发明提供了通过向有CDAD风险的受试者施用本发明的分离多肽或包含所述多肽的组合物预防疾病Hf^nCDAD)的方法，例如具有下列特征的受试者:i)免疫系统较弱的受试者，例如老年受试者(例如65岁以上的受试者)或2岁以下的受试者；ii)免疫力低下的受试者，例如患有AIDS的受试者；iii)服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv)计划住院的受试者或住院受试者；v)在重症监护室或预期前往重症监护室(I⑶)的受试者；vi)接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii)进入或计划进入长期护理，例如疗养院的受试者；viii)患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；ix)有以上提到的两种或更多种特征的受试者，例如计划接受胃肠道手术的老年受试者；x)有炎症性肠病的受试者；和/或xi)患有复发性CDAD的受试者，例如已经历一次或多次CDAD发作的受试者。
[0024]在一个实施方案中，本发明提供了生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的方法。可使用细菌表达系统，例如大肠杆菌表达系统由编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。
[0025]在一个实施方案中本发明提供了 C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，其中毒素A的19个重复单元经由至少4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基组成的连接子与毒素B的23个重复单元连接。举例而言，本发明的连接子可包含序列RSMH(Arg-Ser-Met-His) (SEQ IDNO:2 或 SEQ ID NO:4 的氨基酸 439-442)。
[0026]在另一个实施方案中本发明提供了(例如)在ARU和/或BRU中包含至少一个突变(例如，插入、取代或缺失)的分离多肽变异体。变异体的序列与SEQ ID N0:2可能有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性。
[0027]本发明还提供了通过重组DNA工程、细菌发酵和蛋白质纯化生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽或其变异体的方法。在一个实施方案中，本发明提供了构建编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的核酸的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了使用细菌表达系统，例如大肠杆菌表达系统生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的方法。
[0028]本发明进一步提供了预防和治疗有需要的受试者，例如人类的CDAD的方法。在此方法中向受试者单独施用C-TAB.G5或C-TAB.G5.1或与一种或多种佐剂例如明矾等联合施用。受试者可能是有暴露于艰难梭状芽胞杆菌风险的健康个体，已经治疗并从艰难梭状芽胞杆菌感染中恢复并且有受艰难梭状芽胞杆菌再感染风险的人类受试者，或当前受艰难梭状芽胞杆菌感染并且可通过诱导艰难梭状芽胞杆菌毒素中和抗体改善其状况的人类受试者。
[0029]本发明提供了包含C-TAB.G5或C_TAB.G5.1的免疫原性组合物。免疫原性组合物可进一步包括呈适合应用于有需要的受试者的剂型，增强抗原特异性免疫反应的佐剂和/或药学上可接受的载体和/或其它组分。可通过肌肉内(IM)递送、皮内(ID)递送、皮下(SC)递送、腹膜内(IP)递送、口服递送、鼻腔递送、口腔递送或直肠递送来递送免疫原性组合物。
[0030]在本发明的另一个实施方案中，免疫原性组合物诱导结合天然艰难梭状芽胞杆菌毒素并且中和其细胞毒活性的抗体，从而对艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)提供了长期、主动防护和/或治疗。
[0031]因此，本发明提供了对预防或治疗有需要的受试者的艰难梭状芽胞杆菌相关疾病有用的免疫原性组合物。
[0032]在另一个实施方案中，本发明提供了编码C-TAB.G5或C_TAB.G5.1的核酸或其片段或变异体。本发明还提供了包含编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的核酸的表达载体。
[0033]本发明的另一个实施方案提供了对C-TAB.G5或C_TAB.G5.1有特异性的抗体及其片段，例如中和、人源化、单克隆、嵌合和多克隆抗体。抗体或其片段可识别毒素A和/或毒素B。
[0034]另一个实施方案提供了包含具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的多肽的疫苗。
[0035]本发明的另一个实施方案提供了包含本发明的核酸、多肽和/或抗体的诊断试剂盒。
[0036]在下面的描述中部分陈述了本发明的其它实施方案和优点，并且部分可从该描述中显而易见，或可从本发明的实践中获知。
[0037]附图简述
[0038]图1A示出了编码C-TAB.G5分离多肽的核酸(SEQ ID NO:1)。图1B示出了 C-TAB.G5分离多肽的氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。毒素A结构域和毒素B结构域之间的氨基酸连接子加有下划线。[0039]图2A示出了编码C-TAB.G5.1分离多肽的核酸(SEQ ID NO:3) ?图2B示出了C-TAB.G5.1分离多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4) ?毒素A结构域和毒素B结构域之间的氨基酸连接子加有下划线。
[0040]图3示出了通过增大C-TAB.G5的剂量并且与明矾佐剂一起联合递送，接种C-TAB.G5的小鼠体内抗体生成增加。小鼠通过頂注射接受2次接种。第一和第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。
[0041]图4示出了通过2次頂注射接受剂量增大的C-TAB.G5(有和无明矾)的小鼠体内，抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B IgG诱导的图示。
[0042]图5示出了在明矾存在或缺乏时，用C-TAB.G5免疫的小鼠体内，一个对数剂量范围内的抗体滴度。第二次免疫2周后通过ELISA评估IgG滴度。数据证明，明矾显著增加了经接种小鼠体内的抗体生成。
[0043]图6示出了对接种C-TAB.G5 (有和无明矾)，然后暴露于致死剂量的毒素A或毒素B的小鼠的保护效应。3周后攻毒(IP)在2周间隔内接受了 2次接种(IM)的小鼠。第二次注射2周后估计毒素A和毒素B中和抗体(TNA)，并测定幸免于致死性攻毒的动物百分t匕。剂量增大的C-TAB.G5赋予更强的TNA生成，以及对致死性攻毒的更强防护。明矾的存在进一步增加了 TNA生成，以及在较低剂量下赋予较高存活率。
[0044]图7示出了对经接种的幼龄(6-7周)和老龄(18个月)小鼠体内C-TAB.G5的抗体反应和保护效果的比较。3周后攻毒(IP)在2周间隔内接受了 2次接种(IM)的小鼠。估计抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的ELISA IgG滴度、TNA生成以及总存活率。幼龄小鼠甚至没有明矾也展示出较高抗体反应，并且当在明矾的存在下接种时，两个组均显示出存活率提高。
[0045]图8示出了对经接种的幼龄和老龄小鼠体内抗C-TAB IgG抗体发展的动力学的比较。幼龄小鼠展示出较高速率和较早的IgG生成，并且当在明矾的存在下接种时，两个组均展示出反应提高。
[0046]图9示出了对用C-TAB.G5.1或类毒素A和B混合物(1:1)免疫的小鼠体内，抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体生成的比较。小鼠通过頂注射接受2次接种。第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。用类毒素免疫诱导出对毒素分子的N末端部分的抗体，而用C-TAB免疫诱导出对毒素分子的C末端部分的抗体。
[0047]图10示出了对用C-TAB.G5.1或类毒素A和B混合物免疫的小鼠体内的TNA生成和对毒素A或B攻毒的防护的比较。3周后用致死剂量的毒素A或毒素B攻毒(IP)在2周间隔内接受了 2次接种(IM)的小鼠。
[0048]图11示出了在用C-TAB.G5.1(有和无明矾)免疫的仓鼠体内的抗C-TAB (A)、抗毒素A(B)和抗毒素B(C) IgG生成。在第O天和第14天仓鼠通过IM注射接受3次接种。在第14、28和35天通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。
[0049]图12示出了在用C-TAB.G5.1 (有或无明矾)免疫的仓鼠体内抗C-TAB IgG抗体发展的图示。
[0050] 图13示出了对用C-TAB.G5.1 (有或无明矾)免疫的仓鼠体内TNA和保护的比较。第三次接种2周后仓鼠通过IP注射接受致死剂量的毒素A或毒素B。[0051]图14示出了在灌胃施用致死剂量的艰难梭状芽胞杆菌孢子后接种C-TAB.G5.1的仓鼠的存活率。将存活率数据标绘为Kaplan-Meier存活拟合曲线并使用对数秩分析进行统计分析。在所有孢子剂量(102、103和IO4)下，在经接种组内观察到100%仓鼠存活率并且与安慰剂组相比存活率显著提高。
[0052]图15示出了在明矾存在或缺乏时，用C-TAB.G5.1免疫的食蟹猴体内的抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体生成。两组猴(3只/组，4-6岁)接受200 μ g的C-TAB.G5.1 (有或无250 μ g明矾)。在研究第0、14、28和42天取血样。使用ELISA法估计抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B IgG滴度。
[0053]图16示出了于PBS或组氨酸缓冲液中递送的I μ g_30 μ g剂量范围内的C-TAB.G5和C-TAB.G5.1的免疫原性的比较。小鼠在2周间隔内接受2次接种(頂)。第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。于PBS或组氨酸缓冲液中递送的C-TAB.G5和于组氨酸缓冲液中递送的C-TAB.G5.1之间，3个抗体滴度全部差异显著(T检验分析)。[0054]图17示出了对小鼠体内C-TAB.G5、C-TABNCTB和C-TADCTB的免疫原性的比较。小鼠在2周间隔内通过頂注射接受每种重组蛋白2次接种。所有免疫均在明矾佐剂缺乏时进行。第二次注射2周后通过ELISA评估抗C-TAB、抗毒素A和抗毒素B抗体的IgG滴度。所有3种融合蛋白均展示出高免疫原性。
[0055]图18示出了小鼠体内对天然毒素B攻毒的防护。如图17所示使小鼠免疫并且3周后通过IP注射用致死剂量的天然毒素B攻毒小鼠。
[0056]图19示出了对在明矾缺乏或存在时接种C-TAB.G5.1或C-TADCTB的仓鼠体内TNA和保护的比较。第三次接种2周后仓鼠通过IP注射接受致死剂量的毒素A或毒素B。
[0057]图20示出了在以不同方案用C-TAB.G5.1免疫的小鼠体内的TNA生成和对毒素A或毒素B攻毒的防护。比较在第O、3和14天或在第O、7和21天或在第O、14和28天通过頂注射接种3次的小鼠组间TNA生成和保护。最后一次注射3周后，用致死剂量的毒素A或毒素B攻毒小鼠(图A呈表格形式而图B呈图形形式)。
[0058]图21示出了在用单独剂量的10 μ g C-TAB.G5.1和12.5 μ g明矾(100 μ I)免疫的小鼠体内，对艰难梭状芽胞杆菌毒素A(55ng/只小鼠)攻毒的防护。所述攻毒在免疫21天、35天或49天后进行。
[0059]发明详述
[0060]概沭
[0061]本发明提供了用于诱导对艰难梭状芽胞杆菌毒素A和B的保护性和/或治疗性免疫反应的免疫原性组合物，包括使用分离多肽C-TAB.G5(SEQ ID NO: 2)或其衍生物C-TAB.G5.1 (SEQ ID NO:4)的用途，所述分离多肽或其衍生物包含毒素A的19个重复单元(RU)和毒素B的23个重复单元(RU)或其肽片段或变异体。
[0062]本发明还提供了生成C-TAB.G5或C_TAB.G5.1分离多肽的方法和制备可用于预防和/或治疗哺乳动物CDAD的组合物(例如，疫苗)的方法。下列描述对重组分离多肽的构建、表达和纯化，其作为抗原诱导特异性免疫反应的用途以及评估在受试者中的保护的更多详情和实例。受试者可为动物或人类。
[0063]可使用几种标准方法中的任一种制备用于本发明方法和组合物中的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽。例如，可使用标准重组DNA技术生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1，其中用含有毒素编码核酸片段的部分的适当表达载体转化适合宿主细胞(见例如Dove等，Infect.1mmun.58:480-8 (1990),和 Barroso 等，Nucleic Acids Researchl8:4004 (1990)?各种表达系统的任一种均可用于生成重组多肽。可在原核宿主(例如细菌(例如大肠杆菌或杆菌(Bacillus)))或真核宿主(例如酵母细胞、哺乳动物细胞(例如C0S1、NIH3T3或JEG3细胞)或昆虫细胞(例如表皮球菌(Spodoptera frugiperda) (SF9)细胞))中生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1。此类细胞可从(例如)美国模式培养物保藏所(ATCC)获得。转化和转染方法及表达载体的选择将取决于所选宿主系统。例如，Ausubel等，ISBN:047132938X描述了转化和转染方法。也可通过化学合成，例如通过Solid Phase Peptide Synthesis, 1984,第 2 版，Stewart 和 Young 编辑,Pierce ChemicalC0.，Rockford, 111中描述的方法或通过标准体外翻译方法生成C-TAB.G5或C-TAB.G5.1，特别是短片段。
[0064]除C-TAB.G5或C_TAB.G5.1序列外，本发明提供了其具功能活性和免疫原性的变异体。所述变异体可具有与C-TAB.G5或C-TAB.G5.1相同水平的免疫原性。与SEQ ID NO: 2或SEQ ID N0:4相比，变异体可具有氨基酸取代、缺失或插入。可使用标准方法制备编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1或其变异体的基因(见下文；还参见例如Ausubel等，同上)。
[0065]除C-TAB.G5或C_TAB.G5.1序列外，本发明进一步提供了包含附加重复序列的C-TAB.G5衍生物。举例而言，与C-TAB.G5 一样，融合蛋白C-TABNCTB (SEQ ID NO: 18，由SEQ ID NO: 17编码)包含CTA的19个重复单元(氨基酸2272-2710) ,CTB的23个重复单元(氨基酸1850-2366)和与CTB的C末端融合的CTB的另10个附加重复序列(氨基酸1834-2057)。另一变异体 C-TADCTB 融合蛋白(SEQ ID NO: 20，由 SEQ ID NO: 19 编码)包含C-TAB.G5 (CTA的19个重复序列和CTB的23个重复序列)加上与C-TAB.G5的C末端融合的CTB的24个附加重复单元(氨基酸1834-2366)。变异体还可包含附加拷贝的C-TAB.G5或其部分。例如，C-TADCTB包含C-TAB.G5中存在的双份CTB重复单元。
[0066]本发明提供了在细菌系统例如大肠杆菌中高水平表达C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的方法，包括向细菌宿主细胞中引入编码C-TAB.G5或C-TAB.G5.1的核酸并且表达C-TAB.G5或 C-TAB.G5.1。
[0067]另外，本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽可与佐剂共价偶联或交联(见，例如，Cryz 等,Vaccinel3:67-71 (1994) ;Liang 等,J.1mmunologyl41:1495-501 (1988)和Czerkinsky 等，Infect.1mmun.57:1072-77 (1989))。
[0068]本发明提供了包含C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽的疫苗，其可防护CDAD并提供对CDAD的治疗。本发明的疫苗包含可经肌肉内(頂)、皮内(ID)、皮下(SC)、口服、鼻腔、口腔或直肠途径递送的新型抗原。疫苗可提供免疫保护或诱导抗体进行被动免疫。
[0069]本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽提供了对CDAD免疫的疫苗。本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽或其变异体为靶向以将对艰难梭状芽胞杆菌相关疾病例如CDAD的保护覆盖范围扩宽至迄今未知或未公布的水平的联合疫苗候选物。单个疫苗提供保护或削弱艰难梭状芽胞杆菌相关疾病的严重程度的该理念代表了在全球水平上管理公共卫生并且特别是缓解流行病的严重程度(例如疗养院、游船)中前进的独特一步。
[0070]如本文所使用，“毒素A蛋白”或“毒素B蛋白”指是造成CDAD的主要原因的艰难梭状芽胞杆菌的毒性蛋白。毒素A和毒素B包含是C末端结合结构域中造成免疫原性的原因的多个重复单元。
[0071]如本文所使用，“野生型”或“天然”指由如同宿主细胞中内源存在的核酸或氨基酸序列构成的全长蛋白。
[0072]如本文所使用，术语“艰难梭状芽胞杆菌相关疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌有关疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌相关的疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌毒素介导的疾病”、“艰难梭状芽胞杆菌感染”和“CDAD”指由艰难梭状芽胞杆菌感染直接或间接引起的疾病。
[0073]“抗原”指当呈递于生物体的免疫细胞时，诱导特异性免疫反应的物质。例如，抗原可为核酸、蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白、融合蛋白、磷脂或其组合的偶联物。抗原可包含B细胞受体(即，B细胞膜上的抗体)或T细胞受体识别的单个免疫原性表位或多个免疫原性表位。可呈病毒样颗粒(VLP)或全细菌或微生物例如细菌或病毒体提供抗原。抗原可为灭活或减毒活病毒。可从来自全细胞或单独膜的提取物或溶解产物获得抗原；或可经化学合成或通过重组方式生成抗原。抗原可单独或与佐剂一起施用。单个抗原分子可具有抗原和佐剂性质。
[0074]用“佐剂”指可能通过抗原呈递细胞的激活，用于特异性或非特异性加强抗原特异性免疫反应的任何物质。佐剂的实例包括油乳液(例如完全或不完全弗氏佐剂(completeor incomplete Freund’s adjuvant))、Montanide 不完全 Seppic 佐剂(例如 ISA)、水包油乳液佐剂(例如Ribi佐剂系统)、含胞壁酰二肽的syntex佐剂制剂、铝盐佐剂(明矾)、聚阳离子聚合物，特别是聚阳离子肽，特别是多聚精氨酸或含至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是KLKLLLLLKLK，在限定的碱基范围内含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的免疫刺激性寡脱氧核苷酸(ODN)(例如，如W096/02555中所述)或基于肌苷和胞苷的ODN (例如，如W001/93903中所述)，或含脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(如W001/93905和 TO02/095027 中所述)，特别是寡聚(dldC) 13 (如 W001/93903 和 W001/93905 中所述)；神经活性化合物，特别是人生长激素(在W001/24822中有描述)或其组合；趋化因子(例如，防御素I或2、RANTES, MIPl-α、ΜΙΡ-2、白细胞间素-8或细胞因子(例如，白细胞间素-10、-2、-6、-10或-12;干扰素-^ ;肿瘤坏死因子-α ;或粒细胞-单核细胞-菌落刺激因子))(查阅Nohria和Rubin, 1994)、胞壁酰二肽变异体(例如，莫拉丁酯(murabutide)、苏氨酰基-MDP或胞壁酰基三肽)、MDP的合成变异体、热休克蛋白或变异体、利什曼原虫(Leishmania)主要 LeIF 的变异体(Skeiky 等，1995，J.Exp.Med.181:1527-1537)、细菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)的无毒变异体,包括胰蛋白酶裂解位点的变异体(Dickenson和 Clements, (1995) Infection and Immunity63 (5): 1617 - 1623)和 / 或影响 ADP-核糖基化的变异体(Douce等，1997)或化学解毒bARE(类毒素)、QS21, Quill A、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸_2-[1，2- 二棕榈酰基-S-甘油基-3-(羟磷酰氧基)]乙酰胺(MTP-PE)和含有可代谢油和乳化剂的组合物。佐剂可与抗原一起施用或可通过与所述抗原相同的途径或通过与所述抗原不同的途径单独施用。单个佐剂分子可具有佐剂和抗原性质。
[0075]所谓“有效量”是指治疗剂足以诱导或增强抗原特异性免疫反应(对于抗原而言)，或治疗或诊断病状(对于药物而言)的量。对免疫反应的此类诱导可提供治疗例如自身免疫性疾病的免疫保护、脱敏、免疫抑制、调节，癌症免疫监视的增强或对确定传染病的治疗性接种。治疗包括治愈、改善或预防。
[0076]所谓“核酸”是指单个脱氧核糖核酸碱基或核糖核酸或其通过磷酸二酯键连接的序列。
[0077]所谓“治疗剂”是指能够用于治疗疾病，缓解疾病的症状，预防疾病或诊断疾病的任何分子。例如，治疗剂可为抗原或药物。
[0078]所谓“受试者”是指动物。受试者可为任何动物，包括任何脊椎动物。受试者可为家畜、实验动物(包括但不限于啮齿动物，例如大鼠、仓鼠、沙鼠或小鼠)或宠物。在一个实施方案中，动物可为哺乳动物。哺乳动物的实例包括人类、灵长类动物、有袋动物、犬、猴子、啮齿动物、猫、猿、鲸、海豚、牛、猪和马。受试者可能需要治疗疾病或可能需要预防性治疗。
[0079]如本文所使用，术语“抗体”指具有特异性结合特定抗原的能力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的片段。抗体为免疫科学中的普通技术人员众所周知。如本文所使用，术语“抗体”不仅指全长抗体分子而且指维持了抗原结合能力的抗体分子片段。此类片段也在本领域中众所周知并且在体外和体内经常性使用。具体而言，如本文所使用，术语“抗体”不仅指全长免疫球蛋白分子而且指抗原结合活性片段，例如众所周知的活性片段F(ab’)2、Fab、Fv 和 Fd0
[0080]如本文所使用， 术语“变异体”可包括不同于野生型多肽的蛋白质和/或多肽和/或肽，其中一个或多个残基已经功能相似的残基保守性取代，并且其进一步展示出野生型多肽大体上相同的功能性质。保守性取代的实例包括一个非极性(疏水性)残基取代另一个(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)，一个极性(亲水性)残基取代另一个(例如精氨酸与赖氨酸之间，谷氨酰胺与天冬酰胺之间，甘氨酸与丝氨酸之间)，一个碱性残基取代另一个(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)或一个酸性残基取代另一个(例如天冬氨酸或谷氨酸)。变异体可包括具有与本发明多肽大体上相同的三级结构，也展示出如本文所述多肽的功能性质的任何多肽。变异体可为野生型多肽的突变体。
[0081]如本文所使用，“治疗”可包括用于试图改变个体或细胞自然进程的任何类型的干预。治疗可包括但不限于单独或联合本领域通常所知的其它治疗方式施用(例如)药物组合物。“治疗”可预防性进行，或在病理事件开始之后进行。
[0082]如本文所使用，“药学上可接受的载体”可包括当与活性成分组合时，允许所述成分保持生物活性并且与受试者的免疫系统无反应性的任何材料。药学上可接受的载体和/或赋形剂可包括缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。一般而言，载体或赋形剂的特性将取决于采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含注射液体，包括药学和生理学上可接受的液体，例如作为媒介物的水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋糖、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)而言，常规无毒固体载体可包括(例如)药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸山梨醇酐酯。
[0083]如本文所使用，“融合”可指核酸和多肽包含未发现按根据本发明放置的顺序或前后关系相互自然缔合的序列。融合核酸或多肽不一定包含核酸或多肽的整个自然序列。融合蛋白具有通过正常肽键连在一起的两个或更多个区段。融合核酸具有通过正常磷酸二酯键连在一起的两个或更多个区段。[0084]分离多肽
[0085]本发明提供了分别如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:4中所示的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽，其包含艰难梭状芽胞杆菌毒素A的19个重复单元和艰难梭状芽胞杆菌毒素B的23个重复单元。C-TAB.G5的同系物，例如C-TAB.G5.1与C-TAB.G5可有1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10个氨基酸不同。C-TAB.G5.1多肽是含有与C-TAB.G5相同的毒素B的C末端结构域的融合蛋白，但是源自艰难梭状芽胞杆菌VP1-10463菌株的毒素A的C末端结构域为源自艰难梭状芽胞杆菌630菌株的相应C-TAB.G5多肽的同系物并且在位置155-156位置的两个氨基酸不同。如SEQ ID N0:3中所示的C-TAB.G5.1编码序列是优化为在大肠杆菌宿主细胞中表达增强的密码子。本发明的C-TAB.G5或C-TAB.G5.1分离多肽在中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B的毒性作用中可能有效。
[0086]毒素A和毒素B分别由艰难梭状芽胞杆菌菌株630的trdA(SEQ ID N0:5)和trdB(SEQ ID NO: 7)基因编码。在结构上，艰难梭状芽胞杆菌毒素包含ADP-葡糖基转移酶结构域、半胱氨酸蛋白酶结构域、疏水区和受体结合区。C末端结构域含有高度重复单元(RU)(也称为组合重复寡肽(CROPS))。RU可为长或短寡肽并且可包含20-50个氨基酸，具有重复的共有YYF基序。RU分组为聚簇。例如，野生型trdA基因(SEQ ID N0:5)编码的毒素A，菌株630 (S EQ ID NO: 6)含有39个RU。39个RU分组为8个聚簇。野生型trdB基因(SEQ ID NO: 7)编码的毒素B，菌株630 (SEQ ID NO: 8)含有24个分组为5个聚簇的RU。以下表1和2示出了 trdA基因和trdB基因编码的艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B中每个RU的氨基酸位置。
[0087]表1:毒素A重复单元(ARU)
【权利要求】
1.一种多肽，其包含与SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列具有至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%，最优选99%序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中接种所述多肽的仓鼠历经在所有孢子剂量下(102、103和IO4)灌胃施用致死剂量的艰难梭状芽胞杆菌孢子而存活。
3.根据权利要求1或根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含源自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的C末端结构域的19个重复单元。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含源自艰难梭状芽胞杆菌毒素B的C末端结构域的23、33或47个重复单元。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽选自SEQID:2、SEQ IDNO:4,SEQ ID N0.18,SEQ ID N0:20 和与 SEQ ID:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0.18 或 SEQ IDNO:20中任一个95%同一的多肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽是分离的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其用于药物中。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其用于预防和治疗难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其用于预防有CDAD风险的受试者的CDAD。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其用于预防有CDAD风险的受试者的CDAD的多肽，其中有CDAD风险的所述受试者为:i)65岁以上的受试者或2岁以下的受试者；ii)患有AIDS的受试者；iii)服用或计划服用免疫抑制药物的受试者；iv)计划住院的受试者或住院受试者；v)在重症监护室或预期前往重症监护室的受试者；vi)接受或计划接受胃肠道手术的受试者；vii)进入或计划进入长期护理，例如疗养院的受试者患有共病且需要经常和/或长期使用抗生素的受试者；或ix)患有复发性CDAD的受试者。
11.一种用于检测受试者的艰难梭状芽胞杆菌感染的诊断试剂盒，其包含根据权利要求I至6中任一项所述的多肽。
12.一种核酸，其包含编码根据权利要求1至6中任一项所述的任何多肽的核苷酸序列。
13.—种生成根据权利要求1至6中任一项所述的多肽的方法，其包括向宿主细胞中引入编码所述多肽的核酸，在允许所述多肽表达的条件下培养所述宿主细胞，以及分离所述多肽。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或根据权利要求12所述的核酸和药学上可接受的载体或赋形剂。
15.一种抗体，其对抗根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，但不识别艰难梭状芽胞杆菌毒素A(SEQ ID NO:6)或艰难梭状芽胞杆菌毒素B (SEQ ID NO:8)。
【文档编号】A61K39/08GK103957931SQ201180073256
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2011年9月5日 优先权日:2011年9月5日
【发明者】L.埃林斯沃思, D.弗莱耶, J-H.田, S.富尔曼, S.克利普费尔-斯塔尔, G.格伦, K.韦斯特里施尼希 申请人:瓦尔内瓦奥地利有限责任公司, 因特塞尔美国有限公司