专利名称：一种用于口服齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂及其转运机制的制作方法
一种用于ロ服齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂及其转运机制技术领域该发明提出了一种新的齐墩果酸ロ服制剂，其特点在于用单硬脂酸甘油酯和硬脂酸为主要材料的齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂，提出了优化的制备エ艺和处方、其在胃肠道的稳定性、在肠道中吸收部位以及生物利用度的优越性，属于药学中纳米药物技术领域。
背景技术：
齐墩果酸(oleanolic acid,简称0A)，为齐墩果烷型五环三萜类化合物，化学名为(3 β )-3-Hydroxyolean-12-en-28_oic acid，分子式为 C3qH48O3，结构式见图 I。20世纪70年代以来，齐墩果酸(oleanolic acid，0A)的保肝作用引起人们的广泛关注。在实验研究中发现[1]，齐墩果酸可使变性坏死的肝组织恢复正常来减轻丙氨酸(ALT)活力下降，肝组织炎症反应减弱，血中丙种球蛋白下降，井能促进肝细胞再生，使坏死区迅速修复，从而抑制发胶原纤维增生，使肝硬变难以形成。有实验[2]证明OA有直接抑制谷丙转氨酶活性的特点。临床已作为肝病辅助治疗的OTC药物，用于急性化学性肝损伤、慢性肝硬化和肝纤维化[3]。然而，OA难溶于水，细胞透过性差，生物利用度差，根据生物药分类体系(Biopharmaceutics Classification System,BCS)分类，属于 Class IV 类药物，大大的限 制了其临床应用。目前市场上主要制剂形式有胶囊和分散片。固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticle, SLN)是指粒径在10 IOOOnm之间的固态胶体颗粒，它以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、单硬脂酸甘油酯等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成固体胶粒给药系统，是ー种可替代乳剤、脂质体和聚合物納米粒的新型胶体给药系统。SLN作为ロ服给药系统时，具备以下优点[4’5] :(1)制备SLN的脂材均为生物可降解、生理相容性好的天然的或合成的类脂材料，因此SLN具有良好的生理相容性；(2) SLN粒子较小，与胃肠道有较好的粘附性，可以延长药物与吸收部位的接触时间，从而增加吸收机会；(3) SLN将药物包载其中，形成实心粒子，在ロ服给药吋，可以保护不稳定药物，使其免受胃肠道环境的破坏；(4)制备エ艺简单易行，适用于エ业化生产；(5)避免有机溶剂的残留；(6) SLN具有一定的缓控释及靶向作用。为解决齐墩果酸(0A)溶解度差及滲透性低等问题，本发明采用以单硬脂酸甘油酯和硬脂酸为主要材料，辅以表面活性剂Tween-80，研制了 OA固体脂质纳米粒制剂(OA-SLN)。经大鼠ロ服灌胃给药后血药动学研究，发现OA-SLN生物利用度得到显著提高。说明OA固体脂质纳米粒在临床上较OA简单制剂如片剂具有更广阔的应用前景。经文献检索，目前没有能够显著提高OA生物利用度的固体脂质纳米粒制剂及其相关转运机制的研究报道。
发明内容
I.该发明的创新点之ー是采用两种脂质材料制备齐墩果酸固体脂质纳米粒。齐墩果酸与单硬脂酸甘油酯具有良好的物理相溶性，其部分溶解度參数之差值最小。但由仅有单硬脂酸甘油酯ー种材料制备的OA-SLN易发生凝集聚沉现象，制剂不稳定。为改善制剂稳定性及提高OA载药率，本发明使用两种脂质材料一一单硬脂酸甘油酯和硬脂酸来制备0A-SLN。该种处方组成防止了单一晶体的形成，具有晶体缺陷，为药物提供更多的容纳空间。2.该发明的创新点之ニ在于提出了 OA-SLN的制备エ艺。按优化处方取适量0A，GMS，SA溶于こ醇中作为油相，配制3% Tween-80水溶液作为水相，两相均放置80°C 90°C水浴中恒温，平衡后，在水浴中，IOOOrpm电动搅拌下，迅速将こ醇溶液滴入至水相中，继续乳化搅拌，使こ醇完全挥发。溶液迅速至于0°C超声水浴固化lOmin，室温放置即得OA-SLN纳米混悬液。制备的OA-SLN包封率大于90%，载药率为4% 5%，平均粒径为70nm 150nm。3.该发明的创新点之三在于发现该 OA-SLN制剂为固溶体结构，OA以分子形式分散于固体脂质纳米粒组成基质中。本发明中制备的OA-SLN在TEM观察下粒子形态圆整、分布均匀。X-射线衍射(XRD)和差示扫描量热技术(DSC)检测以及体外释放结果互相验证，共同表明OA药物以分子形式均匀分散在SLN组成基质中，与脂材形成固溶体结构。4.该发明的创新点之四在于发现该OA-SLN制剂在人工胃液及肠液中具有良好的稳定性，能够维持固体纳米粒形态发挥药效，有利于ロ服给药。胃肠道中苛刻的环境，对ロ服药物以及ロ服药物输送系统是一大考验。药物输送系统在胃肠道中能否稳定存在，直接影响到药物制剂的药效。本发明按照中华人民共和国药典2005版，以粒径和包封率为指标，考察OA-SLN在人工胃、肠液中的稳定性，结果表明OA-SLN在人工胃液或肠液中24h之内，粒径略有増加，但无显著变化。在人工胃液3h，人工肠液中12h，制剂的包封率无明显变化。5.该发明的创新点之五在于发现该OA-SLN制剂生物利用度显著提高。SD大鼠灌胃给药，OA-SLN的AUC与OA混悬液相比，提高了近3. 9倍，Cmax提高了23倍，达峰时间Tmax无显著性变化，均在半小时左右。OA与OA-SLN的表观分布容积(Vz/F)和表观清除率(C1/F)也有显著不同。其中，OA的Vz/F为1535. 75L/Kg，是OA-SLN的10倍。OA的清除速率明显高于制剂组。以上结果表明，OA-SLN较OA的肠吸收速率得到明显提高，SLN有明显改善OA肠渗透性，促进肠吸收的作用。该制剂生物利用度的提高为发挥药效奠定了基础。6.该发明的创新点之六在于发现该OA-SLN制剂在肠道内的吸收部位主要在于小肠部分，即十二指肠、空肠、回肠。OA经SLN包载后小肠粘附性増加了 I. 69倍，为药物与肠粘膜的接触提供了更多的机会，有利于肠粘膜对药物的吸收。大鼠原位在体肠灌流实验结果显示，大鼠在体肠循环120min后，OA-SLN在十二指肠、空肠、回肠中的累积吸收百分率分别在45 %以上，60min内，十二指肠的吸收速度大于空肠与回肠；而OA-SLN在结肠中的累积吸收百分率为25. 81±0. 93%，明显低于其他三个肠段。说明OA-SLN的主要吸收部位在小肠，这可能与小肠的生理结构有关，小肠的皱皱和绒毛使得肠腔内表面积大大増加，为药物在吸收部位的有效吸收提供了可能。7.该发明的创新点之七在于发现SLN制剂的肠粘膜转运机制为细胞间隙和跨细胞转运的协同作用，其中跨细胞转运是主要的转运途径。SLN的细胞摄取受到P-gp外排作用的影响。本发明采用三种方法研究了 SLN肠粘膜转运机制。激光共聚焦显微镜成像结果表明SLN载体对跨细胞转运和细胞旁路转运均有促进作用。SLN给药系统的跨膜转运可能存在跨细胞转运和细胞旁路转运两种途径，其中以跨细胞转运途径为主。荧光偏振研究结果表明SLN所用的表面活性剂Tween-80，以及空白药物载体SLN均可显著增加细胞膜的流动性。细胞膜流动性的改变有利于紧密连接的打开以及药物的跨细胞膜转运。细胞透过性实验结果表明，SLN给药系统为P-gp的底物，其吸收受到P-gp外排作用的影响。
图I.齐墩果酸的分子结构图。图2. OA-SLN的透射扫描图像，标尺为O. 2um。图3. OA-SLN与0A、SLN及OA+SLN X-粉末衍射图谱。其中a为0A，b为OA与SLN简单混合，c为空白SLN，d为0A-SLN。 图4. OA-SLN 与 0A,SLN 及 OA+SLN DSC 图谱。其中 a 为 0A，Λ H = 87. 77J/g,熔点为 312. 41 °C ;b 为 OA 与 SLN 简单混合，ΔΗ = 68. 03J/g，熔点为 60. 34 °C ；c 为 0A-SLN，Λ H=74. 77J/g，熔点为 59. 98°C ;d 为空白 SLN，Δ H = 72. 50J/g，熔点为 58. 87。。。图5. OA和OA-SLN体外释放曲线(η = 3)。图6.药物与SLN的结合方式。其中a为药物以分子形式分散固体脂质纳米粒中，形成固溶体结构，体现出恒速率释放特征；b为脂质分子形成“核”，药物形成“売”，包在脂质分子的外面，有明显的界面，释放时表现为短时间内的突释完全；c为药物被脂质分子包载在“核”中，在释放中体现出弛豫效应，即开始一段时间内药物释放为0，一段时间后，方出现释放。图7. OA和OA-SLN大鼠灌胃后的血药动力学曲线。给药剂量为含0A10mg/kg(η =6)。图8. OA-SLN在肠道不同部位的吸收曲线。图9. Caco-2细胞穿透实验装置图。在12孔细胞培养板上放入合适大小的Transwell , Transwell 内腔为AP侦彳，Caco-2细胞种在Transwell 的聚碳酸酯膜上，
Transwell 外腔为BL侧。细胞培养液充盈12孔细胞培养吧的培养孔。图10.Caco-2细胞摄取香豆素-SLN的共聚焦显微镜图像。(a)为空白SLN ;(b)为香豆素Coumarin-6 ;(c)为香豆素与SLN混合物；(d)为包载了香豆素的SLN，即Coumarin-6-SLN。
具体实施例方式实施例10A-SLN脂材的选择一、计算方法脂材与药物的相容性决定了制剂的成功与否以及药物包封率的高低。通过计算脂材和药物的部分溶解度參数，比较各脂材与齐墩果酸之间部分溶解度參数的差，来选择合适脂材。部分溶解度參数的计算采用GCMte]法，计算公式如下
_2] .=i￡￡.,4式中Sd、δρ、Sh分别代表色散溶解度參数、极性溶解度參数和氢键溶解度參数，Fd、Fp、Eh分别代表色散力、偶极相互作用、氢键相互作用，V是药物的摩尔体积或聚合物分子中的重复结构单元的体积。根据如下公式比较药物与类脂的部分溶解度參数的差别Λ δρ:Λ δ ρ = [ ( δ d,「δ d, d) 2+ ( δ ρ,「δ p, d) 2+ ( δ h,「δ h, d)2]1/2式中δ da为类脂的δ d，δ d,d为药物的δ d，δ pa为类脂的δ ρ，δ p,d为药物的δ ρ，s U为类脂的Sh，δ U为药物的Sh。若Λ δρ越小，表示药物与类脂的部分溶解度參数越接近，即相容性越好。本发明在长链脂肪酸和甘油酯中选择合适的脂材，选择范围为硬脂酸SA，棕榈酸PA，单硬脂酸甘油酯GMS，单月桂酸甘油酯MLN，三硬脂酸甘油酯TSN，三棕榈酸甘油酯TPN,三油酸酯Τ0Ν，三月桂酸甘油酯TLN。
ニ、结果和结论计算部分溶解度參数，得到各个脂材与药物OA之间的部分溶解度參数之差，结果如表I所示。结果可知，GMS与OA的Λ δρ最小，相容性最好。由于单ー脂材制备SLN易发生凝集聚沉现象，不稳定，而且据文献m报道，合用多种脂材制备SLN，可防止单一晶体的形成，从而形成晶体缺陷，为药物提供更多的容纳空间，有利于提高包封率。因此本发明联用GMS和SA两种脂材。表I脂材与OA的部分溶解度參数
权利要求
1.一种用于ロ服给药的齐墩果酸固体脂质纳米粒制剂，其特征在干，该制剂含有类脂材料、表面活性剤、药物齐墩果酸。所述类脂材料为单硬脂酸甘油酯和硬脂酸；所述表面活性剂为聚氧こ烯失水山梨醇单硬脂酸酯Tween-80。
2.根据权利要求I所述的制剂，该制剂为ロ服悬浮液、片剂、胶囊。
3.权利要求I所述制剂的制备方法，其特征为乳化-溶剂挥发法。具体步骤如下取适量齐墩果酸0A，单硬脂酸甘油酯GMS，硬脂酸SA溶于こ醇中作为油相，配制合适度的Tween-80水溶液作为水相，两相均放置80°C 90°C水浴中恒温，平衡后，在水浴中，IOOOrpm电动搅拌下，迅速将こ醇溶液滴入至水相中，继续乳化搅拌，使こ醇完全挥发。溶液迅速至于0°C超声水浴固化lOmin，室温放置即得OA-SLN纳米混悬液。
4.权利要求I所述的制剂在结构上位固溶体结构，OA以分子形式分散于固体脂质纳米粒组成基质中。
5.权利要求I所述的制剂在人工胃液及肠液中具有良好的稳定性，能够维持固体纳米粒形态发挥药效，有利于ロ服给药。
6.权利要求I所述的制剂生物利用度较OA混悬液提高了近3.9倍，达峰浓度Cmax提高了 23倍。
7.权利要求I所述的制剂在肠道内的吸收部位主要在于小肠部分，即十二指肠、空肠、回肠。
8.权利要求I所述的制剂ロ服后在肠道的转运机制为细胞间隙和跨细胞转运的协同作用，其中跨细胞转运是主要的转运途径。SLN的细胞摄取受到P-gp外排作用的影响。
全文摘要
该发明提出了齐墩果酸固体脂质纳米粒(OA-SLN)新剂型，属于药学中纳米药物技术领域。其结构见附图，OA药物以分子形式分散在类脂材料中，形成了固溶体结构。类脂材料组成主要为单硬脂酸甘油酯和硬脂酸，表面活性剂为Tween-80。采用乳化-溶剂挥发法经处方优选后能得到包封率＞90％，载药率＞4％的OA-SLN。发现了OA-SLN具有良好的胃肠道稳定性；生物利用度得到显著提高；肠道内的吸收部位主要在于小肠部分；口服后在肠道的转运机制为细胞间隙和跨细胞转运的协同作用，其中跨细胞转运是主要的转运途径，细胞摄取受到P-gp外排作用的影响。OA-SLN口服给药最佳制剂剂型为纳米片剂或胶囊。
文档编号A61K9/20GK102688190SQ20121012936
公开日2012年9月26日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者刘畅, 孙慧, 谢英, 陈建华 申请人:谢英, 陈建华