专利名称：用阳离子脂质体形成金纳米球壳构建基因药物共载体系及制备方法
技术领域：
本发明涉及以阳离子脂质体为模板形成金纳米球壳结构，以金纳米球壳结构为载体，构建药物和基因的共载体系，所载药物为阿霉素等抗癌药物，所载基因为SiRNA等。
背景技术：
阳离子脂质体被比较广泛的应用于药物载体和基因载体，但是脂质体是亚稳的结构，在体液中不够稳定，在体内循环时间比较短，可以对阳离子脂质体进行修饰，改善其稳定性。金纳米材料具有比较独特的物理化学特性，金纳米球壳结构因为表面等离子体共振效应，在近红外区吸收峰。研究者已有利用脂质体为模板，在表面沉积金，形成纳米空心 球结构，并利用脂质体载盐酸阿霉素等抗癌药物，用脉冲激光照射金纳米球壳，可以达到控制药物释放的目的。金纳米球壳也被广泛用于基因的载体，利用巯基与金的反应，将阳离子性聚合物修饰在金纳米空心球的表面，利用静电吸附效应，将基因吸附在金纳米空心球表面，从而构建基因载体，或者将需要投递的基因一端修饰上巯基，再利用巯基与金的结合作用，达到投递基因的目的。研究表明，在肿瘤治疗过程中，基因与药物联合治疗有很好的治疗效果，构建一个基因和药物的共载体系成为药物和基因联合治疗一个重要的内容。现在很多构建药物基因共载的方法是将药物和基因利用化学的方法接在一起，进行的化学反应的过程比较复杂，反应过后杂质不易去除，并且基因十分不稳定，操作过程，稍有不慎，会造成基因的分解；也有的研究者实现了药物和基因的共载，但是当载体携带药物和基因进入细胞后，药物和基因并不能释放到细胞质中，而药物和基因必须在细胞中能够释放才能起作用，因此需要要一个简单快捷的方法来构建一个基因和药物的共载体系，并且能够很好的实现药物和基因的释放。此发明利用金纳米空心球构建基因和药物的共载体系是一个比较好的方法，金纳米球壳结构本身毒性小，并且具有良好的光学性能，研究已表明，近红外区的脉冲激光照射，会使球壳结构破裂，从而可以释放药物和基因。
发明内容
本发明的目的在于利用以阳离子为模板形成的金纳米球壳结构，构建一个基因药物的共载体系，为基因和药物的共投递提供一个优良载体。本发明的原理是利用阳离子性脂质体进行载药，在脂质体溶液中加入氯金酸和还原剂，在脂质体的表面沉积一层金纳米空心球壳。将要投递的目标基因的一端修饰上巯基，再利用巯基与金的结合作用将基因接在金纳米球壳的表面，从而形成一个药物和基因的共载体系。
本发明的制备方法如下a.将二棕榈酰磷脂酰胆碱和单棕摘酰磷脂酰胆碱按照重量比在I :1和1:0之间进行投料，加入修饰有1，2-双(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000，1，2-双(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000的质量占总质量的5%，将上述物质溶解在磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使得磷脂浓度浓度为40-60nM，加入盐酸阿霉素，使得盐酸阿霉素浓度为5-10nM。循环冷冻融化，通过IOOnm的聚碳酸酯膜挤出，形成载药的阳离子脂质体；取上述制备的脂质体溶液lmL，加入7-18uL浓度为IOOnM氯金酸溶液，再加入10. 5uL_27uL浓度为500nM的抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳结构；b.将50nmol的单链小干扰RNA (siRNA)在pH=3. 8的缓冲溶液中还原得到带巯基单链siRNA,加入到Iml金纳米球壳溶液中，在6000rpm条件下离心10分钟,在30mM轻乙基哌嗪乙硫磺酸100mM、pH=7. 5醋酸钠溶液中重分散三次，形成药物基因共载的金纳米球壳。氯金酸和抗坏血酸的体积加入不同，形成的金壳厚度不同，吸收峰也不同。
本发明所载基因为带巯基的基因，可以将带有二硫键的基因还原，5' -H0-(CH2)6-SS- (CH2) 6-spacer 18-ACCCUGMGUU-CAUCUGCACCACdCdG- (C-H2) 6-NH2 — SH- (CH2) 6-spacer18-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2 将 50nmol 的单链 siRNA 在 ρΗ=3· 8 的缓冲溶液中还原得到带巯基单链siRNA,加入到Iml金纳米球壳溶液中,在6000rpm条件下离心10分钟，在30mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，IOOmM醋酸钠(pH=7. 5)中重分散三次，形成药物基因共载的金纳米球壳；也可以直接订做带巯基的基因，例如SH-miR-21，将带巯基的基因溶解在TE缓冲溶液中，浓度为2umol/L，按照与金纳米球壳溶液体积比在64:1与2:1的范围内混合，形成药物基因共载的金纳米球壳。本发明的优点是利用成熟的脂质体载药体系形成无毒的金纳米空心球，以金纳米空心球为基础构建了基因和药物的共载体系，为基因和药物的共投递提供了方法说明书附I :以阳离子脂质体为模板形成的金纳米球壳结构的TEM照片；图2 :药物基因共载体系不意图
具体实施例方式下面通过例子对本发明进行进一步的阐述。实施例I :a.阳离子脂质体的制备DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000按照重量比40:40:10的比例溶解在PBS溶液中(pH=7. 4)，形成60nM的脂类溶液，加入盐酸阿霉素，使得的盐酸阿霉素的浓度为5nM，将溶液按照标准的循环冷冻冷冻-融化方法制脂质体，在通过IOOnm的聚碳酸酯膜中挤出形成脂质体。将制备好的脂质体在PBS溶液中透析，除去多余的盐酸阿霉素。b.金纳米壳的形成取ImL上述制备的脂质体溶液，加入18uL IOOnM的氯金酸溶液和27uL 500nM的抗坏血酸溶液，形成的金纳米球壳吸收峰为1064nm ;制好的样品重新在PBS溶液中，透析12h。c. siRNA与金纳米球壳的连接选取的siRNA为绿色荧光蛋白沉默基因，正义链的核苷酸序列为 5’ -HO-(CH2)6-SS-(CH2)6-spacerl8-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2,寡核苷酸首先进行强稳定作用，50nmol寡核苷酸在60°C的pH=3. 8的缓冲溶液中孵化30min,把RNA溶解在50uL水中，加入pH=7. O的Tris (2-carboxyethyl)phosphineHCl (TCEP，O. 5M)，IOmin后，加入氯仿萃取，取水层，得到巯基化的RNA。将新还原的带巯基的RNA(3uM in 5mM TCEP，pH=7. 00)加入步骤b中制备的金纳米球壳溶液ImL中，超声，在4°C条件下隔夜放置。在6000rpm条件下离心10分钟，在30mM HEPES, IOOmM醋酸钠(pH=7. 5)中重分散三次。得到单链siRNA与金纳米球壳的复合物，从而构建了药物与基因的共载体系。实施例2 a.阳离子脂质体的制备DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000重量比为90:0:10，加入PBS 溶液，加入盐酸阿霉素，使得盐酸阿霉素的浓度为ΙΟηΜ，其余实施步骤与实施例I中阳离子性脂质体的制备过程相同。b.金纳米壳的形成氯金酸溶液和抗坏血酸溶液加的浓度不同，形成的金壳厚度和粒径都不同，等离子体共振效应产生的吸收峰也不同。实施例I中形成的金纳米球壳吸收峰为1064nm，在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳吸收峰为655nm。制好的样品重新在PBS溶液中透析12h。c. siRNA与金纳米球壳的连接选取的siRNA为绿色荧光蛋白沉默基因，正义链的核苷酸序列为 5’ -HO-(CH2)6-SS-(CH2)6-spacerl8-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2,寡核苷酸首先进行强稳定作用，50nmol寡核苷酸在60°C的pH=3. 8的缓冲溶液中孵化30min,把RNA溶解在50uL水中，加入pH=7. O的Tris (2-carboxyethyl)phosphineHCl (TCEP, O. 5M)，IOmin后，加入氯仿萃取，取水层，得到巯基化的RNA。将新还原的带巯基的RNA(3uM in 5mM TCEP，pH=7. 00)加入步骤b中制备的金纳米球壳溶液ImL中，超声，在4°C条件下隔夜放置。在6000rpm条件下离心10分钟，在30mM HEPES, IOOmM醋酸钠(pH=7. 5)中重分散三次。得到单链siRNA与金纳米球壳的复合物，从而构建了药物与基因的共载体系。实施例3 a.阳离子脂质体的制备DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000重量比为90:0:10，其余实施步骤与实施例I中阳离子性脂质体的制备过程相同。b.金纳米壳的形成加入18uL IOOnM的氯金酸溶液和27uL 500nM的抗坏血酸溶液，形成的金纳米球壳吸收峰为1064nm ;加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳吸收峰为655nm。制好的样品重新在PBS溶液中透析12h。c.基因与金纳米球壳的连接将SH-miR-21(20ymol/L)用TE缓冲液(10mmol/L，PH=8. O的Tris-HCL，lmmol/L EDTA)稀释至一定的浓度，带巯基的miR-21浓度为2 μ mol/L,根据预先设计好的体积比例(64:1、16:1、2:1)，将相同量的SH_miR-21与金纳米球壳在TE缓冲溶液中混合，室温孵育20分钟后得到两者的复合物，从而构建了药物与基因的共载体系。实施例4:a.阳离子脂质体的制备DPPC，MPPC，DPPE-PEG2000重量比为 45:45:10，其余实施步骤与实施例I中阳离子性脂质体的制备过程相同。b.金纳米壳的形成氯金酸溶液和抗坏血酸溶液加的浓度不同，形成的金壳厚度和粒径都不同，等离子体共振效应产生的吸收峰也不同。实施例I中形成的金纳米球壳吸收峰为1064nm，在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳吸收峰为655nm。制好的样品重新在PBS溶液中透析12h。c.基因与金纳米球壳的连接将SH-miR-21(20ymol/L)用TE缓冲液(10mmol/L，PH=8. O的Tris-HCL，lmmol/L EDTA)稀释至一定的浓度，带巯基的miR-21浓度为2 μ mol/L,根据预先设计好的体积比例(64:1、16:1、2:1)，将相同量的SH_miR-21与金纳米球壳在TE缓冲溶液中混合，室温孵育20分钟后得到两者的复合物，从而构建了药物与基因的共载体系。实施例5:a.阳离子脂质体的制备DPPC，MPPC，DPPE-PEG2000重量比为 45:45:10，其余实施步骤与实施例I中阳离子性脂质体的制备过程相同。b.金纳米壳的形成氯金酸溶液和抗坏血酸溶液加的浓度不同，形成的金壳厚度 和粒径都不同，等离子体共振效应产生的吸收峰也不同。实施例I中形成的金纳米球壳吸收峰为1064nm，在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳吸收峰为655nm。制好的样品重新在PBS溶液中透析12h。c.将 SH-miR-21 (20 μ mol/L)用 TE 缓冲液(10mmol/L，ΡΗ=8· O 的 Tris-HCL，ImmoI/LEDTA)稀释至一定的浓度，带巯基的miR-21浓度为2 μ mol/L,根据预先设计好的体积比例(64:1、16:1、2:1)，将相同量的SH-miR-21与金纳米球壳在TE缓冲溶液中混合，室温孵育20分钟后得到两者的复合物，从而构建了药物与基因的共载体系。实施例6:a.阳离子脂质体的制备DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000重量比为45:45:10，加入的PBS溶液，形成浓度为60nM的脂质溶液，加入盐酸阿霉素，使得盐酸阿霉素浓度为10nM，其余实施步骤与实施例I中阳离子性脂质体的制备过程相同。b.金纳米壳的形成氯金酸溶液和抗坏血酸溶液加的浓度不同，形成的金壳厚度和粒径都不同，等离子体共振效应产生的吸收峰也不同。在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳吸收峰为655nm。制好的样品重新在PBS溶液中透析 12h。c.将 SH-miR-21 (20 μ mol/L)用 TE 缓冲液(10mmol/L，ΡΗ=8· O 的 Tris-HCL，Immo I/LEDTA)稀释至一定的浓度，带巯基的miR-21浓度为2 μ mol/L,根据预先设计好的体积比例(64:1、32:1，、16:1、8:1、2:1)，将相同量的SH-miR-21与金纳米球壳在TE缓冲溶液中混合，室温孵育20分钟后得到两者的复合物，从而构建了药物与基因的共载体系。所用siRNA基因序列为5，-HO-(CH2)6-SS-(CH2)6-spacer18-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2所用带巯基的microRNA序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGU
权利要求
1.以阳离子性脂质体为模板形成的金纳米空心球壳结构的药物基因共载体系，其特征是利用阳离子性脂质体载亲水性的药物，在阳离子脂质体外包裹金，形成内部载药的金纳米球壳结构，基因通过巯基接在金纳米球壳结构的表面，从而构建内部载药、外部载基因的金纳米球壳共载体系。
2.如权利要求I所述的体系，其特征是所述的药物为盐酸阿霉素的亲水性抗癌药物。
3.如权利要求I所述的体系，其特征是所述的基因为所有带巯基或者可以修饰出巯基的基因。
4.构建权利要求I的金纳米空心球壳结构的药物基因共载体系的的方法，其特征是步骤如下 a.将二棕榈酰磷脂酰胆碱和单棕摘酰磷脂酰胆碱按照重量比在I: I和I : O之间进行投料，加入修饰有1，2-双(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000，1，2-双(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000的质量占总质量的5%，将上述物质溶解在磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，使得磷脂浓度浓度为40-60nM，加入盐酸阿霉素，使得盐酸阿霉素浓度为5-10nM。循环冷冻融化，通过IOOnm的聚碳酸酯膜挤出，形成载药的阳离子脂质体；取上述制备的脂质体溶液lmL，加入7-18uL浓度为IOOnM氯金酸溶液，再加入10. 5uL_27uL浓度为500nM的抗坏血酸溶液，形成金纳米球壳结构； b.将50nmol的单链小干扰RNA(siRNA)在pH=3. 8的缓冲溶液中还原得到带巯基单链siRNA，加入到Iml金纳米球壳溶液中，在6000rpm条件下离心10分钟，在30mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸100mM、pH=7. 5醋酸钠溶液中重分散三次，形成药物基因共载的金纳米球壳。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是所述步骤b.为直接订做带巯基的基因SH-miR-21，将带巯基的基因溶解在碱性缓冲溶液中，浓度为2umol/L，按照与金纳米球壳溶液体积比在64 : I与2 : I的范围内混合，形成药物基因共载的金纳米球壳。
全文摘要
本发明涉及用阳离子脂质体形成金纳米球壳构建基因药物共载体系及制备方法；阳离子脂质体用DPPC，MPPC，DPPE-PEG等磷脂及其衍生物通过膜挤出发行程阳离子脂质体，在形成过程中将亲水性的药物盐酸阿霉素载入脂质体中，形成载药的阳离子性脂质体，在阳离子性脂质体溶液中加入氯金酸溶液，吸附在阳离子脂质体表面，加入的抗坏血酸溶液还原，形成金纳米球壳结构。将带二硫键的绿色荧光蛋白沉默基因的单链还原出巯基，接在金纳米球壳的表面，形成基因和药物的共载体系。金纳米球壳毒性低，并有比较独特的光学性质，以金纳米球壳构建药物基因共载体系可以为药物和基因的共治疗提供载体，可以选择光来照射金纳米球壳，利用光热转化性质实现药物和基因的共释放。
文档编号A61K47/02GK102805873SQ20121016812
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者高立章, 刘贵高, 原续波, 何芳 申请人:天津大学