一种对抗新城疫病毒感染的长效多肽及其修饰物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗新城疫病毒感染的多肽及其修饰物。所述多肽的氨基酸序列为序列表中序列1；所述修饰物为用胆固醇对所述多肽氨基末端进行修饰所得的产物；所述修饰为在序列表中序列1的第一个氨基酸上连接所述胆固醇。本发明所提供的多肽修饰物可高效地抑制病毒入侵宿主细胞，在抗病毒活性方面效果明显（细胞水平为12nM单位，鸡胚水平为0.1mg单位，鸡活体水平为0.5mg单位），且在新城疫病毒感染前2天至2天后肌肉注射，皆可有效抵御这种可入侵禽类血脑屏障的高致病性病毒感染。本发明为多肽类制剂的应用提供了重要依据，在动物医学领域具有重要的应用前景和创新意义。
【专利说明】一种对抗新城疫病毒感染的长效多肽及其修饰物
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种抗新城疫病毒感染的多肽及其修饰物。
【背景技术】
[0002]目前畜牧业产值占全国农业总产值的32%，在国民经济中发挥着越来越重要的作用，其中畜禽传染病的防治在畜牧兽医科学研究中居首要位置。新城疫病毒是严重威胁养禽业的“第一杀手”，由新城疫病毒为主的病原体多重感染所引致的多病因呼吸道传染病，目前是造成家禽养殖经济损失的主要因素，据农业部2010年工作年度报告，我国仅由新城疫造成的经济损失每年均超过二十亿元！而由此引发的相关损失则难以估量。近年来新城疫病毒感染的宿主范围还有不断扩大的趋势，与呼吸道传染病禽流感相似，该病毒变异及进化速度很快，不仅可感染二百多种水禽，并可跨种感染哺乳动物，对人类健康影响不容忽视！研制出对抗该病毒感染高效制剂，是现今迫在眉睫尚待解决的科学论题。
[0003]本课题组证明，在新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)入侵过程中，融合糖蛋白的七肽重复区域(heptad repeat) HRl与HR2相互折叠形成六聚体结构(6-Helix),使病毒囊膜与宿主细胞的脂质双层膜拉近，引致不可逆的膜融合过程发生；体外合成的HR2多肽可特异地通过竞争结合其配体HR1，以阻断病毒自身6-Helix结构的形成，由此抑制融合糖蛋白介导的膜融合过程。Galdieix)等采用基因突变策略将源自人艾滋病毒HR2区域多肽的氨基或羧基末端用2-4个赖氨酸或谷氨酸修饰，获得抗病毒入侵活性更明显的新型多肽；Nishikawa等将HR2螺旋亲水面的b，c，f及g位氨基酸置换为赖氨酸或谷氨酸，结果表明盐桥作用可增强多肽的螺旋形成趋势。
[0004]将蛋白/多肽等与生物可降解的高分子可溶性化合物通过一定的化学手段结合(如化学交联法)成复合物，可赋予多肽类药物新的优良性能(如降低生物技术药物的清除率)。通常选用高分子化合物有右旋糖酐、清蛋白、聚乙二醇(PEG)等。其中，聚乙二醇化是将聚乙二醇分子连接在蛋白分子上以延长其半衰期，可通过较少的给药次数达到相应生物效应，由于水分子的吸引，其流体动力学大小升高更多，可降低药物的清除半衰期。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种抗新城疫病毒感染的多肽。
[0006]本发明所提供的多肽的氨基酸序列为序列表中序列I。
[0007]其中，序列I由33个氨基酸组成。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种抗新城疫病毒感染的多肽修饰物。
[0009]本发明所提供的多肽修饰物为用胆固醇对所述多肽进行修饰所得的产物；所述多肽的氨基酸序列为序列表中序列I。
[0010]在本发明的实施例中，所述修饰具体为在序列表中序列I的第一个氨基酸上连接所述胆固醇，所采用的是胆固醇氯甲酸酯与多肽第一个氨基反应的常规修饰方法，即胆固醇氯甲酸酯的氯离子(CL)被取代掉继而与多肽氨基联接。[0011 ] 所述多肽(序列I)或所述多肽修饰物在制备如下任一产品中的应用也属于本发明的保护范围:
[0012]I)抗新城疫病毒产品；
[0013]2)治疗和/或预防由新城疫病毒感染所致疾病的产品。
[0014]本发明的再一个目的是提供一种抗新城疫病毒的产品，或治疗和/或预防由新城疫病毒感染所致疾病的产品。
[0015]本发明所提供的产品的活性成分为所述多肽或所述多肽修饰物。
[0016]在本发明中，所述新城疫病毒为鸡新城疫病毒，具体为F48E9毒株、La Sota毒株、K毒株或R毒株。
[0017]所述修饰物的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0018]本发明所提供的修饰物的制备方法包括以下步骤:制备氨基酸序列是序列表中序列I的多肽，将序列I的第一个氨基酸上连接胆固醇，得到所述修饰物。
[0019]所述多肽(序列I)的编码基因，或含有所述编码基因的重组载体、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
[0020]本发明在对囊膜病毒融合糖蛋白七肽重复区域结构及功能研究的基础上进行基因改造与修饰，得到序列表中序列I所 示的多肽及其修饰物，该多肽胆固醇修饰物可高效地抑制病毒入侵宿主细胞，在抗病毒活性方面效果明显(细胞水平为12nM单位，鸡胚水平为0.1mg单位，鸡活体水平为0.5mg单位)，且在新城疫病毒感染前后2天内肌肉注射，皆可有效抵御这种可入侵禽类血脑屏障的高致病性病毒感染。多肽类药物具备用药剂量小、不易产生耐药性，且毒副作用低等突出优势，而修饰后多肽的抗病毒时间延长，为多肽类制剂的应用提供了重要依据，在动物医学领域具有重要的应用前景和创新意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为七肽重复区(heptad repeat, HR)各位点(a_g位点)相对空间位置示意图。左为侧面图，右为俯视图。其中，a位点为α-螺旋形成的最重要关键区域，多为亮氨酸(Leu，L)与异亮氨酸(lie，I) ；d, e位点为α -螺旋形成的次要关键区域，亦属蛋白结合区；b，c，f，g位点多为极性氨基酸，为水溶性区域。
[0022]图2为在12nM终浓度下各多肽对NDV病毒感染所致细胞病变的影响。其中，A代表序列I所示多肽，B代表多肽的胆固醇修饰物，C代表序列2所示对照多肽。A-C中，I均表示病毒与多肽共同加入细胞；2均表示病毒与多肽37°C混合I小时后加入细胞；3均表示先加入病毒，37°C抚育45分钟后，再加入多肽；4均表示先加入多肽于4°C混合30分钟，然后再感染病毒。
[0023]图3为鸡胚实验中，接种NDV病毒株F48E9 (200个TCID5tl,即病毒原液Iml进行IO6稀释后取IOOyL病毒液)和0.1mg多肽(0.25mM，100 μ 1)，不同时段病毒感染所致鸡胚病变情况分析。其中，其中，A代表序列I所示多肽；Β代表多肽的胆固醇修饰物；C代表序列2所示对照多肽。
[0024]图4为鸡体内实验中，接种NDV病毒株F48E9和0.5mg多肽(L 25mM, 100 μ I )，病毒不同稀释度感染所致鸡体病变情况分析。其中，A代表多肽的胆固醇修饰物出代表序列I所示多肽；C代表序列2所示对照多肽。[0025]图5为鸡体内实验中，接种NDV病毒株F48E9 (200个TCID5tl)和0.5mg多肽(1.25mM，100 μ 1)，不同时段(天)病毒感染对鸡体存活率的影响。其中，A代表病毒感染前I天加入多肽的胆固醇修饰物；Β代表病毒感染前2天加入多肽的胆固醇修饰物；C代表病毒感染同时加入多肽的胆固醇修饰物山代表病毒感染后I天加入多肽的胆固醇修饰物；E代表病毒感染后2天加入多肽的胆固醇修饰物；F代表病毒感染同时加入序列2所示对照多肽。
[0026]图6为胆固醇氯甲酸酯结构,分子式为C28H45ClO2,分子量为449.11。
【具体实施方式】
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]本发明中所用新城疫病毒为鸡新城疫病毒(NDV)毒株F48E9、标准弱毒La Sota株、以及分离毒株K与R，均购自中国兽药监察所，产品目录号均为毒株全称。
[0030]9-10日龄鸡胚:北京梅里亚公司，产品目录号为“ CtSPF鸡胚”。
[0031]4周龄鸡:北京梅里亚公司，产品目录号为“ C SPF鸡”。
[0032]本发明所涉及的术语:
[0033]细胞病变(cytopathic effect，CPE):为致细胞病变作用，指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性，利用此种病变效应可进行病毒定量。病毒感染形成细胞病变常见合胞体(即多个细胞聚集一起形成多核的大细胞)与噬斑(细胞脱落形成空斑)两种。
[0034]病变融合率:形成合胞体的病变细胞占所有细胞的比率。合胞体即多个细胞膜融合后形成巨大细胞，里面很多细胞核挤在一起。
[0035]IC50:在蛋白抗病毒的抑制试验中常用到IC5tl，其为病变细胞(如合胞体)占所有细胞的比率(即病变融合率)为50%时蛋白所对应的浓度，即50%inhibition constraction,IC500
[0036]实施例1、多肽及其修饰物的制备
[0037]根据新城疫病毒(NDV)F48E9毒株融合糖蛋白HR2区域(氨基酸序列如序列表中序列3所示，对应于GenBank N0.:AF079172的氨基酸序列的第467-497位)的高级结构(HR各位点(a-g位点)相对空间位置示意图如图1所示)，对其进行氨基酸突变与重组，即首先保持a位点为亮氨酸或异亮氨酸；将亲水位点b、c、f、g交叉突变为带电氨基酸(如赖氨酸K与谷氨酸E)，同时将新合成多肽的氨基末端用两个连续的赖氨酸(KK)，羧基末端用两个连续的谷氨酸(EE)进行修饰以维持电荷平衡；再将蛋白结合位点d的484位氨基酸由Ser突变为 Val,经软件预测(http: //www.ch.embnet.0rg/software/helix form, html),此突变可以促α-螺旋形成趋势。经上述突变与重组后得到序列表中序列I所示的多肽。序列2所示的对照多肽与上述多肽结构相似，特别的是，鉴于HRl为HR2模拟蛋白的作用位点，根据氨基酸极性或疏水性等特性对多肽d、e位点进行同义突变，再根据HR互作预测软件(http://www.ch.embnet.0rg/software/COILS form, html)选择与 HRl 祀位结合可能性最低的序列，即可能性小于30%，以确保所设计多肽(未修饰多肽)的抗病毒活性并非由于引入大量荷电氨基酸EE或KK所致，并同时排除非特异性原因。此外，在序列I所示多肽的基础上，再采用胆固醇(胆固醇氯甲酸酯)修饰于其氨基末端(序列I的第一个氨基酸)，即得到序列I所示多肽的胆固醇修饰物。
[0038]简而言之，I)树脂溶胀:树脂wang resin先用二氯甲烷DCM(15ml/g)作用并振荡30min，使树脂具有很好的溶胀性能，立体上是一个空间网状结构，反应物分子可以在树脂内部自由移动。2)氨基酸连接:通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Lys(Boc)-OH (N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸)保护氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DMAP (4- 二甲氨基吡啶)，DCC (二环己基碳二亚胺)，最后加入DMF (二甲基甲酰胺)溶解，振荡30min。用醋酸酐封闭。3)连接检测:采用茚三酮法(Kaiser)检测连接效率，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾，苯酚溶液各一滴，105°C — 110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应。4)洗:DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)洗两次。5)多肽修饰:以体积比为2: I，混合DMF与二甲基亚砜DMSO溶解液，加入至三倍量的氯甲酸酯中，超声至溶解完全(时间不可过长)，加入吡啶调节pH=8-9，与上述4)混合。6)检测:加少量DCM至液体没过树脂，加热至40摄氏度，氮气鼓泡反应120min，茚三酮检测应呈阴性，即反应完全。7)洗树脂:DMF(IOml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(IOml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干IOmin0 8)切割树脂;将由体积百分含量94% (v/v)的三氟乙酸TFA,2.5% (v/v)的水、2.5% (v/v)的I, 2-乙二硫醇EDT和1% (v/v)的苯甲硫醚TIS组成的混合溶液作为碳正离子俘获试剂，以减少正离子对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应，切割时间为120min。9)胆固醇修饰多肽纯化:用HPLC和MS断定所需要的纯度80%以及分子量的准确性。即选择HPLC进行修饰多肽的纯度分析，采用Kromasil 100-5C18,
4.6mmX 250mm, 5micron 的柱子；流动相:Buffer A 是 0.1%TFA/H20 (体积百分含量为 0.1%的TFA水溶液)；Buffer B是0.1%TFA/CAN (体积百分含量为0.1%的TFA/醋酸-硝酸纤维素溶液)；洗脱梯度是:10%-50% (v/v) Buffer B ;时间是16min。选用电喷雾ES1-MS质谱分析进行分子质量的确定，即采用流动率为0.2ml/min,反应时间是I分钟，Buffer A是
0.1%HC00H/H20 (体积百分含量为0.1%的甲酸的水溶液)，Buffer B是0.1%HC00H/CAN (体积百分含量为0.1%的甲酸的醋酸-硝酸纤维素溶液)，所测修饰多肽分子质量为4322.22，其中多肽自身分子质量3909.61，胆固醇氯甲酸酯分子式为C28H45ClO2，分子量为449.11，其结构图如图6所示，结果表明修饰多肽合成及其纯度均符合实验要求。
[0039]实施例2、多肽及其修饰物作用靶点的检测及其二级结构稳定性的检测
[0040]本实施例所涉及的多肽及其修饰物为实施例1制备所得，共有如下四个:
[0041]I)多肽:氨基酸序列如序列表中序列I所示的多肽。
[0042]2)多肽的胆固醇修饰物:在序列I所示的多肽的N端进行胆固醇修饰所得的产物。
[0043]3)对照多肽:氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽。
[0044]4)野生HR2多肽:氨基酸序列如序列表中序列3所示的多肽。
[0045]采用蛋白质体外结合试验进行多肽及其修饰物作用靶点研究及其二级结构稳定性的检测。鉴于HRl为HR2的作用位点，直接采用Jasco J-715圆二色谱实验开展研究，操作温度为25°C，光路为0.1cm，记录波长范围为195-235nm。具体操作如下:将上述四种多肽分别与 HRl 多肽(氨基酸序列 Aall9-172 位，AAVALNQAQ ENARNIffRLKESIKKTNEAVLELKDGLATTAIALDKVQKFINDDI)等摩尔混合，使每个体系中两种多肽总和的终浓度均为ΙΟμΜ ;同时设置五种多肽(上述四种多肽和HRl多肽)中每一种多肽各自的单独体系作为对照，每种多肽在各自单独体系中的终浓度均为ΙΟμΜ。以上述五个单独体系和四个混合体系为研究对象，研究上述四个多肽的作用靶点及其二级结构的热稳定性。
[0046]对上述四个多肽的作用靶点的研究结果表明，所有多肽均在208nm与222nm出现两个波谷，为标准的α -螺旋结构，与野生HR2多肽和HRl多肽混合体系相比，对照多肽与HRl多肽混合物的螺旋形成趋势未发生明显变化，而多肽(或多肽的胆固醇修饰物)与HRl多肽混合物的螺旋形成趋势更加明显。这一结果表明，序列I所示多肽(或多肽的胆固醇修饰物)的靶位与野生HR2多肽相同，仍是HRl。
[0047]对上述四个多肽二级结构的热稳定性的研究结果表明，在222nm下，与对照多肽和HRl多肽混合体系相比，多肽(或多肽的胆固醇修饰物)与HRl多肽混合物的热变性温度更高，具体的，对照多肽和HRl多肽混合体系的热变性温度约为50°C，这与各单体热变性温度相近；多肽的胆固醇修饰物与HRl多肽混合物的热变性温度大于100°C (100°C时二级结构仍没有被破坏)；多肽与HRl多肽混合物的热变性温度为85°C。野生HR2多肽与HRl混合体的热变性温度为85°C。这一结果表明，多肽(或多肽的胆固醇修饰物)与HRl多肽所形成的复合体很稳定。
[0048]实施例3、细胞水平检测多肽及其修饰物对新城疫病毒的抗感染活性
[0049]本实施例所涉及的多肽及其修饰物为实施例1制备所得，共有如下四个:
[0050]I)多肽:氨基酸序列如序列表中序列I所示的多肽。
[0051]2)多肽的胆固醇修饰物:在序列I所示的多肽的N端进行胆固醇修饰所得的产物。
[0052]3)对照多肽:氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽。
[0053]4)野生HR2多肽:氨基酸序列如序列表中序列3所示的多肽。
[0054]一、感染模型的制备
[0055]1、鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞毒增殖
[0056]原代鸡胚成纤维(CEF)细胞的获得:在无菌条件下，将9-10日龄鸡胚取出后，仔细将头尾、骨头与脂肪组织剔除，余下部分用PBS洗涤3遍后尽量剪成小块，加0.25%胰酶消化30分钟，PBS洗涤3遍后加入70毫升含有10%血清的DMEM培养液，北京迈晨公司，产品目录号为CM15019)，大力冲洗出成纤维细胞，含有细胞的培养液过三层纱布，以5ml/瓶或200 μ L/24孔板分装，37°C细胞培养24小时后(覆盖率达80%以上)即可进行下一步实验。
[0057]按照细胞瓶培养液1/10体积的量接种鸡新城疫病毒(NDV)毒株F48E9的病毒原液，待原代鸡胚成纤维细胞病变(形成大合胞体)达75% (—般为48小时)时，采用反复冻融法收获病毒，即将细胞瓶放入-20°C冻存2小时后放置室温至部分融化，此时平摇细胞瓶使贴壁细胞脱壁，再次放入-20°C冻存，如此反复3次，使病毒从细胞中释放出来，细胞毒放-20°C或-70°C冻存。
[0058]2、步骤I所得细胞毒的毒力测定
[0059]采用细胞病变(合胞体)实验检测步骤I所得细胞毒的毒力，具体操作如下:
[0060]将步骤I得到的细胞毒进行10倍比稀释得到IO1-1O12不同稀释度的细胞毒悬液；用96孔板培养CEF细胞至单层，向各孔中加入细胞毒悬液，50 μ L/孔，共十二个稀释度，每个稀释度设八个孔，同时设置正常不加入细胞毒的细胞对照，于37°C的二氧化碳培养箱中放置30小时后观察细胞病变(CPE)并计算TCID5tl (形成细胞病变的病毒滴度)。实验重复3次，结果取3次重复的平均值。
[0061]TCID50的计算方法:记录出现CPE现象的孔的比率值高于且最接近50%的病毒稀释度，以及低于且最接近50%的病毒稀释度，并计算比距，从而获得TCID5tl结果。其中，比距=(高于且最接近50%的出现CPE现象的孔的比率值一 50%)/(高于且最接近50%的出现CPE现象的孔的比率值一低于且最接近50%的出现CPE现象的孔的比率值);I个TCID5tl=比距X (低于且最接近50%的出现CPE现象的孔的病毒稀释度的对数-高于且最接近50%的出现CPE现象的孔的病毒稀释度的对数)+高于且最接近50%的出现CPE现象的孔的病毒稀释度的对数。
[0062]结果表明NDV的病毒TCID5tl效价为2 X IO9,即将病毒原液Iml按照1:1O6的体积比进行稀释后，接种48孔细胞板，以50 μ L/孔，另加入50 μ L/孔培养液，培养30小时后，该细胞板将出现100个TCID5tl单位的噬斑,此为以后步骤的病毒标准参考量。
[0063]二、抑制实验
[0064]将上述步骤一 I中冻存的细胞毒原液稀释1:106，准备用于接种48孔细胞板，50 μ I/孔，另加入50 μ L/孔培养液(DMEM，北京迈晨公司，产品目录号为CM15019)，即接种量为100个TCID5tlt5将上述准备好的病毒稀释液按照上述接种量与不同终浓度(病毒+多肽+细胞体系浓度)(5、10、50、250、1000、5000、20000、4000011]\0的上述四种多肽溶液中的任一种(多肽，或多肽胆固醇修饰物，或对照多肽，或野生HR2多肽；溶剂为无菌超纯水，50 μ I/孔)，同时加入48孔细胞板中步骤一 I中获得的CEF细胞的单细胞层。37°C，CO2温箱继续培养30h后,用0.5% (0.5g/100ml)吉姆萨染液染色3_5min,水洗后镜检,每孔板取五个视野并计算IC5(I。实验重复三次。结果显示，多肽和多肽的胆固醇修饰物在nM级浓度即可有效抑制抑制病毒感染，明显强于野生HR2多肽(μ M级，详见参考文献Structure andfunction study of paramyxovirus fusion protein heptad repeat peptides, Archivesof Biochemistry and Biophysics，2005，436 (2)，316-322)。此外，未修饰的多妝和多妝的胆固醇修饰物，与野生HR2多肽的IC5。分别为10.5±1.4ηΜ、8.8±1.0ηΜ，10±3.2μΜ，表明未修饰多肽和多肽的胆固醇修饰物较野生HR2多肽抗病毒效果更强。
[0065]此外，分别在如下四 种情况下，病毒(100个TCID5tl)与12ηΜ多肽加入48孔板中培养的步骤一 I中获得的CEF细胞的单细胞层:1)病毒与多肽共同加入；2)病毒与多肽37°C混合I小时后加入；3)先加入病毒，37°C抚育45分钟后，再加入多肽；4)先加入多肽于4°C混合30分钟，然后再感染病毒。结果详见图2，从图中可以看出，当多肽浓度为12nM时，多肽的胆固醇修饰物的抗病毒活性较未修饰的多肽在病毒感染不同处理阶段均有优势，且病毒感染前加入(图2中的A4和B4比较)效果相对显著，但所有实验条件下两种多肽抗病毒活性仍在一个数量级。
[0066]实施例4、鸡胚内实验检测多肽及其修饰物对新城疫病毒的抗感染活性
[0067]本实施例所涉及的多肽及其修饰物为实施例1制备所得，共有如下四个:
[0068]I)多肽:氨基酸序列如序列表中序列I所示的多肽。
[0069]2)多肽的胆固醇修饰物:在序列I所示的多肽的N端进行胆固醇修饰所得的产物。
[0070]3)对照多肽:氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽。
[0071]4)野生HR2多肽:氨基酸序列如序列表中序列3所示的多肽。
[0072]一、感染模型的制备
[0073]1、鸡胚毒的增殖
[0074]9-10日龄鸡胚经尿囊腔每胚接种10 μ I购买的新城疫病毒F48E9，培养至鸡胚死亡后收集尿囊液(约65小时)，即为鸡胚毒，按照实施例3步骤一 2所述方法进行细胞病变(合胞体)实验以测定其TCID5tl,随后冻存于_70°C。病毒感染鸡胚可见出血现象。
[0075]2、步骤I所得的鸡胚毒的毒力测定
[0076]将9-10日龄鸡胚(5只)经尿囊腔接种步骤I所得的鸡胚毒，每只鸡胚接种50个TCID50单位，即病毒原液Iml按照1:106的体积比进行稀释后，取25 μ L，在鸡胚死亡后，观察鸡胚病变及记录死亡时间。
[0077]结果显示，鸡胚呈现全身出血性病变(出血病变程度为+++)，死亡时间为65小时，所有鸡胚结果一致。病毒引致鸡胚病变表征为出血(NDV)，肉眼即可观察并区分正常与感染状况。鸡胚出血病变程度分以下几个等级:_ (不出现出血胚)，+ (轻微)，++ (中等)，+++(严重)。
[0078]二、抑制实验
[0079]将9-10日龄鸡胚随机分13组，每组5只。将13组鸡胚均经尿囊腔接种步骤I所得的鸡胚毒原液，每只鸡胚接种50个TCID5tl单位)，并同时经尿囊腔接种不同浓度的多肽(或多肽胆固醇修饰物，或对照多肽，或野生型HR2多肽)(0.1mg/只、0.5mg/只或1.0mg/只)，每种多肽每个剂量均接种I组，另I组仅加病毒。观察并统计鸡胚存活时间，同时待鸡胚死亡后观察病变。实验重复三次。结果表明，每只鸡胚接种0.lmg(0.25mM, 100 μ I)的未修饰的多肽，或多肽的胆固醇修饰物，或野生型HR2多肽均可完全抑制NDV感染鸡胚的病变(即鸡胚不出血，出血病变程度为_)，鸡胚可存活超过140小时；每只鸡胚接种0.5mg的未修饰的多肽，或多肽的胆固醇修饰物，或野生型HR2多肽均可完全抑制NDV感染鸡胚的病变(即鸡胚不出血，出血病变程度为_)， 鸡胚可存活超过140小时；每只鸡胚接种Img的多肽(所有多肽)均影响鸡胚自身发育，从而加重NDV (强毒)对鸡胚的毒害，与感染模型中鸡胚病变程度相仿(出血病变程度为+++)，均存活至65小时。在同样实验条件下(0.1mg/只、0.5mg/只或1.0mg/只)，对照多肽与感染模型中鸡胚病变程度均相仿(出血病变程度为+++)，亦存活至65小时。
[0080]鉴于上述未修饰的多肽与野生型HR2多肽的抗病毒活性相近，故采用200个TCID5tl病毒株F48E9滴度(即病毒原液Iml按照1:1O6的体积比进行稀释后，取100 μ L)进一步研究未修饰的多肽、多肽的胆固醇修饰物0.1mg (0.25mM, 100 μ I)的抗病毒效果,实验其他部分的具体操作步骤同上，同时设置只接种病毒不接种多肽的加毒对照组。结果表明，此病毒滴度下，野生型HR2多肽未能有效抑制NDV感染鸡胚的病变(出血病变程度为+++)，鸡胚只可存活至55小时，与加毒对照组死亡时间一致。而此浓度下的未修饰的多肽和多肽的胆固醇修饰物显示出高效的抗病毒能力，每只鸡胚接种0.1mg的未修饰的多肽或多肽的胆固醇修饰物即可有效抑制NDV感染鸡胚的病变(即鸡胚不出血，出血病变程度为_)，鸡胚可存活超过140个小时。采用相同的方法，进行NDV另外三个病毒株(La Sota、K与R毒株)的实验，结果表明，鸡胚接种0.1mg的未修饰的多肽或多肽的胆固醇修饰物即可有效抑制NDV感染鸡胚的病变(即鸡胚不出血，出血病变程度为_)。
[0081]为进一步评价未修饰的多肽与多肽的胆固醇修饰物在鸡胚内抗病毒效果的功效，将NDV病毒株F48E9 (200个TCID5tl)感染鸡胚尿囊腔之前36小时至之后36小时的不同时间点(每隔6h作为一个时间点)加入多肽0.1mg (0.25mM, 100 μ I),以研究其对鸡胚死亡及病变程度的影响。实验其他部分的具体操作步骤同上。如图3所示，未修饰的多肽仅在病毒感染前6小时至同时加入鸡胚时发挥功能(即不出现出血胚，A);但多肽的胆固醇修饰物在感染前12小时至同时加入均可完全抑制病变(即不出现出血胚，B);而对照多肽为表现出病变抑制效应(即出现出血胚，C)。同样实验条件下，野生型HR2多肽在病毒感染任何时间内处理感染鸡胚，结果均与对照多肽组死亡时间与症状一致，结果未列出。
[0082]实施例5、鸡体内实验检测多肽及其修饰物对新城疫病毒的抗感染活性
[0083]本实施例所涉及的多肽及其修饰物为实施例1制备所得，共有如下四个:
[0084]I)多肽:氨基酸序列如序列表中序列I所示的多肽。
[0085]2)多肽的胆固醇修饰物:在序列I所示的多肽的N端进行胆固醇修饰所得的产物。
[0086]3)对照多肽:氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽。
[0087]4)野生HR2多肽:氨基酸序列如序列表中序列3所示的多肽。
[0088]一、病毒多肽同时注射
[0089]将4周龄鸡随机分20组，每组5只。将20组鸡经滴鼻点眼接种步骤I所得的鸡胚毒原液与5种不同稀释度(ΙΟ2、ΙΟ4、ΙΟ6、108、101°倍稀释)下的病毒株F48E9100 μ L，并同时肌肉注射0.5mg多肽(浓度为1.25mM, 100 μ I ;多肽涉及未修饰多肽、多肽的胆固醇修饰物和对照多肽)，每种多肽均接种I组，另5组仅加相应稀释度(102、104、IO6UO8UOki倍稀释)的病毒。观察并统计鸡体存活时间，同时观察存活时间及记录死亡鸡体病变，其中鸡体超过40日的记录为存活(鸡体死亡被阻断)。
[0090]结果显示，对照多肽组(图4中C)中，NDV病毒原液Iml即使稀释101°倍，仍可导致鸡体死亡(21天);而在IO6稀释度下，100 μ L (BP 200个TCID5tl)病毒感染的鸡体约10天死亡；而多肽的胆固醇修饰物(`图4中Α)，在病毒IO6稀释度下可完全阻断病毒感染引致的鸡体死亡；此外，未修饰的多肽(图4中B)仅保护部分鸡体免受感染，在IO6稀释度下75%鸡体仍可于感染后35天时死亡，即鸡体试验中，胆固醇修饰多肽亦展现出长效活性。
[0091]二、病毒多肽不同时间注射
[0092]将4周龄鸡随机分12组，每组5只(2组/次实验，即重复2次)。将12组鸡经滴鼻点眼接种200个TCID5tl鸡胚毒F48E9 (即IO6稀释度下取100 μ L病毒液)，并在感染鸡体之前 2 天(day-2)至之后 2 天(day 2)内不同时间点(day_2、day_l、dayO、dayl、day2)肌肉注射0.5mg多肽的胆固醇修饰物(浓度为1.25mM, 100 μ I)或对照多肽(与病毒感染同时注射，即dayO)，研究对鸡体存活率的影响，每个时间段均接种I组。观察并统计鸡体存活时间，同时观察存活时间及记录死亡鸡体病变，其中鸡体超过40日的记录为存活(鸡体死亡被阻断)。
[0093]结果表明，多肽的胆固醇修饰物在病毒感染前2天至I天后加入(图5中A-D)，可使85%以上的鸡体获得有效保护；在感染2天后加入(图5中E)，可使80%以上的鸡体获得有效保护(即鸡体存活超过40日)，而对照多肽组(图5中F)中，鸡体仅存活10天。
[0094]实施例6、多肽及其修饰物的细胞毒性实验
[0095]本实施例所涉及的多肽及其修饰物为实施例1制备所得，共有如下四个:
[0096]I)多肽:氨基酸序列如序列表中序列I所示的多肽。
[0097]2)多肽的胆固醇修饰物:在序列I所示的多肽的N端进行胆固醇修饰所得的产物。
[0098]3)对照多肽:氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽。
[0099]4)野生HR2多肽:氨基酸序列如序列表中序列3所示的多肽。[0100]采用lactate dehydrogenase (LDH)实验研究各多肽对细胞是否有毒性,具体利用购自Roche公司商品化的毒性检测试剂盒完成。向培养至单层CEF细胞中加入以下各终浓度的上述四种多肽中的一种:5μΜ、25μΜ、50μΜ、100μΜ、250μΜ、500μΜ、1.0mM,2.5mM,并轻轻混合均匀，24小时后按照试剂盒说明书测定毒性指数。实验重复三次。结果显示，上述四种多肽在2.5mM浓度及以 下对细胞均无毒性作用。
【权利要求】
1.多肽，其特征在于:所述多肽的氨基酸序列为序列表中序列I。
2.权利要求1所述多肽的修饰物，其特征在于:所述修饰物为用胆固醇对所述多肽进行修饰所得的产物。
3.根据权利要求2所述的修饰物，其特征在于:所述修饰为在序列表中序列I的第一个氨基酸上连接所述胆固醇。
4.权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的修饰物在制备如下任一产品中的应用: 1)抗新城疫病毒产品； 2)治疗和/或预防由新城疫病毒感染所致疾病的产品。
5.抗新城疫病毒的产品，其特征在于:所述产品的活性成分为权利要求1所述的多肽或权利要求2或 3所述的修饰物。
6.治疗和/或预防由新城疫病毒感染所致疾病的产品，其特征在于:所述产品的活性成分为权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的修饰物。
7.权利要求2或3所述修饰物的制备方法，包括以下步骤:制备氨基酸序列是序列表中序列I的多肽，将序列I的第一个氨基酸上连接胆固醇，得到权利要求2或3所述的修饰物。
8.权利要求1所述多肽的编码基因，或含有所述编码基因的重组载体、重组细胞、重组菌或重组病毒。
【文档编号】A61P31/14GK103450351SQ201210170743
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月29日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】王晓佳 申请人:中国农业大学