专利名称：一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，属于高分子化合物的多糖领域以及医药技术领域。
背景技术：
随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。目前全球糖尿病患者已超过I. 2亿人，我国患者人群居世界第二位。根据发病机制不同，糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依赖型)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型)，其中II型糖尿病约占总数的85%以上。根据治疗机理不同，治疗II型糖尿病的药物可以分为1)促胰岛素分泌剂，如磺酰脲类；2)胰岛素增敏剂，如屈吉 他宗等噻唑烷衍生物；3) a-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖(Acarbose)等。目前a -葡萄糖苷酶抑制剂药物被认为是II型糖尿病的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物。现代药理学研究表明，天然产物中得到的多糖具有抗肿瘤、抗凝血、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂和促进机体免疫力的生物活性。缘管將苔(Enteromorpha Iinza)是我国东南沿海生长十分丰富的大型緑藻，东南亚国家重要的食物资源，作为药用历史也已有二百多年，《本草纲目》中即有记载。其中的多糖成分是它们多种生物活性的物质基础，而且，从天然产物中得到的多糖没有细胞毒性，这为其应用于药物和食品领域奠定了安全的基础。国内外关于其中多糖生物活性的报道主要集中在增强免疫活性方面，目前尚未见对缘管浒苔多糖降血糖活性的研究，本发明方法将为缘管浒苔这一丰富的可再生资源的深入开发和利用提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供ー种具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，并明确其单糖组成，为其应用于食品和药物中提供科学依据。为了实现上述发明目的，本发明方法通过以下技术方案实现第一歩，具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的提取，按照如下步骤操作I)将缘管浒苔粉碎后过80目筛，加入8倍体积水，于100°C下加热回流3h，重复回流三次，用4层纱布过滤，合并滤液，滤液于3000 X g离心20min，除去细微不溶物；2)将滤液用sevag法脱蛋白，收集上清液，减压蒸馏浓缩至原体积1/4，加入3倍体积的こ醇在4°C下放置过夜，抽滤，透析，冷冻干燥，得到固体缘管浒苔粗多糖；第二歩，具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的分离纯化，按照如下步骤操作I)将固体缘管將苔粗多糖配成10mg/mL的溶液,离心,取上清液上Q-SepharoseFast Flow凝胶柱；
2)分别用 H20,0. 2M、0. 5M、0. 8M 和 I. OM 的 NaCl 溶液洗脱;其中，0. 5M 的 NaCl 洗脱得到的组分为具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖；
3)用苯酚-硫酸法检测并合并组分，透析，冷冻干燥制得分离纯化后的缘管浒苔多糖。本发明所述的具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的多糖为酸性多糖，含有SO42-基团。本发明所述的具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖，其单糖组成为甘露糖、L (_)_岩操糖、D-匍糖糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖和D-木糖，它们的摩尔比是
I.00:0. 66:0. 46:0. 41:0. 27:0. 19。本发明測定了分离纯化后缘管浒苔多糖的a-葡萄糖苷酶抑制活性，方法如下混合102iiL磷酸盐缓冲液(PBS 0. 5M, pH 6. 8)、102 y L不同浓度的缘管浒苔多糖样品、282 u LH2O和200 U L对硝基苯-a -D-半乳糖苷(pNPG, 6mmol/L)；混合液于37 V水浴中保持5min,再加入200 ii La -葡萄糖苷酶(0. lU/mL)，37 °C保持30min ;最后加入
0.4M(pH=10. 4)甘氨酸缓冲液I. 2mL終止反应。以阿卡波糖为阳性对照，紫外分光光度计测定410nm处的吸光度值A。空白、背景和样品的測定条件相同。抑制率(%) = ^-心_六13)]/^\100%，其中，Ac :空白对照；Ab :背景吸收；Ai :样品吸收；样品的降血糖活性用IC5tl表示，IC50通过GraphPad软件计算得到。经体外a-葡萄糖苷酶抑制试验表明，提纯后的缘管浒苔多糖具有非常强的a -葡萄糖苷酶抑制活性，具有明显的降血糖活性，可用于治疗II型糖尿病，对于海藻和海洋资源的开发具有重要意义。本发明方法与现有技术相比，具有如下优点在中国，阿卡波糖被广泛地应用于II型糖尿病的治疗以及I型糖尿病的辅助治疗。但是，阿卡波糖在临床应用中具有一定的副作用，可以导致恶心、呕吐和腹泻等现象。本发明方法操作简单，从海藻中的得到的多糖是ー种天然的食品，没有细胞毒性，无副作用。因此，缘管浒苔多糖以其明显的降血糖作用，有望替代阿卡波糖成为新型的天然降血糖药物。
图I为多糖对a -葡萄糖苷酶的活性抑制曲线图。
具体实施例方式下面通过具体实施例和附图对本发明方法做进ー步阐述。实施例I、第一歩，具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的提取I)粉碎将缘管浒苔清洗干净，晾干，粉碎，过80目筛；2)提取加入8倍体积水，于100°C下加热回流3h，重复回流三次，用4层纱布过滤，合并滤液，滤液于3000 X g离心20min，除去细微不溶物；3) sevag法脱蛋白将氯仿正丁醇=5:1 (体积比)的sevag试剂与2)中所得滤液按照体积比4:1混匀，于水浴振荡器中振荡30min，收集上清液，反复多次，于190_900nm处进行紫外扫描，直至280nm处无吸收峰为止；4)醇沉上清液减压蒸馏，浓缩至原体积1/4，加入3倍体积的こ醇在4°C下放置过夜，抽滤；5)透析固体重新溶解于蒸馏水，3500道尔顿(D)透析袋中透析3天；6)冷冻干燥降透析后的缘管浒苔多糖减压浓缩，冷冻干燥，得到固体粗多糖；第二歩，具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的分离纯化I)上样将固体缘管浒苔粗多糖配成10mg/mL的溶液，离心，取上清液上Q-Sepharose Fast Flow 凝胶柱；
2)洗脱分别用 H20、0. 2M、0. 5M、0. 8M和 I. OM 的NaCl 溶液洗脱;其中，0. 5M 的NaCl洗脱得到的组分为具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖；3)收集洗脱液用苯酚-硫酸法检测，合并组分；4)透析得到的组分用3500D透析袋透析，直至AgNO3检测无NaCl析出为止；5)冷冻干燥减压浓缩，冷冻干燥，得到分离提纯后的活性缘管浒苔多糖。实施例2、具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的单糖组成分析I)水解将20mg提纯后的缘管浒苔多糖加入2M的三氟こ酸(TFA) 4mL于密封的玻璃管中，在110°C下水解6h ；2)除去TFA :水解物中加入3ml甲醇，于旋转蒸发仪上旋蒸，反复多次直至TFA被完全除去；3)衍生化用20iU ニ甲基亚砜(DMSO)移出水解物，加入100 yl双(三甲基硅烷基)三氟こ酰胺(BSTFA)于密封的玻璃管中，90°C下衍生Ih ；4) GC-MS分析衍生物经超滤膜过滤，上样I ，进行GC-MS分析。GC-MS(GCMS-QP2010SE)配有毛细管柱 RTX-1MS (30mX0. 25mmX0. 25um)；5)程序升温接ロ温度和检测温度设为260°C，程序升温设为100°C，10°C /min升温到220°C，再以30C /min升温到260。。。采用GC-MS分析具有a -葡萄糖苷酶抑制活性缘管浒苔多糖的单糖组成，结果显不其单糖组成为甘露糖、L (-)-岩操糖、D-匍糖糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖和D-木糖,它们的摩尔比是1.00:0. 66:0. 46:0.41:0. 27:0. 19 ;其中单糖含量最高的是甘露糖，其次是L(-)-岩藻糖。实施例3、缘管浒苔多糖的a -葡萄糖苷酶抑制活性測定本发明測定了缘管浒苔多糖的a-葡萄糖苷酶抑制活性，方法如下混合102 ULPBS (0. 5M, pH 6. 8)，102 ii L 不同浓度的多糖样品(0.02,0.06,0. I, 0. 12, 0. 15,0.2,0.4,0.6，0. 8and I. Omg/ml)，282 u LH2O 和 200 u L 对硝基苯-a -D-半乳糖苷(pNPG, 6mmol/L);混合液于37°C水浴中保持5min,再加入200 u L a -葡萄糖苷酶(0. lU/mL)，37°C保持30min ；最后加入0. 4M(pH=10. 4)甘氨酸缓冲液I. 2mL終止反应。以阿卡波糖为阳性对照，紫外分光光度计测定410nm处的吸光度值A。空白、背景和样品的測定条件相同。抑制率(%)=[六。-心-六13)]/^\100%，其中，Ac :空白对照；Ab :背景吸收；Ai :样品吸收；样品的降血糖活性用IC5tl表示，IC50通过GraphPad软件计算得到。多糖对a-葡萄糖苷酶的活性抑制曲线图如图I所示，图中横坐标为a-葡萄糖苷酶抑制剂样品的浓度，纵坐标为样品对a -葡萄糖苷酶的抑制率。其中ELP-2、ELP-3和ELP-4分别为0. 2MNaCl、0. 5MNaCl和0. 8MNaCl洗脱得到的多糖组分的a -葡萄糖苷酶抑制活性曲线。分离纯化后的缘管浒苔多糖都具有一定的a-葡萄糖苷酶抑制活性，其中，0.5M的NaCl洗脱得到的多糖即ELP-3组分的活性最強，对a -葡萄糖苷酶的半数抑制率IC50=O. 36mg/mL,明显强于阳性对照阿卡波糖(IC5tl=O. 46mg/mL)。因此，ELP-3是ー种非常强 的a-葡萄糖苷酶抑制剂，具有降血糖的作用。
权利要求
1.ー种具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，其特征在于按照如下步骤操作第一歩，具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的提取将缘管浒苔粉碎后过80目筛，加入8倍体积水，于100°C下加热回流3h，重复回流三次，用4层纱布过滤，合并滤液，滤液于3000 Xg离心20min，除去细微不溶物；将滤液用sevag法脱蛋白，收集上清液，减压蒸馏浓缩至原体积1/4，加入3倍体积的こ醇在4°C下放置过夜，抽滤，透析，冷冻干燥，得到固体缘管浒苔粗多糖；第二歩，具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的分离纯化将固体缘管將苔粗多糖配成10mg/mL的溶液,离心,取上清液上Q-SepharoseFast Flow凝胶柱；分别用H20、0. 2M、0. 5M、0. 8M和I. OM的NaCl溶液洗脱;其中，0. 5M的NaCl洗脱得到的组分为具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖；用苯酚-硫酸法检测并合并组分，透析，冷冻干燥得分离纯化后的缘管浒苔多糖。
2.根据权利要求I所述的ー种具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，其特征在于所述的具有a -葡萄糖苷酶抑制活性的多糖为酸性多糖，含有SO42-基团。
3.根据权利要求I所述的ー种具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，其特征在于其单糖组成为甘露糖、L (-)-岩藻糖、D-葡糖糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖和D-木糖，它们的摩尔比是:1. 00:0. 66:0. 46:0. 41:0. 27:0. 19。
4.根据权利要求I所述的ー种具有a-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，其特征在于提纯后的缘管浒苔多糖具有a -葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖活性。
全文摘要
本发明涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法。将缘管浒苔粉碎过筛后加入水，于100℃下重复加热回流，过滤，离心除去细微不溶物；将滤液用sevag法脱蛋白后，减压蒸馏浓缩至原体积1/4，加入乙醇在4℃下放置过夜，抽滤，透析，冷冻干燥，得到固体缘管浒苔粗多糖；将缘管浒苔粗多糖配成10mg/mL的溶液，离心，取上清液上Q-Sepharose Fast Flow凝胶柱；用不同浓度的NaCl溶液洗脱；其中，0.5M的NaCl洗脱得到的组分为具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖；用苯酚-硫酸法检测并合并组分，透析，冷冻干燥制得分离纯化后的缘管浒苔多糖。本发明方法操作简单，制得的多糖无细胞毒性，无副作用，具有明显的降血糖作用，可用于制备降血糖的药物或食品。
文档编号A61P3/10GK102775512SQ20121029705
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者张凝, 张立新, 李金花 申请人:青岛大学