抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途
【专利摘要】本发明涉及抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途。具体地，本发明通过大量筛选和分析kozak序列，发现具有大幅度提高HPVL1蛋白表达水平的kozak序列；并对人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1(HPV?L1)的16、18和58基因进行重新设计和序列优化，排除影响翻译的mRNA的二级结构，并据此构建高表达的HPV?L1基因表达盒，所述表达盒尤其适用于在毕赤酵母中表达，并具有蛋白表达量高、稳定性好的特点。
【专利说明】抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和疫苗学领域，具体地，本发明涉及抗人乳头瘤病毒的三价疫苗及其制法和用途。
【背景技术】
[0002]宫颈癌是常见的妇科恶性疾病，在最常见的妇女癌症中，宫颈癌的发病率高居第二。HPV (乳头瘤病毒)病毒感染与宫颈癌的发生密切相关，人类至今已经分离到了至少118种乳头瘤病毒。目前已证实，在肛生殖系统癌症中，由HPV感染所诱发的癌症占3.7%。
[0003]在已被分离出的HPV病毒亚型中，已发现有15种具有诱导生殖系统癌症的发生，因而被归为高危性HPV病毒亚型(如HPV16, 18，31，33，52和58)，其中HPV16和HPV18两种亚型在全世界占所有由HPV感染诱发宫颈癌的70%。继HPV16和HPV18之后，HPV58和HPV52在亚洲和非洲具有高患病率，占全世界宫颈癌发病率的2-3%。大规模中国妇女HPV病毒亚型分布分析表明，整体上HPV的患病率(包括高危和低危HPV病毒亚型)在侵入性子宫颈癌(ICC)为82.7%，在高度鳞状上皮内病变(HSIL)中为88.5%，在低度鳞状上皮内病变(LSIL)为 69.3%ο
[0004]HPV是一种DNA病毒，直径约为45_55nm，呈球形，无包膜，衣壳为72个壳微粒组成对称偏斜的20面体，其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白(LI)和次要衣壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白LI在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称为病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒与天然病毒有相似的空间构象、免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化。
[0005]含不同亚型或混合型HPV的VLPs/Ll蛋白预防性疫苗已相继被成功研制并开始在临床实验上使用。美国默克 公司研究出了含有HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的四价疫苗(商品名Gardasil)，已获FDA批准并在美国上市，英国的葛兰素史克公司也研究出了含有HPV16和HPV18的两价疫苗。
[0006]但是，就目前的HPV疫苗的生产工艺而言，大多采用大肠杆菌、酿酒酵母(如Merk公司)或昆虫细胞(如葛兰素史克公司)作为反应器进行生产。大肠杆菌表达的LI蛋白不能被正确折叠和修饰，并以包涵体的形式表达，因此要组装成病毒样颗粒LI蛋白需要经过变性和复性的过程，纯化工艺复杂，同时体外组装的病毒样颗粒的免疫原性低于真核表达并自主组装的病毒样颗粒。用酿酒酵母生产HPV的VLP也存在一些明显的缺点，例如，酿酒酵母中的外源HPVLl基因存在于质粒而非染色体上，导致分泌效率差、表达菌株不够稳定、在生产过程中易发生质粒丢失等现象。此外，酿酒酵母的分泌蛋白平均每条侧链有50-150个甘露糖残基，这种过度的糖基化导致所生产的VLP在某些个体中产生不利的过敏反应；酿酒酵母无法采用高密度发酵，发酵成本很高。
[0007]目前为止，还没有人体对具有不同基因型的各HPV病毒亚型之间存在交叉反应的报道，因此针对某一病毒亚型的特异性疫苗通常只能使得接种者对该特定病毒亚型有预防效果。为使易感人群或患者具有针对抗一种以上病毒亚型(尤其是多种高危HPV)的预防免疫功能或治疗效果，迫切需要对该人群联合施用针对几种相应的不同病毒亚型疫苗。[0008]总之，本领域目前尚缺乏低成本、高效率的多种HPV LI蛋白或VLP的制备方法，因此迫切需要开发新的高效、简便、低成本地制备HPV的LI蛋白或VLP的方法，尤其是制备同时含有HPV16、HPV18和HPV58的LI蛋白或VLP的方法，以便能够开发针对多种特定亚型的疫苗。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供非常适于在毕赤酵母中表达HPVLl蛋白的kozak序列以及HPVLl表达盒。
[0010]本发明的另一目的是提供一种优化的人乳头瘤状病毒16、18和58L1蛋白的核酸序列。
[0011]本发明的另一目的是提供一种制备抗人乳头瘤状病毒的疫苗的制备方法。
[0012]在本发明的第一方面，提供了一种编码人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白LI的核酸分子，所述的核酸分子选自下组:
[0013](I)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 3所示，或与SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.: 2相同或基本相同；
[0014](2)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 6所示或，或与SEQ ID N0.: 6所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.: 5相同或基本相同；
[0015](3)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 9所示，或与SEQ ID N0.: 9所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
[0016]在另一优选例中，所述的基本相同为氨基酸序列的同源性> 98%，较佳地> 99%。
[0017]在另一优选例中，序列如SEQ ID N0.:3所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤病毒HPV16L1 蛋白。
[0018]在另一优选例中，序列如SEQ ID N0.:6所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤病毒HPV18L1 蛋白。
[0019]在另一优选例中，序列如SEQ ID N0.:9所示的核酸分子编码野生型人乳头瘤病毒HPV58L1 蛋白。
[0020]在本发明的第二方面，提供了一种人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白HPVLl的表达盒，所述表达盒的5’ -3’依次具有下述元件:kozak序列、HPVLl编码序列、和终止子。[0021 ]在另一优选例中，所述的 kozak 序列为:5 ’ - (A/T) A (A/C) AA (A/C) ATGTC (T/C) _3 ’。
[0022]在另一优选例中，所述的kozak序列任选自SEQ ID N0.: 10-25，较佳地任选自SEQID NO: 10、12、14 或 22，更佳地为 SEQ ID NO: 10。
[0023]在另一优选例中，所述HPVLl编码序列选自下组:
[0024](I)序列如SEQ ID N0.:3所示，或与SEQ ID N0.:3所示序列的同源性> 95% (较佳地≥98%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.: 2相同或基本相同；
[0025](2)序列如SEQ ID N0.:6所示，或与SEQ ID N0.:6所示序列的同源性> 95% (较佳地≥98%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.: 5相同或基本相同；[0026](3)序列如SEQ ID N0.:9所示，或与SEQ ID N0.:9所示序列的同源性≥95% (较佳地≥98%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
[0027]在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的核酸分子或本发明第二方面所述的表达盒。
[0028]在另一优选例中，所述载体为pPIC3.5和pPIC3.5K，较佳地为pPIC3.5K。
[0029]在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体或染色体整合有本发明第一方面所述的核酸分子或本发明第二方面所述的
表达盒。
[0030]在另一优选例中，所述宿主细胞为毕赤酵母。
[0031]在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有1-50个拷贝的本发明第一方面所述的核酸分子或本发明第二方面所述的表达盒。
[0032]在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有2-10个拷贝，较佳地3-7个拷贝的本发明第一方面所述的核酸分子或本发明第二方面所述的HPVLl基因表达盒。
[0033]在本发明的第五方面，提供了一种制备人乳头瘤病毒HPVLl蛋白的方法，包括步骤:
[0034](i)在适合的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而表达出人乳头瘤病毒HPVLl蛋白；和
[0035](ii)分离所述蛋白。
[0036]在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒HPVLl蛋白选自下组:HPV16L1 ；HPV18L1 ；或 HPV58L1。
[0037]在本发明的第六方面，提供了一种制备人乳头瘤病毒HPVLl病毒样颗粒的方法，包括步骤:
[0038](a)在适合的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而产生人乳头瘤病毒HPVLl病毒样颗粒；和
[0039](b)分离所述病毒样颗粒。
[0040]在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒HPVLl病毒样颗粒选自下组:HPV16L1病毒样颗粒；HPV18L1病毒样颗粒；*HPV58L1病毒样颗粒。
[0041]在本发明的第七方面，提供了一种制备疫苗组合物的方法，包括步骤:
[0042]将本发明的第五方面所述方法制备的人乳头瘤病毒HPVLl蛋白或本发明的第六方面所述方法制备的人乳头瘤病毒HPVLl病毒样颗粒与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。
[0043]在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒LI蛋白为HPV16L1 ；HPV18L1 ;*HPV58L1。
[0044]在另一优选例中，所述的HPVLl病毒样颗粒为:HPV16L1病毒样颗粒；HPV18L1病毒样颗粒；或HPV58L1病毒样颗粒。
[0045]在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，更佳的为GLA佐剂。
[0046]在本发明的第八方面，提供了一种制备人乳头瘤三价疫苗的方法，包括步骤:
[0047](a)在适合的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而分别产生HPV16L1病毒样颗粒、HPV18L1病毒样颗粒和HPV58L1病毒样颗粒；和[0048](b)分离所述HPV16L1病毒样颗粒、HPV18L1病毒样颗粒和HPV58L1病毒样颗粒，将所述病毒样颗粒与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成三价疫苗。
[0049]在另一优选例中，所述的疫苗佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，更佳的为GLA佐剂。
[0050]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0051]图1显示kozak序列优化结果，其中，图1A为16个kozak序列对目的蛋白产量的提高效果，其中，第I个、第3个、第5个和第13个的kozak序列的效果最明显，分别提高了
1.5倍-2.2倍,最优的kozak序列是第I个kozak序列；图1B为相应的Western Blot实验结果。
[0052]图2显示了宿主细胞的染色体中HPV16L1基因拷贝数对目的蛋白产量的影响，其中，图2A显示，拷贝数越多，HPV16L1蛋白的产量越高；图2B为基因拷贝数对目的蛋白产量Western Blot实验结果。
[0053]图3显示了宿主细胞的染色体中多拷贝HPV18L1基因鉴定结果见，图3A显示不同的基因拷贝数对目的蛋白产量的影响，结果表明，在不同的宿主中，HPV18L1基因的拷贝数为1-3，拷贝数越多，HPV18L1蛋白的产量越高；图3B为基因拷贝数对目的蛋白产量的Western Blot实验结果。
[0054]图4显示了宿主细胞的染色体中多拷贝HPV58L1基因鉴定结果，图4A显示，不同的基因拷贝数对目的蛋白产量的影响，在不同的宿主中，HPV18L1基因的拷贝数为1-3，拷贝数越多，HPV18L1蛋白的产量越高；图4B为基因拷贝数对目的蛋白产量的Western Blot实验结果。
`[0055]图5显示体外重组蛋白的表达结果；图5A表明，目的蛋白在12h开始表达，到48h达到高峰，在48-96h表达稳定；图5B显示优化后的HPV16L1的表达体系在各个时间点其目的蛋白的Western Blot实验结果。
[0056]图6显示HPV16L1表达蛋白电泳结果，泳道1_9分别代表不同洗脱组分，目的蛋白约56kD，其纯度约为90.0%。
[0057]图7显示自组装HPV16L1病毒样颗粒鉴定结果，组装HPV16L1病毒样颗粒大小不均一，颗粒直径分布在25nm至65nm之间，平均粒径45nm，与基因序列未优化HPV的VLP的颗粒直径分布相同。
【具体实施方式】
[0058]本发明人通过广泛而深入的研究，筛选并优化了大量的kozak序列，意外地发现了可以在毕赤酵母中极大促进HPVLl蛋白表达的kozak序列，并据此构建了含有kozak序列的HPVLl基因表达盒；本发明人还对人乳头瘤状病毒HPV16L1、HPV18L1和HPV58L1的基因序列进行了针对性地优化设计，从而大大提高了目的蛋白产量；本发明还提供了具有高拷贝HPVLl基因的宿主细胞，所述宿主细胞生产HPVLl目的蛋白的能力可以提高16倍以上。在此基础上完成了本发明。[0059]术语
[0060]如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“VLP”或“VLPs”指通过体外基因重组技术获得的病毒样颗粒(Virus-like particle, VLP),它具有天然病毒的外部结构,但不包含病毒DNA/RNA,因此VLP在体内不会复制，提高了疫苗应用的安全性，同时，VLP具有极好的免疫原性。
[0061]如本文所用，术语“HPVL1”指人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白LI。
[0062]如本文所用，术语“HPV VLP”指由人乳头瘤状病毒HPV的主要衣壳蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
[0063]如本文所用，术语“HPV16L1”和“HPV16L1VLP”分别指人乳头瘤状病毒HPV16的主要衣壳蛋白LI和由该LI蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
[0064]如本文所用，术语“HPV18L1”和“HPV18L1VLP”分别指人乳头瘤病毒HPV18的主要衣壳蛋白LI和由该LI蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
[0065]如本文所用，术语“HPV58L1”和“HPV58L1VLP”分别指人乳头瘤病毒HPV58的主要衣壳蛋白LI和由该LI蛋白自组装形成的病毒样颗粒。
[0066]kozak序列筛选及优化
[0067]如本文所用，术语kozak序列(kozak consensus sequence)是指存在于起始密码子AUG附近的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。在真核细胞中，翻译的起始位点大多在5'端的AUG密码子位点。当与mRNA的5'端帽子结构结合后，核糖体的40S小亚基对mRNA进行扫描，直到遇到第一个AUG密码子。核糖体的40S小亚基对AUG周围核酸序列的识别在很大程度上引发翻译的起始，并影响翻译效率。
[0068]本发明提供了一类特别适合在毕赤酵母中调控HPV LI蛋白表达的kozak序列，所述的 kozak 序列为:5，- (A/T) A (A/C) AA (A/C) ATGTC (T/C) 3’。
[0069]本发明人筛选并优化了大量的kozak序列，各个kozak序列的信息见表1。并将所述kozak序列与编码HPV16L1、HPV18L1、或HPV58L1的核苷酸序列连接。
[0070]测试所优化和筛选的kozak序列在毕赤酵母中对基因表达的影响，发现其中有4个经优化的kozak序列能够大幅度提闻目的蛋白的表达效率(最闻可以达到2倍以上)。4个经优化的kozak序列为:第I个kozak序列(SEQ ID N0.10)、第3个kozak序列(SEQ IDN0.12)、第 5 个 kozak 序列(SEQ ID N0.14)、和第 13 个 kozak 序列(SEQ ID N0.22)。
[0071]表1
[0072]
【权利要求】
1.一种编码人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白LI的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子选自下组: (1)核酸分子的序列如SEQID N0.:3所示，或与SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.: 2相同或基本相同； (2)核酸分子的序列如SEQID N0.:6所示或，或与SEQ ID N0.:6所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.: 5相同或基本相同； (3)核酸分子的序列如SEQID N0.:9所示，或与SEQ ID N0.:9所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%，更佳地≥99%)，且编码的氨基酸序列与SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
2.一种人乳头瘤病毒HPV的主要衣壳蛋白HPVLl的表达盒，其特征在于，所述表达盒的5’ -3’依次具有下述元件:kozak序列、HPVLl编码序列、和终止子。
3.如权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述的kozak序列为:5’-(A/T)A(A/C)AA (A/C)ATGTC(T/C) -3’。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的表达盒。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体或染色体整合有权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的表达盒。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的染色体具有1-50个拷贝的权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的表达盒。
7.一种制备人乳头瘤病毒HPVLl蛋白的方法，其特征在于，包括步骤: (i)在适合的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而表达出人乳头瘤病毒HPVLl蛋白；和 (?)分离所述蛋白。
8.一种制备人乳头瘤病毒HPVLl病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括步骤: (a)在适合的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而产生人乳头瘤病毒HPVLl病毒样颗粒；和 (b)分离所述病毒样颗粒。
9.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，包括步骤:将权利要求7所述方法制备的人乳头瘤病毒HPVLl蛋白或权利要求8所述方法制备的人乳头瘤病毒HPVLl病毒样颗粒与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。
10.一种制备人乳头瘤三价疫苗的方法，其特征在于，包括步骤: (a)在适合的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，所述宿主细胞为毕赤酵母，从而分别产生HPV16L1病毒样颗粒、HPV18L1病毒样颗粒和HPV58L1病毒样颗粒；和 (b)分离所述HPV16L1病毒样颗粒、HPV18L1病毒样颗粒和HPV58L1病毒样颗粒，将所述病毒样颗粒与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成三价疫苗。
【文档编号】A61P31/20GK103667319SQ201210333085
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月10日 优先权日:2012年9月10日
【发明者】潘卫庆, 徐新东, 张远斌 申请人:同济大学