专利名称：冬凌草纳米微粒的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种冬凌草纳米微粒的制备方法及其应用。
背景技术：
冬凌草是唇形科茶菜属植物碎米桠变种，因其植株凝结薄如蝉翼、形态各异的蝶状冰凌片而得名，全株结满银白色冰片，风吹不落，随风摇曳，日出后闪闪发光，展现出神奇的自然景观，具有独到的观赏作用，具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血之效，主要分布于河南及黄河流域以南，具有耐寒、耐旱、病虫害少等特点。冬凌草的药用部位是全株，具有综合开发利用价值的植物。冬凌草味甘苦，性微寒，其中含有冬凌草甲素、冬凌草乙素、熊果酸、齐墩果酸、冬凌草多糖等多种功效成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化和增强免疫力等作用。现代应用主治咽喉肿痛、扁桃体炎、气 管炎、慢性肝炎、风湿痛，并对食管癌、乳腺癌、直肠癌等有缓解作用。中国发明专利申请其申请号201110288022. 9，公布号CN102327318A，公布日2012. 01. 25，公开了冬凌草具有防治骨质疏松症的作用。纳米中药制剂是指运用纳米技术制造的,粒径小于IOOnm的中药有效成分、有效部位、原药及其复方的制剂。与常规制剂相比，纳米制剂具有活性高、生物利用度高、良好缓控释性能以及靶向给药等特性。目前，可应用于中药制剂的纳米技术有很多，例如超细粉碎技术、喷雾干燥法、高压均质技术、化学沉淀法、界面聚合、乳化聚合等，但这些方法都有其应用的局限性。例如，超细粉碎技术不受中药溶解性能的限制，但是存在效率低、噪音大、生产量小等缺点；喷雾干燥法除了受溶解性限制外，其得到的颗粒不一定都是纳米级；化学沉淀法等化学方法会引入化学溶剂，对人体和环境产生危害。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种冬凌草纳米微粒的制备方法，该纳米微粒制品应用于防治骨质疏松症方面，相对于常规剂型的冬凌草制品而言具有更加明显的效果。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是
一种冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤
(1)将冬凌草与去离子水或无水乙醇中的一种或两种组合溶剂按I:I 20混合后，在回流提取温度为70°C 95°C下回流提取30min 300min，趁热过滤，得到滤渣和滤液；
(2)将步骤(I)得到的滤液在60°C 90°C的条件下进行减压蒸馏浓缩至原体积的1/2 1/10 ；
(3)将步骤(2)得到的浓缩滤液进行脱色、脱蛋白质处理，然后将处理液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为50%飞0%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物和上清液；
(4)将沉淀物用1(Γ50倍的去离子水充分溶解，然后上凝胶柱进行层析，用超纯水洗脱，洗脱速度为O. lmfl. Oml/min，用紫外分光光度法进行跟踪并收集洗脱液；(5)将步骤(4)的洗脱液与超临界CO2抗溶剂系统的液体泵相连；
(6)启动超临界CO2抗溶剂系统，结晶釜的温度为40°C 80°C，结晶釜的压力为8Mpa 50Mpa，CO2 的流量为 30 300L/hr ；
(7)启动超临界CO2抗溶剂系统的夹带剂泵和步骤(4)中的液体泵，洗脱液与甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种夹带剂的进料比为10: f 1:10，洗脱液与夹带剂先混合后，经超临界CO2抗溶剂系统的纳米喷嘴喷入结晶釜中，流量控制在IOOmf 1000ml/hr ;洗脱液中的溶剂和夹带剂进入分离釜中解析并分离，洗脱液中的溶质在结晶釜内析出为微细颗粒，该微细颗粒即为冬凌草纳米微粒。所述步骤(7)中的纳米喷嘴的口径为I IOOnm;所述的分离釜温度为35°C 600C，分离压力为4Mpa 7Mpa，优选分离釜温度为50°C，分离压力为5Mpa ;所述的CO2气体的纯度不低于99%。
所述的凝胶柱层析所用的填料为葡聚糖凝胶系列、琼脂糖凝胶系列或丙烯葡聚糖凝胶系列中的一种。为了更完整地提取有效成份，将步骤(3)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为60°/Γ70%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物II和上清液；将上述离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为70°/Γ80%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物III和上清液；再将上述离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为80°/Γ90%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物IV ;将上述得到的沉淀物II、沉淀物III和沉淀物IV与步骤(3)中得到的沉淀物合并。上述制备方法得到的冬凌草纳米微粒可在防治骨质疏松症方面以及制备防治骨质疏松症的药物中的应用，具有很好的疗效。本发明与现在技术相比，其有益效果在于
第一、采用超临界CO2抗溶剂技术制备冬凌草纳米微粒，无需脱除溶剂残留、干燥、粉碎等后续处理工序，大大提高生产效率；整个过程中采用的CO2具有无臭、无毒、无污染、不易燃易爆的特点，使生产环境具有更高的安全性；产品中无溶剂残留，使产品品质具有更高的安全性。第二、本发明的制备方法制得的冬凌草纳米微粒，具有更高的生物利用度和靶向给药的特点。通过切除大鼠卵巢建立骨质疏松模型，检测骨密度，验证了冬凌草纳米微粒对骨质疏松是具有保护作用的，并通过对比试验验证了纳米级冬凌草微粒较常规粒度的冬凌草微粒，在治疗骨质疏松症方面具有更加明显的效果。通过实验测定其诱导T淋巴细胞增殖反应的影响，发现随着用量的增加，其对ConA诱导的T淋巴细胞的增殖反应有显著增强作用，并分析了冬凌草纳米微粒在治疗骨质疏松和诱导T淋巴细胞增殖反应方面的相关性。另外，通过临床实验验证了冬凌草纳米微粒对于绝经后骨质疏松症以及骨质疏松性骨折的治疗作用。
图I为本发明的冬凌草纳米微粒的制备方法中超临界CO2抗溶剂系统的流程示意图。附图标注=C1是承装冬凌草洗脱液的原料罐，P1是液体泵，P2是夹带剂泵，F1是结晶釜，F2是分离釜。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，下面结合附图及实施例进一步阐明本发明内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，并给出本发明的有益效果的实验例。实施例I :
一种冬凌草纳米微粒的制备方法，包括如下步骤
(I )、将冬凌草与去离子水按I: I混合后在95°c加热条件下回流提取60min，趁热过滤，滤渣重复上述操作I次，合并滤液；
(2)、将步骤(I)得到的滤液在70°C的条件下进行减压蒸馏浓缩至原体积的50%；
(3)、将步骤(2)的浓缩液经活性炭脱色、sevage法脱蛋白质后，用95%乙醇调节至溶液 中乙醇浓度为55%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀I和上清液；
(4)、将步骤(3)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为65%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀II和上清液；
(5)、将步骤(4)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为75%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀III和上清液；
(6)、将步骤(5)离心得到的用上清液95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为85%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀IV ；
(7)、将沉淀Γιν用10倍去离子水充分溶解后上葡聚糖凝胶柱层析，用超纯水洗脱，洗脱速度为O. lml/min，每管10ml，收集30号 100号管的洗脱液；
(8)、合并步骤(7)收集得到的洗脱液将其放入冬凌草洗脱液的原料罐C1中，并与超临界CO2抗溶剂系统的液体泵P1相连；
(9)、启动超临界CO2抗溶剂系统，其中结晶釜Fl的温度为45°C，结晶釜的压力为8Mpa，，CO2 的流量为 30L/hr ；
(10)、启动超临界CO2抗溶剂系统的夹带剂泵P2和液体泵P1，选择乙醇为夹带剂，调节各自的频率，使夹带剂泵和液体泵的进料比为1: 1，洗脱液与夹带剂混合后经超临界CO2抗溶剂系统的纳米喷嘴喷入结晶釜F1中，分离釜F2的温度为50°C，分离压力为5Mp，纳米喷嘴的口径为lOOnm，洗胶液中的溶剂和夹带剂进入分离釜中解析并分离，洗脱液中的溶质在结晶釜内析出为微细颗粒，该微细颗粒即为冬凌草纳米微粒。本实施例制备的冬凌草纳米微粒的平均粒径为126. 9nm。实施例2:
一种冬凌草纳米微粒的制备工艺，包括如下步骤
(1)、将冬凌草与去离子水按1:10混合后在80°C加热条件下回流提取120min，趁热过滤，滤渣重复上述操作I次，合并滤液；
(2)、将步骤(I)得到的滤液在80°C的条件下进行减压蒸馏浓缩至原体积的10%；
(3)、将步骤(2)的浓缩液经活性炭脱色、sevage法脱蛋白质后，用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为55%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀I和上清液；
(4)、将步骤(3)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为65%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀II和上清液；(5)、将步骤(4)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为75%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀III和上清液；
(6)、将步骤(5)离心得到的用上清液95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为85%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀IV ；
(7)、将沉淀广IV用20倍去离子水全部充分溶解后上琼脂糖凝胶柱层析，用超纯水洗脱，洗脱速度为O. 5ml/min, 10ml/tube,收集10号 40号管的洗脱液；
(8)合并步骤(7)收集得到的洗脱液将其放入冬凌草洗脱液的原料罐C1中，并与超临界CO2抗溶剂系统的液体泵P1相连；
(9)、启动超临界CO2抗溶剂系统，其中结晶釜的温度为50°C，结晶釜的压力为20Mpa，CO2的流量为50L/hr ；
(10)、启动超临界CO2抗溶剂系统的夹带剂泵P2和液体泵P1，选择乙醇为夹带剂，调节 各自的频率，使夹带剂泵和液体泵的进料比为3:1，洗脱液与夹带剂混合后经超临界CO2抗溶剂系统的纳米喷嘴喷入结晶釜F1中，分离釜F2的温度为55°C，分离压力为6Mpa，纳米喷嘴的口径为50nm，洗胶液中的溶剂和夹带剂进入分离釜中解析并分离，洗脱液中的溶质在结晶釜内析出为微细颗粒，该微细颗粒即为冬凌草纳米微粒。本实施例制备的冬凌草纳米微粒的平均粒径为77. 2nm。实施例3
一种冬凌草纳米微粒的制备方法，包括如下步骤
(1)、将冬凌草与去离子水按1:20混合后在70°C加热条件下回流提取180min，趁热过滤，滤渣重复上述操作I次，合并滤液；
(2)、将步骤(I)得到的滤液在90°C的条件下进行减压蒸馏浓缩至原体积的10%；
(3)、将步骤(2)的浓缩液经活性炭脱色、sevage法脱蛋白质后，用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为55%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀I和上清液；
(4)、将步骤(3)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为65%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀II和上清液；
(5)、将步骤(4)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为75%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀III和上清液；
(6)、将步骤(5)离心得到的用上清液95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为85%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀IV ；
(7)、将沉淀广IV用15倍去离子水全部充分溶解后上丙烯葡聚糖凝胶柱层析，用超纯水洗脱，洗脱速度为O. 25ml/min, 10ml/tube,收集10号 50号管的洗脱液；
(8)合并步骤(7)收集得到的洗脱液将其放入冬凌草洗脱液的原料罐C1中，并与超临界CO2抗溶剂系统的液体泵P1相连；
(9)、启动超临界CO2抗溶剂系统，其中结晶釜的温度为55°C，结晶釜的压力为35Mpa，CO2的流量为80L/hr ；
(10)、启动超临界CO2抗溶剂系统的夹带剂泵P2和液体泵P1，选择乙醇为夹带剂，调节各自的频率，使夹带剂泵和液体泵的进料比为1: 1，洗脱液与夹带剂混合后经超临界CO2抗溶剂系统的纳米喷嘴喷入结晶釜F1中，分离釜F2的温度为55°C，分离压力为5Mpa，纳米喷嘴的口径为60nm，洗胶液中的溶剂和夹带剂进入分离釜中解析并分离，洗脱液中的溶质在结晶釜内析出为微细颗粒，该微细颗粒即为冬凌草纳米微粒。本实施例制备的冬凌草纳米微粒的平均粒径为86. 5nm。实施例4
一种冬凌草纳米微粒的制备方法，包括如下步骤
(1)、将冬凌草与去离子水按1:5混合后在85°C加热条件下回流提取240min，趁热过滤，滤渣重复上述操作I次，合并滤液；
(2)、将步骤(I)得到的滤液在85°C下进行减压蒸馏浓缩至原体积的20%；
(3)、将步骤(2)的浓缩液经活性炭脱色、sevage法脱蛋白质后，用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为55%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀I和上清液； (4)、将步骤(3)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为65%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀II和上清液；
(5)、将步骤(4)离心得到的上清液用95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为75%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀III和上清液；
(6)、将步骤(5)离心得到的用上清液95%乙醇调节至溶液中乙醇浓度为85%，低温静置12小时，离心分离得到沉淀IV ；
(7)、将沉淀Γιν用10倍去离子水充分溶解后上葡聚糖凝胶柱层析，用超纯水洗脱，洗脱速度为O. lml/min，每管10ml，收集30号 100号管的洗脱液；
(8)、合并步骤(7)收集得到的洗脱液将其放入冬凌草洗脱液的原料罐C1中，并与超临界CO2抗溶剂系统的液体泵P1相连；
(9)、启动超临界CO2抗溶剂系统，其中结晶釜的温度为40°C，结晶釜的压力为12Mpa，CO2的流量为150L/hr ；
(10)、启动超临界CO2抗溶剂系统的夹带剂泵P2和液体泵P1，选择乙醇为夹带剂，调节各自的频率，使夹带剂泵和液体泵的进料比为1: 5，洗脱液与夹带剂混合后经超临界CO2抗溶剂系统的纳米喷嘴喷入结晶釜F1中，分离釜F2的温度为45°C，分离压力为5Mpa，纳米喷嘴的口径为80nm，洗胶液中的溶剂和夹带剂进入分离釜中解析并分离，洗脱液中的溶质在结晶釜内析出为微细颗粒，该微细颗粒即为冬凌草纳米微粒。本实施例制备的冬凌草纳米微粒的平均粒径为104. 8nm。实验例I :
为了验证冬凌草纳米微粒可在防治骨质疏松症方面的应用效果，按本发明制备方法得到的冬凌草纳米微粒进行对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响实验
I、实验方法
将32只SD雄性大鼠随机分为4组，即对照组、模型组、纳米给药组和常规给药组，每组8只。除对照组外，其余三组进行切除卵巢手术。4周后，给药组分别进行冬凌草纳米微粒和冬凌草常规制剂的灌胃给药，对照组和模型组进行相同体积生理盐水的灌胃给药，连续给药30d。30d后分别测定其骨密度。2、实验结果
冬凌草对去卵巢大鼠股骨骨密度的测定结果如下表2。表2.冬凌草对去卵巢大鼠股骨骨密度的影响
权利要求
1.一种冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)将冬凌草与去离子水或无水こ醇中的一种或两种组合溶剂按I:I 20混合后，在回流提取温度为70°C 95°C下回流提取30min 300min，趁热过滤，得到滤渣和滤液； (2)将步骤(1)得到的滤液在60で^KTC的条件下进行减压蒸馏浓缩至原体积的1/2 1/10 ； (3)将步骤(2)得到的浓缩滤液进行脱色、脱蛋白质处理，然后将处理液用95%こ醇调节至溶液中こ醇浓度为50%飞0%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物和上清液； (4)将沉淀物用1(Γ50倍的去离子水充分溶解，然后上凝胶柱进行层析，用超纯水洗脱，洗脱速度为O. lmfl. Oml/min，用紫外分光光度法进行跟踪并收集洗脱液； (5)将步骤(4)的洗脱液与超临界CO2抗溶剂系统的液体泵相连； (6)启动超临界CO2抗溶剂系统，结晶釜的温度为40°C 80°C，结晶釜的压カ为8Mpa 50Mpa，CO2 的流量为 30 300L/hr ； (7)启动超临界CO2抗溶剂系统的夹带剂泵和步骤(4)中的液体泵，洗脱液与甲醇、こ醇、こ酸こ酯或丙酮中的一种夹带剂的进料比为10: f 1:10，洗脱液与夹带剂先混合后，经超临界CO2抗溶剂系统的纳米喷嘴喷入结晶釜中，流量控制在IOOmf 1000ml/hr ;洗脱液中的溶剂和夹带剂进入分离釜中解析并分离，洗脱液中的溶质在结晶釜内析出为微细颗粒，该微细颗粒即为冬凌草纳米微粒。
2.根据权利要求I所述的冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于所述步骤(7)中的纳米喷嘴的口径为I lOOnm。
3.根据权利要求I所述的冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于所述的分离釜温度为35°C 60°C,分离压カ为4Mpa 7Mpa。
4.根据权利要求I所述的冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于所述的分离釜温度为50 C，分尚压力为5Mpa。
5.根据权利要求I所述的冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于所述的CO2气体的纯度不低于99%。
6.根据权利要求I所述的冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于所述的凝胶柱层析所用的填料为葡聚糖凝胶系列、琼脂糖凝胶系列或丙烯葡聚糖凝胶系列中的ー种。
7.根据权利要求I所述的冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于将步骤(3)离心得到的上清液用95%こ醇调节至溶液中こ醇浓度为60°/Γ70%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物II和上清液；将上述离心得到的上清液用95%こ醇调节至溶液中こ醇浓度为709Γ80%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物III和上清液；再将上述离心得到的上清液用95%こ醇调节至溶液中こ醇浓度为80°/Γ90%，低温静置12 24小时，离心分离得到沉淀物IV ;将上述得到的沉淀物II、沉淀物III和沉淀物IV与步骤(3)中得到的沉淀物合并。
8.根据权利要求I所述的冬凌草纳米微粒的制备方法，其特征在于将步骤(I)滤渣重复步骤(I)操作I次，合并滤液。
9.一种如权利要求I所述的制备方法制备的冬凌草纳米微粒在防治骨质疏松症方面的应用。
10.一种如权利要求I所述的制备方法制备的冬凌草纳米微粒在制备防治骨质疏松症方面药物中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种冬凌草纳米微粒的制备方法，主要是将冬凌草提取物采用超临界CO2抗溶剂技术处理。本发明还公开了通过本发明制备方法制得的冬凌草纳米微粒在治疗骨质疏松方面的应用。本发明因采用超临界CO2抗溶剂技术制备冬凌草纳米微粒，无需脱除溶剂残留、干燥、粉碎等后续处理工序，大大提高生产效率；整个过程中采用的CO2具有无臭、无毒、无污染、不易燃易爆的特点，使生产环境具有更高的安全性；产品中无溶剂残留，使产品品质具有更高的安全性。
文档编号A61K36/53GK102824405SQ20121034870
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者曾智平, 华健 申请人:华健