专利名称：一种利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的方法
技术领域：
本发明属于兽用生物制品领域。更具体地，本发明涉及一种利用生物反应器工业化生产病毒疫苗的方法。
背景技术：
犬细小病毒病(Canineparvovirus disease, CPVD)是由犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)引起的犬的一种急性传染病。可在犬和猫之间传播，各种年龄的犬都能感染，断奶后的幼龄犬最为易感，传播速度快，发病率和死亡率高达70%以上。自正式报道犬细小病毒病在我国流行以来，该病对我国养犬业造成了极大的危害。给动物接 种疫苗是预防犬细小病毒感染的最有效的方法，目前国内生产犬细小病毒疫苗的方法多采用传统转瓶法或鸡胚生产工艺，但与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要体现在培养病毒滴度低、产品质量不均一稳定、批间差大，生产效率低等。因此，特别需要一种新的均一高效的生产犬细小病毒灭活疫苗的方法。
发明内容
本发明提供一种利用生物反应器工业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，该方法是利用生物反应器载体系统培养制苗用细胞，感染病毒后可获得高效价的病毒抗原。该方法较现有的转瓶或鸡胚生产工艺具有病毒滴度高、质量均一稳定、生产效率高、过程可控性好的特点，是今后大规模工业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展方向。本发明所采用的技术方案如下一种利用生物反应器工业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤I)应用生物反应器微载体和片状载体系统培养制苗用细胞；2)接种犬细小病毒，进行生物反应器扩增病毒；3)收获犬细小病毒的病毒培养液；4)犬细小病毒经二乙烯亚胺(BEI)灭活，加入佐剂制备疫苗。其中，优选的是，本发明步骤I)所用的制苗用细胞系为犬肾细胞系MDCK或猫肾细胞系F81。本发明步骤2)所接种的犬细小病毒毒株为CPV-2型病毒株。病毒是经过细胞适应性培养而来，具体方法为将犬细小病毒接种制苗用细胞后盲传，即取接种病毒后病毒培养上清按I :3的量接种新鲜培养细胞进行不断传代，待细胞出现典型病变或上清中可明显检测到病毒为止，一般传至3到5代即可，扩增并冻存病毒液作为反应器生产用毒种。本发明进一步优选的技术方案是，所用的生物反应器带有Cell-Lift搅拌浆并使用Cytodex系列微载体培养系统；或者所用的生物反应器带有篮式搅拌浆并使用酯片载体系统；或者，所用的生物反应器为一次性激流式生物反应器并使用纸片载体培养系统。其中，Cytodex系列微载体的使用浓度为5_20g/L ;酯片载体使用FibraCel disks圆盘状酯片载体，其使用浓度为200-2000g每批次；纸片载体使用国产一次性聚酯纤维纸片载体，使用量为160g或1200g每批次。本发明进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗用细胞工艺包含微载体单级或放大培养工艺，单级培养所用种子细胞为转瓶或细胞工厂培养贴壁细胞，放大培养所用种子细胞为生物反应器微载体系统培养所获细胞。单级培养优选为14L生物反应器单级培养模式，放大培养优选为14L到40L放大培养模式。具体放大方法为将微载体上生长细胞通过胰酶消化装置消化下来以后，连同新的微载体一起导入到新的更大体积的生物反应器中继续培养，依此方法放大到所需生产规模。本发明14L到40L放大培养模式采用一种胰酶消化装置消化细胞，避免了大规模消化细胞工艺繁琐及消化时间长的缺点，消化下来的细胞在微载体上重新贴附及生长状态良好。本发明进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗用细胞方式为补料分批培养方式或连续灌注的培养方式。其中，生物反应器片状载体系统培养方式优选为补料分批培养方式，生物反应器微载体系统培养方式则优选为灌注培养方式。本发明进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗工艺条件 温度为 360C _37°C，搅拌转速为 40RPM -60RPM，溶氧(DO)为 30%_60%，pH 为 7. 0-7. 2。本发明进一步优选的技术方案是，步骤I)所述的生物反应器培养制苗用细胞所用的细胞生长液为分别添加5-10%的小牛血清的DMEM/F12、DMEM、MEM或199培养基，在一具体的实施例中，采用的培养基为添加8%的小牛血清的DMEM/F12培养基。在一个具体的实施方式中，本发明采用的生物反应器载体培养系统中聚酯纤维纸片载体量160g，接种细胞密度为2-6X 109cells，优选的为2_4X 109cells，接种病毒前总细胞量在2X IOiciceIls以上。在另一个具体的实施例中，本发明所使用的Cytodex I微载体浓度为5-20g/L，优选的为6-10 g/L，接种细胞密度为O. 5-2X 106cellS/mL。本发明进一步优选的技术方案是，本发明的生物反应器培养模式可以是分批培养、补料分批培养、连续培养或灌注培养方式任一。在一个具体的实施例中，本发明所采用的制苗用细胞培养模式为补料分批培养方式，在另一个具体的实施例中，本发明所采用的制苗用细胞培养模式为连续灌注培养方式。生物反应器扩增病毒可以按任意比例接种犬细小病毒。优选的是，本发明步骤2)所述的犬细小病毒接种量按O. 001-0. IMOI进行接种，在更加优选的另一具体实施例中，本发明所采用的病毒接种量为O. 01M0I。MOI即病毒感染复数(Multiplicity Of Infection)的英文缩写，直观来讲就是总病毒数与总细胞数的比值，通过取样计数接种病毒前细胞浓度来确定接种病毒量。本发明进一步优选的技术方案是，步骤2)所述的病毒培养工艺为补料分批培养或连续灌注培养，采用的病毒维持培养基为原倍的或浓缩了 2-5倍的培养基，更优选为浓缩了 2-3倍的培养基。培养过程中，间歇补加营养物质如葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物或乳清蛋白水解物任一或其组合。本发明进一步优选的技术方案是，步骤2)生物反应器扩增培养工艺条件为温度为 340C _35°C，搅拌转速为 40RPM-50RPM，溶氧(DO)为 30%_60%，pH 为 7. 2-7. 4。病毒维持培养基为DMEM/F12、DMEM、MEM或199基础培养基的任一之中添加O. 5%_2%的小牛血清，优选的是DMEM/F12基础培养基中添加2%的小牛血清。病毒的收获可以按任一方式收获，本发明步骤3)所采用的病毒抗原收获方式依病毒培养方式不同而可以米用不同收获方式。病毒培养方式为补料分批培养时收获病毒可米用分批收获方式，病毒培养为连续灌注培养时收获病毒可采用连续收获方式。灭活是指用物理或化学手段杀死病毒、细菌等，但是不损害它们体内有用抗原的方法。生物制品行业制苗用病毒常用的灭活方法有甲醛灭活、BPL(i3_丙内酯)灭活及BEI (二乙烯亚胺)灭活，甲醛灭活以使病毒的蛋白、核酸变性来达到灭活而保留部分抗原的目的；BPL和BEI灭活是一种新型的病毒灭活方法，仅破坏病毒的核酸而不破坏病毒的蛋白质而达到灭活目的，保持病毒的免疫原性。本发明步骤4)所述的病毒灭活方法为BEI灭活，该方式灭活获得的产品具有较好的免疫原性。除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
图I为本发明利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的工艺流程图。图2为14L生物反应器中微载体上细胞生长曲线图。图3a为细胞接种后12h的微载体体状态图。图3b为细胞接种后培养60h的微载体体状态图。图3c为接毒后36h的微载体体状态图。图3d为接毒后96h的微载体体状态图。
具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例，其作用应被理解为是对本发明的解释和说明，而不用于限制本发明的范围。实施例I IOL安普激流式生物反应器纸片载体系统培养生物反应器为安普AP20激流式生物反应器，配备一次性聚酯纤维纸片载体系统。细胞为猫肾传代细胞F81，购自上海研晶生化，制苗用犬细小病毒为CPV-2型病毒株，其ATCC保藏号为VR-2016。DMEM/F12培养基购自北京清大天一公司，小牛血清购自武汉三利生物技术有限公司。I)生物反应器的准备及纸片载体的处理将细胞培养袋无菌条件下装好电极，泵入新鲜培养基。细胞生长培养基为添加10%小牛血清的DMEM/F12液体培养基。将无菌pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)导入预装有纸片载体的灌注培养袋中，浸泡过夜。将PH7. 2的PBS排出，开启循环泵让灌注袋中充满细胞生长培养基。设定温度、搅拌转速及通气，无菌备用。2)接种细胞进行反应器培养用转瓶静置培养种子细胞，按总细胞为2X IO9ceIls的细胞量接种IOL安普生物反应器，灌注培养袋中预装载体量为160g。设定工艺条件如下温度为37°C，搅拌转速为50RPM，pH为7. 2 (CO2和加NaHCO3调节)，溶氧为50%(氮气和空气调节)。过程中每12h取样测定葡萄糖消耗情况，若葡萄糖浓度过低可置换部分新鲜培养基。 3 )接种病毒及病毒增殖培养细胞培养4-5天后，当葡萄糖日消耗量超过2g，预测细胞总量达2X IOiciceIls时按O. 01M0I接种犬细小病毒,接种病毒后静置培养6h,后打开循环泵,用病毒维持液置换细胞生长培养基为病毒维持培养基，让灌注袋中充满病毒维持培养基，病毒维持培养基为DMEM培养基添加2%的小牛血清。设定工艺条件如下温度为34°C，搅拌转速为50RPM，pH为7. 3 (CO2和加NaHCO3调节)，溶氧为60% (氮气和空气调节)，过程依葡萄糖消耗需补加原倍的或浓缩的培养基，当糖耗明显降低或取样明显观察到游离细胞时结束培养，过程可分批收获病毒液，病毒培养周期为2-4天。4)病毒血凝效价检测
(I)在“V”型微量反应板上进行。每孔加入50uL，pH 7. 2的O. 01mol/L的PBS液或生理盐水，向第I孔滴加步骤3)所收获的病毒上清50uL，吸放3 5次混匀，然后从第一孔吸出50uL加入第二孔，以相同方法混匀，再从第二孔吸50uL加入第三孔，如此做倍比稀释至倒数第二孔，再从倒数第二孔吸出50uL弃去，最后一孔不加病毒(抗原)作为红细胞对照。(2)吸取O. 5%鸡红细胞悬浮液，每孔滴加50uL，加毕后在微量振荡器上振荡15 30秒，使其混合均匀，静置室温下或37°C温箱中作用20 40分钟。(3)当对照孔红细胞全部沉入孔底中间，即可判定各孔的红细胞凝集情况。以病毒最大的稀释度孔出现100%凝集现象者为这个病毒的凝集价，即一个血凝单位。(4)所收获病毒上清检测步骤如下表，检测结果显示生物反应器分批补料培养病毒抗原血凝效价为可达213。表I为所收获抗原HA效价检测步骤及结果
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I 2 345 6 7 8 9 10 Il 材料对照
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/1^1 ilp ^jffI 平 ρ Π9"uL·, ￡* L·, L·,I L·,
pl72 B PiSCuL) W 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 ~50^ 醫霉濯团50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
0.5%的鸡红细胞(uL)^^5(Γ δ() 50 50 δ() 50 50 50 50 δ() δΟ "50^
EEHBfP^^^ 37V, 20 40 分W^^
结果######### ++1 —'—注:#为完全凝集，++为不完全凝集，一为不凝集。5)病毒灭活及制苗将收获的病毒液按O.Olmmol/mL的量加入BEI灭活过夜，灭活检验合格后按O. 5mg/mL的量加入氢氧化铝胶佐剂配制疫苗，分装冻干后制成成品。实施例2 14L NBS搅拌式生物反应器放大培养反应器为NBS公司Celligen 310生物反应器，带Cell-Lift搅拌桨。微载体为GE公司Cytodexl载体，细胞生长培养基为DMEM/F12培养基(北京清大天一生物技术有限公司)添加10%的小牛血清(武汉三利生物技术有限公司)，猫肾传代细胞F81购自上海研晶生化，CPV-2型病毒株为ATCC(美国菌种保藏中心)VR-2016毒株。I)生物反应器的准备将生物反应器罐体进行彻底清洗，将pH及DO电极进行标定后安装到罐体上，包扎管道接口并进行检漏试验，完成后进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121 °C，30min，自然冷却 至室温。将无菌过滤好的细胞生长培养基无菌连接到反应器上，通过蠕动泵导入罐体，培养基的最少加入量以浸没电极探头为标准，设定参数，并打开反应器温度、搅拌及通气控制进行培养基的平衡和预培养，过夜待用。2)生物反应器培养制苗用细胞具体步骤为按GE公司的说明书预处理微载体，浓度为10g/L，之后连同细胞生长培养基导入到生物反应器中，设定生物反应器培养工艺条件为温度为37°C，搅拌转速为45RPM，DO为50%, pH为7. 2。待稳定后接种F81细胞，细胞密度在I X 106cells/mL后开始灌注生长液，后依细胞密度调整灌注速率为每天O. 5-2个工作体积，取样显微镜观察细胞完全长满微载体后可用于接种病毒或者按如下方法放大培养将NBS 14L生物反应器长满的微载体细胞导入到一种细胞消化装置中，用无菌PH7. 2的PBS洗涤1-2次，加入胰酶消化5-10分钟后加入生长液终止消化，并按总浓度10g/L的载体量加入新的微载体并导入到NBS 40L生物反应器中，同上述14L生物反应器培养参数设定培养工艺条件，采用连续灌注培养直到细胞长满微载体，细胞生长周期为3-5天。生物反应器中微载体上细胞生长曲线如附图2所示。3)接种病毒并培养繁殖病毒细胞取样观察全部长满载体表面后，接种犬细小病毒。病毒接种量为0.01M0I。接种病毒后生物反应器培养工艺条件为温度为34°C，搅拌转速为50RPM，DO为60%，pH为7. 3，病毒维持液为DMEM培养基添加2%的小牛血清。接种病毒6h后用病毒维持液置换生物反应器中细胞生长液，灌注速率为每天O. 5-2个工作体积，24h后进行连续灌注培养病毒并连续收获上清，直到细胞病变脱落后结束培养，并低温保存病毒液，病毒培养时间为3-4天。显微镜观察接种病毒前和接种病毒后生物反应器细胞贴附微载体情况如图3所
/Jn ο4)病毒血凝效价检测接种病毒后每24h取样，按实施例I步骤4)检测方法进行病毒血凝效价检测，检测结果见下表。表I生物反应器收获病毒血凝效价测定结果
病毒培养时间~|24h |48h |72h |96h
权利要求
1.ー种利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤 I)应用生物反应器微载体和片状载体系统培养制苗用细胞； 2)接种犬细小病毒，进行生物反应器扩增病毒； 3)收获犬细小病毒的病毒培养液； 4 )犬细小病毒经ニこ烯亚胺(BEI)灭活，加入佐剂制备疫苗。
2.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤I)所用的制苗用细胞为犬肾细胞系MDCK或猫肾细胞系F81，所述步骤2)使用的犬细小病毒毒株为CPV-2型病毒株。
3.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤I)所述生物反应器为 带有Cell-Lift搅拌桨和Cytodex系列微载体培养系统的生物反应器，或 带有篮式搅拌桨和Celligen310酯片载体系统的生物反应器，或 带有纸片载体培养系统的一次性激流式生物反应器。
4.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤I)应用生物反应器微载体和片状载体系统进行制苗用细胞的培养エ艺模式为14L生物反应器单级培养模式或14L到40L放大培养模式。
5.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤I)所述生物反应器培养制苗用细胞的エ艺条件为温度为36°C _37°C，搅拌转速为 40RPM -60RPM，溶氧(DO)为 30%_60%，pH 为 7. 0-7. 2，细胞生长培养基为 DMEM/F12、DMEM、MEM或199基础培养基的任一之中添加5%-10%的小牛血清。
6.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤I)应用生物反应器微载体和片状载体系统进行制苗用细胞培养所采用的培养方式为分批补料培养或连续灌注培养。
7.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤2)接种犬细小病毒后病毒扩增培养エ艺条件为温度为34°C _35°C，搅拌转速为40RPM-50RPM，溶氧(DO)为 30%_60%，pH 为 7. 2-7. 4。病毒维持培养基为 DMEM/F12、DMEM、MEM或199基础培养基的任一之中添加O. 5%-2%的小牛血清。
8.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤2)接种犬细小病毒的接种量按O. 001M0I -O. IMOI进行接种。
9.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在干，步骤2)所采用的病毒培养方式为分批补料培养和连续灌注培养；分批补料培养所用培养基为原倍或浓缩2-5倍的病毒維持培养基，并间歇补加营养物质，所述营养物质选自葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物、乳清蛋白水解物中的任一或二者以上的组合。
10.根据权利要求I的利用生物反应器エ业化生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤3)所采用的收获犬细小病毒的方法为分批收获或连续收获方式。
全文摘要
本发明公开了一种利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤(1)应用生物反应器微载体和片状载体系统进行制苗用细胞培养; (2)接种犬细小病毒并进行病毒扩增培养;(3)收获病毒培养液;(4)病毒液经BEI灭活，加入佐剂制备疫苗。本发明具有培养细胞密度大、病毒滴度高、质量均一稳定、过程可控和生产效率高的优点，克服了现有转瓶或鸡胚生产工艺产品批间差大、抗原含量低和生产效率低的不足。
文档编号A61K39/23GK102861329SQ20121034888
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者李伟, 刘洁, 秦红刚, 漆世华, 朱薇, 谢红玲, 韩兴, 王桢桢, 王威, 温文生 申请人:武汉中博生物股份有限公司